JP3667470B2 - 酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定法及び測定試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定法及び測定試薬に関するものである。
さらに詳しくいえば、本発明は、アミノ末端側が分子量の大きい保護基で保護されたペプチドを基質とし、酸性条件下においてカルボキシ末端のアミノ酸から順次遊離していく酸性カルボキシペプチダーゼの活性を迅速に、かつ正確に測定する方法及びその測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酸性カルボキシペプチダーゼ（以下ＡＣＰａｓｅという）は、酸性条件下（ｐＨ３〜６）において、タンパク質やポリペプチドのカルボキシ末端からアミノ酸単位で分解する酵素であり、該ＡＣＰａｓｅは、例えば醸造過程あるいは醸造物などにおけるアミノ酸の生成量に深く関係することから、醸造、食品工業などにおいては、該酵素活性を測定することは極めて重要とされている。
従来のＡＣＰａｓｅ活性の測定としては、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒで表される合成基質を用い、同酵素によってカルボキシ末端から切断され遊離したアミノ酸（チロシン）量を、ニンヒドリン法によって測定し、その活性値を求める方法（注釈編集委員会編「第四回改正国税庁所定分析法注解」第２２６頁、日本醸造協会（１９９３年）参照）が一般的である。
しかしながら、この方法においては、麹の抽出液のようにアミノ酸が多く混在する試料では、そのまま測定することが困難であり、試料は予め必ず透析して該アミノ酸を除去しなければならず、その透析に、例えば一昼夜などの長時間を要すること、またニンヒドリン反応の際に煩雑な操作を要すること、などの欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来のＡＣＰａｓｅ活性の測定法が有する欠点を克服し、アミノ酸が混在する試料においても、該アミノ酸を除去するための透析をすることなく簡便な操作で、迅速かつ高感度に試料中のＡＣＰａｓｅ活性を測定し得る新規なＡＣＰａｓｅ活性の測定法、及びＡＣＰａｓｅ活性測定試薬を提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
これまで、ＡＣＰａｓｅ含有試料に合成ペプチドを基質として加え、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を酵素法により定量し、試料のＡＣＰａｓｅ活性を測定する方法は知られていない。
本発明者らは、ＡＣＰａｓｅ活性測定の際、ＡＣＰａｓｅ含有試料に、特定の構造を有する合成ペプチド基質（以下、単にペプチド基質という）を加えて反応させ、該基質のカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させ、その遊離したアミノ酸を酵素法により測定することにより、ＡＣＰａｓｅ活性を高感度で測定できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、酸性カルボキシペプチダーゼ含有試料に、一般式、Ｒ−Ｘ−Ｙ （１）
（式中、Ｒはアミノ末端保護基、Ｘは１個以上のアミノ酸残基、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基をそれぞれ意味する）で表されるペプチドを基質として加え、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を酵素法により定量することを特徴とする酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法であり、また、一般式、Ｒ−Ｘ−Ｙ （１）
（式中、Ｒはアミノ末端保護基、Ｘは１個以上のアミノ酸残基、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基をそれぞれ意味する）で表されるペプチド基質、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該ペプチド基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸にアルカリ条件下で特異的に作用する酵素、及び発色系に用いる酵素又は酵素と発色剤を含有してなる酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定試薬である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
先ず、本発明に用いられる測定試料としては、ＡＣＰａｓｅを含有するものであればよく、特に制限はないが、具体的には微生物の固体培養の抽出液および液体培養液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液などが用いられる。試料が固体の場合には、一旦精製水又は適当な緩衝液に溶解又は懸濁させるのがよい。また必要により、不溶物をろ過などの操作で除去してもよい。
【０００６】
本発明に用いられるペプチド基質としては、前記一般式（１）において、Ｒは分子量の大きいアミノ末端の保護基であり、例えばベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などが挙げられる。またＸは、１個以上のアミノ酸残基を意味し、アミノ酸が長鎖になるにつれて試料中に混在する酸性プロテアーゼの作用によりペプチド基質内部が切断されやすくなるので、例えばロイシン、グルタミン酸、チロシンなどの１個のアミノ酸の残基であることが好ましい。さらにまた、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基であり、例えばチロシン、ロイシン、アラニン、サルコシン（Ｓａｒ）などの残基が挙げられる。これらのうち、Ｙがサルコシンであるものを用いれば、米麹抽出液などの測定試料中にはサルコシンが殆ど混在しないので、ブランク値が高くならず好ましい。そして本発明に用いられる前記一般式（１）で表される好適なペプチド基質の具体例としては、例えばＣｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒなどが挙げられる。
なお、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒは、後述するように通常のペプチド合成法によって合成することができる。
【０００７】
また、ＡＣＰａｓｅの作用によりカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を、酵素法によって定量する方法としては、例えば該遊離したアミノ酸をアルカリ条件下で、その遊離アミノ酸に特異的に作用する酵素と反応させて生成する生成物を発色定量する方法が用いられる。そして前記した遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素としては、前記一般式において、Ｙが、サルコシンの場合；例えばサルコシンオキシダーゼ、チロシンの場合；例えばチロシナーゼ、チロシンジカルボキシラーゼなど、ロイシンの場合；例えばロイシンデヒドロゲナーゼなど、アラニンの場合；例えばアラニンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。いずれの酵素についても、その給源は特に限定されるものではなく、市販のものを用いることができる。
【０００８】
前記の発色定量する方法の例としては、遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素（例えば該アミノ酸がチロシンであればチロシナーゼなど）を加えて反応させ、生成した発色性物質の発色量を測定し、アミノ酸量に換算する方法（直接定量法）、あるいは、遊離したアミノ酸に特異的に作用するオキシダーゼ系酵素（例えば該アミノ酸がサルコシンであればサルコシンオキシダーゼ）を加えて反応させ、発生した過酸化水素の量を定量し、アミノ酸量に換算する方法、遊離したアミノ酸に特異的に作用するデヒドロゲナーゼ系酵素（例えば該アミノ酸がロイシンであればロイシンデヒドロゲナーゼなど）を加えて反応させ、生成したＮＡＤＨの量を発色定量するか、あるいは生成したＮＨ3を化学的発色法で定量し、アミノ酸量に換算する方法（間接定量法）、遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素を加えて反応させ、生成した物質（例えばピルビン酸など）に特異的に作用するオキシダーゼ系やデヒドロゲナーゼ系の酵素を働かせ、前記の間接定量法の方法と同様にして定量する方法（間接２段階定量法）、などの公知の方法が挙げられる。そして遊離したアミノ酸によって、これらの方法を適宜選択して用いることができる。
