SU786853A3

SU786853A3 - Способ определени активности х-пролилдипептидиламинопептидазы

Info

Publication number: SU786853A3
Application number: SU762415363A
Authority: SU
Inventors: Нагацу Тосихару; Сакакибара Сумпеи
Original assignee: Адзиномото Ко, Инк (Фирма)
Priority date: 1975-10-30
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1980-12-07
Also published as: CA1080216A; DE2649171A1; GB1518207A; SE7612064L; JPS5620839B2; US4119620A; FR2329646B1; NL7612030A; JPS5255593A; FR2329646A1

Description

анилина, n-фенилаэоанилина и 4-фени азо-1-нафтиламина. Предпочтительным вл етс остаток п-нитроанилина, та как содержащее его дипептидное производное лучше всего раствор етс в воде, наиболее стабильно и синтезировать его проще всего. Активность фермента по отношению к новым дипептидным производным Х-1-пролин-У различна в зависимости от того, какбва круппа N-конечной аминокислоты (X). Дипептидные производные , - содержащие нейтральную ил основную аминогруппу в качестве X, наиболее легко гидролизуютс фермен том, а те, которые содержат кислотную аминогруппу, наиболее слабо. Дипептидные производные, содержащие нейтральную или основную аминокислотную группу, или их соли, таких кислот как п-толуолсульфонова кис лота, подход т в качестве субстрато но производные основных аминокислот гигроскопичны. Дипептидные производ ные, содержащие группу глицина, отличаютс самой большой скоростью гидролиза при рН 8,7 из различных дипептидных производных X-Ь-пролина-Y; в темноте они обладают высоко стабильностью и легко раствор ютс в воде. Производные глицина, особен его соль такой кислоты, как хлорист водородна и п-толуолсульфонова , н гигроскопичны по сравнению с производными основных С1МИНОКИСЛОТ и удоб при анализе. П-нитроанилид глицил-L -пролина или его соли, особенно п-т луолсульфонат (тозилат), вл ютс наилучшими субстратами. Если используема аминокислота содержит боковые функциональные гру пы, то они могут быть использованы после того, как функциональные тру пы будут защищены. Например, в случае кислых аминокислот, их использу ют после того, как боковые карбокси ные группы превращают в сложные эфи ры, такие как бензиловый эфир. Аргинин используют после того, как группу гуанидина защищают обычной защитной группой, такой как тозил, нитро-, п-нитро-бензил-карбонил и 2-(изопропилоксикарбонил)3,4,5,6-тетрахлор-бензоил , и особенно двум первыми группами, тогда как N-аминогруппу лизина обычно защищаю известными аминозащищающими группам предпочтительно теми же защитными группами, как и те, что используют дл защиты N-аминогруппы. Защитную группу N-защищенного-Х-L-пролина-У , полученного таким образом , затем отщепл ют с помощью известного способа, завис щего от природы N-защитной группы/ и, если она есть, защитной группы боковых функциональных групп. Очень важно от щепить только защитную группу, не затронув остальные, в этой реакции .элиминировани . Можно также синтезировать необходимые Дипептидные производные соединением вначале N-защищенного X-L-пролина с частью V-II, а затем отщепить защитную группу от полученного Х-1-пролина-У. Если нужно получить соли кислот дипепг-идных производных, то их получают при -взаимодействии дипептидных производных с кислотами в такой среде, как вода, этанол. Соли также получают из N-защищенных производных при взаимодействии их с кислотс1Ми, если защитна группа вл етс т-бутилоксикарбонилом или аналогом, который может быть отщеплен под действием кислоты. Среди различных солей кислот тозилат вл етс наиболее предпочтительным , так как он образует твердые кристаллы, которые не включают примесей , присутствующих в маточном растворе , и который может быть поэтому получен с высокой степенью чистоты . простой перекристаллизацией. Активность фермента легко измер етс , если в качестве субстратов используют Дипептидные производные или их соли. Вначале приготавливают водный раствор Х-1-пролина-У или его соли подход щей концентрации. Если дл растворени субстрата в воде требуетс слишком мало времени, то предпочтительно использовать подход щие вещества дл ускорени скорости растворени; , такие как неионные детергенты , кислоты или спирты, или использовать субстрат в пористой форме, чего MoXiCHo достичь замораживанием. Пористый субстрат наиболее удобен дл рутинного анализа фермента; рН раствора субстрата мен етс в зависимости от того, какой субстрат используют . рН обычно расположен в интервале от 6 до 9, и предпочтительно от 7,5 до 8,9. Субстраты спонтанно гидролизуютс при рН свЕлие 9,5, но расторы .