DE2552570C3 - Tri- und Tetrapeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Serinproteasen - Google Patents

Tri- und Tetrapeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Serinproteasen

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Description

R1 Wasserstoff, Alkanoyl mit 1-12 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl
A2 Asp, Asu, GIu oder GIn und
R2 eine spektrophotometrisch bestimmbare Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl- oder Methoxynaphthylgruppe
sowie deren Additionssalze mit Säuren, wobei |D die Aminosäurereste L-Konfiguration aufweisen
2. Tetrapeptide der allgemeinen Formel
R1— A1 —A2—Gly-Arg-NH-R2 (II)
in der A1 GIy, VaI, Leu, He, Pro, Phe oder Tyr bedeutet und die Reste R1, A2 und R2 die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.
3. Verwendung der Tri- und Tetrapeptide nach Anspruch 1 und 2 zur Bestimmung von Serinproteasen.
30
35
Die Erfindung betrifft Tripeptide der allgemeinen Formel
R1—A2—Gly-Arg-NH-R2
sowie Tetrapeptide der allgemeinen Formel
- R1 —A1 — A2—Gly-Arg-NH-R2
mit den in den Ansprüchen angegebenen Bedeutungen sowie deren Verwendung zur Bestimmung von Serinproteasen.
Die Tri- bzw. Tetrapeptide der Erfindung sind insbes. für die Bestimmung des Faktors Xa (E. C 3.4.21.6) oder für die Untersuchung von Reaktionen, die die Bildung, Inhibierung oder Verbrauch von Xa verursachen, oder selbst für die Bestimmung solcher Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an ihnen teilnehmen, geeignet
Der Faktor X ist eine Schlüsselsubstanz in der Reaktionsreihe, die zur Blutkoagulation führt Die Aktivierung des Faktors X bewirkt die Bildung des proteolytischen Enzyms, des Faktors Xa, welches direkt für die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin verantwortlich ist. Für Diagnosen wäre es besonders wertvoll, wenn ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa zur Verfügung stünde.
Die bisher verwendeten Reagenzien zur Bestimmung des Faktors Xa bestehen gewöhnlich aus Estersubstraten sehr unspezifischen Charakters. Ein Beispiel hierfür ist p-Nitrophenyl-p'-guanidinobicnzoat (p-NPGB), das ein gutes Substrat für Thrombin, Trypsin und Plasmin ist Seine Anwendbarkeit für den Faktor Xa ist auf die Verwendung für gereinigte Enzymzubereitungen begrenzt. Die bei der Verwendung von Blut erhaltenen Ergebnisse sind nicht verwertbar, und zwar infolge der Anwesenheit von anderen Esterasen mit einer Aktivität für P-NPGB(R. L.Smith,J. Biol.Chem.248,2418(1972).
in der DE-OS 2322116 sind sehr gut wirkende cfarömogene Amidsubstrate für Thrombin-ähnliche Enzyme beschrieben worden. Eines dieser Substrate mit der Formel
Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid (A)
arbeitet gut bei Thrombin, wird jedoch bei der Verwendung nut dem Faktor Xa lediglich geringfügig gespalten. Die Suszeptibilität eines Substrates bezüglich Thrombin sou vernachlässigbar sein, wenn es in diagnostischer Blutanalyse für den Faktor Xa verwendet werden solL
Die Bereitstellung eines für den Falöor Xa spezifischen Substrats, das somit gegenüber der Spaltung durch Thrombin weniger empfindlich, ist, wäre daher erwünscht. Das Substrat sollte die biologischen Funktionen des Enzyms, d.h. die Spaltung von Amidbildungen, messen. Weiterhin ist es erwünscht, daß das Substrat rasch in leicht bestimmbare Produkte gespalten werden kann, z. B. in chromophore Verbindungen, die in leichter Weise spektrophotometrisch verfolgt werden können.