【０００９】
また、前記の発色定量の具体例としては、例えばサルコシンオキシダーゼなどの過酸化水素発生系においては、生成した過酸化水素にパーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、２，４−ジクロロフェノール（２，４−ＤＣＰ）を加えて発色させる方法、また例えばロイシンデヒドロゲナーゼなどのＮＡＤＨ生成系においては、生成したＮＡＤＨに、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ）及び２−Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−〔４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ〕−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４）を加えて発色させる方法、さらにまた、例えばチロシナーゼなどのように、該酵素のみ使用して発色させる方法などの公知の方法が挙げられる。そして、各発色量は、分光光度計（例えば日立社製Ｕ−２０００型など）を用いて発色物質特有の波長で定量する。
【００１０】
次に、ＡＣＰａｓｅ活性を測定するための有利な系としては、試料中のＡＣＰａｓｅによりペプチド基質のカルボキシ末端からアミノ酸を遊離させる反応（第１の反応）においては、例えば前記一般式（１）で表されるペプチド基質０．２〜２０ｍＭ及び酢酸−酢酸ナトリウムなどの緩衝液２〜１００ｍＭを含有するｐＨ３〜６の系が挙げられる。
また、遊離したアミノ酸量を酵素法により定量するための反応（第２の反応）において、その遊離アミノ酸に特異的に作用する酵素と反応させて生成物を発色定量するための系としては、リン酸又はトリス・ＨＣｌなどの０．１〜１．０Ｍ緩衝液を含有するｐＨ７〜１０の系に、前記した遊離アミノ酸に特異的に作用する酵素又は該酵素と発色剤を含む系が挙げられ、例えば生成した過酸化水素の定量には、パーオキシダーゼ、４−ＡＡ、２，４−ＤＣＰを含む系、生成したＮＡＤＨの定量には、１−メトキシＰＭＳ及びＷＳＴ−４を含む系などが挙げられる。また、遊離のアミノ酸がチロシンなどの場合には、チロシナーゼなどの酵素のみを含む系などが挙げられる。
【００１１】
次いで、本発明の方法によるＡＣＰａｓｅ活性を測定するのに好適な実施態様を説明する。まず、第１の反応として、前記一般式（１）で表されるペプチド基質を０．２〜２０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭを酢酸−酢酸ナトリウムなどの緩衝剤と共に、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜６（酸性条件）、好ましくはｐＨ３〜４の条件下で２〜１０分間、好ましくは３〜５分間インキュベートする。次に、測定すべきＡＣＰａｓｅを含む試料液を加えて急速に攪拌し、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜６（酸性条件）、好ましくはｐＨ３〜４の条件下で少なくとも１分間、好ましくは５〜２０分間酵素反応させる。
次に、第２の反応として、例えばリン酸又はトリスなどの緩衝液０．１〜１．０Ｍ（反応停止液）を加えてｐＨ７〜１０（アルカリ条件）、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の条件としてＡＣＰａｓｅの酵素反応を停止させた後、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で、第１の反応で遊離したアミノ酸に特異的に作用する前記した酵素を過剰量若しくは十分量添加し、少なくとも５分間、好ましくは２０〜３０分間反応させる。この時、必要に応じて、遊離アミノ酸に対応した前記した発色剤、酵素又は補酵素などの適宜な量を同時に添加する。第２の反応後、吸光度を測定し、分光光度計にて４００ｎｍ〜６００ｎｍ、好ましくは４７５ｎｍ〜５５０ｎｍの波長における吸光度を測定し、その測定結果と予め算出しておいたアミノ酸検量線から遊離したアミノ酸の全量を算出し、ＡＣＰａｓｅ活性の計算に用いる。
【００１２】
また測定系には、通常、ペプチド基質由来の遊離アミノ酸のほかに、試料由来の遊離のアミノ酸も混在することが多いが、そのうちのペプチド基質由来の遊離アミノ酸量のみを求めるには、別に対照として、第１の反応において、測定すべきＡＣＰａｓｅを含む試料液を、前記反応停止液の添加直前に加える以外は以下前記と同様にして吸光度を測定し、試料由来の遊離のアミノ酸量を求める。そして前述したペプチド基質由来及び試料由来の遊離のアミノ酸の混在状態で求めた吸光度とこの対照の吸光度の差（Ｅ）を求めることにより得られる。また、検量線は、ペプチド基質の代わりに各アミノ酸標準溶液を、また試料液の代わりに水を用いて、上記と同様の操作によって作成する。
得られたＥから、この検量線により各アミノ酸量を求める。
なお、ＡＣＰａｓｅ活性は、３７℃で６０分間に各ペプチド基質から１μｇの各アミノ酸を生成する単位を１単位とした。
【００１３】
【実施例】
以下に、参考例及び実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
参考例 （ペプチド基質；Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒの製造の例）
先ずＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅを、文献「実験化学講座２２ 有機合成ＩＶ 酸・アミノ酸・ペプチド」（日本化学会編、丸善株式会社）第２６１頁、記載の方法に従い、以下の手順で合成した。
Ｓａｒ−ＯＭｅ・ＨＣｌ（２４．４ｇ、１７６ｍｍｏｌ、バッケム社製）をジクロロメタン（３００ｍｌ）に溶解し、−８℃に冷却して攪拌下にトリエチルアミン（２４．６ｍｌ、１７６ｍｍｏｌ）を加えた。これにＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（６５．９ｇ、１６０ｍｍｏｌ、バッケム社製）を加え、さらに０℃に冷却したジシクロヘキシルカルボジイミド（３６．３ｇ、１７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５０ｍｌ）溶液を加え、０℃で１時間、さらに室温で５時間反応させた。反応後、析出したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をろ別し、ろ液を分液漏斗に移し、ジクロロメタンを加えて約１ｌに希釈した後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、水で３回、１Ｍ塩酸で３回、さらに水で３回洗浄した。無水硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させた後、減圧濃縮して結晶を析出させた。次にこの結晶を熱酢酸エチルで溶解し、不溶物をろ別した後、ろ液を放置することによりＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅを５７．５ｇ（収率７２．３％）得た。
【００１４】
