DE2753653C2

DE2753653C2 - Tetrapeptide

Info

Publication number: DE2753653C2
Application number: DE2753653A
Authority: DE
Inventors: Leif Erik Dr. Särö Aurell; Karl Göran Dr. Claeson; Leif Roger Dr. Hisings-Backa Simonsson
Original assignee: Kabi AB
Current assignee: Chromogenix AB
Priority date: 1976-12-01
Filing date: 1977-12-01
Publication date: 1983-07-21
Also published as: PL110803B1; IL53187A0; PL109588B1; FI773242A; SE437153B; DK155333B; BE861295A; DK155333C; ATA859677A; CH637627A5; HU176983B; US4276375A; JPS578720B2; NO774092L; IT1092154B; JPS5369693A; IL53187A; DE2760116C2; DK535377A; DE2753653A1

Description

in der R³ eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- oder Cyclohexylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe der Formel

-CH₂-(CH₂J_n-OH

in der π 1 oder 2 ist,

oder eine substituierte Aminoalkylgruppe der Formel

-CH₂-(CHz)₀-NR-¹R⁵

bedeutet, in der R* und R^s Methyl oder Ethyl bedeuten, oder eine monosubstituierte Amidfunktion der allgemeinen Formel

-CO-NH-R³

in der R³ wie oben definiert ist, oder eine disubstituierte Amidfunktion der allgemeinen Formel

-CO-NR₂

in der R³ wie oben definiert ist, oder die Gruppe - NR₂ ein Morpholino-, Piperidino- oder Piperazinorest ist, bedeuten sowie deren Säureadditionssalze.

Die £rfindung betrifft Tetrapeptide mit der im Anspruch angegebenen allgemeinen Formel.

Die Tetrapeptide der Erfindung stellen neue chromogene Substrate für Serinproteasen dar. Sie eignen sich zur Bestimmung des Faktors Xa (E C 3.4.21.6) oder für die Untersuchung von Reaktionen, in denen Xa gebildet, inhibiert oder verbraucht wird, darüber hinaus für die Bestimmung von Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an ihnen teilnehmen.

Der Faktor X ist eine Schlüsselsubstanz in der Reaktionsfolge, die zu der Blutkoagulation führt. Die Aktivierung des Faktors X veranlaßt die Bildung des nroteolytischen Enzyms, des Faktors Xa, der direkt für die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin verantwortlich ist. Diese Umwandlung durch den Faktor Xa schließt die Spaltung von zwei Peptidbindungen im Prothrombinmolekül ein. Vor diesen beiden Orten der Spaltung tritt genau die gleiche Aminosäuresequenz auf, nämlich - He - GIu - GIy - Arg -.

3S Für diagnostische Zwecke ist ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des Koagulationsfaktors Xa besonders wertvoll. Das bisher am besten geeignete Reagenz für die Xa-Bestimmung besteht aus chromogenen Peptid- Substraten mit einer Aminosäuresequenz -He-GIu-GIy-Arg-, die derjenigen Sequenz entspricht, die den Spaltungsstellen des natürlichen Substrates Prothrombin vorangeht. Das aus der DE-AS 25 52 570 bekannte Substrat Benzoyl-IIe-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2222), das das beste Substrat in dieser Reihe ist, weist eine Aminosäuresequenz auf, die mit dem oben erläuterten Teil des natürlichen Substrats identisch ist. Dieses Substrat ist bereits in klinischen Versuchen angewendet worden, z. B. bezüglich des Antifaktors Xa und Heparin (A. N. Teien, M. Lie un und U. Abildgaard, Thrombosis Research 8,413,1976). Diese Verfahren beruhen auf der folgenden Reaktion:

Bz- lie—Glu—Gly—Arg—pNA

Xa

Bz-lie—Glu—Gly—Arg—OH + pNA

Das freigesetzte p-Nitrolanilid (pNA) weist ein Lichtabsorptionsmaximum auf, das sich von dem des Substrats unterscheidet. Die enzymatische Reaktion kann leicht verfolgt werden, indem man die Zunahme der Absorption bei 405 nm verfolgt, die proportional der Menge des aktiven Paktors Xa ist.