Die Tri- bzw. Tetrapeptide dev Erfindung können grundsätzlich gemäß zwei verschiedenen Verfahren hergestellt werden.
1. Das erste Verfahren beruht auf der Kopplung der chromophoren Gruppe R2 mit Arginin, gefolgt von einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur mittels einer fortschreitenden Kopplung der verbleibenden Aminosäuren. Die chromophore Gruppe wird hier als Blockierungsgruppe der C-terminalen Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet
2. Das andere Verfahren beruht auf dem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur, wonach die verwendeten Blockierungsgruppen entfernt und die chromophore Gruppe R2 an die Peptidstruktur gekoppelt wird.
Während der Stufensynthese der Peptidstruktur gemäß den genannten Verfahren ist es möglich, nach jedem Koppeln einer neuen Aminosäuren eine geeignete Reinigung durch Gelfiltration zu bewirken.
Die in der Stufensynthese der Peptidderivate verwendeten Kopplungsmethoden sind an sich bekannt und in der Peptidchemie üblich. Als Schutzfunktion für Aminogruppen können bekannte und in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen, z. B.
Cbo (carbobenzoxy), MeOCbo (p-Methoxycarbobenzoxy), NOjCbo (μ-Nitrocarbobenzoxy), MCbo(p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy), BOC (tert-Butyloxycarbonyl), TFA (trifluoracetyl) oder
Formyl
verwendet werden. Die «-Carboxylgruppe kann mittels einer Umwandlung in andere aktive, in der Peptidchemie bekannte und häufig verwendete Derivate aktiviert werden. Diese Derivate können entweder isoliert oder in situ hergestellt werden. Beispiele hierfür sind p-Nitrophenylester, Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, Säureazide und Säureanhydride, wobei die letzteren entweder symmetrisch oder unsymmetrisch sein können. Sie kann auch mit einem Carbodiimid aktiviert werden, z. B. mit N-N'-Dicyclohexylcarbodiimid. Die C-terminale Carb-
oxylgruppe in dem Aminopeptidderivat oder dem Ammosäuederivat kann durch Veresterung geschützt werden, und zwar z. B. durch Veresterung zum Methyl-, Ethyl- oder Isopropylester, oder mittels einer Umwandlung zu dem chromophoren Anilinderivat, das dabei als Schutzgruppe während des Aufbaus der Peptidkette wirkt Diejenigen freien funktioneilen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, können während der Synthese der Peptide oder der Peptidderivate in der folgenden Weise geschützt werden:
Für den Schutz der verbleibenden Arginyl-<i-guanidinogruppe kann man in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppen verwenden, z. B. die bei der Protonierung erhaltene oder NO2 oder TOS (p-ToIuoIsuIfonyl).
10 Als Schutz für die Carboxylgruppe der Glutamin- und Asparaginsäure kann man ebenfalls häufig in der Peptidchemie verwendete Schutzgruppen, z.B. die Benzyl· und tertiären Butyischutzgruppen verwenden.
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert, wobei auf die Beispiele bezug genommen wird. Die Beispiele erläutern die Herstellung verschiedener Substrate gemäß der Erfindung mittels der Stufensynthese.
Bei der dünnschichtchromatografischen Analyse von FJuaten und Produkten wurden als Absorptionsmedhim mit Silicagel F2M beschichtete Glasplatten verwendet Die verwendeten Lösungsmittelsysteme sind gemäß der folgenden Tabelle bezeichnet;
Bezeichnung Lösungsmittel Volumenverhältnisse
A
C
D
Pi
n-Butanol: Essigsäure : Wasser n-Propanol: Ethylacetat: Wasser n-Heptan : n-Butanol: Essigsäure Chloroform : Methanol
Nach der Dünnschichtchromatografie wurden die Platten zunächst im UV-Licht (254 iün) und anschließend mittels der Chlor/Toluidinreaktion als Entwicklungsverfahren untersucht (Lit: G. Pataki: Dünnschichtchromatografie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter, Berlin, 1966, S. 125).