次いで、前記文献の第２７４頁に記載の方法に従い、以下の手順でＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅをけん化によってエステル除去した。すなわち、前記Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅ（１４．４ｇ、２９ｍｍｏｌ）をメタノール（１５０ｍｌ）とジオキサン（５０ｍｌ）の混合溶媒に溶かし、これに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２９ｍｌ）を滴下した。３時間後、１Ｍ硫酸で溶液のｐＨを注意深く７とし、減圧下で溶媒を留去した。残査に酢酸エチル及び５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、分液漏斗中で洗浄した。酢酸エチルで３回洗浄した後、１Ｍ硫酸で酸性とした。生成した沈殿物を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を濃縮した後、残査にヘキサンを加え、粗結晶を得た。この粗結晶を酢酸エチルとヘキサンから再結晶させ、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ ９．５ｇ（収率６７．８％）を得た。
なお、得られた結晶をＨＰＬＣで分析した結果、９７％の純度であった。
【００１５】
実施例１
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがサルコシンの場合＞）
＜試料の調製＞
測定試料として、蒸し米に黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を接種して常法により製麹して得た米麹を、「第四回改正国税庁所定分析法注解」の２１１−４−２に記載の方法（ただし、透析操作を省略した）で抽出して米麹抽出液を得て、この抽出液を原液とした。この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１．０となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；０．５ｍＭ Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ
（前記参考例と同様にして得たものを使用）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
７０Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダーゼ（キッコーマン社製）
７０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ
７０ｍｇ／ｄｌ水 ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）
０．２％ ２−４ジクロロフェノール（２，４−ＤＣＰ）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）に、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒを０．５ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液０．２ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートした。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を１００μｌ加えて各々反応を開始させ、３７℃で２０分間インキュベートしてカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させた。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため、０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を１．０ｍｌ加えて反応液のｐＨをアルカリ条件とした。該反応液に、７０Ｕ／ｍｌサルコシンオキシダーゼ０．１ｍｌを加えて作用させ、発生した過酸化水素を７０Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．１ｍｌ、７０ｍｇ／ｄｌ水 ４−ＡＡ ０．１ｍｌ及び０．２％ ２，４−ＤＣＰ ０．１ｍｌを加えて発色させ、発色量を分光光度計（日立Ｕ−２０００型）を用いて５１０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をトリス・ＨＣｌ緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図１における縦軸のｙ）を求めた。
【００１６】
その結果は図１に示すとおりであり、５１０ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９６、ｙ＝０．０６３３ｘ＋０．００１３）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
なお、前記した従来法（「第四回改正国税庁所定分析法注解」第２２６頁）と本発明の方法との測定結果の比較をしたところ、ｒは０．９８２と極めて高い相関を示す直線関係が得られた。
【００１７】
実施例２
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがチロシンの場合＞）
＜試料の調製＞
実施例１に記載したのと同様にして米麹抽出原液を得て、この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．２５、０．５、０．７５、１．０となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；２．０ｍＭ Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ペプチド研究所社製）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
４４０Ｕ／ｍｌ チロシナーゼ（シグマ社製）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にペプチド基質としてＣｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒを２．０ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液１ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートする。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を２００μｌ加えて各々反応を開始させ、３７℃で２０分間インキュベートしてカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させた。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため、０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．６ｍｌ加え反応液のｐＨをアルカリ条件とした。その後、４４０Ｕ／ｍｌ チロシナーゼを１００μｌ添加してペプチド基質から遊離したチロシンを発色性物質であるＤＯＰＡキノンに変えることにより定量した。発色量は、分光光度計（日立Ｕ−２０００型）にて４７５ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をリン酸緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図２における縦軸のｙ）を求めた。なお、ここでの吸光度の差は、米麹抽出液の各濃度における最大値を示すところで求めた。
【００１８】
その結果は図２に示すとおりであり、４７５ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９８、ｙ＝０．１９７８ｘ＋０．００５）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
【００１９】
実施例３
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがロイシンの場合＞）
＜試料の調製＞
実施例１に記載したのと同様にして米麹抽出原液を得て、この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．２５、０．５、０．７５となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；０．５ｍＭ Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（バッケム社製）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
