NO142074B - Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser - Google Patents

Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser Download PDF

Info

Publication number
NO142074B
NO142074B NO753945A NO753945A NO142074B NO 142074 B NO142074 B NO 142074B NO 753945 A NO753945 A NO 753945A NO 753945 A NO753945 A NO 753945A NO 142074 B NO142074 B NO 142074B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
ileu
glu
gly
arg
pna
Prior art date
Application number
NO753945A
Other languages
English (en)
Other versions
NO142074C (no
NO753945L (no
Inventor
Leif Erik Aurell
Karl Goeran Claeson
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of NO753945L publication Critical patent/NO753945L/no
Publication of NO142074B publication Critical patent/NO142074B/no
Publication of NO142074C publication Critical patent/NO142074C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/28—Bound to a nonpeptide drug, nonpeptide label, nonpeptide carrier, or a nonpeptide resin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser. De nye substrater er spesielt skikket for bestemmelse av faktor Xa (E.C. 3. 4. 21. 6) eller for studium av reaksjoner i hvilke Xa dannes, inhiberes eller forbrukes, eller også for bestemmelse av faktorer som påvirker eller deltar i så-danne reaksjoner.
Faktor X er en nokkelsubstans i den sekvens av reaksjoner som leder til blodets koagulering. Aktivering av faktor X er opphav til det proteolytiske enzym, faktor Xa, som er direkte an-svarlig for protrombinets overforing til trombin. En enkel be-stemmelsesmetode for koaguleringsfakt or Xa ville være av stor diagnostisk verdi.
Hittil anvendte reagenser for bestemmelse av faktor Xa har vanligvis bestått av estersubstrat med særlig uspesifikk ka-rakter. Et av disse er f.eks. p-nitrofenyl-p'-guanidinobenzoat (p-NPGB) som også er et godt substrat for trombin, trypsin og plasmin. Dets anvendelse for faktor Xa er begrenset til rensede enzymtilberedninger.
Med blod erholdes ubrukbart resultat på grunn av nær-vær av andre esteraser med aktivitet for p-NPGB (R.L. Smith, J. Biol. Chem. 248, 2418 (1972).
Meget gode kromogene amidsubstrater for trombinlignende enzymer er beskrevet i svensk patent nr. 380 257. Ét av disse som har formelen Benzoyl-Rhe-Va1-Arg-p-nitroanilid (S-2160) fungerer utmerket for trombin, mens faktor Xa derimot spalter substratet ubetydelig. For å være anvendbart ved diagnostiske blodanalyser bor et substrat for faktor Xa bare i ubetydelig grad kunne påvirkes av trombin.
Onskelig for faktor Xa ville være et substrat som bare spaltes ubetydelig av trombin. Substratet.bor måle enzymets biologiske funksjon, nemlig å spalte amidbindinger. Dessuten ønskes en hurtig spaltning av substratet til målbare produkter, f.eks. kromofore forbindelser som lett kan følges spektrofotometrisk.
De nye kromogene enzymsubstrater ifølge oppfinnelsen er av amidtype med høy følsomhet for faktor Xa og er kjennetegnet ved følgende generelle formel:
eller salter derav, hvor er hydrogen eller benzoyl, R, er nitrofenyl, A^ er en enkeltbinding eller en av aminosyrene Gly, Val, Leu, Ileu, Phe eller Tyr, og A2 er Glu, Gin, Asp eller Asn.
De nye substrater kan fremstilles ved hjelp av i prinsippet to forskjellige metoder. 1. Den ene metode er basert på at den kromofore gruppe R2 kobles til argininet og at den onskede peptidstruktur derefter bygges opp ved suksessiv påkobling av ovrige aminosyrer. Den kromofore gruppe gjor derved tjeneste som beskyttelsesgruppe for den C-terminale carboxylgruppe i den forste aminosyre. 2. Den annen metode er basert på oppbygning av on-sket peptidstruktur, og forst derefter avspaltes anvendte beskyttelsesgrupper og påkobles den kromofore gruppe R^.
Ved den ifolge begge disse metoder anvendte