Die Bedeutung der nachstehend verwendeten Abkürzungen sind die folgenden:
Aminosäuren
Diese Abkürzungen beziehen sich auf Aminosäurereste. Die freie Aminosäure oder das freie Peptid werden mittels H- an der Aminogruppe und -OH an der Carboxylgruppe bezeichnet Die Aminogruppe wird immer links, die Carboxylgruppe rechts angegeben.
30
Arg = Arginin
Asn = Asparagin
Asp = Asparaginsäure
Gin = Glutamin
GIu = Glutaminsäure
GIy ·= Glycin
He = Isoleucin
Leu = Leucin
Phe = Phenylalanin
Pro = Prolin
Tyr «= Tyrosin
VaI = Valin
iere Abk
Ac		 ürzungen:
— Acetyl
Ac2O — Acetanhydrid
AcOH = Essigsäure
BOC — tert-Butyloxycarbonyl
Bz — Benzoyl
BZl - Benzyl
Bz2O — Benzoesäureanhydrid
Cbo — Carbobenzoxy
DCCL - Dicyclohexylcarbodiimid
DMF — Dimethylformamid
Et3N — Triethylamin
MCbo — p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy
MeOH — Methanol
(3:1:1)
(7:1:2)
(3:2:1)
(9:1)
OtBu = tert-Butyloxy
OEt = Ethyloxy
OMe = Methyloxy
OpNP = p-Nitrophenoxy
OiPr — i-Propyloxy
pNA — p-Nitroanilid
TFA = Trifluoracetyl
TOS = 4-To!uolsulfonyI
Das Gel 15, das in den Ausführungsbeispielen bei der Gelfiltration verwendet wird, ist ein quervernetztes Dextrangel. Das Gel LH-20 ist ein hydroxypropyliertes quervernetztes Dextrangel. Der Ionenaustauscher QAE-25 ist ein quervernetztes Dextrange! mit Diethyl-(2-hydroxypropyI)-aminoethyl-Funktionen als funktionelle Gruppe.
Beispiel I Bz-Ile-GIu-Gly-Arg-pNA Die Verbindungen Ia bis Id sind Zwischenprodukte
45
50 Ia
Cbo-Gly-Arg-(NO2)-pNA
(Mol-Gew. 530.4)
5,0 g (10,6 mMol) Cbo-Arg-(NO2)-pNA wird in 21 ml AcOH und 22 ml 4 N HBr in AcOH unter wasserfreien Bedingungen gelöst Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und danach langsam in 200 ml Ether unter heftigem Rühren eingegossen. Die Etherlösung wird dekantiert und der erhaltene granulatförmige Rückstand weitere zweimal mit 100 ml Ether behandelt Nach dem Trocknen im Vakuum über P2Os und KOH-PIätzchen bei 30°C erhält man eine nahezu quantitative Ausbeute (4,95 g) des Hydrobromids des
Aminosäurederivats. Das Produkt erweist sich in A als
dünnschichtchromatographisch homogen.
Das obige Produkt wird in 50 ml destillierten DMF
gelöst. Die Lösung wird auf —10° C gekühlt und mit Et3N versetzt bis die Lösung neutral ist (2,1 ml). Ausgefallenes Et3N · HBr wird abgefiltert und das Filtrat auf -10°C gekühlt. 3.9 g (11,8 mMol)
Cbo-Gly-OpNP werden zugegeben. Man laßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach drei Stunden wird die Lösung erneut auf — 100C gekühlt und mit 0,45 g (53 mMol) Et3N gepuffert Die Pufferprozedur wird ein weiteres Mal nach zwei bis drei Stunden wiederholt. Man läßt die Reaktionslösung über Nacht stehen und verdampft im Vakuum bei 400C Das zurückbleibende schwere öl wird sorgfältig mit 100 ml destilliertem Wasser gerührt. Das Wasser wird dekantiert, und das Waschverfahren wird weitere zwei Mal wiederholt. Das zurückbleibende öl wird in warmem MeOH gelöst. Beim Kühlen fällt das Produkt in kristalliner Form aus.