субстрата, особенно раствор п-нитроанилида глицил-1-пролина, стабилен при вышеупом нутом оптимуме рН и может хранитьс при свыше недели без заметного разложени Активность фермента измер ют при контакте субстрата с Х-пролил-диаминопептидазой или образцом, содержащим ее, в водной среде, предпочтительно в буферном растворе, таком как трималеат буфер, глицин-NaOH буфер и амидиол буфер при температуре от 30 до в течение определенного промежутка времени, определ фермент обычным способом, и затем определ ют освобожденные Y-H. Инкубационный период определ ют в со ответствии с количеством субстрата и фермента. Даже если сырой фермент, такой как сыворотка человек, исполь зуют в качестве источника фермента, то активность измер ют достаточно точно, так как субстрат практически не гидролизуетс другими ферментами, сопровождающими сырой фермент. Количество освобожденных Y-H легко определ5пот, измер поглощение фе ментной, реакционной смеси непосредственно на длине волны, соответствую щей индивидуальной группе Y-H а именно при 385 нм дл п-нитроанилина 493 нм дл п-фенилазоанилина и 532 н дл 4-фенилазо-1-нафтиламина. Пр мой фотометрический метод прост, удобен точен и, таким образом, подходит дл рутинного анализа активности фермента . Когда У-Н группой вл етс п-нитроанилин , активность фермента можно определ ть диазотизицией п-нитроанилина , осуществл емой за счет избытка нитрата натри в кислой среде. При этом измерении количество п-нитроанилина , который образовалс , может быть рассчитано измерением непро реагировавшего нитрата натри ; однако обычно определ етс так назьшаемым способом азосоединени , разлага непрореагировавший нитрит натри сул фаминовой кислотой сульфатом аммони , мочевиной и т.д., подверга взаимодействию образовавшийс п-нитрофенилдиазониум с соедин ющим компо нентом, таким как (- 1-нафтил) этилендиамин , и затем измер поглощение образовавшегос азосоединени на длине волны, характеризующей это азосоединение. Этот косвенный метод определени более сложен, чем предыдущий пр мой фотометрический способ, но более чувствителен. Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение более подробно. Пример 1. п-Нитроанилид М-бензилоксикарбонил-1- пролииа. Треххлористый фосфорил (50,6 г) медленно размещают в растворе N-бензилоксикарбонил-1-пролина (74,8 г) и п-нитроанилина (41,4 г) в тетрагидрофуране (400 мл) при . В смесь по капл м добавл ют триэтилами ( 92,4 мл), причем температуру внутри поддерживают при -15°С. Триэтиламин добавл ют до рН 7, после чего температуру реакционной смеси повышают до комнатной и перемешивают смесь, в течение 3 ч. Растворитель замен ют этилацетатом (1,2 л), раствор последовательно промывают водой (100 мл), 1 н. сол ной кислотой (300 мл X 5), водой (400 мл), 5%-ным раствором гидрокарбоната (300 мл X 3) и насыщенным раствором хлористого натри (300 мл и сушат над сульфатом магни . Высушенный рас тпор концентрируют при пониженном давлении, остаток кристаллизуют , добавл этиловый эфир, и полученный продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетата (300мл) и метанола (50 мл), выход 56 г, т. пл. 159-161 С, ,60(,0 метанол). Найдено, %: С 62,07; Н 5,20; N 11,62. Ci,H,,05Nj Вычислено, %: С 61,77; Н 5,19; N 11,38. Пример 2. Бромгидрат п-нитроанилида L-пролина. п-Нитроанилин N-бензилоксикарбонил-1-пролина (55,4 г), раствор ют в 26%-ном растворе безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (200 мл) при 0°С, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор примешивают в сухой этиловый эфир (2 л) дл кристаллизации продукта, который выдел ют декантацией, отмывеиот этиловым эфиром и сушат, выход 47 г. Неоч(военный продукт используют в следующих примерах без дальнейшей очистки. Пробу дл анализа получают перекристаллизацией из смеси метанола с этиловьм эфиром. Т.пл. 225-226°С, 22 35,бО(,0, CHjOH). Найдено, %: С 41,75; Н 4,34; Н 13,30. .Br Вычислено, %: С 41,79; Н 4,46; N 13,29. Пример 3. п-Нитроанилид N-бензилоксикарбонил-глицил-L-пролина . N-бензилоксикарбонил-глициновый оксисукцинимидный сложный эфир (48 г, 0,16 моль) перемешивают в охлажденную смесь бромгидрата п-нитроанилида L-пролина (47 г, 0,15 моль) i триэтиламина (22 мл) и N-оксибензтриазола (1 г) в диметилформамиде (100 мл). Всю смесь перемеишвают при ксмиатной температуре в течение 1 ч, поддержива в течение этого времени рН раствора 6 с помощью триэтиламина, а затем раствор перемешивают еще в течение 19 ч при комнатной температуре. Растворитель удал ют испаренн л при понижение давлении, в остаток добавл ют .