oppbygning av peptidstrukturen kan hensiktsmessig renselse gjen-nomføres ved hjelp av gelfiltrering efter hver påkobling av en ny aminosyre.
Ved oppbygningen av peptidderivatene anvendes vanlige, innen peptidkjemien kjente og anvendte kob-lingsmetoder. Som a-aminobeskyttelsesgrupper kan benyttes de vanlige, innen peptidkjemien kjente beskyttelsesgrupper, som f.eks. Cbo (carbobenzoxy), MeOCbo (p-methoxycarbobenzoxy), NOgCbo
(p-nitrocarbobenzoxy), MCbo (p-methoxyfenylazo-carbobenzoxy), BOC (tert-butyloxycarbonyl), TFA (trifluoracetyl) eller formyl. a-carboxylgruppen kan aktiveres ved at den overfores til forskjellige aktiverte, innen peptidkjemien kjente og ofte anvendte deri-vater, som enten kan isoleres eller genereres in situ, som f.eks. p-nitrofenylester, triklorfenylester, penta-klorfenylester, N-hy-droxysuccinimidester, syreazid, syreanhydrid, som enten kan være symmetrisk eller usymmetrisk, eller også kan aktiveres med et car-bodiimid som N,N'-dicyclohexylcarbodiimid. Den C-terminale carboxylgruppe i aminopeptidderivatet eller aminosyrederivatet kan beskyttes ved at den forestres til f.eks. methyl-, ethyl- eller iso-propylester eller ved at den overfores til det kromofore anilin-derivat som således fungerer som beskyttelsesgruppe under oppbygningen av peptidkjeden. I reaksjonen kan frie funksjonelle grup-per som ikke deltar ved oppbygningen av peptidene eller peptidderivatene beskyttes på fblgende måte: For beskyttelse av arginylrestens <£-guanidogruppe anvendes vanlige, innen peptidkjemien brukte aminovernegrupper, som f.eks. protonisering, NGv, eller Tos (p-toluensulfonyl) . Som vern for carboxylgruppen i glutaminsyre og asparaginsyre anvendes vanlige innen peptidkjemien brukte vernegrupper som f.eks. benzyl og tert. butylvernegrupper.
Oppfinnelsen vil bli beskrevet mer detaljert i de fblgende, ikke begrensende, utforelseseksempjer: ama viser fremstil-ling av forskjellige substrater ifolge oppfinnelsen ved trinnvis syntese.
Ved den tynnskiktkromatografiske analyse av eluat og produkter anvendes glassplater med kiselgel F254 (Merck) soin aD~ sorpsjonsmiddel. Anvendte opplosningsmiddelsystem er betegnet som angitt i den fblgende tabell.
Efter tynnskiktskromatograferingen ble platene forst studert i UV-lys (254 nm), og derefter ble anvendt klor/toluidin-reaksjonen (litt: G. Pataki: Diinnschichtchromatografie in der Aminosa'ure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co. Berlin, 1966, side 125) som fremkallingsmetode.
De nedenfor anvendte forkortelser har fblgende betyd-ning:
Aminosyrer:
Forkortelsene angår aminosyreester. Den frie aminosyre eller peptidene angis av H- ved aminogruppen og -OH ved carboxylgruppen. Aminogruppen angis alltid til venstre, og carboxylgruppen til hbyre.
Alle aminosyrer i forbindelsene har L-konfigurasjon om ikke annet er angitt.
Ileu = Isoleucin
Arg = Arginin Leu = Leucin
Asn = Asparagin
Asp = Asparaginsyre Phe = Fenylalanin
Gin = Glutamin
Glu = Glutaminsyre Tyr = Tyrosin
Gly = Glycin Val = Valin
Ovrige forkortelser:
Ac = Acetyl MCbo = p-methoxyfenylazo- carbobenzoxy Ac20 = Eddiksyreanhydrid MeOH = Methanol AcOH = Eddiksyre OtBU = tert.-butyloxy
BOC = tert-butyloxycarbonyl OET = Ethyloxy
Bz = Benzpyl OMe <=> Methyloxy
Bz1 = Benzyl OpNP = p-nitrofenoxy
Bz,,0 = Benzoesyreanhydrid OisoPr = iso-propyloxy
Cbo = Carbobenzoxy pNA <=> p-nitroanilid
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid TFA = Trifluoracetyl
DMF = Dimethylformamid Tos = p-toluensulfonyl Et„N = Triethylamin
Eksempel _ L HC3 • B -Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA
Ia Cbo-Gly-Arg-(N02)-pNA (m.v. 530.4)