Es ist bereits eine große Anzahl von synthetischen Substraten für den Faktor Xa beschrieben worden, und zwar von L Aurell, G. Claeson, G. Kaflsson und P. Friberger in »Peptides 1976, S. 191, Prox. from the XlVth European Peptide Symposium«, Weipon, Belgien, 1976. Dabei wurden die Aminosäuren in der natürlichen Sequenz variiert. Sie wurden abwechselnd durch andere ähnliche Aminosäuren ersetzt, wobei jedoch in keinem Falle ein besseres Substrat als S-2222 erhalten wurde. Sogar sehr geringe Änderungen in der natürlichen Sequenz, z. B. den Ersatz von He durch Leu, ergibt Substrate mit einer stark herabgesetzten Empfindlichkeit.

Die Definition »Ca- bis C4-Alkanoylgruppe« für die Gruppe R¹ der allgemeinen Formel bedeutet Acetyl-, Propanoyl- sowie n- oder iso-Butanoylgruppen.

Die Reste R² bedeuten Gruppen, die bei der Spaltung chromogene oder fluoresziende Verbindungen ergeben.

erhalten.

Enzym und Substrat wurden in einer Pufferlösung gemischt; die Geschwindigkeit der Hydrolyse wurde spektrophotometrisch gemessen. Die Substratkonzentration (So) wurde verändert, während die Enzymkonzentration konstant gehalten wurde. Die reziproke

Geschwindigkeit 7- wurde anschließend gegen die

⁰ JL

reziproke Substratkonzentration s_n aufgetragen. Aus

IO

15

deren Absorptiop^maximum von dem des Substrats verschieden ist, insbesondere 4-NHrophenyl-, /J-Naphthyl- und 4-Metboxy-jJ-naphthyIgruppen,

In den Tetrapeptiden der Erfindung ist die y-Carboxylgruppe des GIu, die bei biologischen pH-Werten eine negative Ladung aufweist und hydrophil ist, durch eine erheblich größere Gruppe, die keine Ladung trägt und weniger hydrophil ist, ersetzt Da früher vorgenommene Änderungen der natürlichen Sequenz,

— He—GIu-GIy-Arg—, lediglich unterlegene Substrate ergaben (L. Aurell et aL s. o.) ist es überraschend, daß die gegenüber dem Stand der Technik vorgenommenen Änderungen an den Tetrapeptiden der Erfindung Substrate ergeben, die erheblich bessere Eigenschaften (vgL Tabelle II) als das bisher als am besten erkannte Substrat, S-2222, aufweisen. Die drastische Erniedrigung der Michaelis-Konstante (K_n.) überrascht dabei am meisten und ist für das Arbeiten in der Praxis die wichtigste, mit den Substraten der Erfindung erreichte Verbesserung. K_n, ist als diejenige Substratkonzentration definiert, die für das Erhalten der halben Maximalgeschwindigkeit (Vm_x) erforderlich ist. Die bisher verwendeten Substrate und auch die Substrate gemäß der Erfindung weisen begrenzte Löslichkeiten auf, und aus diesem Grunde sollte die Substratkonzentration unterhalb von 1 mM sein, wenn man in Pufferlösung und Blutplasma unter praktischen Bedingungen arbeitet Mit S-2222, das eine K_m von 0,83 mM aufweist, kann man lediglich die Hälfte der V_max ausnutzen, wogegen man mit den Substraten der Erfindung, deren £".„ zwei- bis fünfmal niedriger ist, die maximale Geschwindigkeit wesentlich besser ausnutzen kann. Es ergeben sich somit offensichtliche Vorteile, wenn man mit den Substraten d<*r Erfindung die Aktivität des Faktors Xa bestimmt Ihre Empfindlichkeit ist einige lOOmal größer als die von S-2222, so daß man eine wesentlich höhere Genauigkeit bei einer erheblich herabgesetzten Empfindlichkeitsgrenze und einem stark herabgesetzten Volumen der Blutprobe erreichen kann.