Ausbeute: 4,2 g(75%)Ia.
Homogen gemäß Dünnschichtchromatographie (TLC) InPi(Ri=0,16)
[α]? -36° fc 0,50, MeOH).
Ib
t-BOC-Glu-(y-OBZl>Gly-Arg(N02)-pNA (Mcl-Gev/. 715»)
2,65 g (5,0 mMol) Ia wird decarbobenzoxyliert und mit 2^Og (5,5 mMol) t-BOC-Glu(y-OBZl)-GpNP gemäß dem Verfahren in Beispiel Ia gekoppelt Das rohe Produkt wird durch Gelchromatografie an einer LH-20 in MeOH enthaltenden Kolonne gereinigt Ausbeute:3,25g(91%)Ib
Homogen gemäß TLC in Pi (Rr=0,22) [«]? -34° (c 1,0, MeOH)
Ic
10
15
20
Cbo-Ile-Glu()>-OBZl)-Gly-Arg(NO2)-pNA (Mol-Gew.8625)
35
1,03 g (1,5 mMol) Ib werden in 10 ml TFA gelöst Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und danach langsam in 75 ml heftig gerührten trockenen Ether gegossen. Die Etherlösung wird dekantiert und der erhaltene granulatförmige Rückstand wird weitere zwei Mal mit 50 ml Ether behandelt Nach dem Trocknen im Vakuum über P2O5 und KOH-Plätzchen bei 300C erhält man das TFA-SaIz des Tripeptidderivats in nahezu quantitativer Ausbeute (1,08g).
Das Produkt ist gemäß TLC in A homogen. Das obige Produkt wird in 20 ml DMF gelest Die Lösung wird auf -10° C gekühlt und mit Et3N (0,23 ml) neutralisiert Danach fügt man 0,65 g (1,68 mMol) Cbo-Ile-OpNP hinzu und läßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach et'va drei Stunden wird die Lösung erneut auf -10° gekühlt und mit 0,12 ml Et3N gepuffert Das Püfferverfahren wird ein weiteres Mal nach zwei bis drei Stunden wiederholt Man läßt die Lösung über Nacht stehen. Der Überschuß an Cbo-Ile-OpNP wird dann durch Zugabe von etwa 100 mg (ca.l,4mMol) n-Butylamin zu der Lösung zerstört. (Der Überschuß an aktivem Ester ist unerwünscht, da es schwierig ist. diesen bei der Gelfiltration von dem Tetrapeptid abzutrennen). Nach etwa 30 Minuten wird die Lösung im Vakuum bei 400C eingedampft Das verbleibende schwere öl wird mit drei Portionen destilliertem Wasser gewaschen. Das öl wird in MeOH gelöst und durch Gelchromatografie an einer mit LH-20 in Methanol gefüllten Kolonne gereinigt.
Ausbeute: ■
1,07 g (83%) Ic, homogen gemäß TLC in P1 (R, = 035).
