JPS585674B2 - アルファヒドロオキシジペプチド受媒質類 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアルファヒドロオキシジペプチド受媒質類に関
する。

本発明の新規受媒質はアルギニンおよびリジン残基のカ
ルボキシル側のペプチド鎖中のアミド結合を裂開する蛋
白質分解酵素の検出および測定に試薬として有用である
。

構造的に関係ある発色性および螢光分析的受媒質は米国
特許第３８８６１３６号、４０２８３１８号、４０６１
６２５号および４０７０２４５号に記載されているが、
しかしこれら受媒質類は末端部分のα−アミン基の代り
にα一水酸化物を置換しても利益をえない。

明確にいえば類似したαオキシ酸がジペプチド受媒質の
Ｎ終点又はＰ３位置において置換された場合少なくも３
利点が生ずることが発見された。

最も注目されるのは緩衝水液中のα−ヒドロオキシで保
護されたアミノ酸受媒質の溶解度がベンゾイルで保護さ
れたものよりも大きいことである。

またαヒドロオキシ受媒質はアミノペプチダーゼ活性に
対する感度を示さないので、Ｎ終点上に保護基の必要な
くまたＮ終点のアミノ酸のＬ型（天然）よりもＤ型の使
用が避けられる。

α−ヒドロオキシ類似物はまた合成中ヒドロオキシ置換
基をブロックおよびデブロツクする必要なく合成か簡単
となる。

α−ヒドロオキシ受媒質はまたそれらのａ−アミノ酸相
対物と非常に似た活動力をもつ同様の酵素的反応性を示
す。

特に本発明は次式： をもつα−ヒドロオキシージペプチド類として特徴づけ
られる新規の分光測定で検出できる受媒質に関する。

上式中Ｒ０は水素、直鎖又は分枝鎖低級（ｃｔ−Ｃ４）
アルキルおよびベンジルより成る群から選ばれたものを
表わし、Ｒ２はバラニトロアニリト、ニトロフエニル、
メチルーニトロフエニル、シニトロフエニル、ナフチル
、ニトローナフチル、４−メチル−７−クマリルアミド
、■−メトオキシ−３−ナフチルアミドおよびチオベン
ジルエステルより成る群から選ばれたものを表わし、Ａ
１はグリシン、アラニン、ヴアリン、ロイシン、フロリ
ン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン
酸、アスパラギン、グルタミン酸、クルタミン、リジン
、ヒドロクリシン、ヒスチシン、アルギニン、フエニル
アラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メ
チオニン、ピペルコリン酸より成るＬ−アミノ酸群から
選ばれたものを表わしかつＡ２はＬ−アルギニン又はＬ
−リジンのいづれかを表わす。

受媒質の最も好ましい群は式： （上式中Ｒ，は水素、直鎖又は分枝鎖低級（ＣｔＣ４）
アルキルおよびベンジルより成る群から選ばれたもので
あり、Ｒ２はバラニトロアニリド、ニトロフエニル、チ
オベンジルエステルより成る群から選ばれたものであり
、Ａ，はグリシン、アラニン、ヴアリン、プロリン、イ
ソロイシン、アスパラキン酸、グルタミン酸およびフエ
ニルアラニンより成るし−アミノ酸群から選ばれたもの
でありかつＡ２はＬ−アルギニン又はＬ − リシンの
いづれかとする）をもつものである。

本発明の受媒質製造に使用するα−オキシ酸類はすべて
Ｍ．ウイニソシらのＪ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ，、Ｌ
旦、２４２３、（１９５６）に記載の方法により製造で
きる。

α−ヒトロオキシβ−フエニルプロピオン酸およびα−
ヒドロオキシイソカプロン酸を与えられて、本発明の受
媒質は次の基本的段階カップリング法によって合成でき
る： をｐ 一二トロフエニルーインシアネイトとカップルさせて とし順にこれをＨＢｒ／酢 酸と処理して とする。

ＣＢＺ−Ｐｒｏ−スクシンイミジルエステルをとカップ
ルさせて保護された とする。

保護されたジペプチドをＨＢｒ／酢酸と処理してとし更
にこれを１−ヒ ドロオキシーペンゾトリアゾールとジクロロへキシルカ
ルボジイミドを用いてα−オキシ酸にカップルさせる。