６ｍＭ ＮＡＤ+ （ベーリンガーマンハイム社製）
３２．３Ｕ／ｍｌ ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡（株）社製）
５ｍＭ ＷＳＴ−４（同仁化学研究所社製）
５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（同仁化学研究所社製）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にペプチド基質としてＣｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを０．５ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液１ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートした。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を３０μｌ加えて各々反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため、０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を１．７ｍｌ加え反応液のｐＨをアルカリ条件とした。その後、ペプチド基質から遊離したロイシンの量を定量するため６ｍＭ ＮＡＤ+ １００μｌ、３２．３Ｕ／ｍｌ ロイシンデヒドロゲナーゼを１００μｌ添加して、ロイシンからＮＡＤＨを生成させ、生成したＮＡＤＨを５ｍＭ ＷＳＴ−４ １００μｌ、５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳを３０μｌ加えて発色定量した。発色量は、分光光度計（日立Ｕ−２０００型）にて５５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をトリス・ＨＣｌ緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図３における縦軸のｙ）を求めた。
【００２０】
その結果は図３に示すとおりであり、５５０ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９７、ｙ＝０．１１６ｘ＋０．００２５）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
【００２１】
実施例４
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがアラニンの場合＞）
＜試料の調製＞
実施例１に記載したのと同様にして米麹抽出原液を得て、この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．２５、０．５、０．７５となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；０．５ｍＭ Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（バッケム社製）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
６ｍＭ ＮＡＤ+ （ベーリンガーマンハイム社製）
１２８．６Ｕ／ｍｌ アラニンデヒドロゲナーゼ（シグマ社製）
５ｍＭ ＷＳＴ−４（同仁化学研究所社製）
５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（同仁化学研究所社製）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にＣｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｌａを０．５ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液１ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートした。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を３０μｌ加えて反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートしてカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させた。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を０．５ｍｌ加えて反応液のｐＨをアルカリ条件とした。その後、ペプチド基質から遊離したアラニンの量を定量するため６ｍＭ ＮＡＤ+ を１００μｌ、１２８．６Ｕ／ｍｌ アラニンデヒドロゲナーゼを１００μｌ添加して、アラニンからＮＡＤＨを生成させ、生成したＮＡＤＨを５ｍＭ ＷＳＴ−４ １００μｌ、５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳを３０μｌ加えて発色定量した。発色量は、分光光度計（日立Ｕ−２０００型）にて５５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をトリス・ＨＣｌ緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図４における縦軸のｙ）を求めた。
【００２２】
その結果は図４に示すとおりであり、５５０ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９６、ｙ＝０．４２６７ｘ＋０．０１７８）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノ酸が混在する試料においても、そのアミノ酸を除去するための長時間を要する透析操作をすることなく、簡便な操作で、迅速かつ高感度に試料中の酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定ができる。したがって本発明は、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が最終産物のアミノ酸の生成量に深く関与し、それが味の重要な指標となる特に清酒、醤油などの醸造分野において、極めて有用である。また、本発明は、醸造分野のみならず、食品工業の分野においても利用が可能であり、有意義である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１のサルコシンオキシダーゼの系による、５１０ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【図２】 実施例２のチロシナーゼの系による、４７５ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【図３】 実施例３のロイシンデヒドロゲナーゼの系による、５５０ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【図４】 実施例４のアラニンデヒドロゲナーゼの系による、５５０ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定法及び測定試薬に関するものである。
さらに詳しくいえば、本発明は、アミノ末端側が分子量の大きい保護基で保護されたペプチドを基質とし、酸性条件下においてカルボキシ末端のアミノ酸から順次遊離していく酸性カルボキシペプチダーゼの活性を迅速に、かつ正確に測定する方法及びその測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酸性カルボキシペプチダーゼ（以下ＡＣＰａｓｅという）は、酸性条件下（ｐＨ３〜６）において、タンパク質やポリペプチドのカルボキシ末端からアミノ酸単位で分解する酵素であり、該ＡＣＰａｓｅは、例えば醸造過程あるいは醸造物などにおけるアミノ酸の生成量に深く関係することから、醸造、食品工業などにおいては、該酵素活性を測定することは極めて重要とされている。
