JP4043535B2 - ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu
〔式中、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸を表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロテイナーゼＡによって該ペプチドの-Phe-Phe-間が切断されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるための修飾基を付与されていてよい、プロテイナーゼＡ活性測定用の基質に関する。
本発明は、とりわけ一般式
A3−A4−A5−A6−Phe−(NO2)Phe−Arg−Leu （II）
〔式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体あるいは一般式
PG−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−FLG （III）
〔式中、PGはアミノ基の保護基、例えばスクシニル基を表し、A3、A4、A5およびA6は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、FLG は 4-メチルクマリル-7-アミド（ＭＣＡ）などの蛍光基を表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体
あるいは
fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 （VI）
〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表されるノナペプチド誘導体
からなるプロテアーゼＡ活性測定用の基質に関し、さらに該基質を用いることを特徴とするプロテイナーゼＡ活性の測定方法及び上記基質を用いてビール中のプロテイナーゼＡ活性を測定してビールの泡安定性を測定する方法に関する。
本発明はさらに、一般式
Lys−Pro−A1−A2−Phe−Phe−Arg−Leu （Ｉ）
（式中、A1およびA2は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Leu 、Arg 又はSer で表されるアミノ酸である。）で表される新規オクタペプチドまたは Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leuで表される新規オクタペプチドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテイナーゼＡ（Proteinase A）は、微生物アスパルティック プロテイナーゼ（Microbial Aspartic Proteinase 、ＥＣ3.4.23.6）に属し、サッカロミセス アスパルティック プロテイナーゼ（Saccaromyces Aspartic Proteinase）、ベイカーズ イースト プロテイナーゼＡ（Baker's yeast Proteinase A）及びサッカロミセス カルボキシル プロテイナーゼ（Saccaromyces Carboxyl Proteinase）の別名があり、一般的なアスパルティック プロテイナーゼ阻害剤であるペプスタチンに感受性がある。
【０００３】
酵母においてはプロテイナーゼＡはリソゾーム様液胞に局在し、老廃タンパク質等の分解により酵母の生存に必要なアミノ酸を供給する役割を担っており、特に窒素源が枯渇した場合の胞子形成時に、細胞内タンパク質の分解の制御に関与していると考えられている。しかし、この酵素はビールの泡を形成するタンパク質の分解に関与することによりビールの泡立ちに影響を与えるので、ビール及びビール酵母中のプロテイナーゼＡの活性はできるだけ低いことが望ましい。しかしながら、微量のプロテイナーゼＡを測定する信頼性の高い方法は知られていない。例えば、プロテイナーゼＡの比較的簡便な活性測定法としては、レニンに対する特異的基質であるSuc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA （Suc はスクシニル基を表し、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）を基質とする蛍光法による方法が開発されている〔Hideyoshi Yokozawa,Hiroshi Ito,Shigeki Murata,and Shin-ichi Ishii ; Analytical Biochemistry,134,210-215(1983) 〕。後述するとおり、この方法の感度はビール中のプロテイナーゼＡの測定には不十分である。
【０００４】
また、P1−P2−P3−P4−P5−(NO2)Phe−Arg−Leu 〔式中、P1、P2、P3、P4、P5は種々のアミノ酸を表し、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕を発色性の基質とするペプスタチン非感受性のカルボキシル プロテイナーゼの活性測定法が知られている〔Kohei Oda,Hiroshi Nakatani and Ben M.Dunn ;Biochimica et Biophysica Acta,1120,208-214(1992)〕。この酵素の基質の一部はプロテイナーゼＡの基質ともなりうるが、この場合の測定感度も低すぎて、ビール中のプロテイナーゼＡの測定には不十分なものであった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のYokozawaらによる、Suc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA を基質とする測定方法は、ビール酵母よりビール中に漏出する微量のプロテイナーゼＡを定量するためには、感度が不十分である。即ち、もともとこの基質はレニン（ＥＣ3.4.23.4）活性の測定用なのでプロテイナーゼＡの検出限界は２．０ｎｇ／ｍｌと比較的感度が低く、以下の問題がある。１）この基質に対するプロテイナーゼＡの親和性が非常に低いために、活性測定のための反応時間が２４時間程度と長くならざるをえない。そのために、基質の非特異的な分解が起きる。２）上記親和性が低いために、プロテイナーゼＡをめぐり、ビール蛋白質そのものと基質が競合する。解決のために基質の量を多くせざるをえなくなり、測定コストが非常に高いものとなる。３）この基質を用いてビール中のプロテイナーゼＡを定量するには、蛍光分析機で分析可能な強さの蛍光を得るために、わざわざ、市販のプロテイナーゼＡを添加して測定せざるをえず、正確な定量は困難である。
【０００６】
以上のことより、例えばビール中におけるような微量のプロテイナーゼＡの定量／活性測定は困難であり、プロテイナーゼＡに特異的な基質の開発が急務とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、カテプシンＤ（ＥＣ3.4.23.5）に特異性の高い基質であるLys−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu をもとにプロテイナーゼＡに特異性の高い基質を鋭意探索した。その結果、次の一般式（IV）
A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu （IV）
（式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸である。）で表されるオクタペプチドが、プロテイナーゼＡに対して極めて良好な親和性を有し、プロテイナーゼＡによってPhe−Phe の間で開裂することを見いだした。従って、本発明は一般式（IV）で表される、プロテイナーゼＡに特異的な新規基質を提供するものである。本発明の基質は、他のプロテアーゼよりもプロテイナーゼＡに対する親和性が大きいのが特徴である。
【０００８】
本発明のプロテイナーゼＡ用新規基質のうち、好ましいものは、A3がAla 、Asp 、Leu 、Arg 又はSer であるもの、あるいはA4がLeu 又はPro であるもの、あるいはA5がAla 、Asp 、Leu 又はSer であるもの、あるいはA6がAla 、Leu 、Lys 又はSer であるものである。特に好ましい基質は、Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu である。
【０００９】