Enzymuntersuchungen mittels chromogenen Substraten sind besonders zur Verwendung in automatischen Analyseneinrichtungen geeignet. Die höhere Empfindlichkeit der Substrate der Erfindung ermöglicht eine kürzere Reaktionszeit in der Vorrichtung und bietet zudem die Möglichkeit, daß mehr Proben in der Zeiteinheit analysiert werden können.

Die Ergebnisse von Vergleichen zwischen den Verbindungen der Erfindung und denjenigen der DE-AS 25 52 570 sind in den Tabellen I, Il und III zusammengefaßt.

K_n, und V_mu wurden mittels der Lineweaver-Burk-Gleichung

dem erhaltenen Lineweaver-Burk-Diagramm wurden AT_mund 7_m„geschätzt(TabelleIII),

Reagenzien:

Puffer: Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethan] 0,05 Mol/l, pH=8,3,I=0,25 (NaCl)

Enzym: FXa-Faktor (6,4 Denson U, Rind) (handelsübliches diagnostisches Reagenz) Eine Ampulle wird in 2 ml Wasser gelöst

Substrat: Das Substrat wird in Wasser auf 2 mMol/1 gelöst

Verfahren:

Puffer, +37"C
Enzym, +20⁰C
Substrat, +37"C

2400-1850 μΐ
50 μΐ
50-600 μΐ

2500 μΐ

30 Vermischen und Ablesen der Änderung der Absorption (Δ OD/mm) bei 405 nm und bei 37° C

Relative Aktivität:

Puffer,+37⁰C 2200 μΐ

Enzym, +20⁰C 50 μΐ

Substrat, +37° C 250 μΐ

Vermischen und Ablesen der Absorption {AOD/ min) bei 405 nm und bei 37° C.

Tabelle 1

Zum Vergleich herangezogene Verbindungen der DE-AS 25 52 570 (die mit *) gekennzeichneten Verbindungen sind in der genannten AS nicht erwähnt fallen jedoch unter deren Anspruch 1)

40

45

A	Bz - He - GIu - GIy - Arg - pN A	'-0-NA	Vergleichs-	ReI. Reak
	( = S-2222; Beispiel 1)		verbindung	tivität
B =	Bz - lie - Asp - GIy - Arg - pNa	: Reaktivitäten (Vergleichsverbindung = 100)	gemäß
	(Beispiel 15)	gegenüber FX_a	Tabelle I
C =	Bz - He-GIu-GIy-Arg-pNa	Beispiel	Λ	230
	(Beispiel 14)		Λ	200
D =	Bz-IIe- Asn - GIy - Arg - pNa		Λ	220
	(Beispiel 16)		Λ	180
E =	Ac - He - GIu - GIy - Arg - pNa	1	Λ	150
	(Beispiel 9)		Λ	340
F·) =	Bz - He - GIu - GIy - Arg - ^-N A	3	Γ	280
G·) =	Bz - He - GIu - GIy - Arg - 4 MeO	4
Tabelle	II	5
Relative		6
	h

Fortsetzung

Beispiel

Vergleichsverbindung
gemäß
Tabelle I

ReI, Reaktivität

10

11

12

13

14

15

16

F*)

G*)

300 250 130 400 350 170 130 160 200 240 210 230

Anmerkung zur Tabelle II:

Die Messung des Beispiels 9 zeigt, daß beim Üiergang von Asp auf Asp-y-OiPr eine vierfache Reaktivitätssteigerung erreicht wird; gemäß Beispiel 12 bewirkt der Übergang von Asn auf Asp-morpholid eine Reaktivitätssteigerung um 30%.

