DE3685724T2 - Synthetisches peptid-substrat fuer die bestimmung von trypsin und alpha-1-antitrypsin. - Google Patents

Synthetisches peptid-substrat fuer die bestimmung von trypsin und alpha-1-antitrypsin.

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DE3685724T2 DE8686116421T DE3685724T DE3685724T2 DE 3685724 T2 DE3685724 T2 DE 3685724T2 DE 8686116421 T DE8686116421 T DE 8686116421T DE 3685724 T DE3685724 T DE 3685724T DE 3685724 T2 DE3685724 T2 DE 3685724T2
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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein synthetisches Peptidsubstrat mit einer farberzeugenden und fluoreszenzemittierenden Gruppe, die für die Bestimmung von Trypsin und alpha&sub1;-Antitrypsin geeignet ist. Das erfindungsgemässe Substrat weist eine beachtlich hohe Selektivität auf, im Vergleich zu bekannten Substraten, und ist somit für die Bestimmung von Trypsin geeignet. Weiterhin kann das erfindungsgemässe Substrat für Untersuchungen von Reaktionen verwendet werden, worin die Funktion von Trypsin inhibiert wird oder worin Trypsin verbraucht wird, oder es kann für Studien von Faktoren verwendet werden, die zu diesen Reaktionen gehören, insbesondere für die Bestimmung von alpha&sub1;-Antitrypsin.
  • alpha&sub1;-Antitrypsin (nachfolgend mit alpha&sub1;-AT bezeichnet) ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 51.000, das in normalem Serum in einer Konzentration von 160 bis 350 mg/dl enthalten ist. Eine Hauptfunktion von alpha&sub1;-AT liegt darin, mit Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin, Kallikrein, etc., und weiterhin mit Elastase, das sich von weissen Blutzellen ableitet, Kollagenase, etc. zur Bildung von stabilen Komplexen zu kombinieren, was zur Neutralisierung oder zur Inhibition der Funktionen dieser Proteasen führt.
  • alpha&sub1;-AT wird ebenfalls als ein akutes Phasenreaktionsmittel bezeichnet und erhöht beachtlich seinen Gehalt im Serum bei akuten Entzündungserkrankungen, nach chirurgischen Eingriffen oder der Zertörung von Geweben. Der Gehalt an alpha&sub1;-AT wird ebenfalls duch die Verabreichung von Östrogen oder Insulin und durch eine Schwangerschaft erhöht, aber durch ernsthafte Leberfunktionsstörungen, wie Lebercirrhose, maligne Hepatitis und Mangelernährungszustände, vermindert. Weiterhin, da es seit kurzem bekannt ist, dass der alpha&sub1;-Antitrypsingehalt ebenfalls durch einen malignen Tumor erhöht wird, wird erwartet, dass alpha&sub1;-AT als ein Marker für damit zusammenhängende Tumore verwendet wird.
  • Die Spezifizität der qualitativen Änderung von alpha&sub1;-AT wurde seit einem Bericht über eine Komplikation von Lungenemphysem und einem alpha&sub1;-Antitrypsinmangel bemerkt (S. Eriksson: Acta Medica Scandinavia, Supplementum 432, S. 41-75 (1965)). Seit dieser Zeit wurde eine Beziehung zwischen alpha&sub1;-AT und einer chronischen, verschliessenden Lungenerkrankung graduell klar. Daher ist es signifikant, dass alpha&sub1;-AT, das klinisch festgestellt wurde, einfach und genau bestimmt werden kann.
  • Die Bestimmung von alpha&sub1;-AT im Serum kann durch Messung der Inhibitionsfähigkeit der Trypsinaktivität durchgeführt werden. Das heisst, wenn Trypsin zu Serum zugegeben wird, wird ein Teil des zugegebenen Trypsins in Abhängigkeit von der Menge von alpha&sub1;-AT deaktiviert. Somit wird die Aktivität des verbleibenden Trypsins gemessen, um alpha&sub1;-Antitrypsin zu bestimmen.
  • Als Substrate zum Bestimmen von Trypsin wurden früher Proteine, wie Gelatine, Hämoglobin, etc., verwendet.