воду (350 мл), а зате14 продукт двгикды экстрагируют этилащетатом (500 мл, 200 мл), Экстракты смешивсиот, последовательно отмывают водой (200 мл), 1 н. сол ной кислотой (200 мл X 2), водой (200 мл) и 5%-иьм раствором гидрокарбоната натри (200 мл X 4) и водой (200 мл) и сушат над сульфатом магни , выход 67 г. Гомогенность этого продукта была подтверждена методом тонкослойной газовой хроматографии на силикг еле с использованием в качестве растворител смеси хлорофо1 1а, метанола и уксусной кислоты объемное отноше|1 е (95:5:3) . П р и м е р 4. п-Нитроанилид гли цил-L-пролнна. п-Нитроанилид N-бензилоксикарбонил-глицин-L-пролина (61 г) подвергают взаимодействию с 26%-иым раств ром безводного бромистого водорода . уксусной кислоте (250 мл) и реакцио ную смесь обрабатывают так же,как в примере 2, в результате чего получаю бромгидрат п-нитроанилида глицил-L-пролина , выход 9 г. БрОмгидрат (20 г) смешивают с 1 М раствором карбоната натри (100 мл) и суспензию экстрагируют хлороформом 8 раз (по 100 мл каждьй раз) после насыщени хлористым на.трием. Экстракты смешивают, пробивают насы щенным раствором хлористого натри (100 мл) и сушат над сульфатом магни . Высушенный раствор концентриру ют, а остаток кристаллизируют из смеси этилацетата с этиловьв эфиром выход 12,7 г, т.пл. 118-120с,ГЛ 115, (, метанол) ,д llStJO (0,1 н. хлористоводородна кислота) П р.и м е р 5. Тозилат-п-нитроанилида глицил-L-пролина. п-Нитроанилид-глицил-L-пролина (584 мг) нейтрализуют раствором моно гидрата п-толуолсульфоновой кислоты в этаноле (380 мг в 10 мл). Продукт кристаллизуют путем помещени раствора в холодильник. Неочищенный про дукт перекристаллизовывают из смеси метанола с этиловым эфиром, выход 312 мг, т.пл. 223-225°С (с разложени ем), frf. - 81,00 (,0, метанол Найдено, %: С 51,82; Н 5,19; N 12,24. Вычислено, %: С 51,72; Н 5,21; N 12,06. Пример 6.. п-Нитроанилид т-бyтилoкcикapбoнил-L-aлaнил-L-пролина . т-Бyтилoкcикapбoнил-L-aлaнин (5,7 г) и бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г) раствор ют в хлороформе (40 мл) с триэтиламином (4,2 мл, 0,03 моль) и в этот раствор добавл ют раствор N.М-дициклогексилкарбодиимида (6,2 г) в хлороформе (5 мл) Всю смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 44 ч и после добавлени нескольких капель уксусной кислоты перемешивание -продолжают еще 2 ч. Осевшие продукты отфильтровывают, фильтраты концентри руют при пониженном давлении. Остаток смешивают с водой и продукт экстрагируют этилацетатом. Экстракт последовательно отмывают 1 н. сол ной кислотой, водой, 5%-ным раствором гидрокарбоната, водой и .насыщенным раствором хлористого натри и с-ушат над сульфатом магни Высушенный раствор концентрируют до получени остатка, который раствор ют в этиловом эфире. Некоторое коли чество нерастворившихс материалов отфильтровывают, фильтрат концентрируют и остаток отверждают титрованием н-гексаном, выход 12,9 г. На тонкослойной хроматограмме этот продукт дает одиночное п тно. Пример 7. Хлоргидрат п-нитроанилида L-аланид L-пролина. Расувор п-нитроанилида т-бутилоксикарбонил-L-аланил-L-пролина (12,9г) в диоксане (20 мл) обрабатывают 6N растворсал безводного хлористого водорода в диоксане (45 мл) в течение 55 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении, а остаток растирают дл отверждени в этиловом эфире, затем отвержденный продукт кристаллизуют из этанола, выход 6,4 г, т.,пл. 130-14. (с разложением ) , oLj - 103,4 (,0, метанол ) . Найдено , %: С 46,12; Н 6,09; N 15,50 . А4Нл904НдС«. 5/4На-0 вычислено, %: С 46,03; Н 5,93; N 15,34. Пример 8. п-Нитроанилид т-бyтилoкcикapбoнил-0-бeнзил-L-acпapтил-L-пролина . т-Бyтилoкcикapбoнил-ft-бeнзил-Lracпаргиловую кислоту (9,7 г 0,03 моль) и бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г, 0,03 моль) присоедин ют друг к другу так же, как в примере 6. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке силикагел (3,6см X 19 см), причем в качестве растворител используют смесь хлороформа и этилацетата (объемное отношение 5:1), Фракции, содержащие основной пик, собирают и концентрируют до получени аморфного твердого вещества, выход 10,3 г. Гомогенность этого продукта была подтверждена тонкослойной хроматографией . Пример 9. п-Нитроанилид L-аспартил-L-пролина. п-Нитроанилид т-бутилоксикарбонил- -бeнзил-L-acпapтил-L-пpoлинa (10,3 г) хорошо смешивают с аназолом (8 мл) и раствор обрабатывают безвЪдным фтористым водородом (около 50 мл) в течение 1 ч при . Фтористый водород отгон ют и продукт осаждают, добавл этиловый эфир. Осажденное вещество дважды отмывают этиловым эфиром, детактируют и сушат. Неочищенный продукт раствор ют в 0,1 М уксусной кислоты и раствор хорошо промывают этиловым эфиром, а затем пропускают через колонку с сильноосновной ионообменной смолой (Амберлит ИР-400, ацетатна форма, 200 мл), которую промывают 0,1 М уксусной кислоты. Элюат и промывки смешивают и концентрируют при пониженном давлении. Остаток кристаллизуют из небольшого количества воды, вькод 5,2 г, . 144-145 С (с разложением ) , - 100,3(,0 1NНС1 ),Е 12170 (0,1N-HC1).