なお、一般式（IV）のオクタペプチドのうち前記一般式（Ｉ）のもの、および Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu で表されるペプチドは、新規化合物であり、それ自体本発明の対象である。一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチドは、プロテイナーゼＡによる切断部位であるPhe−Phe のペプチド結合を有するオクタペプチドであり、好ましい具体例には、Lys−Pro−Ala−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Leu−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Ser−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Asp−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Leu−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ser−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu などがある。
【００１０】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒等は当該技術分野で慣用されている略号、あるいは、IUPAC-IUB の命名委員会で採用された略号を使用している。例えば下記の略号が使用されている。また、アミノ酸はＬ型を意味するものとする。
【００１１】
Ala ：アラニン
Leu ：ロイシン
Ser ：セリン
Asp ：アスパラギン酸
Lys ：リシン
Arg ：アルギニン
Phe ：フェニルアラニン
Pro ：プロリン
一般式（IV）で表される本発明のプロテイナーゼＡ用基質であるオクタペプチドは、ペプチド化学において通常用いられる方法、例えば、Schroder and Lubke著「ザ ペプチド（The Peptides）」第一卷、Academic Press , New York , U.S.A （１９６５年）、泉屋信夫ら著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）（１９８５年）などに記載されている方法である液相法及び固相法のいずれによっても製造することができる。
【００１２】
液相法及び固相法のいずれによる場合も、ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法等が挙げられる。
【００１３】
縮合反応を行う前に、それ自体公知の手段により、アミノ酸やペプチド中の反応に関与しないカルボキシル基、アミノ基等を保護したり、また反応に関与するカルボキシル基、アミノ基を活性化してもよい。
【００１４】
縮合反応は、通常溶媒中で行われ、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル等のエステル類、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、エタノール等のアルコール類、ピリジン、水等の溶媒、又は、これらの混合物中で行うことができる。
【００１５】
反応温度は、一般に使用される約−３０℃〜約５０℃の範囲で行うことができる。
【００１６】
本発明のペプチドの合成に所望により用いられる保護基の脱離反応は、使用する保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合に影響を与えずに保護基を除く方法はよく知られている。
【００１７】
このようにして製造された本発明のオクタペプチドは、反応終了後、それ自体公知のペプチドの分離手段、例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、クロマトグラフィー等によって収得することができる。
【００１８】
また、前記オクタペプチドの塩として、酸付加塩及び塩基性塩を挙げることができる。このような酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸等）又は有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、シュウ酸、メタスルホン酸等）等の塩が挙げられる。また、塩基性塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩等が挙げられる。
【００１９】
一般式（IV）で表される本発明のプロテイナーゼＡ用基質は、Phe−Phe の間の開裂を検出してプロテイナーゼＡの活性を測定するために、そのまま又は適当な修飾を加えた誘導体として用いることができる。例えば、前記一般式（II）あるいは（III）で表される誘導体は、該開裂を吸光法または蛍光法で検出するために適し、測定感度が低いという、従来技術の欠点を解決した新たなプロテイナーゼＡ活性の微量測定法を提供する。なお、Phe−Phe の間の開裂を検出できる他の適当な修飾を施した一般式（IV）の基質を用いることも本発明の範囲内である。
【００２０】
吸光法によるプロテイナーゼＡ活性の測定においては、一般式（IV）の基質のＣ末端に近い方のＰｈｅをＮＯ2 により修飾して、前記一般式（II）で表されるオクタペプチド誘導体とし、そのPhe−(NO2)Phe〔(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕の間が加水分解されることにより生ずる３００ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。ＮＯ2 により修飾された誘導体の製造方法は、例えば、日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２１】
吸光法による本発明のプロテイナーゼＡの活性測定法を説明すると、次のとおりである。プロテイナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量（例えば１μｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与えるための０．２Ｍ程度のリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍ程度のクエン酸を含むｐＨ４．３のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液適量（例えば２５０μｌ）、前記一般式（II）で表される基質の約１ｍＭの水溶液適量（例えば５０μｌ）及び蒸留水適量（例えば１９９μｌ）を混合して、プロテイナーゼＡの作用温度（例えば１５℃〜３７℃好ましくは３７℃）で、１０秒〜２０分間反応させる。約３００ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、既知量のプロテイナーゼＡによる減少と比較して、サンプル中のプロテイナーゼＡの量を求めることができる。
【００２２】
蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の一つとして、一般式（IV）の基質のＮ末端にアミノ基の保護基を、そしてＣ末端に蛍光基を導入して、前記一般式（III）で表されるオクタペプチド誘導体として使用する。例えば、Ｎ末端にスクシニル基を付加させ、Ｃ末端に検出用の蛍光基であるＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を付加させた一般式
Suc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Ｖ）
（式中、Suc はスクシニル基を表し、A3、A4、A5、A6はそれぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）で表されるオクタペプチド誘導体を基質として用いる。蛍光基としては、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）が好ましいが、他の検出基としてｐ−ニトロアニリド、β−ナフチルアミド、β−ナフチルエステル等を用いてもよい。アミノ基の保護基としては、スクシニル基が好ましいが、他にｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル等を挙げることができる。これらの基をオクタペプチドに付加させる方法は、例えば、前記の日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２３】
上記一般式（III）のオクタペプチド誘導体を基質として用いた場合においても、プロテイナーゼＡはPhe −Phe の間を加水分解するわけであるが、生じた分解産物より蛍光基を遊離させるためには適当な蛋白分解酵素、例えば、Ｎ末端に保護基を持たないペプチドのみに作用する、アミノペプチダーゼＭを用いる。
【００２４】
蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の実施方法を、一般式（Ｖ）で表されるオクタペプチド誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次のとおりである。プロテイナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量（例えば、１０〜１００μｌ、好ましくは４０μｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与えるための０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液適量（例えば、２５０μｌ）、一般式（Ｖ）で表される基質の１ｍＭ水溶液適量（例えば、０．１〜１００μｌ、好ましくは１〜１０μｌ）及び蒸留水適量（例えば、２０８μｌ）で反応液を作成し、プロテイナーゼＡの作用温度（例えば、１５℃〜３７℃、好ましくは３７℃）で、１〜６時間好ましくは約３時間、遮光下で反応させる。カルシウムイオンはプロテイナーゼＡ活性に全く影響を与えないので、カルシウムを反応液中に添加する必要はないが、存在していてもさしつかえない。