  • Nachdem aber Bergmann et al 1939 berichteten, dass Trypsin Amidase- und Esterasefunktionen zusätzlich zu der Proteinzersetzungsfunktion aufwies, wurden verschiedene synthetische Substrate (beispielsweise Bz-L-Arg-OEt, Tos-L-Arg-OMe, BzDL-Arg-pNA, Tos-L-Arg-pNA, etc.) bei der Bestimmung verwendet, basierend auf der Amidobindung oder der Esterbindung von Arginin. Aber diese synthetischen Substrate wiesen Probleme bei der Spezifizität von Substraten sowie bei der Löslichkeit in Wasser oder Pufferlösungen auf. Als Substrate zum Bestimmen von Trypsin wurden weiterhin Z-Val-Gly-Arg-pNA (CHR-TRY, ein Warenname, hergestellt von Pentapharm A.G.), etc. (US-PS 4 278 762) und Aminomethylcoumarin (AMS) entwickelt, die Fluoreszenz nach der Freilassung emittieren können (Smith et al, Chemical Abstr. 92:159413h (1980)). In der oben genannten Formel bedeuten Bz Benzoyl, Arg Araginyl, OEt Ethoxy, Tos p-Toluolsulfonyl, OMe Methoxy, pNA p-Nitroanilid, Z eine Benzyloxycarbonylgruppe, Val Valyl und Gly Glycyl.
  • Auf der anderen Seite kann bei der Bestimmung von alpha&sub1;-AT im Serum unter Verwendung eines farbentwickelnden Substrates, wenn Nebenreaktionen mit anderen Proteasen als Trypsin, wie Plasmin, Thrombin, Faktor Xa, Urokinase, etc., stattfinden, von denen erwartet wird, dass sie in dem Serum vorhanden sind, eine genaue Messung nicht erwartet werden.
  • Das oben genannte CHR-TRY, das das beste Substrat für die Bestimmung von Trypsin ist, ist nicht immer im Hinblick auf die Substratspezifizität zufriedenstellend. Das heisst, es ist bekannt, dass CHR-TRY beachtlich mit Thrombin, Plasmin, Faktor Xa, Urokinase, etc., die anders sind als Trypsin, reagiert. Weiterhin können bei dem Verfahren zur colorimetrischen Bestimmung einer gelben Farbe von p-Nitroanilid, die unter Verwendung von CHR-TRY als ein Substrat hergestellt ist, Einflüsse von Serumkomponenten nicht verhindert weden.
  • Die Menge an alpha&sub1;-AT in dem Serum liegt üblicherweise bei 160 bis 350 mg/dl, wobei der Wert etwa 10 mal so gross ist wie der von alpha&sub2;-Macroglobulin (alpha&sub2;-M) in einer molaren Konzentration, wobei alpha&sub2;-M ebenfalls in dem Serum vorhanden ist. Weiterhin reagiert alpha&sub1;-AT leicht mit verschiedenen Entzündungsreizen, um die Menge davon auf das etwa 2- bis 4-fache in dem Serum zu erhöhen. Um alpha&sub1;-AT, das in einer grossen Menge vorhanden ist und das sich bezüglich der Menge stark verändert, bei dem folgenden Verfahren zu bestimmen, tauchen viele Probleme auf:
  • alpha&sub1;-AT in dem Serum + Trypsin (Überschuss, bekannte Menge) T [alpha&sub1;-AT x Trypsin-Komplex) + Trypsin (restliche Menge) (inaktiviert) Substrat Trypsin (restliche Menge) Peptid + pNA Bestimmung von alpha&sub1;-AT
  • Das heisst, um alpha&sub1;-AT genau mit einer Serumverdünnungsrate um das etwa 100- bis 150-fache, was üblicherweise auf diesem Gebiet verwendet wird, zu messen, sollte eine grosse Menge an Trypsin zusammen mit einer beachtlich grossen Menge an dem Substrat verwendet werden. Um die Untersuchung durch Verwendung geeigneter Mengen des Enzyms durchzuführen und um das Substrat in einem geeigneten Messbereich zu haben, ist es im Gegensatz dazu erforderlich, das Serum auf das etwa 500- bis 1000-fache zu verdünnen. Aber eine derartig hohe Verdünnungsrate ist unerwünscht, da die Vorgehensweise bei der täglichen Bestimmung kompliziert wird und leicht bei der Messung Fehler verursacht, die Reaktivität mit alpha&sub1;-AT und Trypsin verändert sich, der Einfluss von alpha&sub2;-Macroglobulin (alpha&sub2;-M) wird nicht vernachlässigbar und eine genaue Messung wird schwierig. Um die Serumverdünnungsrate auf das etwa 100- bis 150-fache einzustellen, ist es erforderlich, neue Substrate zu entwickeln, die eine geeignete Reaktivität mit Trypsin und eine hohe Löslichkeit in Wasser oder Pufferlösungen aufweisen.
  • Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein synthetisches Peptid zur Verfügung zu stellen, das für die Bestimmung von Trypsin und alpha-Antitrypsin, insbesondere für die Bestimmung von alpha&sub1;-AT, mit einer geeigneten Serumverdünnungsrate geeignet ist, wobei es eine hohe Spezifizität für Trypsin und eine ausreichende Löslichkeit in dem Messsystem aufweist.
  • Diese Erfindung stellt ein synthetisches Peptid der Formel zur Verfügung:
  • worin A&sub1; eine Prolyl (Pro)- oder Alanyl (Ala)-Gruppe ist; worin Leu eine Leucylgruppe ist; und worin Lys eine Lysylgruppe ist, oder ein Säureadditionssalz davon.
  • Diese Erfindung schlägt ebenfalls ein Verfahren zur Verwendung eines synthetischen Peptides der Formel:
  • worin A&sub1;, Leu und Lys wie oben definiert sind, oder eines Säureadditionssalzes davon, als ein Substrat zum Bestimmen von Trypsin oder alpha&sub1;-Antitrypsin vor.
  • Diese Erfindung schlägt weiterhin ein Verfahren zum Bestimmen von alpha&sub1;-Antitrypsin vor, umfassend die Zugabe einer Trypsinlösung mit einer bekannten Menge an Trypsin zu einer Probenlösung, die Inkubation der resultierenden Mischung, die Zugabe einer Substratlösung, die als ein Substrat ein synthetisches Peptid der Formel:
  • worin A&sub1;, Leu und Lys wie oben definiert sind, oder ein Säureadditionssalz davon enthält, zu der Mischung, die Inkubation der resultierenden Mischung, die Zugabe eines Kupplers zu der Mischung und das colorimetrische Messen einer erzeugten Farbe.
  • Die beigefügte Zeichnung ist eine Kalibrierungskurve für die Bestimmung von alpha&sub1;-AT.
  • Das synthetische Peptid dieser Erfindung wird durch die Formel dargestellt:
  • worin A&sub1; eine Prolyl (Pro)- oder Alanyl (Ala)-Gruppe ist; worin Leu eine Leucylgruppe ist; und worin Lys eine Lysylgruppe ist, oder es ist ein Säureadditionssalz davon. Da das synthetische Peptid der Formel (I) (nachfolgend umfasst das Peptid der Formel (I) ebenfalls ein Säureadditionssalz davon) beachtlich hydrophile Gruppen, wie eine Hydroxylgruppe und eine Carboxylgruppe als den farberzeugenden Anteil
  • aufweist, weist es beachtliche Auflösungseigenschaften in Wasser auf.
  • Das synthetische Peptid der Formel (I) weist ebenfalls eine ausgezeichnete Substratspezifizität für Trypsin auf, im Vergleich zu den Substraten des Standes der Technik, wie CHR-TYR (Z-Val-Gly-Arg-pNA). Dies kann durch die folgende Tabelle 1 gezeigt werden, worin relative Reaktivitäten von Substraten mit verschiedenen Proteasen, wie Trypsin (Try), Thrombin (TH), Plasmin (PL), Faktor Xa (FXa), Kallikrein (KL) und Urokinase (UK) gezeigt sind, indem die Reaktivität eines Substrates, dargestellt durch die Formel
  • H-D-Pro-Leu-Lys-pNA (II)
  • mit Proteasen gleich 100 gesetzt wird. Das Substrat der Formel (II) ist im Hinblick auf das synthetische Peptid der Formel (I) nur im Hinblick auf die chromophile Gruppe unterschiedlich. TABELLE 1 Substrat Protease ANMERKUNG: Anfängliche Substratkonzentration: 2 mmol. Die Werte in Klammern sind die gemessenen Werte für die optische Dichte. Detaillierte Messbedingungen sind in dem unten erwähnten Beispiel 3 beschrieben.