は更にＨＦ 又はメタンースルフオン酸と反応させてアルギニンから
グアニジンー保護Ｒ基を除去する。

適当するＲ基にはメトオキシベンゼンスルフオニル、ニ
トロおよびトシル基がある。

アミノ酸類のα−アミノ保護用ＣＢＺ基は１−プチルー
オキシ力ルボニルおよびＯ−ニトロフエニルスルフォニ
ル基の様な他の部分で代替できる。

他のアミノ酸類は上記製法に述べたもので十分置換でき
る。

例えば検出できる離脱基に直接結合したアミノ酸はアル
ギニン又はリジンのいづれでもよい。

ジペプチド部分の中心のアミノ酸は上にＡ１として示し
たアミノ酸のいづれでもよい。

Ｎ終点のα−ヒドロオキシ置換基は普通グリシン、アラ
二ンおよびフエニルアラニン中の類似アミンをα−ヒド
ロオキシで置換して製造されるが、またヴアリン、ロイ
シン、インロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギ
ン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジ
ン、ヒドロオキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、チ
ロシン、トリプトファン、システインおよびメチオニン
から誘導できる。

好ましい発色団はバラニトロアニリドであるが、メチル
ニトロフエニル、ニトロフエニル、ジニトロフエニル、
ナフチルおよびニトロナフチルの様な一般に認められた
第２クロム酸部分も使用できる。

プラピンガーらのＪ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．、３
０、１７８１（１９６５）を参照されたい。

４−メチル−７−クマリルアミド、（モリカらのＪ．Ｂ
ｉｏ，ｃｈｅｍ，、８２，１４９５（１９７７））、１
−メトオキシ−３−ナフチルアミド、（工−ｙリンらの
Ａｒｌａｌ，１３ｉｏ ｃｈｅｍ−、８０、３５５（１
９７７））およびチオベンジルエステルの様なこの分野
でよく使われている螢光分析用離脱基もまた使用できる
。

下記特定実施例は好ましいα−ヒドロオキシ受媒質の製
法を示すものである。

実施例Ｉ Ｎω一メトオキシベンゼンスルフオニル−Ｌ −アルギ
ニル〜ｐ−ニトロアニリド・ＨＢｒの製造ニシムラらの
Ｃｈｅｍ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｕ１１、２４、１５６８（１
９７６）に記載の方法により製造したＮα一カルボベン
ズオキシーＮω一（４−メトオキシベンゼンスルフオニ
ル）−Ｌ−７ルギニン２３？をヘクサメチルホスホルア
ミド１００ｍｌ中に溶解した。

えた溶液にトリエチルアミン６．７ｍｌとｐ−ニトロフ
エニルイソシアネイト１５．８ｇを加えた。

液を室温で一夜攪拌した後５％重炭酸ナトリウム液１３
００ｍｌ中に注入した。

えた沈澱を沢過ろーとに捕集し５％、重炭酸ナトリウム
液（２Ｘ４００ｍｌ）、水（１×３００ｍｌ）、ＩＮ塩
酸（３Ｘ３００ｍｌ）および水（２ｘ２００ｍｌ）で順
次洗った。

沈澱をろーと中で真空吸引乾燥した後沸とうするメタノ
ールで抽出した。

（３×３００ｍｌ）メタノール抽出液を併せメタノール
を３５℃で真空蒸発した。

半固体残渣をシリカゲル管を使いクロロホルム中１−５
％メタノールを用いて溶離して精製しＮα一カルポベン
ズオキシーＮω−（４−メトオキシベンゼンスルフオニ
ル）−Ｌ−アルギニンーｐ−二｝ｏアニリドを得た。

この６．０ｙを酢酸中３０％臭化水素酸溶液にとかした
。

えた反応混合物を室温に４５分間保ち次いで乾燥エーテ
ル４００ｒｆＬｌに注入した。

沈澱した塩を乾燥エーテル（２×１００ｍｌ）で洗いＮ
ω−メトオキシベンゼンスルフオニルーし−アルギニル
ーｐ−ニトロアニリト臭化水素酸塩をえた。

実施例２ Ｎα一ＣＢＺ−Ｐｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
の製造 テトラヒドロフラン１０ｍｌとジメチルホルマミド２ｍ
ｌ中にカルボベンズオキシーＬ−プロリンースクシンイ
ミジルエステル０．７７（２ミリモル）とＮω一ＭＢＳ
−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＢｒ １．１？（２ミリモル
）をとかした。