Найдено, %: С 48,03; Н 5,63; N 14,16.

C.,s4ie9bN4 3/2НЗ.О

Вычидлено, %: С 47,74; Н 5,61; N 14,85.

и м е р 10. п-Нитроанилид т-буТилоксикарбонил- -бензил-1-глутамил-L-пролина .

Бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г) и т-бутилоксикарбонил-у -бензил-1 ,-глютаминовую кислоту, вьаделенную из дициклогексиламиновой соли (17,1 г), присоедин ют с помощью N,N -дициклогексилкарбодинмида, как в примере 6. Сырой продукт очищают на хроматографической колонке до получени аморфного твердого вещества, выход 12j7 г.

Гемогенность твердого вещества была подтверждена с псвлсш1ью тонкослойной хроматографии.

Пример 11. п-Нитроанилид L-глутамил-L-пролина.

п-Нитроанилид т-бутилоксикарбонил- бeнзил-L-глютaмил-L-пpoлинa (10 г 0,018 моль) обрабатывгиот фтористым водородом (около 50 мл) и реакционную смесь обрабатывают как в примере 9. Конечный продукт получен в виде кристаллов, выход 4,7, т. пл. 1171260С (с разложением), - 82,8 ( ,0, вода) .

Найдено, %: С 49,73; Н 5,91; N 14,54

Ь 5/4Н2.0

Вычислено, %: С 49,66; Н 5,87; N 14,88.

. П-р и м е р 12. п-Нитроанилид N ,N -дибeнзилoкcикapбoнил-L-лнзил-L-пролина .

Бромгидрат п-нитроанилида L-пролина (9,5 г) соедин ют с Н,К -дибензи oкcикapбoнил-L-лизинoм (12,4 г) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 6. Конечнь продукт получают в виде аморфного твердого вещества , выход 15,8 г.

Гемогеиность продукта была подтверждена с помсхцью тонкослойной хроматографии.

П р и м е р 13. Дитолизат п-нитроанилида L-лизил-L-пролина.