Tabelle III Vergleich von	K_m,	V_max und	*'max*	*^fmax*
Beispiel bzw.		Km ■ 10"		Km
Vergleichs verbindung		Mol/I
/K_n,
Vmax "ΙΟ⁸
mol/min - K

C
1
2
3
6
7

15

16

8,3
8,0
2,6
2,9
2,1
2,8
1,7
2,0
2,2

0,7 1,0 3,1 2,8 3,8 3,2 5,3 4,5 3,2

Die Tabelle zeigt, daß die Tetrapeptide der Erfindung die Messung von FXa bei niedrigen Substratkonzentrationen (Km möglichst niedrig) und erhöhter Empfindlichkeit (V_mtx möglichst !?och) im Vergleich zu den bekannten Tetrapeptiden A und C gestatten.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Für die dünnschichtchromatographische Analyse von Eluaten und Produkten wurden mit Silicagel F254 (Merck) beschichtete Glasplatten als Absorptionsmedium verwendet Das verwendete Lösungsmittelsystem bestand aus Chloroform, Methanol, Essigsäure und Wasser in Volumenverhältnissen von 34 :4 :9 :2, ausgenommen, wenn die Bezeichnung Pa verwendet wird; in diesen Fällen besteht das Lösungsmittelsystem aus Chloroform/Methanol/Essigsäure im Volumenverhältnis von 17 :2 :2.

Nach der dünnschichtchromatographischen Trennung wurden die Platten zunächst im UV-Licht (254 nm) und anschließen^ mit der Chlor/Toluidin-Reaktion (G. Patakü, Dünnschichtchromatografie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co Berlin, S.

125,1966) als Entwicklungsmethode untersucht.

Die Bedeutungen der nachstehend verwendeten Abkürzungen sind die folgenden:

Aminosäuren:

Diese Abkürzungen beziehen sich auf Aminosäure' reste. Die freie Aminosäure bzw. das freie Peptid wird durch H- an der Aminogruppe und durch -OH an der Carboxylgruppe rechts angegeben.

Sofern nichts anderes angegeben ist, weisen sämtliche eingesetzten Aminosäuren die L-Konfiguration auf.

Arg

Asp

Asn

GIu

GIn

GIy

He

Leu

Arginin

Asparaginsäure

Asparagin

Glutaminsäure

Glutamin

Glycin

He

Leucin

Weitere Abkürzungen:

Ac

AcOH

Bi

DCCI

DMF

Et₃N

HOBT

HOSu

MeOH

OEt

OMe

OpNp

OiPr

pNA

QAE

SOCI2

TLC

Acetyl

Essigsäure

Benzoyl

Dicyclohexylcarbodiimid

Dimethylformamid

Triethylamin

a-Hydroxybenzotriazol

N-Hydroxysuccinimid

Methanol

Ethyloxy

Methyloxy

p-Nitrophenoxy

i-Propyloxy

p-Nitroanilid

Quartäre Aminoethylsepharose

Thionylchlorid

Dünnschichtchromatografie

Beispiel 1

HCl

Bz-IIe- GIu(OMe) - GIy - Arg - pNA (M 748,2)

Bei 0⁰C werden 30 μΙ destilliertes SOCI₂ zu 0,5 ml absolutem Methanol unter wasserfreien Bedingungen gegeben. Nach der ersten heftigen Reaktion läßt man die Lösung etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur so stehen und fügt dann 75 mg (0,1OmMoI) Bz - He - GIu-GIy-Arg-pN A · HCl (S-2222) hinzu. Man rührt die Lösung 5 Stunden und dampft ein. Das erhaltene öl wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und durch Gelchromatografie an einer Kolonne gereinigt, die Sephadex LH-20 in .,Methmol entnält. Methanol dient als Eluierungsmittel. Der reine Methylester, der nach der Abdampfung des Methanols erhalten wird, wird in Wasser gelöst und Iyophilisiert. Ausbeute: 30 mg (40%).