\<x\£ -32° (c0,3, MeOH : DMF, 95 :5) Id
Bz-IIe-Glu(}.-OBZl)-Gly-Arg(NO2)-pNA
260 mg (030 mMol) Ic wird gemäß dem Verfahren des Beispiels Ia decarbobenzoxyliert Das Produkt zeigt im TLC in A zwei Flecken (Rr=0,45 und 0,60). Das IR-Spektrum zeigt, daß das Produkt aus einem Gemisch von
HBr · H-Ile-Glu(j--OH)-Gly-Arg(NO2)-pNAund
HBr - H-He-Glu(y-OBZr)-Gly-Arg(NO2)-pNA besteht Dieses Gemisch wird mit 800 mg (0,35 mMol) Benzoesäureanhydrid gemäß dem Verfahren des Beispiels Ia umgesetzt Das rohe benzoylierte Produkt wird an einer Kolonne mit LH-20 in Methanol gereinigt Man erhält zwei Fraktionen, und zwar «:130 mg, [α]? -15° (cOJ5, CH3CN), Rf=2Ö in P, und ß: 105 mg, [«]? -11° (c OA CH3CN), Rf=0,06 in P1. Das IR-Spektrum zeigt daß die zwei Fraktionen aus
Bz-Ile-Glu(y-OBZl)-Gly-Arg(NO2>pNAund Sz-Ile-Glu-Gly-Arg(Nq2)-pNA
besteht (Die Reaktion mit IiF ergibt aus beiden Fraktionen das gleiche Endprodukt, ie.)
Ie
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA HCl (Mol-Gew.7343)
100 mg (0,12 mMol) Id, Fraktion «, und 0,5 ml Anisol werden in das Reaktionsgefäß eines Sakakibara-Apparates gegeben. In das Gefäß werden etwa 5 ml trockener Fluorwasserstoff eindestilliert Man läßt 75 Minuten unter Rühren bei 0°C reagieren. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck abdestilliert, und man lest den öligen Rückstand in 10 ml AcOH (33% in Wasser) sowie reinigt chromatografisch an einer Kolonne mit G-15 in 33% AcOH in Wasser. Die das reine, von der Schutzgruppe befreite Tetrapeptidderivat enthaltende Fraktion des Eluats wird dann lyophilisiert Die erhaltene Verbindung wird in MeOH : destilliertem Wasser (95:5) gelöst und an einem schwach basischen anionischen Austauscher QAE A-25 in dessen Chloridform, und zwar mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch als Eluant, chromatografie». Das Methanol wird aus dem EIu^t bei 300C unter vermindertem Druck entfernt Die verbleibende wäßrige Lösung wird lyophilisiert
Ausbeute:
75 mg (85%), homogen gemäß TLC in A (Rf=0,48). [«]£' -MO0 (c0£, 50% AcOH in dest Wasser) Aminosäurenanalyse:
1Ie: 0,98, GIu: 0,96, Arg: 0,89, GIy: 1,00.
Beispiel II H-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · 2 HCl
100 mg (0,116 mMol) Ic wird mit Fluorwasserstoff umgesetzt, gereinigt und an einem Ionenaustauscher behandelt, und zwar gemäß dem Verfahren des Beispiels Ie.
Ausbeute:
56 mg (73%), homogen gemäß TLC in A (R1=034). [«]? -35° (cO,5, 50% AcOH in destilliertem Wasser) Aminosäureanal/se:
He:0,96,GIu:0,94, Arg:0,96,GIy: !,00.
Weiterhin wurden die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen III bis XXVI hergestellt
Tabelle 1
') r 0,5 in 50% Essigsäure.
2) Rf-Werte: DC-Fertigp!atten Kieselgel 60 F254 in Butanol : Essigsäure : Wasser 3:1:1.