п-Нитроанилид .И-дибензилоксикapбoнил-L-лизил-L-пpoлинa (9,5 г) обрабатывают 26%-Hfcw раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционную смесь обрабатывают по методике примера 2. Таким образом получают дибромгидрат п-нитроанилида L-лизил-L-пролина , выход 7,8г.. :

Бромгидрат раствор ют в 0,1 М уксусной кислоте, раствор пропускают через колонку Амберлита 1 R-400 (в форме эцетата,,200 мл),которую промывсши 0,1 м уксусной кислотой. Элюат и промывки соедин ют и выпаривают до остатка при пониженном давлении; затем остаток раствор ют в смеси этанола с моногидратом п-толуолсульфоновой кислоты (5,5 г). Концентрирование раствора при пониженном давлении дает остаток, который кристаллизуют, растира его с этиловым эфиром, выход 10,1 г, т. пл. 92-130 С (с разложением ), UJ - 32, (,1, вода-)

0

Найдено, %; С 49,76; Н 6,02; N 9,26

Ci%H4 O oM, ftj

Вычислено, %: С 50,05; Н 6,11; N 9,42

s

. П р и м е р 14. п-Нитроанилид N -бeнзилoкcикapбoнил-N -тoзил-L-apгинид-L-пролина .

Бромгидрат п-нитр(оанилида L-пролина (12,0 г) и N-бензилоксикарбонилrN -тoзил-L-apгинин , который вьщел ют

0 из соли циклогексйламида (23 г), раствор ют в хлорофО Ж е (60 мл) и в раствор примешивают 1-этил-З-(3-диметиламинопропил )-карбодиимид (6,8 мл) при . Смесь перемешивают еще в

5 течение 17 ч при комнатной температуре и далее обрабатывеиот, как в .примере 3, выход 22,3 г.

Гомогенность этого продукта под0 тверждена с помощью тонкослойной хроматографии.

П р и м е р 15. дитозилат п-нитроанилида L-аргинин-L-пролина.

п-Нитроанилид N-бензилоксикарбо-.

5 нил-N -тoзил-L-apгинил-L-пролина (8,2 г) обрабатывают безводньм фтористым водородсм, как в примере 9. После удалени избытка Фтористого водорода остаток обрабатывают, как в примере 13. Конечный продукт

0 получен в виде кристалла, выход 7,3, т. пл. 125-138 с- (с разложением) , W -31,4«С (,0, вода).

Найдено, %: С 47,79; Н N 12,53

5

CMH4-fO-fo Sa.-5/2H2,0

Вычислено, %: С 47,67; Н 5,85; N 12,56.

Пример 16. п-Фенилазоанилид N-бензилоксикарбоиил- L- пролииа.

0

п-Фенилазоанилин (7,9 г) и Н-бен3 илоксикарбонил- L-пролин (10,0г.) соедин ют и реакционную смесь обрабатывают , как в примере 6. В результате получают твердый продукт, вы5 ход 10,8.

Этот продукт используют в следую цен примере 17 без дгшьнейней очистки . Образец дл ангшиза получают рекристгшлизацией из н-гексанэтилацетата .,о А

0

Т. пл. 141-143 C,Wt - 87,0С (С«1,О, диметилформамид).

Найдено, %: С 70,27; N 5,61; N 12,93 5CAsHx40iN-v

Вычислено, %: С 70,07; Н 5,65; N 13,08

Пример 17. п-Фенилазоанилид

Ы-т-бутилоксикарбонил-глйцил-1-пролина . .

п-Фенилазоанилид N-бензилокси ,карбонил-1-пролина (4,3 г 0,01 моль) обрабатывают 25%-ным раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционную смесь обрабатыва |рт, как в примере 2.

Бромгидрат п-фенилазоанилида L-пролина, полученный таким образом, и т-бутилоксикарбонилглицин (2,5 г) соедин ют, как в примере 6. Сырой продукт полученный при этом, очищают на хроматографической колонке; после очистки получают конечный продукт в виде кристаллов, выход 3,4 г, т. пл. 172-176°С, fo( 110, (,0, иметилформамид).

Найдено, %: С 64,08; Н 6,73; N 15,18

QZAHigO Ng

вычислено, %: С 63,84; Н 6,47; N 15,51.

П р и м е р 18. Тозилат п-фенилазоанилнда глицин L-пролина п-Фенилазоанилид т-бутилоксикарбонил-глицил-L-пролина (2,5 г) раствор ют в уксусной кислоте (8 мл) вместе с моногидратом п-толуолсульфоновой кислоты (2,3 г). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. ПРОДУК.Т оса одают, добавл в реак ционную смесь этиловый эфир, выдел ют фильтрованием и отмывают этиловым эфиром. Полученный твердый продукт дважды перекристаллизовывают из смеси этанола с этиловым эфиром, выход 1,6 г, т. пл. 141-155 С (с разложением) , Го.}; ..68,7°С (, диметилформамид),6 2 25000(0,1 н. сол на кислота).