Das Produkt ist homogen gemäß TLC, Rf = 033. [λ] i? - 40,3° (c 0,5,50% HOAc/H₂O).

Beispiel 2
Bz - He - GIu(OEt)-GIy-Arg-pN A · HCI (M 762,2)

μΙ destilliertes SOCI₂ werden bei - 10⁰C zu 1,0 ml absolutem Ethanol unter wasserfreien Bedingungen gegeben. Nach 30 Minuten bei RaumtemDeratur setzt

man 150mg S-2222 hinzu. Nach Beendigung der Reaktion nach etwa 15 Stunden (bestimmt mit TLC) wird die Lösung eingedampft. Das erhaltene öl wird in einer kleinen Menge von 30% HOAc in Wasser gelöst und chromatografisch an einer Kolonne gereinigt, die Sephadex»G 15 in 10% HOAc in Wasser enthält. Der reine Ethylester aus dem Eluat wird lyophilisiert.

Ausbeute: 70 mg (46%).

Homogen gemäß TLC, Rr = 0,40.

[α]» -37,7° (cOA 50% HOAc/H₂O).

Beispiel 3 Bz-lle-Glu(OiPr)~Gly-Arg-pNA · HCI(M 776,3)

Die Synthese erfolgt gemäß Beispiel 2, wobei man jedoch absolutes Isopropanol anstelle von Ethanol verwendet. Die Reaktion ist nach 16 Stunden beendet. Die ChromatoErafie und Lyophilisierune erfolet wie in Beispiel 2 beschrieben.

Ausbeute: 90 mg(58%).

Homogen gemäß TLC, Rf = 0,44.

[α]? -36,4° ^0.5.50%

Beispiel 4

Bz-lle-Glu(O-cyclohexyl)-Gly-Arg-pNA · HCl (M 833.3)

60 μΙ SOCb werden zu 1,0 ml trockenem Cyclohexanol gegeben. Nach einer Stunde setzt man bei Raumtemperatur 200 mg S-2222 hinzu. Nach Beendigung der Reaktion nach etwa 12 Stunden wird die Lösung verdampft und wie in Beispiel 2 und 3 beschrieben chromatografie^, wonach das Produkt lyophilisiert wird.

Ausbeute: 170 mg (75%).

Homogen gemäß TLC, Rf = 0.50.

[*] f - 38.6^T ^c0.5. 50% HOAc/HjO).

Beispiel 5

Bz-lle-Glij[O-CH2CH₂N(CH3)2]-Gly-Arg-pN-A • HCI (M 859,8)

75 mg (0.10 mMol) S-2222 und 100 mg (0,8 mMol) 4-, Dimethylaminoethanol-hydrochlorid werden in 1,0 ml trocknem, destilliertem DMF gelöst, wonach man 10 μΙ Pyridin. 10 mg HOBT (0,074 mMol) und anschließend 25 mg (0,12 mMol) DCCI zusetzt Der gebildete Dicyclohexyiharnstoff wird nach etwa 24 Stunden ">" abfiltriert; die DMF-Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft Das zurückbleibende öl wird in einer geringen Menge 95% MeOH -5% Wasser gelöst und an einer Kolonne gereinigt die QAE25-Ionenaustauscherharz in der Chloridform enthält Das gleiche Lösungsmittelgemisch wird als Eluierungsmittel verwendet Bei diesem Verfahren wird das Hydrochlorid des Dimethylaminoethylesters frei von anderen Peptiden erhalten, enthäh jedoch einige kleinere Verunreinigungen, z. B. Dimethylaminoethanol-hydrochlorid. Die den Dimethylaminoethylester enthaltende Fraktion wird eingedampft und chrornatografisch an einer Kolonne gereinigt die Sephadex* G15 in 10% HOAc/Wasser enthält Die Lösung des reinen Esters wird iyophiiisiert *⁵

Ausbeute: 60 mg (58%).

