DE3045430C2 - α-Hydroxyacyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide und deren Verwendung - Google Patents

α-Hydroxyacyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide und deren Verwendung

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DE3045430C2
DE3045430C2 DE3045430A DE3045430A DE3045430C2 DE 3045430 C2 DE3045430 C2 DE 3045430C2 DE 3045430 A DE3045430 A DE 3045430A DE 3045430 A DE3045430 A DE 3045430A DE 3045430 C2 DE3045430 C2 DE 3045430C2
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Description

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich als Substrate zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen, wie Thrombin und Trypsin. Diese Substrate werden durch solche Enzyme hydrolysiert und ergeben p-Nitroanilin, das spektrophotometrisch bestimmt werden kann und somit die vorhandene Enzymmenge anzeigt
Die erfindungsgemäßen Substrate eignen sich als Reagentien zum Nachweis und zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen, die Amidbindungen in Peptidketten am Carboxylende von Arginin- und Lysinresten spalten?
Strukturell verwandte chromogene und fluoreszierende Substrate sind in den US-PS 38 86 136,40 28 318, 40 61 625 und 40 70 245 beschrieben. Bei keinem dieser bekannten Substrate ist die N-terminale «-Aminogruppedurch eine «-Hydroxylgruppe ersetzt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß zumindest 3 spezielle Vorteile erzielt werden können, wenn am N-terminalen Ende bzw. an der P3-Stelle eines Tripeptid-Substrats eine analoge «-Hydroxysäure verwendet wird. Besonders bemerkenswert ist, daß die Löslichkeit in wäßrigen Puffern bei Vorliegen der «-Hydroxylgruppe größer ist als bei benzoylblockierten Aminosäuresubstraten. Ferner zeigen a-Hydroxysubstrate keine Empfindlichkeit gegenüber einer Aminopeptidase-Wirkung, so daß keine blockierenden Gruppen an den N-Endgruppen erforderlich sind und es nicht notwendig ist, die D-Form anstelle der (natürlichen) L-Form der N-endständigen Aminosäure zu verwenden. Die a-Hydroxyanalogen erleichtern auch die Synthese, da es nicht erforderlich ist, die Hydroxylsubstituenten während der Synthese mit Schutzgruppen zu versehen und diese wieder zu entfernen. Die a-Hydroxysubstrate zeigen ähnliche enzymatische Reaktivitäten, wobei die Kinetik mit denen der entsprechenden a-Aminosäureprodukte sehr ähnlich ist.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substrate verwendeten a-Hydroxysäuren lassen sich alle gemäß dem Verfahren von M. Winitz et aU J· Am. Chem. Soc Bd. 78 (1956), S. 2423 herstellen. Ausgehend von «-Hydroxy-/?-phenylpropionsäure und a-Hydroxyisocapronsäure lassen sich die erfindungsgemäßen Substrate gemäß folgendem grundlegenden Kupplungsverfahren herstellen:
Carbobenzoxy
wird mit p-Nitrophenylisocyanat gekuppelt. Das erhaltene
CBZ-Arg—pNA
wird mit HBr/Essigsäure behandelt, wobei man R
HBr-Arg—pNA
erhält CBZ-Pro-Succinimidylester wird mit
R HBr—Arg—pNA
gekuppelt, wodurch man geschütztes
R CBZ-Pro—Arg—pNA
erhält.
Das geschützte Dipeptid wird mit HBr/Essigsäure behandelt. Das gebildete
(CBZ)-Arg —OH
HBr-Pro—Arg—pNA
wird weiter an eine a-Hydroxysäure unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid gekuppelt. Das
a-Hydroxysäure — Pro—Arg — pN A
kann ferner mit HF oder Methansulfonsäure umgesetzt werden, um die Guanidinschutzgruppe R vom Arginin zu entfernen.
Geeignete R-Gruppen sind Methoxybenzolsulfonyl, Nitro und Tosyl.
Die CBZ-Gruppe zum Schutz der a-Aminogruppe von Aminosäuren kann durch andere Reste ersetzt werden; beispielsweise durch tert.-Butyloxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfonyl.
Die cbromophore Gruppe ist p-Nitroanilid, Die Beispiele erläutern die Herstellung von bevorzugten «-Hydroxjacyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroaniliden.