従来のＡＣＰａｓｅ活性の測定としては、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒで表される合成基質を用い、同酵素によってカルボキシ末端から切断され遊離したアミノ酸（チロシン）量を、ニンヒドリン法によって測定し、その活性値を求める方法（注釈編集委員会編「第四回改正国税庁所定分析法注解」第２２６頁、日本醸造協会（１９９３年）参照）が一般的である。
しかしながら、この方法においては、麹の抽出液のようにアミノ酸が多く混在する試料では、そのまま測定することが困難であり、試料は予め必ず透析して該アミノ酸を除去しなければならず、その透析に、例えば一昼夜などの長時間を要すること、またニンヒドリン反応の際に煩雑な操作を要すること、などの欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来のＡＣＰａｓｅ活性の測定法が有する欠点を克服し、アミノ酸が混在する試料においても、該アミノ酸を除去するための透析をすることなく簡便な操作で、迅速かつ高感度に試料中のＡＣＰａｓｅ活性を測定し得る新規なＡＣＰａｓｅ活性の測定法、及びＡＣＰａｓｅ活性測定試薬を提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
これまで、ＡＣＰａｓｅ含有試料に合成ペプチドを基質として加え、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を酵素法により定量し、試料のＡＣＰａｓｅ活性を測定する方法は知られていない。
本発明者らは、ＡＣＰａｓｅ活性測定の際、ＡＣＰａｓｅ含有試料に、特定の構造を有する合成ペプチド基質（以下、単にペプチド基質という）を加えて反応させ、該基質のカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させ、その遊離したアミノ酸を酵素法により測定することにより、ＡＣＰａｓｅ活性を高感度で測定できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、酸性カルボキシペプチダーゼ含有試料に、一般式、Ｒ−Ｘ−Ｙ （１）
（式中、Ｒはアミノ末端保護基、Ｘは１個以上のアミノ酸残基、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基をそれぞれ意味する）で表されるペプチドを基質として加え、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を酵素法により定量することを特徴とする酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法であり、また、一般式、Ｒ−Ｘ−Ｙ （１）
（式中、Ｒはアミノ末端保護基、Ｘは１個以上のアミノ酸残基、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基をそれぞれ意味する）で表されるペプチド基質、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該ペプチド基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸にアルカリ条件下で特異的に作用する酵素、及び発色系に用いる酵素又は酵素と発色剤を含有してなる酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定試薬である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
先ず、本発明に用いられる測定試料としては、ＡＣＰａｓｅを含有するものであればよく、特に制限はないが、具体的には微生物の固体培養の抽出液および液体培養液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液などが用いられる。試料が固体の場合には、一旦精製水又は適当な緩衝液に溶解又は懸濁させるのがよい。また必要により、不溶物をろ過などの操作で除去してもよい。
【０００６】
本発明に用いられるペプチド基質としては、前記一般式（１）において、Ｒは分子量の大きいアミノ末端の保護基であり、例えばベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などが挙げられる。またＸは、１個以上のアミノ酸残基を意味し、アミノ酸が長鎖になるにつれて試料中に混在する酸性プロテアーゼの作用によりペプチド基質内部が切断されやすくなるので、例えばロイシン、グルタミン酸、チロシンなどの１個のアミノ酸の残基であることが好ましい。さらにまた、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基であり、例えばチロシン、ロイシン、アラニン、サルコシン（Ｓａｒ）などの残基が挙げられる。これらのうち、Ｙがサルコシンであるものを用いれば、米麹抽出液などの測定試料中にはサルコシンが殆ど混在しないので、ブランク値が高くならず好ましい。そして本発明に用いられる前記一般式（１）で表される好適なペプチド基質の具体例としては、例えばＣｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒなどが挙げられる。
なお、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒは、後述するように通常のペプチド合成法によって合成することができる。
【０００７】
また、ＡＣＰａｓｅの作用によりカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を、酵素法によって定量する方法としては、例えば該遊離したアミノ酸をアルカリ条件下で、その遊離アミノ酸に特異的に作用する酵素と反応させて生成する生成物を発色定量する方法が用いられる。そして前記した遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素としては、前記一般式において、Ｙが、サルコシンの場合；例えばサルコシンオキシダーゼ、チロシンの場合；例えばチロシナーゼ、チロシンジカルボキシラーゼなど、ロイシンの場合；例えばロイシンデヒドロゲナーゼなど、アラニンの場合；例えばアラニンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。いずれの酵素についても、その給源は特に限定されるものではなく、市販のものを用いることができる。
【０００８】
前記の発色定量する方法の例としては、遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素（例えば該アミノ酸がチロシンであればチロシナーゼなど）を加えて反応させ、生成した発色性物質の発色量を測定し、アミノ酸量に換算する方法（直接定量法）、あるいは、遊離したアミノ酸に特異的に作用するオキシダーゼ系酵素（例えば該アミノ酸がサルコシンであればサルコシンオキシダーゼ）を加えて反応させ、発生した過酸化水素の量を定量し、アミノ酸量に換算する方法、遊離したアミノ酸に特異的に作用するデヒドロゲナーゼ系酵素（例えば該アミノ酸がロイシンであればロイシンデヒドロゲナーゼなど）を加えて反応させ、生成したＮＡＤＨの量を発色定量するか、あるいは生成したＮＨ3を化学的発色法で定量し、アミノ酸量に換算する方法（間接定量法）、遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素を加えて反応させ、生成した物質（例えばピルビン酸など）に特異的に作用するオキシダーゼ系やデヒドロゲナーゼ系の酵素を働かせ、前記の間接定量法の方法と同様にして定量する方法（間接２段階定量法）、などの公知の方法が挙げられる。そして遊離したアミノ酸によって、これらの方法を適宜選択して用いることができる。
【０００９】
また、前記の発色定量の具体例としては、例えばサルコシンオキシダーゼなどの過酸化水素発生系においては、生成した過酸化水素にパーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、２，４−ジクロロフェノール（２，４−ＤＣＰ）を加えて発色させる方法、また例えばロイシンデヒドロゲナーゼなどのＮＡＤＨ生成系においては、生成したＮＡＤＨに、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ）及び２−Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−〔４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ〕−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４）を加えて発色させる方法、さらにまた、例えばチロシナーゼなどのように、該酵素のみ使用して発色させる方法などの公知の方法が挙げられる。そして、各発色量は、分光光度計（例えば日立社製Ｕ−２０００型など）を用いて発色物質特有の波長で定量する。