Найдено, %: С 57,53; Н 5,60;: N 12,99

OgNjj

Вычислено, %: С 57,65; Н 5,77; N 12,93.

Пример19. 4-Фенилазо-1-нафтиламид Ы-бензилоксикарбонил-1-про-лина .

4-Фенилазо-1-нафтиламин (4,9 г) и Ы-бензилоксикарбонил-1-пролин (5,0 г) соедин ют и затем реакционную смесь обрабатывают,как в примере 6. Конечный продукт получают в виде кристаллов, выход 3,5 г. т.пл. 136-138°С, -75,9°С (,0, диметилформамид ) ,

Найдено, %: С 72,68; Н 5,57; ,93

С,9 Нjq Оа N ,

вычислено, %: С 72,78; Н 5,48; N 11,71.

П р и м е р 20. 4-Фенилазо-1-нафТиламид-т-бутилоксикарбонил-глицил- , -L-пролина.

4-Фенилазо-1-нафтиламид-М-бензилoкcикapбoнил-L-пpoлинa (2,5 г) обрабатывают- 25%-ным раствором безводного бромистого водорода и уксусной кислоте (25 мл) и реакционную смесь 5 обрабатывают,как в примере 2.

Бромгидрат 4-фенилазо-1-нафтиламида t-пролина, полученный таким обра , зом, и т-бутилоксикарбон L-глицин (1,36 г) соедин ют с N, }-дициклоIQ гексилкарбодимидом и реакционную

смесь обрабатывают, как в примере 6. Сырой продукт очищают затем на хроматографической колонке, после чего конечный продукт получают в кристаллическом виде, выход 1,1 г.

5 На тонкослойной хроматограмме этот продукт про вилс в виде одиночного п тна.

П р и м е р 21. 4-Фенилазо-1-нафтиламид глицил-L-пролина.

0 4-Фенилазо-1-нафтиламид т-бутилокси-глицил-L-пролина С1,0 г) обрабатывают моногидратом н-толуолсульфоновой кислоты (0,76 г) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 17.

5 Тозилат 4-фенилазо-1-нафтиламида глицилпролина, полученный таким образом , раствор ют в метаноле и нейтрализуют 5%-ным раствором гидрокарбоната натри дл высаждени продукта.

« Высаженный из раствора продукт ввдел ют фильтрованием, отмывают водой, сушат перекристаллизовывеиот из смеси метанола с водой, выход 0,67 г, т. пл. 127-138 С (с разложением), М , , диметилформа мидГ. t(KC 14.400 (0,1 н. сол на кислота).

Найдено, %: С 66,45; Н 5,81; N 16,69

Cji H- iOjN -3/4H.

0 вычислено. %: С 66,56; Н 5,95; N 16,88

П р и м е р 22. Изучают св зь между инкубационным периодом и количеством гидролизованного субстрае та, использу п-нитроанилид глицил-L-пролина и сыворотку человека в качестве субстрата и источника фермента соответственно, и пробу гйдролизованного субстрата отбирают дл

последующего пр мого фотометрического измерени .

Тозилат п-нитроанилида глицил-L-пролина раствор ют в 2%-ном водном растворе неполного детергента (Nikkol NP-10, Nikko, Chemical, Osaca, Japan)

5 в концентрации 3 мм дл получени раствора субстрата. Затем приготовл ют следующие 4 пробирки:

экспериментальна пробирка, содержаща 0,5 мл 0,15 М глицин-NaOH0 в качестве буфера (рН 8,7) О,5 мл

раствора субстрата и 0,5 мл человечес кой сыворотки;

пробирка,содержаща 0,5 мл 0,15 г-. глицин-NaOH в качестве буфера 0,5 wj:

5 раствора субстрата и 0,05 мл воды; эталонна пробирка, содержаща 0,6 мл буфера, 0,5 мл субстрата и 0,5 мл водного раствора п-нитроанили на; контрольна пробирка, содержаща 0,5 мл буфера и 0,5 мл субстрата. Все пробирки инкубируют при 37°С в течение времени, указанного в табл.1,и затем реакцию останавли;вают добавлением 3,О мл 1 М ацетата в качестве буфера (рН 4,2) в каждую пробирку. В контрольную пробирку добавл ют 0,05мл человеческой сыворотки после остановки реакции. Фотометр устанавливают на нуль с помощью холостой пробирки, а затем измер ют поглощение экспериментальной (э), контрольной (к) и стандартной (С) пробирок на длине волны 385 мл в кю вете толщиной 1 см. Количество п-ни роанилина, освобожденного в реакции с ферментом, рассчитывают по уравне -Ц. 150 (н моль) . Результаты приведены в табл.1. Таблица 1 Результаты этих испытаний подтверждают , что реакци ферментации линейно зависит от времени. Ту же самую процедуру повтор ют той разницей, что вместо человеческ сыворотки используют гомогенный фер мент, выделенный препаративно из по челюстной железы человека. Пример23. Зависимость межд количеством фермента и количеством гидролизованного субстрата изучают тозилате п-нитроанилида глицил-L-пролина и человеческой сыворотке, которые используют в качестве субстрата и источника фермента соответственно , и пробу на гидролизуемость субстрата осуществл ют по сле дующим азосочетани м. Приготовл ют следующие пробирки: экспериментальна пробирка,- содержаща 1,0 мл 0,15 М глицин-NaOH в качестве буфера (рН 8,7), 1,0 мл раствора субстрата, приготовленного в примере 21, и человеческую сыворотку в объеме, указанном в табл.2. контрольна пробирка, содержаща 1,0 мл глицин-NaOH в качестве буфера и 1,0 мл раствора субстрата. Обе пробирки, как экспериментальную , так и контрольную, инкубируют при.37с в течение 30 мин, а затем добавл ют 0,1 мл человеческой сыворотки в контрольную пробирку. Реакцию останавливают добавл 0,4 мл 30%-ного водного раствора хлорной кислоты. После центрифугировани со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин каждые 0,5 мл надосадочной жидкости перенос т в другую пробирку, Кроме того 0,1 мл водного раствора п-нитроанилина и 2,4 мл 30%-ного раствора хлорной кислоты добавл ют в эталонную пробирку, а 2,5 мл раствора хлорной кислоты - в холостую пробирку . Во все четыре пробирки добавл ют по 0,5 мл 0,2%-ного водного раствора нитрита натри при и при этой температуре их выдерживают в течение 10 мин. Затем добавл ют 0,5 мл свежеприготовленного 0,5%-ного водного раствора сульфата аммони . Через 2 мин добавл ют 1,0 мл 0,05%ного раствора N-(1-нафтил)-этилендиамина и пробирки инкубируют при в течение 30 мин в темноте. Фотометр устанавливают на нуль с помощью холостой пробирки, измер ют поглощение экспериментальной (Э), контрольной (К) и стандартной (с) пробирок при 548 нм. Количество п-нитроанилина, образовавшегос с помощью фермента, рассчитывают по уравнению ( Е - с) X 500 А 2,5 1 ОТЗ где А есть объем 0,5 мМ водного раствора п-нитроанилина, использованного в стандартной пробирке (мл). Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2 Результаты этих испытаний подтверждают , что реакци ферментации линейно зависит от количества фермента .

Пример 24, ЗмМ раствора суОстратов приготавливают, как в примере 2, причем в качестве субстратов используют различные дипептидные производные или их соли. Активности фермента по отношению к раэличньм субстратам , скорости гидролиза и оптимальные значени рН различных субстратов с помощью фермента измер ют, как в примере 22.