この反応混合物にｎ一メチルモルフオリンＱ．２４ｍｌ
（２ミリモル）を加え室温で一夜攪拌した。

反応混合物を真空蒸発してえた油状残渣を塩化メチレン
３００ｍｌ中に懸濁させた。

液を１ｎ次ＩＮ塩酸（１×６０ｍｌ）、塩溶液（１ｘ６
０ｍｌ），重炭酸ナトリウム飽和水溶液（１×６０ｍｌ
）、塩溶液（１ｘ６０ｍｌ）で洗った。

液を無水ＭｇＳＯ４上をとおして乾燥し２−３ｍｌに濃
縮した。

この液に無水エーテルを加え沈澱生成物を沢過捕集して
０．６４５’をえた。

実施例３ Ｌ−Ｐｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ −Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＢｒ
の製造 ３０％ＨＢｒ／酢酸１．Ｏｍｌ中にＮ″−ＣＢＺ−Ｌ−
Ｐｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．６４ｇをと
かした。

液を室温に１時間保った後無水エーテル５０−６０ｍｌ
中に注入した。

生成沈澱をｒ過捕集し真空デシケーター中で乾燥して０
．４５ｇをえた。

実施例４ α−オキシ酸一Ｐｒｏ−Ｎω−ＭＢＳ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
の製造 テトラヒド口フラン１０ｍｌとジメチルホルマミド２ｍ
ｌ中にＰｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＢｒ
４．３７ｍ９（０．６８ミリモル）、α−オキシ酸（０
．６８ミルモル）および１−ヒドロオキシーペンゾトリ
アゾール９２〜（０．６８ミリモル）をとかした。

この液をＯ℃で攪拌しなからｎ−メチルモルフオリン０
．１ｍｌ（０．６８ミリモル）とジシクロへキシル力ル
ポジイミド１４０ｍ９（０．６８ミリモル）を加えた。

反応混合物を室温にあたため一夜攪拌した。

ジシクロへキシルウレアを沢過し沢液を真空蒸発し残渣
をクロロホルム又はメタノール中に懸濁又は溶解しエー
テルで沈澱させた。

固体をｒ過捕集した。

この方法により下記の保護された化合物類も合成した： （１）Ｌ−α−ヒドロオキシーβ−フエニルグロピオニ
ツク−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
１ （２）Ｄ−α−ヒドロオキシーβ−フエニルプロピオニ
ツクーＬ−Ｐｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
， （３）Ｌ一α−ヒドロオキシイソカプロイツクーし−Ｐ
ｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ，（４）Ｄ−
α−ヒドロオキシイソ力プ口イツクーＬ−Ｐｒｏ−Ｎω
一ＭＢＳ−Ｌ−Ａｒｇ −ｐＮＡ１（５）グリコリツク
ーＬ−Ｐｒｏ−Ｎω一ＭＢＳ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ， 実施例５ α−オキシ酸一Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡメタン
スルホン酸（３５ｓｑ）中にα−オキシ酸−Ｌ−Ｐｒｏ
−Ｌ−Ｎω−ＭＢＳ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（０．５ミリモル
）をとかした。

室温３０分後にこの反応混合物を無水エーテル中に注入
し生成沈澱を涙過捕集した。

更にメタノールーエーテルとテトラヒドロフラン−エー
テルから生成物を沈澱させた。

ｎ−プタノール：酢酸：水４：１：１を用いて展開した
ＴＬＣは単一点を示した。

この方法により次の化合物を合成し酵素受媒質として使
用した： （１）Ｌ一α−ヒドロオキシーβ−フエニルグロピオニ
ツクーＬ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ，（２）Ｄ一α
−ヒドロオキシーβ−フエニルプロピオニツクーＬ−Ｐ
ｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ１（３）Ｌ一α−ヒドロオキ
シイソ力プロイツクーＬ一Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
１ （４）Ｄ一α−ヒドロオキシイソカグロイツク−Ｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、 （５）グリコリツクーＬ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
。