【００２５】
次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりプロテイナーゼＡの反応を停止させた後に、ｐＨ約８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液適量（例えば２００μｌ）と適当なアミノペプチダーゼ溶液適量（例えば、アミノペプチダーゼＭを蒸留水に約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解させたもの５μｌ）を加えて更に３７℃で１時間程度、遮光下でインキュベートした後、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりアミノペプチダーゼ反応を停止させ、反応液を適当に希釈したものの蛍光度を励起波長３５０〜３７５ｎｍの間、蛍光波長４４０〜４７０ｎｍの間で測定する。励起波長および蛍光波長は、用いる蛍光基によって適宜選択する。上記の反応条件でビールのプロテアーゼＡ活性を測定する場合には、反応混合物を約７倍に希釈すれば蛍光分析機による測定に都合がよい。
【００２６】
蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の別の例として、一般式（IV）の基質のＮ末端に蛍光基、例えば(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を、そしてＣ末端に該蛍光基の蛍光を抑制するためのジニトロフェニル(Dnp)含有基、例えば-Lys(Dnp)-NH2を導入して、前記一般式（VI）で表されるノナペプチド誘導体として使用する。例えば、Ｎ末端にMOCAc基を付加させ、Ｃ末端に-Lys(Dnp)-NH2基を付加させた一般式
MOCAc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−Lys(Dnp)-NH2 (VII）
（式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル基を表し、A3、A4、A5、A6はそれぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸を表す。）で表されるノナペプチド誘導体を基質として用いる。蛍光基としては、アントラニロイルベンジル(ABz)基等を用いてもよい。−Lys(Dnp)-NH2部分は、リジン以外にもジニトロフェニル置換基を持つ適当なアミノ酸を用いることができる。該リジンをアミド化したのは、カルボキシペプチダーゼによる非特異的切断から保護するためであり、他の適当な保護基を同様に用いることも可能である。これらの基を一般式（IV）のオクタペプチドに付加させる方法は、例えば、前記の日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２７】
上記一般式(VI）のノナペプチド誘導体を基質として用いた場合においても、プロテイナーゼＡはPhe −Phe の間を加水分解するわけであるが、本蛍光法においては上記の蛍光法の場合と異なって、生じた分解産物より蛍光基を遊離させるためのアミノペプチダーゼＭ等の蛋白分解酵素の使用を必要としない。即ち、本蛍光法では、基質の蛍光基は分解前にはジニトロフェニルの存在により抑制されており、この基質のPhe −Phe の間が加水分解されると蛍光値が約２００倍上昇して検出可能になる。したがって、反応が１工程であるため簡便且つ迅速である。例えばビール中のプロテアーゼＡ活性の測定を約２時間で行うことが可能である。
【００２８】
本蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の実施方法を、一般式(VII）で表されるノナペプチド誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次のとおりである。前記同様にしてプロテイナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量を、一般式(VII）で表される基質と、プロテイナーゼＡの作用温度で反応させる。次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりプロテイナーゼＡの反応を停止させた後に、反応液を適当に希釈したものの蛍光度を励起波長３１０〜３５０ｎｍの間（蛍光基がMOCAcの場合は３２８ｎｍが好ましい）、蛍光波長３７０〜４１０ｎｍの間（蛍光基がMOCAcの場合は３９３ｎｍが好ましい）で測定する。励起波長および蛍光波長は、用いる蛍光基によって適宜選択する。上記の反応条件の場合には、反応混合物を約７倍に希釈すれば蛍光分析機による測定に都合がよい。
【００２９】
上記いずれの基質を用いる測定方法においても、既知濃度の市販酵素（シグマ社製、米国）について測定した検量線からサンプル中のプロテイナーゼＡ濃度を測定することができる。本発明の好ましい態様では、検出限界は０．０３ｎｇ／ｍｌ以下である。ただし、このプロテイナーゼＡの量は、その１ｍｇが１５単位（ユニット）の活性を示すとして計算したものである。１ユニットは、インシュリンのβ鎖（分子量３，３５３）を基質とした場合に、ｐＨ６．０、２５℃で１分間に１μｍｏｌの基質を加水分解する酵素活性である。従って、１．５×１０-5ユニットの酵素活性が１ｎｇのプロテイナーゼＡに相当する。
【００３０】
また、プロテイナーゼＡ活性をより簡便に測定するためには、
(a) プロテイナーゼＡの特異的基質である、一般式（II）または（III）で表されるオクタペプチド誘導体あるいは一般式(VI)で表されるノナペプチド誘導体
(b) プロテイナーゼＡの精製標品（例えば、米国シグマ社製のもの）
(c) 反応用緩衝液〔例えば、マックルバイン（McIlvaine ）緩衝液〕
を含むプロテイナーゼＡ活性測定用キットを利用すればよい。
【００３１】
【実施例】
次いで、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１．オクタペプチド誘導体の合成
表１に示すオクタペプチド誘導体は全て米国アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製のモデル４３２Ａシナジー（Model 432A SYNERGY）型ペプチドシンセサイザーを用いて固相法により合成した。ニトロ基（ＮＯ2 ）の導入は、日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載の方法により、行った。
【００３３】
これとは別に、Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Suc はスクシニル基を表し、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）を、Ｃ末端を７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）で保護したアミノ酸から出発して液相法により合成した。MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 (式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル基を、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。) も同様にして合成した。合成されたペプチドは全てＨＰＬＣ的に純粋であった。
【００３４】
ＨＰＬＣの条件は、溶離液は１０ｍＭのリン酸カリウム溶液と５０ｍＭの硫酸二ナトリウムを等量混合した溶液に２０容量％から６０容量％のアセトニトリルの濃度勾配（２５分）をつけたもので、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２ ＯＤＳカラム（内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、米国ＹＭＣ社製）を用い、２１０ｎｍで検出し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．であった。
【００３５】
この測定条件下において、例えば上記Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の保持時間（ retention time ）は１８分前後であった。
【００３６】
実施例２．プロテイナーゼＡに対する親和性の測定（吸光法）