  • Wie aufgrund der Tabelle 1 klar ist, ist das Substrat PS-1188, ein Substrat dieser Erfindung mit CHA als dem farbproduzierenden Anteil, ziemlich gering bezüglich der Reaktivität mit Thrombin, Plasmin, Faktor Xa, Kallikrein und Urokinase. Beispielsweise ist die relative Reaktivität 0 % in dem Fall von Thrombin, 3 % in dem Fall von Plasmin, 37 % in dem Fall von Faktor Xa und 2 % in dem Fall von Kallikrein. Diese Werte bedeuten, dass das Substrat PS-1188 dieser Erfindung im Hinblick auf die Selektivität beachtlich verbessert ist im Vergleich zu dem CHR-TRY aus dem Stand der Technik, bei dem die relative Reaktivität in dem Fall von Thrombin bei 2200 %, in dem Fall von Plasmin bei 43 %, in dem Fall von Faktor Xa bei 2114 % und in dem Fall von Kallikrein bei 74 % liegt.
  • Da das synthetische Peptid der Formel (I) ausgezeichnet im Hinblick auf die Wasserlöslichkeit und Substratspezifizität ist, kann es zum Bestimmen von Trypsin oder alpha&sub1;-Antitrypsin mit hoher Genauigkeit verwendet werden. Wenn die Substratspezifizität, die in Tabelle 1 gezeigt ist, berücksichtigt wird, ist das synthetische Peptid der Formel (I) für die Bestimmung von alpha&sub1;-AT besonders geeignet.
  • Das Prinzip der Bestimmung von Trypsin oder alpha&sub1;-Antitrypsin liegt in der Reaktion des synthetischen Peptides der Formel (I) mit Trypsin zur Erzeugung einer gefärbten Substanz, die durch Reaktion des freigelassenen 3-Carboxy-4-hydroxy-anilins mit Pentacyanoaminferroat (PCAF) oder einem geeigneten Kuppler (durch oxidative Kupplung) erhalten ist, und liegt in der Durchführung der colorimetrischen Bestimmung.
  • Alternativ wird das freigelassene 3-Carboxy-4-hydroxyanilin durch eine anregende Wellenlänge von 328 nm angeregt und die emittierte Fluoreszenzwellenlänge von 540 nm wird durch konventionelle fluorometrische Analyse gemessen. Die fluorometrische Analyse ist für die Bestimmung der Trypsinaktivität geeignet.
  • Das colorimetrische Bestimmungsverfahren, das oben erwähnt ist, ist insbesondere für die Bestimmung von alpha&sub1;-AT geeignet. alpha&sub1;-AT in dem Serum kann beispielsweise wie folgt bestimmt werden:
  • alpha&sub1;-AT in dem Serum + Trypsinlösung (bekannte Menge im Überschuss)
  • T [alpha&sub1;-AT x Trypsin] + Trypsin (restliche Menge) (inaktiviert) Substrat Trypsin (restliche Menge) Peptid + CHA CHA + PCAF Kuppler Farbentwicklung Messung
  • Bei den oben genannten Vorgängen wird das Substrat mit Trypsin in einer Pufferlösung mit einem pH von 8,0 bis 8,7 zur Reaktion gebracht.
  • Um eine gefärbte Substanz zu bilden, wird das 3-Carboxy-4-hydroxyanilin, das von dem synthetischen Peptid der Formel (I) freigelassen ist, mit Natriumpentacyanoaminferroat (das Pentacyanoaminferroat-Verfahren) zur Reaktion gebracht oder einer oxidativen Kupplung mit einem Kuppler unterworfen (das oxidative Kupplungsverfahren). Als Kuppler können Verbindungen aus der Anilinserie, wie N,N-Diethylanilin, N,N-Diethyl-m-toluidin, etc. in dem Fall der Farbentwicklung bei einer sauren Stelle, und Phenolverbindungen, wie Phenol, Naphthol, Thymol, Kresol, etc., in dem Fall der Farbentwicklung bei einer alkalischen Stelle verwendet werden.
  • Bei der oxidativen Kupplung wird ein Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, Persulfate, Metaperjodate, und ähnliche Oxidationsmittel verwendet. Unter diesen ist die Verwendung von Metaperjodat bevorzugt.