Bdispiel Substrat (Hydrochloride) -35 TLC2)
(eingegangen -43
am 6. 7. 1977) -77
III Bz-Leu-Glu-Gly-Arg-pNA -17 0,52
IV Bz-Val-Glu-Gly-Arg-pNA -45 0,48
V Bz-Pro-Glu-Gly-Arg-pNA -43 0,40
VI Bz-Gly-Glu-Gly-Arg-pNA -37 0,42
VIl Bz-Phe-Glu-Gly-Arg-pNA -35 0,52
VIII Bz-Tyr-Glu-Gly-Arg-pNA -61 0,53
IX Ae-lle-Glu-Gly-Arg-pNA -50 0,40
X H-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA -38 0,32
XI H-Pro-Glu-Gly-Arg-pNA -40 0,20
Xi! HGIyGIuGIy Arg-pNA -53 O..26
XUI H-Phe-Glu-Gly-Arg-pNA -36 0,38
XIV Bz-Ile-Gln-Gly-Arg-pNA -16 0,42
XV Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA -17 0,50
XVI Bz-Ile-Asn-Gly-Arg-pNA -38 0,42
XVII Bz-Glu-GIy-Arg-pNA -24 0,46
XVIH Bz-Gln-GIy-Arg-pNA -24 0,40
XIX Bz-Asp-Gly-Arg-pNA -26 0,46
XX Bz-Asn-Gly-Arg-pNA -30 0,40
XXI H-Glu-Gly-Arg-pNA -27 0,30
XXIl H-Asp-Gly-Arg-pNA -41 0,24
XXIII H-Asn-Gly-Arg-pNA -40 0,16
XXIV H-Gln-Gly-Arg-pNA 0,25
XXV Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-2-Naphthylamid 0,26
XXVI Bz-Ile-Glu-Gly-Arg^-Methoxy^-Naphthylamid 0,28
Beispiel XXVII
CnHnCO-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HCL (Mol-Gew. 812.4)
(eingegangen am 14.7.1978)
Die Verbindungen XXVII a und b betreffen Zwischenprodukte.
XXVIIa
BOC-Ile-Glu(OBZl)-GIy-Arg(NO2)pNA (Mol-Gew. 828.9)
Ausführung und Ausgangsmäterial wie für I c; statt Cbo-Ile-OpNP jedoch BOC-He-OpNP Ausbeute: 113 g (76%) XXVI a.
TLC in Pi (Rf - 0,35) zeigt nur einen Fleck.
TFA zugegeben. Man läßt 20 Minuten reagieren, wonach das Produkt mit Ether ausgefällt und auf übliche Weise getrocknet wird. Das trockene DFA-SaIz wird in 3 ml Dioxan gelöst und mit 185 mg (2,2 mMol in 2 ml destilliertem Wasser gelösten NaHCO3 versetzt Unter Kälte und Rühren werden danach 360 μ] (etwa 1,5 mMol) Laurinsäurechlorid (C11H23COCI) hinzugege ben. Kurz danach erstarrt der ganze Kolbeninhalt; und das TLC (Pi) ergibt, daß die Reaktion beendet ist und so gut wie keine Nebenprodukte gebildet wurden.
Das Produkt wird mit destilliertem Wasser durchgearbeitet und anschließend aus warmem MeOH umkristallisiert
Ausbeute: 562 mg (62%) XXVII b
TLC in Pi (R,«0,33):nur ein Fleck
[α]? -12,7° (Cl.O.DMF)
XXVIIb
CnH23CO-Ile-Glu(OBZl)-Gly-Arg(NO2)pNA
(Mol-Gew. 91 !,1)
829 mg (1,0 mMol) XXVII a werden in 7 ml trockenem CH2a2 gelöst und 2,4 ml trockenes, destilliertes
XXVIIc
250 mg (0,27 mMol) XXVTI b läßt man mit Fluorwasserstoff gemäß Beispiel I e reagieren, jedoch ohne Anisol. Der eingedampfte Rückstand wird in einer
kleinen Menge MeOH gelöst und an einer Säule mit LH-20 in MeOH, wobei MeOH Eluationsmittel ist, chromatografiert. Die Fraktion mit dem gewünschten Produkt wirr! in einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Die Substanz wird in EtOH : H2O 50:50 gelöst. Es folgt Ionenaustausch an einer Sephadex°-Säule (QAE ■ 25) in r^loridform; das gleiche Mittel dient als Elutionsmittel. Das Eluat wird aus einer Wasser-Essigsäure-Mischung lyophilisiert, nachdem das EtOH völlig verdampft wurde.
Ausbeute: 107 mg (48%) XXVII.