Homogen gemäß TLC, R_f=0,50.

[«]*> -35,0° (cOp.50% HOAcZH₂O).

Beispiel 6
Bz-lie—GIu-Gly—Arg—pNA · HCl (M 775,3)

CONH-CH(CHj)₂

240 mg (033 mMol) S-2222 und 45 mg (039 mMol) HOSu werden in 1 ml trockenem destilliertem DMF gelöst. Die Lösung wird auf -5°C gekühlt und mit 120 mg (0,58 mMol) DCCl versetzt Man läßt die Temperatur auf Umgebungstemperatur steigen, kühlt nach 4 Stunden die Lösung erneut auf 0°C und filtriert und wäscht den ausgefallenen Dicyclohexyiharnstoff. Die DMF-Lösung (etwa 2 ml) wird auf 0⁰C abgekühlt und mit 0,1 ml reinem Isopropylamin versetzt. Nach etwa 70 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung unter verringertem Druck eingedampft, mit 5 ml Wasser vermischt und erneut eingedampft. Das Produkt wird in etwa 4 ml 50%iger HOAc/Wasser gelöst und chromatografisch an einer Kolonne gereinigt, die Sephadex® G 15 in 33% HOAc/H₂O enthält. Das gleiche Lösungsmittelgemisch wird als Eluierungsmittel verwendet. Die das reine Isopropylamid enthaltende Fraktion wird verdampft und an einer Kolonne, die quarternäre Aminoethylsepharose®, QAE25, in der Chloridform in 95%iger MeOH/5% Wasser enthält, einem Ionenaustausch unterworfen. Das Eluat wird eingedämmt in Wasser gelöst und Ausbeute: 120 mg (47%).

Homogen gemäß TLC, Rf = 039.

[<x]>_D> -30,6" fcO,5, MeOH).

Beispiel 7
Bz—iie—Glu—Gly—Arg—pNA · HCI (M 802,3)

CON

Die Synthese wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, wobei man jedoch anstelle von Isopropylamin Piperidin verwendet.

Ausbeute: 105 mg (40%).

Homogen gemäß TLC, Rf = 0,50.

[α]? -34" (cOAMeOH).

Beispiel 8
Bz- lie—Glu—Gly—Arg—pNA · HCl (M 822,3)

CON(CH₂-CH₂-OH)₂

Die Synthese wird gemäß dem Verfahren des Beispiels 6 durchgeführt, wobei man jedoch anstelle von Isopropylamin Diethanolamin verwendet

Ausbeute: 120 mg (45%).

Homogen gemäß TLC, Rf=0,25.

Beispiel 9
Bz - He-Asp(OiPr)-GIy-Arg-pNA · HCl (M 7623)

30 μΙ destilliertes SOCl₂ werden zu 0,5JnI trockenem Isopropanol gegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur werden 73 mg (0,1OmMoI) Bz - He - Asp - GIy - Arg - pN A - HCl (M 720,2) zugegeben. Nach Beendigung der Reaktion nach etwa 18 Stunden wird die Lösung eingedampft, chromatografiert und lyophilisiert, und zwar gemäß den Verfahren der Beispiele 2,3 und 4.

Ausbeute: 32 mg (42%).

Homogen gemäß TLC, Rf=0,46.

[«]? -22,7° fcQÄ3ö% HOAcZH₂O).

Beispiel 10
Bz - lie - Asp(OEt)-GIy-Arg-pN A · HCI (M 748,2)

Die Synthese wird gemäß dem Verfahren des Beispiels 9 durchgeführt, wobei man jedoch Ethanol anstelle von Isopropanol verwendet.

Ausbeute: 28 mg (37%).

Homogen gemäß TLC, Rf=O₁JO.

M >i -23,5° (cO,5,50% HOAcZH₂O).