実施例１で合成した種々のオクタペプチド誘導体を基質とした場合の市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米国）活性を吸光法により測定した。
【００３７】
すなわち、市販プロテイナーゼＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、蒸留水中）１μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ４．３のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、基質の１ｍＭ水溶液５０μｌ及び蒸留水１９９μｌで全量５００μｌの反応液を作成し、３７℃で１０秒〜２０分間反応させ、３００ｎｍにおける吸光度の減少により酵素活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例３．蛍光法によるビール中のプロテイナーゼＡ活性の測定
ビール液４０μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、実施例１で合成したSuc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を作成し、３７℃で３時間反応させた。
【００４０】
次いで、８０℃−５分の熱処理によりプロテイナーゼＡ反応を停止させた後に、ｐＨ８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液２００μｌとアミノペプチダーゼＭ溶液〔ピアース ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）製のアミノペプチダーゼを蒸留水に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度、溶解させたもの〕５μｌを加えて更に３７℃で１時間インキュベートした後、７倍に希釈したものの蛍光度を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定した。既知濃度の市販酵素について測定した検量線からビール中のプロテイナーゼＡ含量を測定した。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
実施例４．蛍光法によるビール中のプロテイナーゼＡ活性の測定（２）
市販プロテイナーゼＡを０．１〜０．８ｎｇ／ｍｌ添加したビール液４０μl、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン(McIlvaine)緩衝液２５０μl 、実施例１で合成したMOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を作成し、３７℃で１時間反応させ、７５℃で５分の熱処理後、４℃で１０，０００ｒｐｍ、１分の遠心で得た上清の蛍光度を励起波長３２８ｎｍ、蛍光波長３９３ｎｍで測定した。表３に示すようにプロテイナーゼＡ含量と蛍光度は良く相関した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
実施例５．ビール中のプロテイナーゼＡ活性と泡安定性との相関
ビールに市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米国）を適当量添加し、３０℃にて２０日間保存した後の泡持ち度を測定し、プロテイナーゼＡ含量と泡安定性との相関を調べたところ、表４及び図１に示すような相関性が得られた。プロテイナーゼＡ含量は実施例３と同様にして測定し、泡持ち度は以下のようにして測定した。
【００４５】
参考例１ 泡持ち度測定法（ＳＨＶ− Schaumhaftvermogen −法）
ビールの泡持ち度を泡の立ち具合とガラス面への泡の付着性を測定することにより評価する。すなわち、ビール全量を一度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込み、注ぎ込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着して残っている泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡持ち度を定量的に評価する。この際、泡持ち度の単位は平方センチメーターで表す〔化学と生物、ｐ１３５４、（１９７５）参照〕。
【００４６】
【表４】
【００４７】
【発明の効果】
本発明は、前記一般式（IV）で表されるペプチドからなるプロテイナーゼＡの基質を提供する。これを前記一般式（III）で表されるオクタペプチド誘導体あるいは前記一般式(VI)で表されるノナペプチド誘導体を基質とする本発明のプロテイナーゼＡ活性の測定方法によれば、該酵素濃度の検出感度が、前記Yokozawaらによるレニン活性測定用の基質を用いる従来の方法と比べて数十倍向上するので、例えばビール中におけるような微量のプロテイナーゼＡの定量が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビール中のプロテイナーゼＡ含量と泡安定性との相関を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu
〔式中、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸を表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロテイナーゼＡによって該ペプチドの-Phe-Phe-間が切断されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるための修飾基を付与されていてよい、プロテイナーゼＡ活性測定用の基質に関する。
本発明は、とりわけ一般式
A3−A4−A5−A6−Phe−(NO2)Phe−Arg−Leu （II）
〔式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体あるいは一般式
PG−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−FLG （III）
〔式中、PGはアミノ基の保護基、例えばスクシニル基を表し、A3、A4、A5およびA6は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、FLG は 4-メチルクマリル-7-アミド（ＭＣＡ）などの蛍光基を表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体
あるいは
fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 （VI）
〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表されるノナペプチド誘導体
からなるプロテアーゼＡ活性測定用の基質に関し、さらに該基質を用いることを特徴とするプロテイナーゼＡ活性の測定方法及び上記基質を用いてビール中のプロテイナーゼＡ活性を測定してビールの泡安定性を測定する方法に関する。
本発明はさらに、一般式
Lys−Pro−A1−A2−Phe−Phe−Arg−Leu （Ｉ）
（式中、A1およびA2は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Leu 、Arg 又はSer で表されるアミノ酸である。）で表される新規オクタペプチドまたは Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leuで表される新規オクタペプチドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテイナーゼＡ（Proteinase A）は、微生物アスパルティック プロテイナーゼ（Microbial Aspartic Proteinase 、ＥＣ3.4.23.6）に属し、サッカロミセス アスパルティック プロテイナーゼ（Saccaromyces Aspartic Proteinase）、ベイカーズ イースト プロテイナーゼＡ（Baker's yeast Proteinase A）及びサッカロミセス カルボキシル プロテイナーゼ（Saccaromyces Carboxyl Proteinase）の別名があり、一般的なアスパルティック プロテイナーゼ阻害剤であるペプスタチンに感受性がある。
【０００３】