臨床的に本発明の受媒質はアンチトロンビン■（ＡＴ■
）測定に使用できる。

アンチトロンビン■は人間の凝固防止系の主成分である
。

これはセリン、即ちこの酵素の活性中心と１：１複合物
を生成することにより種々のセリン蛋白酵素を抑制する
。

ヘパリンの存在はＡＴ■におけるこの蛋白酵素との反応
速度を約１００倍に増加する。

ＡＴｍの化学は次式に記載できる： ヘパリンの存在はＡＴｍの活性を助長するので、トロン
ビンの抑制もできる他の血漿蛋白質の抑制からＡＴ■に
よるそれを記述できる。

故にヘパリンのない場合に測定された“進行性トロンビ
ン活性”と異なった実在として全ＡＴ■活性を測定でき
る。

結局他の蛋白質抑制機構よりもＡＴ■を用いれば凝固防
止系における欠点をはっきり確認できる。

本試験は試料中の人のＡＴｍがＩ：１モル比において人
のび一トロンビンを抑制するという事実に基づ匂過剰の
トロンビンは遊離して無色受媒質を加水分解する。

この受媒質が裂開されると分光測定で検出できる離脱基
を放出し、それは検出できる色又は螢光の発生で示され
る吸収スペクトル中の著しい移行をおこす。

この受媒質の裂開は線維素原中の線維素生成となるアル
ギニルーグリシン結合の裂開と似ている。

反応混合物の螢光色発生を監視することによってトロン
ビンによる受媒質の変化過程を追求できる。

ＡＴ■ｏ量および発生した螢光又は色の量は逆比例する
ので、ＡＴｍ濃度は容易に決定できる。

本発明による合成受媒質類を商業的に入手しうるｋａｂ
ｉ受媒質類と動力学的に比較するのに必要なパラメータ
を検討した結果、マイケリス−メントン方程式から誘導
されるラインウイーバー・パークのプロットのパラメー
タを使用することが望ましいことがわかった。

これらはＫｍ（酵素−受媒質複合体の解離恒数；通常ｍ
Ｍ単位で表示）、Ｖｍａｘ（モル−１秒−１単位での回
転最大速度）、ｋｃａｔ（発色団によるカラーを与える
受媒質の毎秒の触媒作用速度）、およびｋｃａｔ／Ｋｍ
比（ｍＭ／ｓｅｃ）である。

これらの値は受媒質一酵素系の全体の動力学的様相を与
える。

上記の可変値を計算するために、２つの測定が必要であ
り、それらは受媒質の濃度の測定およびある分析系にお
ける活性酵素の濃度の測定（酵素濃度はｋｃａｔ従って
ｋｃａｔ／Ｋｍ値を計算するために必須である）である
。

後者がより難かしい。受媒質の濃度の測定は２×１０−
４Ｍトリプシン溶液を使用する受媒質の消化ならびに生
成する最犬のｐＮＡカラーの測定によって行なった。

４０５ｎｍにおけるｐＮＡの消去係数を使用して、分析
に使用した受媒質の濃度を計算することができる。

酵素濃度の測定はもつと困難である。

文献の研究により、パラニト口フエニルーバラグアニジ
ノ・ベンゾエー｝（ｐＮ ＰＧＢ）を分析に使用すべき
所定の酵素を滴定するために使用して、それぞれの分析
中に使用される活性酵素の正確な濃度を求めることがで
きることがわかった。

それ以上の標準化をすべての酵素滴定について同一の緩
衝液（Ｖｅｒｎａｌ Ｏ．ＩＭ，ｐＨ８．３、０．０２
Ｍ ＣａＣｌ２）を使用して行ない、それによって均等
の妥当性ですべての酵素測定を行なった。

動力学的検討はすべての酵素一受媒質のペアについて同
じ緩衝液（Ｔｒｉｓ ０．１７Ｍ，ｐＨ７．４）中で求
めた。

下記の第１表は表示する酵素に対するそれぞれの受媒質
の動力学的速度の計算結果である。

これは１５種の受媒質×５種の酵素の組合せについて脂
、ｋｃａｔ，ｋｃａｔ／Ｋｍの値を表示したものである
。

ただしこれはＸａを除いたすべての酵素についてのもの
であり、Ｘａについては脂およびＶｍａｘのみが示して
ある。

それはＸａ濃度が計算しえない（滴定に利用しうる酵素
量があまりにも少ない）ためである。

下記の第２表は合成受媒質の実際の有用性を示すもので
ある。

第２表は酵素をとり、すべての動力学的パラメータにわ
たる最大値によって受媒質を４段階に格付げし、最良の
ものから順次並べて示している。

この分類は５種の酵素のうちの３種が合成受媒質に対し
て最高の動力学的パラメータを与えることを示している
。

２０箇所のうちの１４箇所が合成受媒質で占められてい
る。

次の第３表は考査表である。

それぞれの酵素について試験した受媒質のすべてについ
て動力学的パラメータを均衡させることによって、試験
中の５種の酵素のそれぞれを測定するための最良の動力
学的パラメータを与える２種の受媒質をえらび出す試み
を行なった。