【００１０】
次に、ＡＣＰａｓｅ活性を測定するための有利な系としては、試料中のＡＣＰａｓｅによりペプチド基質のカルボキシ末端からアミノ酸を遊離させる反応（第１の反応）においては、例えば前記一般式（１）で表されるペプチド基質０．２〜２０ｍＭ及び酢酸−酢酸ナトリウムなどの緩衝液２〜１００ｍＭを含有するｐＨ３〜６の系が挙げられる。
また、遊離したアミノ酸量を酵素法により定量するための反応（第２の反応）において、その遊離アミノ酸に特異的に作用する酵素と反応させて生成物を発色定量するための系としては、リン酸又はトリス・ＨＣｌなどの０．１〜１．０Ｍ緩衝液を含有するｐＨ７〜１０の系に、前記した遊離アミノ酸に特異的に作用する酵素又は該酵素と発色剤を含む系が挙げられ、例えば生成した過酸化水素の定量には、パーオキシダーゼ、４−ＡＡ、２，４−ＤＣＰを含む系、生成したＮＡＤＨの定量には、１−メトキシＰＭＳ及びＷＳＴ−４を含む系などが挙げられる。また、遊離のアミノ酸がチロシンなどの場合には、チロシナーゼなどの酵素のみを含む系などが挙げられる。
【００１１】
次いで、本発明の方法によるＡＣＰａｓｅ活性を測定するのに好適な実施態様を説明する。まず、第１の反応として、前記一般式（１）で表されるペプチド基質を０．２〜２０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭを酢酸−酢酸ナトリウムなどの緩衝剤と共に、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜６（酸性条件）、好ましくはｐＨ３〜４の条件下で２〜１０分間、好ましくは３〜５分間インキュベートする。次に、測定すべきＡＣＰａｓｅを含む試料液を加えて急速に攪拌し、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜６（酸性条件）、好ましくはｐＨ３〜４の条件下で少なくとも１分間、好ましくは５〜２０分間酵素反応させる。
次に、第２の反応として、例えばリン酸又はトリスなどの緩衝液０．１〜１．０Ｍ（反応停止液）を加えてｐＨ７〜１０（アルカリ条件）、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の条件としてＡＣＰａｓｅの酵素反応を停止させた後、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で、第１の反応で遊離したアミノ酸に特異的に作用する前記した酵素を過剰量若しくは十分量添加し、少なくとも５分間、好ましくは２０〜３０分間反応させる。この時、必要に応じて、遊離アミノ酸に対応した前記した発色剤、酵素又は補酵素などの適宜な量を同時に添加する。第２の反応後、吸光度を測定し、分光光度計にて４００ｎｍ〜６００ｎｍ、好ましくは４７５ｎｍ〜５５０ｎｍの波長における吸光度を測定し、その測定結果と予め算出しておいたアミノ酸検量線から遊離したアミノ酸の全量を算出し、ＡＣＰａｓｅ活性の計算に用いる。
【００１２】
また測定系には、通常、ペプチド基質由来の遊離アミノ酸のほかに、試料由来の遊離のアミノ酸も混在することが多いが、そのうちのペプチド基質由来の遊離アミノ酸量のみを求めるには、別に対照として、第１の反応において、測定すべきＡＣＰａｓｅを含む試料液を、前記反応停止液の添加直前に加える以外は以下前記と同様にして吸光度を測定し、試料由来の遊離のアミノ酸量を求める。そして前述したペプチド基質由来及び試料由来の遊離のアミノ酸の混在状態で求めた吸光度とこの対照の吸光度の差（Ｅ）を求めることにより得られる。また、検量線は、ペプチド基質の代わりに各アミノ酸標準溶液を、また試料液の代わりに水を用いて、上記と同様の操作によって作成する。
得られたＥから、この検量線により各アミノ酸量を求める。
なお、ＡＣＰａｓｅ活性は、３７℃で６０分間に各ペプチド基質から１μｇの各アミノ酸を生成する単位を１単位とした。
【００１３】
【実施例】
以下に、参考例及び実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
参考例 （ペプチド基質；Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒの製造の例）
先ずＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅを、文献「実験化学講座２２ 有機合成ＩＶ 酸・アミノ酸・ペプチド」（日本化学会編、丸善株式会社）第２６１頁、記載の方法に従い、以下の手順で合成した。
Ｓａｒ−ＯＭｅ・ＨＣｌ（２４．４ｇ、１７６ｍｍｏｌ、バッケム社製）をジクロロメタン（３００ｍｌ）に溶解し、−８℃に冷却して攪拌下にトリエチルアミン（２４．６ｍｌ、１７６ｍｍｏｌ）を加えた。これにＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（６５．９ｇ、１６０ｍｍｏｌ、バッケム社製）を加え、さらに０℃に冷却したジシクロヘキシルカルボジイミド（３６．３ｇ、１７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５０ｍｌ）溶液を加え、０℃で１時間、さらに室温で５時間反応させた。反応後、析出したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をろ別し、ろ液を分液漏斗に移し、ジクロロメタンを加えて約１ｌに希釈した後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、水で３回、１Ｍ塩酸で３回、さらに水で３回洗浄した。無水硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させた後、減圧濃縮して結晶を析出させた。次にこの結晶を熱酢酸エチルで溶解し、不溶物をろ別した後、ろ液を放置することによりＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅを５７．５ｇ（収率７２．３％）得た。
【００１４】
次いで、前記文献の第２７４頁に記載の方法に従い、以下の手順でＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅをけん化によってエステル除去した。すなわち、前記Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅ（１４．４ｇ、２９ｍｍｏｌ）をメタノール（１５０ｍｌ）とジオキサン（５０ｍｌ）の混合溶媒に溶かし、これに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２９ｍｌ）を滴下した。３時間後、１Ｍ硫酸で溶液のｐＨを注意深く７とし、減圧下で溶媒を留去した。残査に酢酸エチル及び５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、分液漏斗中で洗浄した。酢酸エチルで３回洗浄した後、１Ｍ硫酸で酸性とした。生成した沈殿物を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を濃縮した後、残査にヘキサンを加え、粗結晶を得た。この粗結晶を酢酸エチルとヘキサンから再結晶させ、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ ９．５ｇ（収率６７．８％）を得た。
なお、得られた結晶をＨＰＬＣで分析した結果、９７％の純度であった。
【００１５】
実施例１
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがサルコシンの場合＞）
＜試料の調製＞