  • Die resultierenden gefärbten Substanzen weisen maximale Absorptionswellenlängen in dem Bereich von 560 bis 770 nm auf, in Abhängigkeit von dem verwendeten Kuppler und dergleichen. Die entwickelte Farbe wird durch die Temperaturänderung schwer geändert und ist stabil, so dass sie für die Bestimmung der Trypsinaktivität geeignet ist. Das synthetische Peptid der Formel (I) wird schwer durch andere Enzyme in dem Serum beeinflusst, wie es oben erwähnt ist. Weiterhin, da die colorimetrische Bestimmung bei einer Wellenlänge von 560 nm oder mehr gemäss dieer Erfindung durchgeführt wird, können hochgenaue Messergebnisse erhalten werden, ohne dass sie durch die Verunreinigungen in der Probe beeinträchtigt werden, wenn dies mit den Verbindungen der p-Nitroanilidserien (pNA, etc.) verglichen wird, die unter Anwendung einer Wellenlänge von 560 nm oder weniger gemessen werden.
  • Wie oben erwähnt, ist das synthetische Peptid der Formel (I) bei der Bestimmung von alpha&sub1;-AT weit besser als die bekannten Substrate.
  • Das synthetische Peptid der Formel (I) kann durch konventionelle Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise wird der farberzeugende Anteil (CHA) zunächst an eine Lysyl (Lys)-Gruppe gebunden und wird weiterhin nacheinander an Aminosäurekomponenten gekuppelt. Es ist ebenalls möglich, zunächst ein N-endständiges Dipeptidfragment zu synthetisieren, mit anschliessender Bindung an eine Lysylgruppe mit dem farberzeugenden Anteil (CHA).
  • Als eine alpha-Aminoschutzgruppe von Aminosäuren, die als Reaktionsmittel verwendet werden, können vorzugsweise eine Carbobenzoxygruppe, eine t-Butyloxycarbonylgruppe oder deren verwandte Gruppen, wie eine p-Methoxycarbonylgruppe, eine p-Nitrocarbonylgruppe oder eine p-Methoxyphenylazolcarbobenzoxygruppe verwendet werden.
  • Als eine Schutzgruppe für die epsilon-Aminogruppe von Lysin ist es bevorzugt, eine Carbobenzoxylgruppe oder eine t-Butyloxycarbonylgruppe zu verwenden.
  • Die Kupplung von zwei Aminosäuren oder die Kupplung eines Dipeptides an eine Aminosäure kann durch Aktivierung der alpha-Carboxylgruppe durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Kupplung unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Trichlorophenol, 4,6-Dimethylpyrimidyl-2-thiol, etc., durchgeführt werden.
  • Die Aktivierung für das oben erwähnte Esterderivat kann vorzugsweise in Gegenwart eines Carbodiimides, wie N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), durchgeführt werden.
  • Das synthetische Peptid der Formel (I) kann in der Form eines Säureadditionssalzes davon verwendet werden. Als die Säure für das Säureadditionssalz kann eine Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, etc., eine organische Säure, wie Essigsäure, Trifluorssigsäure, etc., verwendet werden.
  • Diese Erfindung wird mit Hilfe der nachfolgenden Beispiele erläutert, worin die folgenden Abkürzungen und analytischen Bedingungen verwendet werden.
    • (1) ABKÜRZUNGEN
  • Lys = Lysin, Lysyl
  • Pro = Prolin, Prolyl
  • Ala = Alanin, Alanyl
  • Leu = Leucin, Leucyl
  • Z = Benzyloxycarbonyl
  • BOC = t-Butyloxycarbonyl
  • -SDP = 4,6-Dimethylpyrimidyl-2-thio
  • DMF = Dimethylformamid
  • MeOH = Methanol
  • BuOH = b-Butanol
  • AcOH = Essigsäure
  • AcOEt= Ethylacetat
  • NEM = N-Ethylmorpholin
  • -pNA = p-Nitroanilid
  • -CHA = 3-Carboxy-4-hydroxy-anilid
  • TLC = Dünnschichtchromatografie
  • GPC = Gel-Permeationschromatografie
  • Die Aminosäuren bedeuten L-Isomeren, wenn nichts anderes angegeben ist.
    • (2) BEDINGUNGEN FÜR TLC
  • Es wurde eine Silicagel F&sub2;&sub5;&sub4;-Platte (hergestellt von Merck & Co., Inc.) verwendet.