Результаты приведены в табл. 3. Таблица 3

п-Нитроанилид-1-лиИзмер ют активности очищенного фермента подчелюстной железы человека в 0,15 М трисмалеат буфере с рН 5,6-8,8 и в 0,15 М глицин-NaOH буфере с рН 8,2-0,4. Дл п-нитроан лида 1-аланил-1-пролина в качестве буфера вместо глицина используют индол, так как глицин затрудн ет фотометрирование при значени х рН 9-10. Значени К измер ют дл трисмал ат буфера с рН 7,0 с применением фермента подчелюстной железы человека . Приведенные значени вл ютс средними из повторных экспериментов Измер ют активности при рН 7,0 в 0,15 М трисмалеат буфере или при рН в 0,15 М глицин-NaOH буфере. При веденные значени вл ютс средними из повторных экспериментов. Очищенный фермент получают следующим способом. Фермент перевод т в растворимое состо ние..из микросоматической фракции автодигерировани и последовательно очищают фракциони рованием с помощью (NH4) с последующей очисткой Sephadex G-200 хроматографией. Субстрат используют в виде дитозилата . Субстрат используют в виде хлоргидрата . Пример 25. Продукты, полученные после инкубировани в течение 30 мин различных п-нитроанилидов X-L-пролинов с очищенным ферментом подчелюстной железы человека или с .человеческой сывороткой, как в примере 22, используют с помснцью бумажной хроматографии, причем в качестве N-кЬнечных аминокислот (X) используют остатки глицина, L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспаргиловой кислоты, L-лизина и L-аргинина. В этом случае, когда используют очищенный фермент, на хроматограмме идентифицируют кроме субстрата только X-L-пролин и п-нитроанилид, а Х-ОН, L-пролин или п-нитроанилид L-пролина не наблюдались. . В этом случае, когда в качестве фермента используют человеческую сыворотку, а в качестве субстрата п-нитроанилид - глицил-пролина, на хроматограмме идентифицируют глицил-L-пролин-глицин , L-ПЕЮЛИН и п:-нитроанилид , а п-нитроанилид L-пролина обнаружен не был. При исследовании скорости гидролиза п-нитроанилида L-пролина человеческой сывороткой обнаружено, что гидролизу подверглось всего лишь 0,7% п-нитроанилида глицил-L-пролина . Было показано, что человеческа сыворотка гидролизует глицин-L-пролин из глицина и L-npoпина . Эти результаты показывгиот, чт глицил-L-пролин может быть гидролиэован предпочтительно Х-пролилдипептидиламинопептидазой , содержащей в сыворотке человека, с получением вначале п-нитроанилида и глицил-L-пролина , который далее гидролизуэтс до глицина и L-пролива другим ферментом в человеческой сыворотке. Пример 26. ЗмМ раствора су зтрата приготавливают, как в примере 22, причем в качестве субстрата используют тозилат п-фенилазоанилида глицил-L-пролина и 4-фенилазо-1-нафгаламид глицил-1-пролина. Испытание активности фермента осуществл ют, добавл 0,05 мл чело веческой сыворо ки в смесь 0,5 мл 1,5 мм буфера глицин-NaOH (рН 8,7) и О,5 мл субстрата раствора в экспериментальной пробирке, выдержива полученный раствор в течение 30 мин при 37°С и останавлива затем реакцию добавлением 3,0 мл 1 н. сол ной кислоты. Поглощение п-фенилазоанилиЗначени активности у молодых лужчин (не старше 40 лет) были значительно выше, чем у молодых женщин, э 0,001.

Значени активности у пожилых женщин были значительно выше, чем у . молодых женщин, р 0,05.

Normal (control)

88 54,9+1,5 23 75,8+28,5 Мераt i tus

П р и м е р 29, Была измерена активность Х-пролилдипептидиламинопептидазы , как в примере 22, с использованием п-нитроанилида глицил-L-пролина и человеческой сыворотки в качестве субстрата и фермента соответ ,ственно.

Результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5

Р . 0,01 да глицил-L-пролива А 493 нм 0,18 и дл 4 фенилазо-1-нафтиламида П 532 мм 0,80. Эти значени сопоставимы с теMKj которые были получены дл п-нитроанилида глицил-L-пролина. П р и м е р 27. Была измерена скорость гидролиза п-фенилазоанилида глицил-1-пролина по методике примера 26 с применением человеческой сыворотки в качестве фермента. Однако холоста пробирка содержала воду вместо раствора фермента, как это было в экспериментальной пробирке, а стандартна ; пробирка содержала 3 мМ раствор п-фенилазо-анилина вместо раствора фермента в экспериментальной пробирке. В результате скорость составила 18,7 г моль/мин/1 сыв. П р и м е р 28. По методике примера 22 была измерена активность Х-пропилдипептидиламинопептидазы , в качестве фермента использовали 88 и человеческую сыворотку и п-нитроанилид глицил-1-пролина в качестве субстрата . Результаты приведены в табл.4. Таблица 4

- 19

x4i c--,, ., ,

,. ,., .4 .-..

Early essential nyper tens ion Fixed essential

78685320

. Продолжение табл, 5

20

80,94+3,87

P 0,001

Claims

Формула изобретения ^г

1. Способ определения активности Х-пролилдипептидиламинопептидазы, отличающийся тем, что фермент инкубируют с субстратом общей формулы X-L-nponHH-J или его кислой солью при температуре от 30 до

45^еС в водной среде при pH 6-9 и определяют количество высвободившегося вещества формулы Υ-н, где X — остаток глицина, L-алацина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-лизина, L-аргинина, У - остаток п-нитроанилина, п-фенилазоанилина, или 4-фенилазо-1-нафтиламина.
2. Способ поп.1, отличающийся тем, что в качестве кислой 'соли используют соль соляной кислоты, бромистоводородной кислоты или η-толуолсульфокислоты .

ВНИИПИ Заказ 8872/63 Тираж 673 Подписное

Филиал ППП ’’Патент·', г. Ужгород, ул. Проектная, 4