Herstellung des Ausgangsprodukts
a,N0>-MethoxybenzoIsuIfonyl-L-argmyl-pnitroanilid · HBr
23 g N^Carbobenzoxy-N^i^methoxybenzoIsulfonyl)-L-arginin, hergestellt gemäß Nishimura et aL, Chem. Pharm. Bull, Bd. 24 (1976), S. 1968, werden in 100 ml Hexamethylphosphoramid gelöst Die erhaltene Lösung wird mit 6,7 ml Triethylamin und 15,8 g p-Nitrophenylisocyanat versetzt Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in 1300 ml einer 5prozentigen Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und nacheinander 2mal mit je 400 ml 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung, lmal mit 300 ml Wasse.3mal niit je 300 ml 1 η Salzsäure und 2mal mit 200 ml Wasser gewaschen. Der Niederschlag wird auf dem Filter durch Absaugen getrocknet und sodann 3mal mit je 30OmI siedendem Methanol extrahiert Die Methanolextrakte werden vereinigt Der nach dem Abdampfen des Methanols unter vermindertem Druck bei 35° C erhaltene halbfeste Rückstand wird an einer mit Kieselgel gepackten Saale unter Verwendung eines Gemisches von 1 bis 5 Prozent Methanol in Chloroform als Elutionsmittel weiter gereinigt Man erhält N«-Carbobenzoxy-N<ll-(4-methoxybenzolsulfonyl)-L-arginin-p-nitroanilid. 6,0 g dieses Produkts werden in 30prozentiger Bromwasserstoffsäure in Eisessig gelöst Das erhaltene Reuktions£,emisch wird 45 Minuten bei Raumtemperatur belassen und sodann in 400 ml trockenen Äther gegossen. Da- ausgefällte Salz wird abfiltriert und 2mal mit je 100 ml trockenem Äther gewaschen. Man erhält N^Methoxybenzolsulfonyl-L-Arginyl-p-nitroanilid-hydrobromid.
b. N«-CBZ-Pro-N-MBS-Arg-pNA
0,7 g (2 mMol) Carbobenzoxy-L-prolin-succinimidylester und 1,1g (2 mMol) N-'-MBS-L-Arg-pNA-HBr werden in 10 ml Tetrahydrofuran und 2 ml Dimethylformamid gelöst Das Reaktionsgemisch wird mit 03 ml (2 mMol) N-Methylmorpbolin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Sodann wird das Reaktionsgemiscb unter vermindertem Druck eingedampft Der ölige Rückstand wird in 300 ml Mßthylenchlorid suspendiert Die Lösung wird mit 1 η Salzsäure (1 χ 60 ml) Kochsalzlösung (1 χ 60 ml), gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (1 χ 60 ml) und
ίο Kochsalzlösung (1 χ 60 ml) gewaschen. Sodann wh J die Lösung über wasserfreiem MgSO4 getrocknet und auf ein Volumen von 2 bis 3 ml eingeengt Die erhaltene Lösung wird mit wasserfreiem Äther versetzt Der Niederschlag wird abfiltriert Die Ausbeute beträgt
15 0,64 g. c.L-Pro-N-'-MBS-Arg-pNA · HBr
0,64 g N-CBZ-L-Pro-N»-MBS-Arg-pNA werden in 10 ml 30% HBr/Essigsäure gelöst Die Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen und sodann in 50 bis 60 ml wasserfreien Äther gegossen. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert und in einem Vakuumexsikkator getrocknet Die Ausbeute beträgt 0,45 g.
Beispiel a. «-HydroxyacyI-Pro-N"-MBS-Arg-pN A
437 mg (0,68 mMol) Pro-N-'-MBS-Arg-pNA · HBR, 0,68 mMol a-Hydroxysäure und 92 mg (0,68 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden in 10 ml Tetrahydrofuran und 2 ml Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird auf 00C gekühlt und unter Rühren mit einem Magnetrührer mit 0,1 ml (0,68 mMol) N-Methylmorpho-Hn und 140 mg (0,68 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wird in Chloroform oder Methanol suspendiert oder gelöst und mit Äther gefällt Der Feststoff wird abfiltriert. Gemäß diesem Verfahren werden die nachstehend aufgeführten blockierten Verbind-.ngen hergestellt:
(1) L-ff-Hydroxyv8-phenylpropionyl-L-Pro-NM-MBS-L-Arg-pNA
(2) D-a-Hydroxy-jS-phenylpropionyl-L-Pro-N^MBS-L-Arg-pNA
(3) L-ff-Hydroxyisocaproyl-L-Pro-N^MBS-L-Arg-pNA
(4) D-a-Hydroxyisocaproyl-L-Pro-N"-MBS-L-Arg-pNA
(5) Glykoloyl-L-Pro-N"-MBS-L-Arg-pNA
Ausbeute: 72,1% d. Th. 48,5% d. Th. nicht ermittelt 42,3% ermittelt 46,3% ermittelt
b.a-Hydroxysäure-L-Pro-L-Arg-pNA
0,5 mMol <%-Hydroxysäure-L-Pro-L-N"-MBS-ArgpNA werden in Methansulfonsäure (35 Äquivalente) gelöst Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in wasserfreien Äther gegossen. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert. Das Produkt wird weiter aus Methanol/Äther und Tetrahydrofuran/Äther gefällt Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse an Kieselgel mit n-Butanol: Essigsäure : Wasser=4 :1 :1 ergibt sich ein einziger Flecken.