若干の受媒質は１回より多くあらわれており、このこと
は恐らく表示する酵素の測定に対して選択性は低いが然
もなお良好な受媒質であることを意味している。

第３表は１０箇所のうち２箇所を除くすべてが合成受媒
質によって占められており、カリクリエンを除くすべて
の酵素にとって最良であることを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： （上式中Ｒ１は水素、直鎖又は分枝鎖低級（Ｃエ−Ｃ４
   ）アルキルおよびベンジルより成る群から選ばれたもの
   を表わし、Ｒ２はバラニトロアニリド、ニトロフエニル
   、メチルーニトロフエニル、ジニトロフエニル、ナフチ
   ル、ニトロナフチル、４−メチル−７−クマリルアミド
   、１−メトオキシ−３−ナフチルーアミド、およびチオ
   ベンジルエステルより成る群から選ばれたものを表わし
   、Ａ１はグリシン、アラニン、ヴアリン、ロイシン、プ
   ロリン、インロイシン、セリン、トレオニン、アスパラ
   ギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リ
   ジン、ヒドログリシン、ヒスチジン、アルギニン、フエ
   ニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン
   、ピペルコリン酸、およびメチオニンより成るＬアミノ
   酸群から選ばれたものを表わしかつＡ２はＬ−アルギニ
   ン又はＬ−リジンのいずれかとする）を有することを特
   徴とするアルギニンおよびリジンのカルボキシル側のペ
   プチド結合を裂開する蛋白質分解酵素の定量測定用発色
   性又は螢光性受媒質。 ２ 式： （上式中Ｒ１は水素、直鎖又は分枝鎖低級（Ｃ１Ｃ４）
   アルキルおよびベンジルより成る群から選ばれたものを
   表わし、Ｒ２はバラニトロアニリト、ニトロフエニル、
   メチル一二トロフエニル、ジニトロフエニル、ナフチル
   、ニトロナフチルおよびチオベンジルエステルより成る
   群から選ばれたものを表わし、Ａ１はグリシン、アラニ
   ン、ヴアリン、ロイシン、フロリン、イソロイシン、ト
   レオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、クルタミン
   酸、フエニルアラニンおよびメチオニンより成るし−ア
   ミノ酸群から選ばれたものを表わしかつＡ２はＬ−アル
   ギニン又はＬ−リジンのいずれかを表わす）を有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白質分解
   酵素の定量測定用発色性又は螢光性受媒質。 ３ 式： （上式中Ｒ１は水素、直鎖又は分枝鎖低級（Ｃ１一Ｃ４
   ）アルキルおよびベンジルより成る群から選ばれたもの
   を表わし、Ｒ２はバラニトローアニリト、ニトロフエニ
   ル、チオベンジルエステルより成る群から選ばれたもの
   を表わし、Ａ１はグリシン、アラニン、ヴアリン、プロ
   リン、インロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸お
   よびフエニルアラニンより成るＬ−アミノ酸群から選ば
   れたものを表わしかつＡ２はＬ−アルギニン又はＬ−リ
   ジンのいずれかを表わす）を有することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の蛋白質分解酵素用発色性又は
   螢光性受媒質。 ４ グリコリツクーし−プロリルーし−アルギニルーｐ
   −ニトローアニリドである特許請求の範囲第３項に記載
   の発色性受媒質。 ５ Ｌ一α−ヒドロオキシイソカプ口イツクーＬ一フロ
   リルーし−アルギニルーｐ−ニトロアニリドである特許
   請求の範囲第３項に記載の発色性受媒質。 ６ Ｄ一α−ヒドロオキシイソカプロイツク−し一フロ
   リルーＬ−アルギニルーｐ−ニトロアニリドである特許
   請求の範囲第３項に記載の発色性受媒質。 ７ Ｌ一α−ヒドロオキシーβ−フエニルプロピオニツ
   ク−Ｌ−ゾロリルーＬ−７ルギニルーｐ一ニトロアニリ
   ドである特許請求の範囲第３項に記載の発色性受媒質。 ８ Ｄ一α−ヒトロオキシーβ−フエニルプロピオニツ
   クーし−プロリルーし−アルギニルーｐ −ニトロアニ
   リドである特許請求の範囲第３項に記載の発色性受媒質
   。