Il

Beispiel 11
Bz-lie — Asp—Gly—Arg—pNA · HCI (M 761,3)

CONH-CH(CHj)₂ ,,

Die Synthese wird gemäß dem Verfahren des Beispiels 6 durchgeführt, wobei man jedoch

R-. _ IU _ A er. _ ΠΙ·/_ Arr. . r.NJ Δ . WPI

anstelle von S-2222 als Ausgangsmaterial verwendet. -'i Ausbeute: 100 mg(40%).
Homogen gemäß TLC, R₍ = 0,40.

Mi»-20.1

Beispiel 12
Bz-Me—Asp—Gly— Arg—pNA · HCI (M 818,3)

CON

Die Synthese wird gemäß dem Verfahren des Beispiels 11 durchgeführt, wobei man jedoch anstelle von Isopropylamin Morpholin einsetzt.

Ausbeute: 95 mg (35%).

Homogen gemäß TLC, Rf = 0,46.

[tx]i> -24,2" (cO,5, MeOH).

Beispiel 13

Bz-IIe- GIu(OMe) - GIy - Arg-0-NA · HCI
Mol-Gew. 753,3

Zu 400 mg (0,53 mMol) in 240 ml wäßriger 0,1 M NaHCO₃-Lösung (pH = 8,2) gelöstem Methylester von S-2222 (Beispiel 1) wird 0,1 mg Trypsin (vom Schwein) gegeben. Nach 30 Minuten ist das pNA völlig abgespalten, wonach 3 ml konzentrierte HOAc (pH 4,2) zugesetzt werden. Das erhaltene Produkt wird lyophilisiert, danach in MeOH gelöst und chromatographisch an einer Kolonne gereinigt, die Sephadex® LH-20 in MeOH enthält, wobei MeOH als Eluierungsmittel verwendet wird. Das Hydrochlorid der reinen Säure,

Bz-IIe-GIu(OMe)-GIy-Arg-OH(13a)

wird lyophilisiert.

Ausbeute: 286 mg (87%).

TLC(Rr = 0,14): nur ein Fleck.

Zu einer Lösung von 158 mg (0.11 mMol) /?-Naphthylamin in 5 ml trockenem Pyridin werden unter Abkühlung im Eisbad 50 ul PCl₃ (0.055 mMol) gegeben, das in trockenem Pyridin gelöst ist. Man läßt die Mischung 30 Minuten unter Umrühren reagieren. Zu '/io der klaren Reaktionslösung werden 58,2 mg(0,10 mMol) 13a gegeben. Die Reaktion ist nach 48 Std. beendet; das Gemisch wird eingedampft. Das erhaltene Öl wird in einigen m! 90% EtOH - 10% H₂O gelöst; die Reinigung erfolgt durch Chromatographie und Ionenaustausch an einer Kolonne, die QAE25 in Chloridform in 90% EtOH-10% H₂O enthält.

50 Die Fraktion mit dem reinen jS-Naphthylamid wird verdampft, in H₂O gelöst und lyophilisiert.
Ausbeute: 16 mg(21%) 13.
TLC (Ri = 0,43): nur ein Fleck.
M" -41,30(^0,5,50% HOAcZH₂O).

Beispiel 14
Bz—He—GIu—GIy—Arg—4-MeO->NA · HCl

CONH — CH(CH,),
Mol.Gew. 810.4

400 mg (0,51 mmol) des Isopropylamids des S-2222 (Beispiel 6) werden wie der Methylester des S-2222 in Beispiel 13 mit Trypsin behandelt.

Bz-lie —GIu-Arg —OH (14a)

C0NH — CH(CH,)₂

Beispiel 13 angegeben isoliert.

Ausbeute: 295 mg (88%) 14a.

TLC (R, = 0,12): nur ein Fleck.