測定試料として、蒸し米に黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を接種して常法により製麹して得た米麹を、「第四回改正国税庁所定分析法注解」の２１１−４−２に記載の方法（ただし、透析操作を省略した）で抽出して米麹抽出液を得て、この抽出液を原液とした。この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１．０となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；０．５ｍＭ Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒ
（前記参考例と同様にして得たものを使用）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
７０Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダーゼ（キッコーマン社製）
７０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ
７０ｍｇ／ｄｌ水 ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）
０．２％ ２−４ジクロロフェノール（２，４−ＤＣＰ）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）に、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓａｒを０．５ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液０．２ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートした。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を１００μｌ加えて各々反応を開始させ、３７℃で２０分間インキュベートしてカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させた。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため、０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を１．０ｍｌ加えて反応液のｐＨをアルカリ条件とした。該反応液に、７０Ｕ／ｍｌサルコシンオキシダーゼ０．１ｍｌを加えて作用させ、発生した過酸化水素を７０Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．１ｍｌ、７０ｍｇ／ｄｌ水 ４−ＡＡ ０．１ｍｌ及び０．２％ ２，４−ＤＣＰ ０．１ｍｌを加えて発色させ、発色量を分光光度計（日立Ｕ−２０００型）を用いて５１０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をトリス・ＨＣｌ緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図１における縦軸のｙ）を求めた。
【００１６】
その結果は図１に示すとおりであり、５１０ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９６、ｙ＝０．０６３３ｘ＋０．００１３）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
なお、前記した従来法（「第四回改正国税庁所定分析法注解」第２２６頁）と本発明の方法との測定結果の比較をしたところ、ｒは０．９８２と極めて高い相関を示す直線関係が得られた。
【００１７】
実施例２
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがチロシンの場合＞）
＜試料の調製＞
実施例１に記載したのと同様にして米麹抽出原液を得て、この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．２５、０．５、０．７５、１．０となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；２．０ｍＭ Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ペプチド研究所社製）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
４４０Ｕ／ｍｌ チロシナーゼ（シグマ社製）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にペプチド基質としてＣｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒを２．０ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液１ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートする。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を２００μｌ加えて各々反応を開始させ、３７℃で２０分間インキュベートしてカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させた。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため、０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．６ｍｌ加え反応液のｐＨをアルカリ条件とした。その後、４４０Ｕ／ｍｌ チロシナーゼを１００μｌ添加してペプチド基質から遊離したチロシンを発色性物質であるＤＯＰＡキノンに変えることにより定量した。発色量は、分光光度計（日立Ｕ−２０００型）にて４７５ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をリン酸緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図２における縦軸のｙ）を求めた。なお、ここでの吸光度の差は、米麹抽出液の各濃度における最大値を示すところで求めた。
【００１８】
その結果は図２に示すとおりであり、４７５ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９８、ｙ＝０．１９７８ｘ＋０．００５）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
【００１９】
実施例３
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがロイシンの場合＞）
＜試料の調製＞
実施例１に記載したのと同様にして米麹抽出原液を得て、この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．２５、０．５、０．７５となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；０．５ｍＭ Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（バッケム社製）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
６ｍＭ ＮＡＤ+ （ベーリンガーマンハイム社製）
３２．３Ｕ／ｍｌ ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡（株）社製）
５ｍＭ ＷＳＴ−４（同仁化学研究所社製）