5,0 g (10,6 mmol) Cbo-Arg(N02)-pNA opploses i 21 ml AcOH og 22 ml 4N HBr i AcOH under fuktighetsfrie betingelser. Re-aksjons oppløsningen omrores ved romtemperatur en time og helles derefter langsomt i 200 ml torr ether under kraftig omroring. Etherfasen skilles derefter fra erholdt utfeldning som vaskes ytterligere to ganger med lOO ml ether. Efter torkning i vakuum over P205 og KOH-perler ved 30°C erholdes HBr-saltet av aminosyrederivatet i praktisk talt kvantitativt utbytte (4,95 g). Produktet er enhetlig ved TLC i A.
Det ovenfor erholdte produkt opploses i 50 ml destillert DMF. Opplosningen kjoles til -10°C, og så meget Et^N tildryppes at opplosningen nøytraliseres (2,1 ml). Utfeldt Et^N-HBr filtre-res fra, og filtratet kjoles pånytt til -10°C. 3,9 g (11,8 mmol) Cbo-Gly-OpNP tilsettes, og opplosningen får langsomt anta romtemperatur. Efter ca. 3 timer kjoles reaksjonsopplosningen pånytt . til -10°C og pufres med O,54 g (5,3 mmol) Et^N. Denne prosedyre gjentaes efter ytterligere 2-3 timer. Efter reaksjon over natten inndampes opplosningen til tregtflytende olje x vakuum ved 40°C. Resten slemmes i og omrSres med tre porsjoner destillert vann. Vannet dekanteres fra, og resterende olje opploses i MeOH, hvorfra produktet erholdes i krystallinsk form.
Utbytte: 4,2 g (75 %) av Ia.
TLC i P1 (Rf = 0,16) viser bare en flekk.
[a]p<4> - 36° (C 0,5, MeOH).
Ib t-Boc-Glu(y-OB l)-Gly-Arg(NO„)-pNA (m.v. 715.8)
2,65 g (5,0 mmol) Ia decarbobenzoxyleres og kobles med 2,50 g (5,5 mmol) t-Boc-Glu(y-OBzl)-OpNP ifolge beskrivelsen under Ib. Råproduktet renses ved kromatografering på en kolonne med SEPHADEX ® LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmedium.
Utbytte: 3,25 g (91 %) av Ib.
TLC i P1 (Rf = 0,22) viser bare en flekk.
OA.
[a]p - 34° (C 1,0, MeOH).
Ic Cbo-Ileu-Glu(x-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA (m.v. 862.9)
1,08 g (1,5 mmol) Ib opploses i 10 ml TFA. Reaksjonsopplosningen omrores 45 minutter ved romtemperatur og helles derefter langsomt i 75 ml torr ether under kraftig omroring. Erholdt utfeldning skilles fra etherfasen og vaskes ytterligere to ganger med 50 ml ether. Efter tbrkning i vakuum over P2°5 °9 KOH-perler ved 30°C erholdes TFA-saltet av tripeptidderivatet i praktisk talt kvantitativt utbytte (1,08 g). Produktet er enhetlig ved TLC i A.
Det ovenfor erholdte produkt opploses i 20 ml DMF, kjoles til -10°C samt nøytraliseres med EtgN (0,23 ml). 0,65 g (1,68 mmol) Cbo-Ileu-OpNP tilsettes, og opplosningen får langsomt anta romtemperatur. Efter ca. 3 timer kjoles reaksjonsopplosningen pånytt til -10°C og bufres med O,12 ml Et^N. Denne prosedyre gjentaes efter ytterligere 2-3 timer. Efterreaksjon finner sted over natten. For å omsette overskuddet av Cbo-Ileu-OpNP og derved unngå at det bnskede tetrapeptidderivat ved den efterfol-gende kromatografiske rensning forurenses av den aktive ester, tilsettes nu ca. lOO mg (ca. 1,4 mmol) n-butylamin til opplosningen. Efter ca. 30 minutter inndampes opplosningen til tregtflytende olje i vakuum ved 40°C. Resten slemmes i og omrores med tre porsjoner destillert vann. Efter dekantering av vannet opploses oljen i MeOH og renses på en kolonne med SEPHADEX ®LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmiddel.
Utbytte: 1,07 g (83 %).
TLC i P^ (Rf = O,35) viser bare en flekk.
[a]p<4> - 32° (C O,3), MeOH:DMF 95:5).
Id Bz-Ileu-Glu(y-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA (m.v. 832 g)
260 mg (0,30 mmol) Id decarbobenzoxyleres ifolge beskri-velse under Ib. Erholdt produkt viser ved TLC i A to flekker (R^= 0,45 resp. 0,60) og ifolge IR er produktet en blanding av HBr-H-Ileu-Glu(y-OH)-Gly-Arg(N02)-pNA og HBr•H-Ileu-Glu(y-0B21)-Gly-Arg(N02)-pNA. Den således erholdte blanding fra ovennevnte kobles som under Ia med 800 mg (0,35 mmol) benzoesyreanhydrid. Råproduktet renses ved krotnatografering på en kolonne med SEPHADEX® LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmiddel. Derved