酵母においてはプロテイナーゼＡはリソゾーム様液胞に局在し、老廃タンパク質等の分解により酵母の生存に必要なアミノ酸を供給する役割を担っており、特に窒素源が枯渇した場合の胞子形成時に、細胞内タンパク質の分解の制御に関与していると考えられている。しかし、この酵素はビールの泡を形成するタンパク質の分解に関与することによりビールの泡立ちに影響を与えるので、ビール及びビール酵母中のプロテイナーゼＡの活性はできるだけ低いことが望ましい。しかしながら、微量のプロテイナーゼＡを測定する信頼性の高い方法は知られていない。例えば、プロテイナーゼＡの比較的簡便な活性測定法としては、レニンに対する特異的基質であるSuc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA （Suc はスクシニル基を表し、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）を基質とする蛍光法による方法が開発されている〔Hideyoshi Yokozawa,Hiroshi Ito,Shigeki Murata,and Shin-ichi Ishii ; Analytical Biochemistry,134,210-215(1983) 〕。後述するとおり、この方法の感度はビール中のプロテイナーゼＡの測定には不十分である。
【０００４】
また、P1−P2−P3−P4−P5−(NO2)Phe−Arg−Leu 〔式中、P1、P2、P3、P4、P5は種々のアミノ酸を表し、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕を発色性の基質とするペプスタチン非感受性のカルボキシル プロテイナーゼの活性測定法が知られている〔Kohei Oda,Hiroshi Nakatani and Ben M.Dunn ;Biochimica et Biophysica Acta,1120,208-214(1992)〕。この酵素の基質の一部はプロテイナーゼＡの基質ともなりうるが、この場合の測定感度も低すぎて、ビール中のプロテイナーゼＡの測定には不十分なものであった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のYokozawaらによる、Suc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA を基質とする測定方法は、ビール酵母よりビール中に漏出する微量のプロテイナーゼＡを定量するためには、感度が不十分である。即ち、もともとこの基質はレニン（ＥＣ3.4.23.4）活性の測定用なのでプロテイナーゼＡの検出限界は２．０ｎｇ／ｍｌと比較的感度が低く、以下の問題がある。１）この基質に対するプロテイナーゼＡの親和性が非常に低いために、活性測定のための反応時間が２４時間程度と長くならざるをえない。そのために、基質の非特異的な分解が起きる。２）上記親和性が低いために、プロテイナーゼＡをめぐり、ビール蛋白質そのものと基質が競合する。解決のために基質の量を多くせざるをえなくなり、測定コストが非常に高いものとなる。３）この基質を用いてビール中のプロテイナーゼＡを定量するには、蛍光分析機で分析可能な強さの蛍光を得るために、わざわざ、市販のプロテイナーゼＡを添加して測定せざるをえず、正確な定量は困難である。
【０００６】
以上のことより、例えばビール中におけるような微量のプロテイナーゼＡの定量／活性測定は困難であり、プロテイナーゼＡに特異的な基質の開発が急務とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、カテプシンＤ（ＥＣ3.4.23.5）に特異性の高い基質であるLys−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu をもとにプロテイナーゼＡに特異性の高い基質を鋭意探索した。その結果、次の一般式（IV）
A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu （IV）
（式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸である。）で表されるオクタペプチドが、プロテイナーゼＡに対して極めて良好な親和性を有し、プロテイナーゼＡによってPhe−Phe の間で開裂することを見いだした。従って、本発明は一般式（IV）で表される、プロテイナーゼＡに特異的な新規基質を提供するものである。本発明の基質は、他のプロテアーゼよりもプロテイナーゼＡに対する親和性が大きいのが特徴である。
【０００８】
本発明のプロテイナーゼＡ用新規基質のうち、好ましいものは、A3がAla 、Asp 、Leu 、Arg 又はSer であるもの、あるいはA4がLeu 又はPro であるもの、あるいはA5がAla 、Asp 、Leu 又はSer であるもの、あるいはA6がAla 、Leu 、Lys 又はSer であるものである。特に好ましい基質は、Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu である。
【０００９】
なお、一般式（IV）のオクタペプチドのうち前記一般式（Ｉ）のもの、および Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu で表されるペプチドは、新規化合物であり、それ自体本発明の対象である。一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチドは、プロテイナーゼＡによる切断部位であるPhe−Phe のペプチド結合を有するオクタペプチドであり、好ましい具体例には、Lys−Pro−Ala−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Leu−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Ser−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Asp−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Leu−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ser−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu などがある。
【００１０】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒等は当該技術分野で慣用されている略号、あるいは、IUPAC-IUB の命名委員会で採用された略号を使用している。例えば下記の略号が使用されている。また、アミノ酸はＬ型を意味するものとする。
【００１１】
Ala ：アラニン
Leu ：ロイシン
Ser ：セリン
Asp ：アスパラギン酸
Lys ：リシン
Arg ：アルギニン
Phe ：フェニルアラニン
Pro ：プロリン
一般式（IV）で表される本発明のプロテイナーゼＡ用基質であるオクタペプチドは、ペプチド化学において通常用いられる方法、例えば、Schroder and Lubke著「ザ ペプチド（The Peptides）」第一卷、Academic Press , New York , U.S.A （１９６５年）、泉屋信夫ら著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）（１９８５年）などに記載されている方法である液相法及び固相法のいずれによっても製造することができる。
【００１２】
液相法及び固相法のいずれによる場合も、ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法等が挙げられる。
【００１３】
縮合反応を行う前に、それ自体公知の手段により、アミノ酸やペプチド中の反応に関与しないカルボキシル基、アミノ基等を保護したり、また反応に関与するカルボキシル基、アミノ基を活性化してもよい。
【００１４】
縮合反応は、通常溶媒中で行われ、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル等のエステル類、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、エタノール等のアルコール類、ピリジン、水等の溶媒、又は、これらの混合物中で行うことができる。
【００１５】
反応温度は、一般に使用される約−３０℃〜約５０℃の範囲で行うことができる。
【００１６】
本発明のペプチドの合成に所望により用いられる保護基の脱離反応は、使用する保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合に影響を与えずに保護基を除く方法はよく知られている。
【００１７】
このようにして製造された本発明のオクタペプチドは、反応終了後、それ自体公知のペプチドの分離手段、例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、クロマトグラフィー等によって収得することができる。
【００１８】
また、前記オクタペプチドの塩として、酸付加塩及び塩基性塩を挙げることができる。このような酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸等）又は有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、シュウ酸、メタスルホン酸等）等の塩が挙げられる。また、塩基性塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩等が挙げられる。
【００１９】