Gemäß diesem Verfahren werden die nachstehenden, als Enzymsubstrate verwendbaren Verbindungen synthetisiert:
60
(1) L-or-Hydroxy-./7-phenylpropionyl-L-Pro-L-Arg-pNA
(2) D-flr-Hydroxy;yß-phenylpropionyl-L-Pro-L-Arg-pNA
(3) L-ff-Hydroxyisocaproyl-L-Pro-L-Arg-pNA
(4) D-tf-Hydroxyisocpproyl-L-Pro-L-Arg-pNA
(5) Glykoloyl-L-Pro-L-Arg-pNA
Ausbeute: 48,2% d. Th. 46% d. Th. nicht ermittelt 41,3% ermittelt 43,6% ermittelt
Klinisch iassen sich die erfindungsgemftßen Substrate beispielsweise zur Messung von Antithrombin HI (AT III) verwenden,
Antithrombon IH ist der Hauptbestandteil des menschlichen Antikoagulationssystems. Es hemmt eine Reihe von Serinproteasen durch Bildung eines
Thrombin + ATIII
Heparin %
1 ; 1-Komplexes mit Serin, dem aktiven Zentrum derartiger Enzyme, Durch Anwesenheit von Heparin wird die Reaktionsgeschwindigkeit von ATIII mit derartigen Proteasen etwa auf das lOOfache erhöht
Die Reaktionsweise von ATIII läßt sich durch folgende Gleichungen wiedergeben:
(Thrombin: ATIII) + Thrombin-Überschuß
Substrat
Thrombin-Überschuß
Dipeptid + p-Nitroanilin
Da die Anwesenheit von Heparin die Aktivität von ATIII erhöht ist es möglich, die Hemmung aufgrund von ATIII von der Hemmung durch andere Plasmaproteine, die ebenfalls Thrombin hemmen, abzugrenzen. Dabei mißt man die gesamte AT III-Aktivität als eine von der »progressiven Antithrombinaktivität«, die in Abwesenheit von Heparin gemessen wird, unterschiedliehe Größe. Als Ergebnis dessen läßt sich klar feststellen, daß ein Defekt im Ant&oagulationssystem in Verbindung mit ATIlI und nicht mit e^iem anderen Proteinhemmechanismus vorliegt
Der Test beruht auf der Tatsache, daß menschliches ?ΐ AT III in einer Probe menschliches «-Thrombin in einem Molverhältnis von 1 :1 hemmt Überschüssiges Thrombin steht zur Hydrolyse eines farblosen Substrats zur Verfugung. Wird dieses Substrat gespalten, setzt es eine spektrophotometrisch nachweisbare austretende Gruppe frei, die eine deutliche Verschiebung im Absorptionsspektrum ergibt was sich in der Entwicklung einer nachweisbaren Färbung oder Fluoreszenz bemerkbar macht Diese Substratspaltung ist analog der Spaltung der Arginyl-GIycin-Bindung in Fibrinogen, die zur Bildung von Fibrin führt. Durch Feststellung der Fluoreszenzentwicklung im Reaktionsgemisch läßt sich der Verlauf der Umsetzung des Substrats durch Thrombin verfolgen. Da die Menge an ATIII und die gebildete Fluoreszenz oder Färbung umgekehrt proportional shid, kann der Gehalt an AT III leicht ermittelt werden.
Vergleich der beanspruchten Substrate mit bekannten und nicht-beanspruchten Substraten
Eine grundlegende Schwiergkeit im Vergleich derartiger Substrate besteht darin, daß die von einzelnen Herstellern und Autoren angegebenen experimentellen Daten häufig nicht miteinander vergleichbar sind. So werden häufig Werte für Kn, und Vmax bei verschiedenen pH-Werten und loneiistärken und gelegentlich auch bei unterschiedlichen Temperaturen angegeben.