TLC in A (Ri = 0,48): nur ein Fleck.
[λ]',' -51,1°
(CQJb, 50% AcOH in destilliertem Wasser)
Chloridgehalt - 4,33% (theoretisch 437%).
Das in Beispiel I beschriebene Substrat wurde in der folgenden Weise zur Bestimmung des Faktors Xa verwendet: Das Prinzip der Bestimmung beruht auf der Tatsache, daß das bei der enzymatischen Hydrolyse gebildete Produkt ein UV-Spektrum aufweist, das von dem des Substrats völlig verschieden ist Das Substrat des Beispiels I, Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA-HCl. weist beispielsweise ein Absorptionsmaximum bei 315 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 12 000 auf. Die Absorption des Substrats bei 405 nm ist unbedeutend. p-Nitroanilin (pNA), das während der enzymatischen Hydrolyse aus dem Substrat gebildet wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 13 200 auf, der bei 4"5 nm lediglich 9620 abnimmt. Durch spektrophotometrische Messung bei 405 nm ist es daher möglich, in leichter Weise das Ausmaß der enzymatischen Hydrolyse, das proportional zu der Menge des gebildeten p-Nitroanilins ist, zu verfolgen. Der Überschuß des Substrats beeinflußt die Messung bei dieser Wellenlänge nicht Diese Situation ist fast identisch für die anderen Substrate der Erfindung. Aus diesem Grunde wurden die spektrophotometrischen Messungen durchweg bei 405 nm durchgeführt. Tabelle 2 zeigt einen relativen Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten für unterschiedliche Enzyme vom Typ der Serinproteasen (E. C 3.4.21) zwischen dem zuvor genannten Substrat (A) und dem Substrat I gemäß der Erfindung. Die Reaktionsgeschwindigkeiten werden gemäß den oben beschriebenen Verfahren bestimmt
Tabelle 2 Konz. Substrat Relative Reaktionsgeschwindigkeiten
Throm- Xa Trypsin Plasmin
bin
0,1 mM (A)
0,25 mM I
100
2
1
100
100
500
100
75
Die Tabelle zeigt, daß der Faktor Xa das Substrat Ie 100 mal schneller als (A) spaltet. Im Vergleich zu (A) wird es lediglich in einem unbedeutenden Ausmaß durch Thrombin beeinflußt. Es liegt somit auf der Hand, daß I entsprechend diesem Vergleich eindeutig das beste Substrat für Xa ist. Weiterhin zeigt die Tabelle, daß I erfolgreich auch als Substrat für Trypsin verwendet werden kann. Dieser positive Trypsineffekt stört jedoch nicht eine Bestimmung des Faktors Xa, da Trypsin normalerweise im Blut nicht zugegen ist.
Schließlich wird in der Tabelle 3 eine qualitative Übersicht über Reaktionsgeschwindigkeiten einiger Verbindungen der Erfindung im Vergleich zu der Verbindung (A) gegeben.
25 Tabelle 3 Relative Reaktionsgeschwindigkeit*) Thrombin Verglüichsverbindung (A).
Beispiel Faktor Xa Trypsin (X) = 90-110%.
Nr. XXXXX XXXXX XXXXX = 70- 90%.
JO 1 (X) XX (X) = 50- 70%.
(A) XXX XXXXX (X) = 30- 50%.
3 XXX XXXX (X) = 10- 30%.
5 XXXX XXXXX X = weniger als 10%.
9 XXXXX XXXXXX (X)
35 14 XXX XXXX (X)
15 XXX XXXXX (X)
16 XX XXX *) XXXXXX = mehr als 110% der Geschwindigkeit der
17
XXXXX
40 XXXX
XXX
XX
X
(X)
45

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    !.Tripeptide der allgemeinen Formel (I)
    R1 —A3—Gly-Arg-NH-R2
    ö)
    10
    in der bedeuten:
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