一般式（IV）で表される本発明のプロテイナーゼＡ用基質は、Phe−Phe の間の開裂を検出してプロテイナーゼＡの活性を測定するために、そのまま又は適当な修飾を加えた誘導体として用いることができる。例えば、前記一般式（II）あるいは（III）で表される誘導体は、該開裂を吸光法または蛍光法で検出するために適し、測定感度が低いという、従来技術の欠点を解決した新たなプロテイナーゼＡ活性の微量測定法を提供する。なお、Phe−Phe の間の開裂を検出できる他の適当な修飾を施した一般式（IV）の基質を用いることも本発明の範囲内である。
【００２０】
吸光法によるプロテイナーゼＡ活性の測定においては、一般式（IV）の基質のＣ末端に近い方のＰｈｅをＮＯ2 により修飾して、前記一般式（II）で表されるオクタペプチド誘導体とし、そのPhe−(NO2)Phe〔(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕の間が加水分解されることにより生ずる３００ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。ＮＯ2 により修飾された誘導体の製造方法は、例えば、日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２１】
吸光法による本発明のプロテイナーゼＡの活性測定法を説明すると、次のとおりである。プロテイナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量（例えば１μｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与えるための０．２Ｍ程度のリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍ程度のクエン酸を含むｐＨ４．３のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液適量（例えば２５０μｌ）、前記一般式（II）で表される基質の約１ｍＭの水溶液適量（例えば５０μｌ）及び蒸留水適量（例えば１９９μｌ）を混合して、プロテイナーゼＡの作用温度（例えば１５℃〜３７℃好ましくは３７℃）で、１０秒〜２０分間反応させる。約３００ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、既知量のプロテイナーゼＡによる減少と比較して、サンプル中のプロテイナーゼＡの量を求めることができる。
【００２２】
蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の一つとして、一般式（IV）の基質のＮ末端にアミノ基の保護基を、そしてＣ末端に蛍光基を導入して、前記一般式（III）で表されるオクタペプチド誘導体として使用する。例えば、Ｎ末端にスクシニル基を付加させ、Ｃ末端に検出用の蛍光基であるＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を付加させた一般式
Suc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Ｖ）
（式中、Suc はスクシニル基を表し、A3、A4、A5、A6はそれぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸であり、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）で表されるオクタペプチド誘導体を基質として用いる。蛍光基としては、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）が好ましいが、他の検出基としてｐ−ニトロアニリド、β−ナフチルアミド、β−ナフチルエステル等を用いてもよい。アミノ基の保護基としては、スクシニル基が好ましいが、他にｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル等を挙げることができる。これらの基をオクタペプチドに付加させる方法は、例えば、前記の日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２３】
上記一般式（III）のオクタペプチド誘導体を基質として用いた場合においても、プロテイナーゼＡはPhe −Phe の間を加水分解するわけであるが、生じた分解産物より蛍光基を遊離させるためには適当な蛋白分解酵素、例えば、Ｎ末端に保護基を持たないペプチドのみに作用する、アミノペプチダーゼＭを用いる。
【００２４】
蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の実施方法を、一般式（Ｖ）で表されるオクタペプチド誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次のとおりである。プロテイナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量（例えば、１０〜１００μｌ、好ましくは４０μｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与えるための０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液適量（例えば、２５０μｌ）、一般式（Ｖ）で表される基質の１ｍＭ水溶液適量（例えば、０．１〜１００μｌ、好ましくは１〜１０μｌ）及び蒸留水適量（例えば、２０８μｌ）で反応液を作成し、プロテイナーゼＡの作用温度（例えば、１５℃〜３７℃、好ましくは３７℃）で、１〜６時間好ましくは約３時間、遮光下で反応させる。カルシウムイオンはプロテイナーゼＡ活性に全く影響を与えないので、カルシウムを反応液中に添加する必要はないが、存在していてもさしつかえない。
【００２５】
次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりプロテイナーゼＡの反応を停止させた後に、ｐＨ約８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液適量（例えば２００μｌ）と適当なアミノペプチダーゼ溶液適量（例えば、アミノペプチダーゼＭを蒸留水に約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解させたもの５μｌ）を加えて更に３７℃で１時間程度、遮光下でインキュベートした後、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりアミノペプチダーゼ反応を停止させ、反応液を適当に希釈したものの蛍光度を励起波長３５０〜３７５ｎｍの間、蛍光波長４４０〜４７０ｎｍの間で測定する。励起波長および蛍光波長は、用いる蛍光基によって適宜選択する。上記の反応条件でビールのプロテアーゼＡ活性を測定する場合には、反応混合物を約７倍に希釈すれば蛍光分析機による測定に都合がよい。
【００２６】
蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の別の例として、一般式（IV）の基質のＮ末端に蛍光基、例えば(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を、そしてＣ末端に該蛍光基の蛍光を抑制するためのジニトロフェニル(Dnp)含有基、例えば-Lys(Dnp)-NH2を導入して、前記一般式（VI）で表されるノナペプチド誘導体として使用する。例えば、Ｎ末端にMOCAc基を付加させ、Ｃ末端に-Lys(Dnp)-NH2基を付加させた一般式
MOCAc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−Lys(Dnp)-NH2 (VII）
（式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル基を表し、A3、A4、A5、A6はそれぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸を表す。）で表されるノナペプチド誘導体を基質として用いる。蛍光基としては、アントラニロイルベンジル(ABz)基等を用いてもよい。−Lys(Dnp)-NH2部分は、リジン以外にもジニトロフェニル置換基を持つ適当なアミノ酸を用いることができる。該リジンをアミド化したのは、カルボキシペプチダーゼによる非特異的切断から保護するためであり、他の適当な保護基を同様に用いることも可能である。これらの基を一般式（IV）のオクタペプチドに付加させる方法は、例えば、前記の日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２７】
上記一般式(VI）のノナペプチド誘導体を基質として用いた場合においても、プロテイナーゼＡはPhe −Phe の間を加水分解するわけであるが、本蛍光法においては上記の蛍光法の場合と異なって、生じた分解産物より蛍光基を遊離させるためのアミノペプチダーゼＭ等の蛋白分解酵素の使用を必要としない。即ち、本蛍光法では、基質の蛍光基は分解前にはジニトロフェニルの存在により抑制されており、この基質のPhe −Phe の間が加水分解されると蛍光値が約２００倍上昇して検出可能になる。したがって、反応が１工程であるため簡便且つ迅速である。例えばビール中のプロテアーゼＡ活性の測定を約２時間で行うことが可能である。