Um eine Vergleichsmöglichkeit der nachstehend angegebenen Werte zu gewährleisten, wurden Lineweaver-Burk-Diagramme aus der Michaelis-Menton-Gleichung (unter der Annahme einer Kinetik 1. Ordnung) aufgestellt Folgende Werte wurden ermittelt: Kn, (Dissoziationskonstante des Enzym-Substrat-Komplexes in mMoI/Liter), Vm„(Maximalgeschwindigkeit in Mol-1 · see-'), Kai (Geschwindigkeitskonstante der bo Farbbildung in see-') und kc,/K„, Diese Werte ergeben ein vollständiges Bild für das kinetische Verhalten eines Substrat-Enzym-Systems. Zur Berechnung der vorgenannten Werte sind jeweils 2 Messungen erforderlich, nämlich die Substratkonzentration und die etwas *■> schwieriger zu ermittelnde Konzentration an aktivem Enzym. Die Enzymkonzentration wird zur Berechnung von Ärar und somit von kc,i/Km benötigt.
Die Messung der Substratkonzentration wird durch Inkubation des Substrats mit einer 2 χ 10-* m Trypsinlösung und Messung der maximalen pNA-Farbentwick-Iung durchgeführt Unter Zuhilfenahme des Extinktionskoeffizienten für pNA bei 405 nm läßt sich die im Test vorliegende Substratkonzentration berechnen.
Für die Messung der Enzymkonzentration steht die Titration mit p-Nitrophenyl-p--ruanidlnobenzoat zur Verfugung. Für sämtliche Enzymtiirationen wurde 0,! m Veronal-Puffer vom pH-Wert 83 (0,02 m CaCI2) verwendet
Die kinetischen Messungen wurden aiie 0,17 m Tris-Puffer vom pH-Wert 7,4 durchgeführt
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt Dabei sind die einzelnen Werte für 11 Substrate (davon 4 erfindungsgemäße Substrate) angegeben.
Nimmt man eine Wichtung der in Tabelle I aufgeführten Werte nach KyKn, und der Spezifität (Kn,) vor, so ergibt sich folgende Reihenfolge:
Trypsin: (5) (2) BzFVR
Thrombin: BzFVR (4) (2) hFPR
Insgesamt gesehen schneiden also die beanspruchten Substrate günstiger ab.
Berücksichtigt man sämtliche ermittelten Parameter, so erweisen sich die nachstehend aufgeführten Substrate als am günstigsten:
Trypsin: (5) (2) kcat mM
Thrombin: (4) kc/Km See"1
Tabelle 1 Reihenfolge der Werte Km TRYPSIN x 105 M"1 See"1
THROMBIN
SUBSTRATE 0,1110
Substrate gemäß 255 0,0787
US-PS 40 61 625 22,9 119
(Bz FVR) 0,125 15,1
51,7 0,569
4,14 11,1
(dPFR) 0,00410 0,195
4,4 keine echte
10,70 Reaktion
(dVLK) 0,007
14,4 0,330
20,5 1,29
(Bz IQGR) 0,034
30 45 430 .'ite 0,805 THROMBIN
Fortsetzung 10,3
SUBSTRATE TRYPSIN 0,128
Beanspruchte wegen Substrat
Substrate mangel keine
(Nummern in Werte
Klammern vgl. 0,106 0,25
Beispiel, Teil b) 2.3 25
IhFPR (1) 0,046 0,217 1,0
112 0,075
24 84
dhFPR (2) 0,13 11
144 0,36
11 16
hGPR (5) 0,041 0,44
113 0,026
28 35
dhLPR (4) 0.17 13
155
9,2
Nicht beansprut 0,35
Substrate 0,41
hPFR 0,0117
keine echte
Reaktion
hVLK
keine echte
Reaktion
hlQCR
Abkürzungen:
FVR = L-Phe-L-Val-L-Arg-pNA.
PFR = L-Pro-L-Phe-L-Arg-pNA.
VLK = L-Val-K-Leu-L-Lys-pNA.
IQGR = L-IIe-L-Glu-L-Gly-L-Arg-pNA.
»h« bezeichnet die entsprechenden a-Hydroxyderivate der
angegebenen Aminosäuren.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. a-Hydroxyacyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroaniUde der allgemeinen Formel
-NO2 H N=/
OH Ö
R1—CH— C—Pro—Arg—N
in der R1 Wasserstoff, geradketüges oder verzweigtes Ci- bis CrAlkyl oder Benzyl bedeutet
Z Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Thrombin und Trypsin.
DE3045430A 1979-12-03 1980-12-02 &alpha;-Hydroxyacyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide und deren Verwendung Expired DE3045430C2 (de)

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