isoleres to fraksjoner a: 130 mg [a]^4 - 15 (C 0.5, CHgCN) og
Rf = 0,20 i P1 samt
8: 105 mg [a]^<4> 11 (C 0.5, CH3CN) og
Rf = 0,06 i P .
IR viser produktene Bz~Ileu-Glu(y-OBz1)-Gly-Arg (N02)-pNA og Bz~ Ileu-Glu-Gly-Arg(N02)-pNA. Ved reaksjon med HF (se le) gir begge produkter samme sluttprodukt (le).
Ie HCl-Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA (m.v. 734.3)
lOO mg (0,12 mmol) Id fraksjon a plaseres i et reaksjons-ror til et sakakibara-apparat og forsynt med 0,5 ml anisol. Roret tilknyttes apparatet, og efter evakuering kondenseres ca. 5 ml tort hydrogenfluorid i roret. Efter 75 minutters reaksjon ved 0°C under omroring ajdestilleres hydrogenfluoridet i vakuum. Den olje-aktige rest opploses i IO ml 33 % AcOH i vann og renses ved kromatografering pa en kolonne med SEPHADEX -15 i 33 % AcOH i vann og med samme opplosningsmiddel som elueringsmedium. Det således erholdte, ved TLC enhetlige utskilte tetrapeptidderivat isoleres ved frysetorkning. Substansen opploses siden i MeOH:destillert vann 95:5 og kromatograferes på en svakt basisk anionbytter QAE-SEPHADEX^A-25 i kloridform i MeOH:vann 95:5 og med samme opplosningsmiddel som elueringsmedium. Eluatet frysetorkes fra vann efter at MeOH er avdrevet ved 30°C i vakuum.
Utbytte: 75 mg (85 7c).
TLC i A (Rf = O,48) viser bare en flekk.
[a]p 04. - 40 (C 0.-5, 50 % AcOH i destillert vann).
Aminosyreanalyse: Ileu: 0,98; Glu: 0,95; Arg: 0,98; Gly: 1,00.
Eksempel II 2HC1- Ileu- Glu- Gly- Arg- pNA
Ila 2HCl- H- Ileu- Glu- Gly- Arg- pNA ( m. v. 666. 6)
lOO mg (O,116 mmol) Ic reageres med hydrogenfluorid samt renses og ionebyttes ifolge beskrivelsen under Ie.
Utbytte: 56 mg (73 %).
TLC i A (Rf = 0,34) viser bare en flekk.
04
[ajp - (C 0.5, 50 % AcOH i destillert vann).
Aminosyreanalyse: Ileu: 0,96; Glu: 0,94; Arg: 0,96; Gly: 1,00.
De ifolge eksemplene fremstiHede substrater anvendes for bestemmelse av faktor Xa i henhold til det folgende.
Prinsippet for bestemmelse er basert på at det ved enzy-matisk hydrolyse dannede spaltningsprodukt utviser et fra substratet helt skilt UV-spektrum. således har substratet ifolge eksempel I H-Ileu-Glu-Gly-Art-pNA-HCl et absorpsjonsmaksimum ved 315 nm med <3en molare ekstinksjonskoeffisient 12000. Ved 405 nm <ar sub-stratets absorpsjon nesten opphort. p-nitroanilin (pNA), som dannes av substratet under den enzymatiske hydrolyse har et absorpsjonsmaksimum ved 380 nm med en molar ekstinksjonskoeffisient 13200, som ved 405 nm bare har avtatt til 9620.
Ved å måle spektrofotometrisk ved 405 nm kan man derfor lett folge graden av den enzymatiske hydrolyse som er proporsjonal med mengden dannet p-nitroanilin. Det tilstedeværende substrat-overskudd forstyrrer ikke målingen ved denne bolgelengde. For ovrige substrat ifolge oppfinnelsen råder nærmest identiske forhold, hvorfor de spektrofotometriske målinger gjennomgående er gjort ved 405 nm.
Tabell 1 viser en relativ sammenligning av reaksjonshas-tigheter mellom det tidligere nevnte substrat S-2160 og substrat I ifolge oppfinnelsen for forskjellige enzymer av typen serinproteaser (E.C. 3. 4. 21). Reaksjonshastighetene er bestemt ifolge ovenfor beskrevne metode.
Av denne tabell fremgår at faktor Xa spalter substrat I lOO ganger bedre enn S-2160, men derimot påvirkes I ytterst ubetydelig av trombin sammenlignet med S-2160. Det fremgår således at I i denne sammenligning er det klart overlegne substrat overfor Xa. Dessuten fremgår av tabellen at I med fordel også kan anvendes som trypsinsubstrat. Da trypsin normalt ikke forekommer i blod, er den gode trypsineffekt derimot ikke hindrende for en blod-bestemmelse av faktor Xa.