【００２８】
本蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定の実施方法を、一般式(VII）で表されるノナペプチド誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次のとおりである。前記同様にしてプロテイナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量を、一般式(VII）で表される基質と、プロテイナーゼＡの作用温度で反応させる。次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりプロテイナーゼＡの反応を停止させた後に、反応液を適当に希釈したものの蛍光度を励起波長３１０〜３５０ｎｍの間（蛍光基がMOCAcの場合は３２８ｎｍが好ましい）、蛍光波長３７０〜４１０ｎｍの間（蛍光基がMOCAcの場合は３９３ｎｍが好ましい）で測定する。励起波長および蛍光波長は、用いる蛍光基によって適宜選択する。上記の反応条件の場合には、反応混合物を約７倍に希釈すれば蛍光分析機による測定に都合がよい。
【００２９】
上記いずれの基質を用いる測定方法においても、既知濃度の市販酵素（シグマ社製、米国）について測定した検量線からサンプル中のプロテイナーゼＡ濃度を測定することができる。本発明の好ましい態様では、検出限界は０．０３ｎｇ／ｍｌ以下である。ただし、このプロテイナーゼＡの量は、その１ｍｇが１５単位（ユニット）の活性を示すとして計算したものである。１ユニットは、インシュリンのβ鎖（分子量３，３５３）を基質とした場合に、ｐＨ６．０、２５℃で１分間に１μｍｏｌの基質を加水分解する酵素活性である。従って、１．５×１０-5ユニットの酵素活性が１ｎｇのプロテイナーゼＡに相当する。
【００３０】
また、プロテイナーゼＡ活性をより簡便に測定するためには、
(a) プロテイナーゼＡの特異的基質である、一般式（II）または（III）で表されるオクタペプチド誘導体あるいは一般式(VI)で表されるノナペプチド誘導体
(b) プロテイナーゼＡの精製標品（例えば、米国シグマ社製のもの）
(c) 反応用緩衝液〔例えば、マックルバイン（McIlvaine ）緩衝液〕
を含むプロテイナーゼＡ活性測定用キットを利用すればよい。
【００３１】
【実施例】
次いで、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１．オクタペプチド誘導体の合成
表１に示すオクタペプチド誘導体は全て米国アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製のモデル４３２Ａシナジー（Model 432A SYNERGY）型ペプチドシンセサイザーを用いて固相法により合成した。ニトロ基（ＮＯ2 ）の導入は、日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載の方法により、行った。
【００３３】
これとは別に、Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Suc はスクシニル基を表し、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）を、Ｃ末端を７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）で保護したアミノ酸から出発して液相法により合成した。MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 (式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル基を、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。) も同様にして合成した。合成されたペプチドは全てＨＰＬＣ的に純粋であった。
【００３４】
ＨＰＬＣの条件は、溶離液は１０ｍＭのリン酸カリウム溶液と５０ｍＭの硫酸二ナトリウムを等量混合した溶液に２０容量％から６０容量％のアセトニトリルの濃度勾配（２５分）をつけたもので、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２ ＯＤＳカラム（内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、米国ＹＭＣ社製）を用い、２１０ｎｍで検出し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．であった。
【００３５】
この測定条件下において、例えば上記Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の保持時間（ retention time ）は１８分前後であった。
【００３６】
実施例２．プロテイナーゼＡに対する親和性の測定（吸光法）
実施例１で合成した種々のオクタペプチド誘導体を基質とした場合の市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米国）活性を吸光法により測定した。
【００３７】
すなわち、市販プロテイナーゼＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、蒸留水中）１μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ４．３のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、基質の１ｍＭ水溶液５０μｌ及び蒸留水１９９μｌで全量５００μｌの反応液を作成し、３７℃で１０秒〜２０分間反応させ、３００ｎｍにおける吸光度の減少により酵素活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
実施例３．蛍光法によるビール中のプロテイナーゼＡ活性の測定
ビール液４０μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、実施例１で合成したSuc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を作成し、３７℃で３時間反応させた。
【００４０】
次いで、８０℃−５分の熱処理によりプロテイナーゼＡ反応を停止させた後に、ｐＨ８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液２００μｌとアミノペプチダーゼＭ溶液〔ピアース ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）製のアミノペプチダーゼを蒸留水に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度、溶解させたもの〕５μｌを加えて更に３７℃で１時間インキュベートした後、７倍に希釈したものの蛍光度を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定した。既知濃度の市販酵素について測定した検量線からビール中のプロテイナーゼＡ含量を測定した。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
実施例４．蛍光法によるビール中のプロテイナーゼＡ活性の測定（２）
市販プロテイナーゼＡを０．１〜０．８ｎｇ／ｍｌ添加したビール液４０μl、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン(McIlvaine)緩衝液２５０μl 、実施例１で合成したMOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を作成し、３７℃で１時間反応させ、７５℃で５分の熱処理後、４℃で１０，０００ｒｐｍ、１分の遠心で得た上清の蛍光度を励起波長３２８ｎｍ、蛍光波長３９３ｎｍで測定した。表３に示すようにプロテイナーゼＡ含量と蛍光度は良く相関した。
【００４３】
【表３】
実施例５．ビール中のプロテイナーゼＡ活性と泡安定性との相関
ビールに市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米国）を適当量添加し、３０℃にて２０日間保存した後の泡持ち度を測定し、プロテイナーゼＡ含量と泡安定性との相関を調べたところ、表４及び図１に示すような相関性が得られた。プロテイナーゼＡ含量は実施例３と同様にして測定し、泡持ち度は以下のようにして測定した。
【００４５】
参考例１ 泡持ち度測定法（ＳＨＶ− Schaumhaftvermogen −法）