    • Lösungsmittel
  • Rf&sub1; = CHCl&sub3;:MeOH:AcOH:H&sub2;O = 80:20:2,5:5
  • Rf&sub2; = n-BuOH:AcOH:H&sub2;O = 4:1:1
  • Rf&sub3; = n-BuOH:AcOH:H&sub2;O = 4:1:5
    • (3) GPC
  • Es wurde ein Polyvinylgel verwendet (Toyo pearl HW 40F, ein Warenname, hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co. Ltd.).
    • BEISPIEL 1 Synthese von H-D-Pro-Leu-Lys-CHA: (A) BOC-Leu-Lys(Z)-CHA
  • In 200 ml einer 1,5 N NEM/DMF-Mischung wurden 45,2 g (0,2 mol) H-Lys(Z)-CHA.HCl aufgelöst und 35,3 g (0,1 mol) BOC-Leu-SDP wurden bei 0 bis 5ºC dazugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde in 1500 ml AcOEt aufgelöst und mit 500 ml einer gekühlten 5 %-igen HCl-Lösung zweimal und mit 500 ml einer gesättigten Kochsalzlösung zweimal gewaschen, mit anschliessender Entfärbung und Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Aktivkohle. Nach dem Trocknen wurde das Magnesiumsulfat und die Aktivkohle filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, unter Erhalt von rohem BOC-Leu-Lys(Z)-CHA. Dieses wurde aus einem gemischten Lösungsmittel aus AcOEt/Ether/n-Hexan umkristallisiert, unter Erhalt von 35,9 g (57,1 %) BOC-Leu-Lys(Z)-CHA.
  • Rf&sub1; = 0,51, Schmelzpunkt 110-119,5ºC
  • [alpha]20D -13,0 (c = 1, DMF)
  • Elementaranalyse für C&sub3;&sub2;H&sub4;&sub4;N&sub4;O&sub9;.1/2H&sub2;O
  • gefunden (%) C 60,42 H 7,10 N 8,77
  • berechnet (%) 60,27 7,11 8,79
    • (B) Z-D-Pro-Leu-Lys(Z)-CHA
  • In 90,8 ml 2 N HCl/AcOH wurden 22,8 g (36,3 mmol) BOC-Leu-Lys(Z)-CHA aufgelöst und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagiert. Nach der Reaktion wurden niedergeschlagene Kristalle erneut in 1000 ml Ether ausgefällt, filtriert und getrocknet, unter Erhalt von 20,1 g (98,0 %) H-Leu-Lys(Z)-CHA.HCl
  • Rf&sub2; = 0,68, Schmelzpunkt: 147-157,5ºC
  • [alpha]20D -0,8 (c = 0,5, MeOH)
  • In 41 ml 1,5 N NEM/DMF-Mischung wurden 11,6 g (20,5 mmol) H-Leu-Lys(Z)-CHA.HCl aufgelöst und 20 ml einer DMF-Lösung, die 7,6 g (20,5 mmol) Z-D-Pro-SDP enthielt, wurden bei 0 bis 5ºC dazugegeben. Die Reaktion wurde 15 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung mit 1000 ml AcOEt verdünnt und mit 500 ml 5 %-igem HCl zweimal und mit 500 ml einer gesättigten Kochsalzlösung zweimal gewaschen, mit anschliessender Entfärbung und Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Aktivkohle. Nach dem Trocknen wurden das Magnesiumsulfat und die Aktivkohle filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, unter Erhalt von rohem Z-D-Pro-Leu-Lys(Z)-CHA. Dieses wurde aus DMF/AcOeth/Ether rekristallisiert, unter Erhalt von 8,7 g (55,6 %) Z-D-Pro-Leu-Lys(Z)-CHA.
  • Rf&sub1; = 0,53, Schmelzpunkt 230,5-235,0ºC
  • [alpha]20D+4,0 (c = 1, DMF)
  • Elementaranalyse für C&sub4;&sub0;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub1;&sub0;
  • gefunden (%) C 62,89 H 6,56 N 9,31
  • berechnet (%) 63,23 6,50 9,22
    • (C) H-D-Pro-Leu-Lys-CHA.2HCl
  • In einem gemischten Lösungsmittel aus 225 ml MeOH, 61,2 ml Wasser und 13,8 ml 1 N HCl wurden 3,5 g 4,6 mmol Z-D-Pro-Leu-Lys(Z)-CHA suspendiert und 2 g schwarzes Palladium wurden dazugegeben. Die katalytische Reduktion wurde 6 Stunden lang bei 30ºC durchgeführt. Nach der Reaktion wurde der Katalysator durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde unter Verwendung einer Toyo Pearl HW40F-Säule und von MeOH als ein Entwicklungslösungsmittel gereinigt, unter Erhalt von 2,2 g (83,4 %) H-D-Pro-Lys-CHA.2HCl.