Claims (1)

  1. Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser, spesielt tilpasset for diagnostisk bestemmelse av faktor Xa, karakterisert ved den generelle formel:
    eller salter derav, hvor er hydrogen eller benzoyl,
    R2 er nitrofenyl, A^ er en enkeltbinding eller en av aminosyrene Gly, Val, Leu, Ileu, Phe eller Tyr, og A2 er Glu, Gin, Asp eller Asn.
NO753945A 1974-12-05 1975-11-24 Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser NO142074C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7415229A SE407058B (sv) 1974-12-05 1974-12-05 Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO753945L NO753945L (no) 1976-06-09
NO142074B true NO142074B (no) 1980-03-17
NO142074C NO142074C (no) 1980-06-25

Family

ID=20322900

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO753945A NO142074C (no) 1974-12-05 1975-11-24 Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser

Country Status (23)

Country Link
US (2) US4028318A (no)
JP (1) JPS5431397B2 (no)
AT (1) AT351565B (no)
BE (1) BE836085A (no)
CA (1) CA1048998A (no)
CH (1) CH619983A5 (no)
CS (1) CS187492B2 (no)
DD (1) DD123316A5 (no)
DE (1) DE2552570C3 (no)
DK (1) DK145461C (no)
ES (1) ES442997A1 (no)
FI (1) FI753246A (no)
FR (1) FR2293439A1 (no)
GB (1) GB1488987A (no)
HU (1) HU174263B (no)
IL (1) IL48506A (no)
IT (1) IT1052318B (no)
NL (1) NL188648C (no)
NO (1) NO142074C (no)
PL (1) PL99020B1 (no)
SE (1) SE407058B (no)
SU (1) SU957762A3 (no)
ZA (1) ZA757441B (no)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4176009A (en) * 1976-01-24 1979-11-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of measuring collagenase activity
SE431201B (sv) * 1976-01-24 1984-01-23 Ajinomoto Kk For anvendning vid metning av kollagenasaktivitet avsett peptidderivat jemte forfarande for nemnda metning
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
SE437153B (sv) * 1976-12-01 1985-02-11 Kabi Ab Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4191809A (en) * 1977-02-26 1980-03-04 Ajinomoto Co., Inc. Method of measuring enzymatic activity using novel peptide derivatives
JPS5415797A (en) * 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
CA1087075A (en) * 1977-08-05 1980-10-07 Robert J. Gargiulo Composition and method for determining transferase and protease activity
US4438029A (en) 1978-01-19 1984-03-20 Research Corporation Synthetic peptides
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
JPS59499B2 (ja) * 1978-11-02 1984-01-07 味の素株式会社 ペプチド誘導体
FR2455083A1 (fr) * 1979-04-24 1980-11-21 Jozefonvicz Marcel Nouveau procede de dosage des proteases et des antiproteases et notamment des proteases et antiproteases des systemes de la coagulation et du complement
DE2921216A1 (de) * 1979-05-25 1980-12-04 Teschemacher Hansjoerg Pharmakologisch aktive peptide
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
US4244865A (en) * 1979-12-03 1981-01-13 Abbott Laboratories α hydroxy tripeptide substrates
CA1161432A (en) * 1980-02-12 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
US4301245A (en) * 1980-05-29 1981-11-17 Dynasciences Corporation Chromogenic method of detecting endotoxins in blood
WO1982000641A1 (en) * 1980-08-25 1982-03-04 Ab Kabivitrum Peptide substrates for determination of protease activity
JPS5753445A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide compound
JPS5753446A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide derivative
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4406832A (en) * 1981-09-03 1983-09-27 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
EP0078764B1 (de) * 1981-11-02 1986-01-02 Pentapharm A.G. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Blutgerinnungsfaktor XII in Humanplasma
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
CA1247086A (en) * 1982-02-17 1988-12-20 Francis R. Pfeiffer Renally active tetrapeptides
DE3211254A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3312191A1 (de) * 1983-04-02 1984-10-11 Karl Mengele & Söhne Maschinenfabrik und Eisengießerei GmbH & Co, 8870 Günzburg Schutzvorrichtung fuer mechanische schraenke und dergleichen geraete bzw. maschinen
FR2546164B1 (fr) * 1983-05-16 1987-07-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de peptides, leur preparation et leur application comme inhibiteurs de l'elastase
DE3446714A1 (de) * 1984-12-21 1986-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
US6297024B1 (en) 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
US6235494B1 (en) 1999-02-08 2001-05-22 The Scripps Research Institute Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates
GB2492104A (en) * 2011-06-22 2012-12-26 Job Harenberg Assay for direct thrombin inhibitors
CN108089006B (zh) * 2016-11-23 2020-09-25 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 凝血因子ⅹ激活剂活性标定的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1042487A (en) * 1964-06-25 1966-09-14 Ici Ltd Polypeptide derivatives
US3778426A (en) * 1970-12-16 1973-12-11 Research Corp Therapeutically useful polypeptides
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Also Published As