ビールの泡持ち度を泡の立ち具合とガラス面への泡の付着性を測定することにより評価する。すなわち、ビール全量を一度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込み、注ぎ込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着して残っている泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡持ち度を定量的に評価する。この際、泡持ち度の単位は平方センチメーターで表す〔化学と生物、ｐ１３５４、（１９７５）参照〕。
【００４６】
【表４】
【発明の効果】
本発明は、前記一般式（IV）で表されるペプチドからなるプロテイナーゼＡの基質を提供する。これを前記一般式（III）で表されるオクタペプチド誘導体あるいは前記一般式(VI)で表されるノナペプチド誘導体を基質とする本発明のプロテイナーゼＡ活性の測定方法によれば、該酵素濃度の検出感度が、前記Yokozawaらによるレニン活性測定用の基質を用いる従来の方法と比べて数十倍向上するので、例えばビール中におけるような微量のプロテイナーゼＡの定量が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビール中のプロテイナーゼＡ含量と泡安定性との相関を示すグラフである。
Claims (7)
- 一般式：
Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu
で表されるペプチドを基本骨格とする、プロテイナーゼA活性測定用の基質。 - 一般式：
Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu
で表されるペプチドを基本骨格とし、プロテイナーゼAによって該ペプチドの -Phe-Phe- 間が切断されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるための修飾基を付与されている、プロテイナーゼA活性測定用の基質。 - 一般式
Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-(NO2)Phe-Arg-Leu
または
PG-Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu-FLG
または
Suc-Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu-MCA
〔式中、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表し、PGはアミノ基の保護基を表し、FLGは蛍光基を表し、Suc はスクシニル基を表し、そしてMCAは4-メチルクマリル-7-アミドを表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体
あるいは
fg-Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
または
fg-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を表し、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表されるノナペプチド誘導体
からなる、請求項2の基質。 - 下記の (a) 、 (b) または (c) の基質：
(a) 一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu
〔式中、A3-A4-A5-A6はAla-Pro-Ala-Lys、又はAla-Leu-Asp-Alaを表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とする、プロテイナーゼA活性測定用の基質；
(b) 一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu
〔式中、A3-A4-A5-A6はAla-Pro-Ala-Lys、又はAla-Leu-Asp-Alaを表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロテイナーゼAによって該ペプチドの -Phe-Phe- 間が切断されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるための修飾基を付与されている、プロテイナーゼA活性測定用の基質；
(c) 一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-(NO2)Phe-Arg-Leu
または
PG-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-FLG
または
Suc-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-MCA
〔式中、A3-A4-A5-A6は前記(b)に定義した通りであり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表し、PGはアミノ基の保護基を表し、FLGは蛍光基を表し、Sucはスクシニル基を表し、そしてMCAは4-メチルクマリル-7-アミドを表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体
あるいは
fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を表し、A3-A4-A5-A6は前記(b)に定義した通りであり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表されるノナペプチド誘導体
からなる、前記(b)の基質；
を用いることを特徴とする、試料中のプロテイナーゼA活性の測定方法。 - 試料がビールであり、ビール中のプロテイナーゼA活性の値から、ビールの泡安定性を求めることを特徴とし、前記ビールの泡安定性を評価する際にビールの泡の立ち具合とビールの泡のガラス面への付着性とを評価することを含む、請求項4の測定方法。
- 下記の (a) 、 (b) または (c) の基質：
(a)一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu
〔式中、A3-A4-A5-A6 はAla-Pro-Ala-Lys、又はAla-Leu-Asp-Alaを表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とする、プロテイナーゼA活性測定用の基質；
(b)一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu
〔式中、A3-A4-A5-A6はAla-Pro-Ala-Lys、又はAla-Leu-Asp-Alaを表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロテイナーゼAによって該ペプチドの -Phe-Phe- 間が切断されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるための修飾基を付与されている、プロテイナーゼA活性測定用の基質；
(c)一般式
A3-A4-A5-A6-Phe-(NO2)Phe-Arg-Leu
または
PG-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-FLG
または
Suc-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-MCA
〔式中、A3-A4-A5-A6は前記(b)に定義した通りであり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表し、PGはアミノ基の保護基を表し、FLGは蛍光基を表し、Sucはスクシニル基を表し、そしてMCAは4-メチルクマリル-7-アミドを表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体
あるいは
fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を表し、A3-A4-A5-A6は前記(b)に定義した通りであり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表されるノナペプチド誘導体
からなる、前記(b)の基質；
を用いることを特徴とする、プロテイナーゼA活性測定キット。 - 一般式：
Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu
で表されるオクタペプチド。
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| JP15479795A JP4043535B2 (ja) | 1994-06-21 | 1995-06-21 | ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法 |
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