  • Rf&sub3; = 0,17, Schmelzpunkt 203ºC (Zersetzung)
  • [alpha]20D -30,0 (c = 0,5, MeOH)
  • Elementaranalyse für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub9;N&sub5;O&sub6;Cl&sub2;.H&sub2;O
  • gefunden (%) C 49,67 H 7,17 N 11,96
  • berechnet (%) 49,49 7,09 12,02
    • BEISPIEL 2
  • H-D-Ala-Leu-Lys-CHA.2HCl (PS-1181) wurde auf gleiche Weise wie bei Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, mit der Ausnahme, dass anstelle von Z-D-Pro-SDP Z-D-Ala-SDP verwendet wurde.
  • Die Eigenschaften von PS-1181 waren wie folgt:
  • Schmelzpunkt 196,5-210ºC
  • Rf&sub3; = 0,26
  • [alpha]20D -48,0 (c = 0,5, MeOH)
  • Elementaranalyse für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub7;N&sub5;O&sub6;Cl&sub2;.1/2H&sub2;O
  • gefunden (%) C 48,38 H 6,95 N 12,94
  • berechnet (%) 48,26 7,00 12,79
    • BEISPIEL 3
  • Die synthetischen Peptide, die in den Beispielen 1 und 2 erhalten wurden, wurden einem Substratspezifizitätstest unterworfen, indem sie mit verschiedenen Enzymen unter den folgenden Bedingungen zur Reaktion gebracht wurden.
  • (1) Substratlösung: 10 mmol/l (Konzentration)
  • (2) Pufferlösung: Tris-HCl-Puffer
  • Die Konzentrationen von NaCl und CaCl&sub2; und der pH (bei 25ºC) wurden wie in Tabelle 2 gezeigt in Abhängigkeit von den Enzymen eingestellt, die zur Reaktion gebracht werden sollten. TABELLE 2 Pufferlösung Tris (mmol/l) Enzym Trypsin (Try) Thrombin (TH) Plasmin (PL) Faktor Xa (FXa) Kallikrein (KL) Urokinase
  • (3) Die verwendeten Enzyme sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Enzym Ursprung Hersteller Fabr.Nr. Einheit Trypsin Thrombin Plasmin Faktor Xa Kallikrein Urokinase Rind Mensch Parcin Worthington Mochida Pharmaceutical Co. Ltd. Green Cross Corp. Sigma Chem. Co.
  • (4) Reaktionsbeendigungslösung in dem Fall von pNA: 10 %-ige Essigsäure
  • (5) Farberzeugendes Reagens für CHA: Natriumpentacyanoaminferroat.
    • MESSVERFAHREN:
  • Die Pufferlösung in einer Menge von 0,3 ml und 0,1 ml einer Enzymlösung wurden in einer Teströhre, die aus hartem Glas hergestellt war, das mit Silizium behandelt wurde, oder einer Teströhre, die aus einem Kunststoff (Polystyrol) hergestellt war und für 5 Minuten in einem konstanten Temperaturbad vorerhitzt war, das bei 37ºC gehalten wurde, angeordnet. Dann wurden 0,1 ml einer Substratlösung zu der Teströhre zugegeben und diese wurde für nur 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschliessend wurden 2,0 ml der Reaktionsbeendigungslösung (in dem Fall von pNA) oder das farberzeugende Reagens (in dem Fall von CHA) zu der Reaktionslösung zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Nach dem Stehenlassen für 10 Minuten bei 37ºC wurde die Absorbanz (optische Dichte) bei 405 nm (in dem Fall von pNA) oder bei 700 nm (in dem Fall von gekuppeltem CHA) gemessen. Die anfängliche Substratkonzentration war 2 mmol/l.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Enzym Beisp. Vergleich Referenz Trypsin Thrombin Plasmin Faktor Xa Urokinase Kallikrein Wellenlänge ANMERKUNG:
  • Aus Tabelle 4 ist klar, dass die synthetischen Peptide dieser Erfindung eine ausgezeichnete Substratspezifizität aufweisen, im Vergleich zu CHR-TRY.