５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（同仁化学研究所社製）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にペプチド基質としてＣｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを０．５ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液１ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートした。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を３０μｌ加えて各々反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため、０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を１．７ｍｌ加え反応液のｐＨをアルカリ条件とした。その後、ペプチド基質から遊離したロイシンの量を定量するため６ｍＭ ＮＡＤ+ １００μｌ、３２．３Ｕ／ｍｌ ロイシンデヒドロゲナーゼを１００μｌ添加して、ロイシンからＮＡＤＨを生成させ、生成したＮＡＤＨを５ｍＭ ＷＳＴ−４ １００μｌ、５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳを３０μｌ加えて発色定量した。発色量は、分光光度計（日立Ｕ−２０００型）にて５５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をトリス・ＨＣｌ緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図３における縦軸のｙ）を求めた。
【００２０】
その結果は図３に示すとおりであり、５５０ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９７、ｙ＝０．１１６ｘ＋０．００２５）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
【００２１】
実施例４
（ＡＣＰａｓｅ活性の測定＜ペプチド基質のＹがアラニンの場合＞）
＜試料の調製＞
実施例１に記載したのと同様にして米麹抽出原液を得て、この米麹抽出原液濃度を１とし、これを希釈して抽出液濃度が０．２５、０．５、０．７５となるように試料を調製した。
＜試薬の調製＞
ペプチド基質；０．５ｍＭ Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（バッケム社製）
緩衝液；５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）
反応停止液；０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
６ｍＭ ＮＡＤ+ （ベーリンガーマンハイム社製）
１２８．６Ｕ／ｍｌ アラニンデヒドロゲナーゼ（シグマ社製）
５ｍＭ ＷＳＴ−４（同仁化学研究所社製）
５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（同仁化学研究所社製）
＜ＡＣＰａｓｅ活性の測定＞
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にＣｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｌａを０．５ｍＭとなるように溶解して得たペプチド基質液１ｍｌを、３７℃で５分間インキュベートした。これに、ＡＣＰａｓｅを含む前記の米麹抽出液を３０μｌ加えて反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートしてカルボキシ末端のアミノ酸を遊離させた。インキュベート後、ＡＣＰａｓｅによる反応を停止させるため０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を０．５ｍｌ加えて反応液のｐＨをアルカリ条件とした。その後、ペプチド基質から遊離したアラニンの量を定量するため６ｍＭ ＮＡＤ+ を１００μｌ、１２８．６Ｕ／ｍｌ アラニンデヒドロゲナーゼを１００μｌ添加して、アラニンからＮＡＤＨを生成させ、生成したＮＡＤＨを５ｍＭ ＷＳＴ−４ １００μｌ、５００μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳを３０μｌ加えて発色定量した。発色量は、分光光度計（日立Ｕ−２０００型）にて５５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。
別に対照として、測定試料をトリス・ＨＣｌ緩衝液の添加直前に加え、以下上記と同様の操作を行い対照の吸光度（Ｂ）を測定し、前記の吸光度（Ａ）と対照の吸光度（Ｂ）との差（Ｅ）（図４における縦軸のｙ）を求めた。
【００２２】
その結果は図４に示すとおりであり、５５０ｎｍの吸光度（ｙ）と米麹抽出液濃度（ｘ）との間には極めて高い相関を示す直線関係（ｒ＝０．９９６、ｙ＝０．４２６７ｘ＋０．０１７８）が得られた。このことから、本発明によれば、試料中のＡＣＰａｓｅ活性を簡便な操作で、迅速かつ高感度に測定できることがわかる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノ酸が混在する試料においても、そのアミノ酸を除去するための長時間を要する透析操作をすることなく、簡便な操作で、迅速かつ高感度に試料中の酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定ができる。したがって本発明は、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が最終産物のアミノ酸の生成量に深く関与し、それが味の重要な指標となる特に清酒、醤油などの醸造分野において、極めて有用である。また、本発明は、醸造分野のみならず、食品工業の分野においても利用が可能であり、有意義である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１のサルコシンオキシダーゼの系による、５１０ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【図２】 実施例２のチロシナーゼの系による、４７５ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【図３】 実施例３のロイシンデヒドロゲナーゼの系による、５５０ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
【図４】 実施例４のアラニンデヒドロゲナーゼの系による、５５０ｎｍの吸光度と米麹抽出液濃度との間の関係を示すグラフ。
Claims (4)
- 酸性カルボキシペプチダーゼ含有試料に、
一般式、Ｒ−Ｘ−Ｙ （１）
（式中、Ｒはアミノ末端保護基、Ｘは１個以上のアミノ酸残基、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基をそれぞれ意味する）で表されるペプチドを基質として加え、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量を酵素法により定量することを特徴とする酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法。 - 請求項１記載の一般式（１）中のＹが、サルコシン、チロシン、ロイシン又はアラニンのいずれかの残基である請求項１記載の酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法。
- 請求項１記載の一般式（１）中のＹが、サルコシン、チロシン、ロイシン又はアラニンのいずれかの残基であり、酵素法により定量する方法が、酸性条件下で酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸量をアルカリ条件下でその遊離したアミノ酸に特異的に作用する酵素を加えて反応させて生成する生成物を発色定量する方法である、請求項１記載の酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法。
- 一般式、Ｒ−Ｘ−Ｙ （１）
（式中、Ｒはアミノ末端保護基、Ｘは１個以上のアミノ酸残基、Ｙはカルボキシ末端のアミノ酸残基をそれぞれ意味する）で表されるペプチド基質、酸性カルボキシペプチダーゼの作用により該ペプチド基質のカルボキシ末端から遊離するアミノ酸にアルカリ条件下で特異的に作用する酵素、及び発色系に用いる酵素又は酵素と発色剤を含有してなる酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定試薬。
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| JPH10117796A JPH10117796A (ja) | 1998-05-12 |
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