Publication number Publication date
NL188648C (nl) 1992-08-17
FR2293439A1 (fr) 1976-07-02
NO142074C (no) 1980-06-25
CS187492B2 (en) 1979-01-31
CA1048998A (en) 1979-02-20
US4028318A (en) 1977-06-07
FR2293439B1 (no) 1979-07-13
ATA900775A (de) 1978-03-15
GB1488987A (en) 1977-10-19
IL48506A0 (en) 1976-01-30
IT1052318B (it) 1981-06-20
DE2552570C3 (de) 1983-11-17
FI753246A (no) 1976-06-06
DK549475A (da) 1976-06-06
AT351565B (de) 1979-08-10
CH619983A5 (no) 1980-10-31
NO753945L (no) 1976-06-09
HU174263B (hu) 1979-12-28
SU957762A3 (ru) 1982-09-07
PL99020B1 (pl) 1978-06-30
JPS5431397B2 (no) 1979-10-06
US4252715A (en) 1981-02-24
IL48506A (en) 1979-05-31
AU8687275A (en) 1977-06-02
ES442997A1 (es) 1977-04-16
NL7513505A (nl) 1976-06-09
JPS5183595A (no) 1976-07-22
DD123316A5 (no) 1976-12-12
DK145461C (da) 1983-04-18
SE407058B (sv) 1979-03-12
DE2552570A1 (de) 1976-06-10
DE2552570B2 (de) 1980-01-10
DK145461B (da) 1982-11-22
NL188648B (nl) 1992-03-16
SE7415229L (sv) 1976-06-06
BE836085A (fr) 1976-03-16
ZA757441B (en) 1976-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO142074B (no) Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
US4440678A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
CA1136124A (en) Easily split substrates for the quantification of proteases
FI56828C (fi) Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
US4457866A (en) Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates
NO142812B (no) Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater
JPH0616719B2 (ja) 酵素の検出および測定用色原体基質
NO156067B (no) Substrat for bestemmelse av plasminogenaktivatorer.
EP0076042A1 (en) Novel substrates for measuring thrombin
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
Dunn et al. Inhibition of pepsin by zymogen activation fragments. Spectrum of peptides released from pepsinogen NH2 terminus and solid phase synthesis of two inhibitory peptide sequences.
CA1068261A (en) Chromogenic thrombin substrates
US4162941A (en) Method for determining a proteolytic enzyme
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
EP0167980B1 (en) Novel substrates for use in measuring the concentration of kallikrein in urine
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
JPS62126197A (ja) 新規な血漿キニノゲナーゼ測定用化合物
JPH0867694A (ja) ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法
EP0513863B1 (en) Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates
JPH0776232B2 (ja) ペプチド誘導体及びその使用方法
JPH0244518B2 (ja) Tanpakubunkaikosooteiryobunsekisuruhoho