    • BEISPIEL 4
  • Unter Verwendung des Substrates, das in Beispiel 1 synthetisiert ist, wurde eine Kalibrierungskurve zum Bestimmen von alpha&sub1;-AT, wie es in der beigefügten Zeichnung gezeigt ist, unter den folgenden Bedingungen hergestellt:
  • (1) Substratlösungskonzentration: 10 mmol/l.
  • (2) Pufferlösung: Tris-HCl 200 mM
  • NaCl 150 mM
  • pH 9,0
  • (3) Enzymlösung: Trypsin 9 ug/ml
  • (4) Lösung zum Auflösen des Enzyms:
  • Glycerin 25 Gew.%
  • Albumin 1 mg/ml
  • pH 3,0
  • (5) Standardserum: Vereintes Serum einer normalen Person
  • (6) Farberzeugende Reagenslösung: Natriumpentacyanoaminferroat-Lösung.
    • MESSVERFAHREN:
  • Das Standardserum wurde mit der Pufferlösung um das 150-fache verdünnt und als die Standardlösung mit einer 100 %-igen Konzentration definiert. Auf der anderen Seite wurde die Pufferlösung als die Standardlösung mit einer Konzentration von 0 % verwendet.
  • Ein Serum in einer Menge von 0,1 ml wurde in einer Teströhre angeordnet, die aus hartem Glas hergestellt war, das mit Silizium behandelt war, oder die aus einem Kunststoff hergestellt war und 5 Minuten lang in einem konstanten Temperaturbad vorerhitzt war, das bei 37ºC gehalten wurde. Dann wurden 0,4 ml einer Trypsinlösung dazugegeben und 5 Minuten lang inkubiert. Anschliessend wurden 0,5 ml der Substratlösung zu der Teströhre zugegeben und für nur 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wurden 2,5 ml der farberzeugenden Reagenslösung zu der Reaktionslösung zur Beendigung der enzymatischen Reaktion zugegeben. Nach dem Stehenlassen bei 37ºC für 10 Minuten wurde die Absorbanz bei 700 nm gemessen.
  • Unter Verwendung der Kalibrierungskurve der beigefügten Zeichnung kann die Aktivität von alpha&sub1;-AT im Serum mit hoher Genauigkeit bestimmt werden, ohne dass dies an Beeinträchtigungen von anderen coexistierenden Enzymen leidet.

Claims (7)

1. Synthetisches Peptid der Formel
worin A&sub1; eine Prolyl (Pro)- oder Alanyl (Ala)-Gruppe ist; Leu ist eine Leucylgruppe; und Lys ist eine Lysylgruppe, oder ein Säureadditionssalz davon.
2. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es
oder ein Säureadditionssalz davon ist.
3. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es
oder ein Säureadditionssalz davon ist.
4. Verfahren zur Verwendung des synthetischen Peptides gemäss Anspruch 1 für die Bestimmung von Trypsin oder alpha&sub1;-Antitrypsin.
5. Verfahren zur Bestimmung von alpha&sub1;-Antitrypsin, umfassend die Zugabe einer Trypsinlösung mit einer bekannten Menge an Trypsin zu einer Probenlösung, Inkubation der resultierenden Mischung, Zugabe einer Substratlösung, die als ein Substrat ein synthetisches Peptid der Formel (I)
worin A&sub1; eine Prolyl (Pro)- oder Alanyl (Ala)-Gruppe ist; worin Leu eine Leucylgruppe ist; und worin Lys eine Lysylgruppe ist, oder ein Säureadditionssalz davon umfasst, zu der Mischung, Inkubation der resultierenden Mischung, Zugabe eines Kupplers zu der Mischung und colorimetrisches Messen einer erzeugten Farbe.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische Peptid der Formel (I)
ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische Peptid der Formel (I)
ist.
DE8686116421T 1985-11-26 1986-11-26 Synthetisches peptid-substrat fuer die bestimmung von trypsin und alpha-1-antitrypsin. Expired - Lifetime DE3685724T2 (de)

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