Zu einer Lösung von 231 mg (0,11 mmol) 4 MeO-/?- NA · HCI in 5 ml trockenem Pyridin werden unter Abkühlen im Eisbad 50 μΙ PCl₃ (0,055 mMol) in trockenem Pyridin gegeben. Man läßt die Mischung 30 Minuten unter Rühren reagieren. Zu '/io der klaren Reaktionslösung werden im Eisbad 65,5 mg (0,10 mMol) von 14a gegeben. Die Reaktion ist nach 48 Std. beendet; das Reaktionsgemisch wird verdampft. Das erhaltene Öl wird in einigen ml 90% EtOH-10% H₂O gelöst. Die Reinigung durch Chromatographie und Ionenaustausch erfolgt an einer Kolonne, die QAE25 in Chloridform in 90% EtOH-10% H₂O enthält. Die Fraktion mit dem reinen 4-Methoxy-/?-naphthyIamid wird eingedampft, in H₂O gelöst und lyophilisiert.

Ausbeute: 24 mg(30%) 14.

TLC(R[ = 0,42):nurein Fleck.

[λ]i^! -31,2° (cO,5,MeOH).

Beispiel 15
Bz-lie —Glu —Gly —Arg—pNA · HCl

con'

Mol.Gew. 803,3

Ausführung und Mengen genau wie für Beispiel 6, 'vobei Morpholin anstelle von Isopropylamin verwendet wird.

Ausbeute: 145 mg (55%) 15.

TLC (Rf=035): nur ein Fleck.

M? -37" (c0,5,50% HOAcZH₂O).

to Beispiel 16
Ac—He—GIu—GIy — Arg—pNA

CON

HCl

Mol.Gew. 845.4
1,69 g (2 mMol) von

H-iie-GIu(OBzI)-GIy-Arg(NO₂)pNA - TFA

werden in 4 ml DMF gelöst und in der Kälte (< - 10° C) mit Et₃N neutralisiert bis ein pH-Papier über der

Reaktionslösung eine basische Reaktion zeigt. Zu dem freigesetzten Amin werden 435 mg (2,2 mMol) Ac-pNP gesetzt. Nach 24 Std. wird die Reaktionslösung verdampft; das erhaltene öl wird durch MeOH + H₂O kristallisiert. Das erhaltene

AC-IIe-GIu(OBzI)-GIy-Ar₆(NO₂)PNA(IOa)

ist rein gemäß TLC.

Ausbeute: 1,40 gi'89%).

1,0 g(l,27 mMol)16a wird mit 30 ml HF 1 Std.bei O⁰C entschützt. Das Produkt wird eingedampft, in 10% HOAc/H₂O gelöst und danach chromatographisch an einer Kolonne, die Sephadex G 15 in 10% HOAc/H₂O enthält, gereinigt; 10% HOAC/H2O dient als Eluierungsmittel.

Die Fraktion mit dem reinen entschützten Produkt wird lyophilisiert. Der Ionenaustausch erfolgt anschließend an einer Kolonne, die QAE 25 in Chloridform in 90% EtOH-10% H₂O enthält. Das gleiche Mittel wird als Eluierungsmitter verwendet. Das reine Produkt,

Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA ■ HCI(16b)

wird lyophilisiert.

Ausbeute: 660 mg (75%).

227 mg (0,33 mMol) 16b werden wie S-2222 in Beispiel 7 behandelt.

Ausbeute: 117 mg (42%) 16.

TLC(Rf = 0,47): nur ein Fleck.

[«]»-31° (W>,5, MeOH).

Claims

Patentanspruch: Tetrapeptide der allgemeinen Formel

R^l—He—NH—CH—CO—GIy—Aig—NH—R² (CH₂),, COX

in der sämtliche Aminosäurereste die L-Konfigura tion aufweisen,

R¹ eine C₂- bis CVAlkanoyl-, Benzoyl-, 4-Methylben-

zoyl-, 4-Methoxybenzoyl- oder Phenylacetylgruppe,

R² eine Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitro-

phenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Chinolyl-, Nitro chinolyl- oder Methoxy-naphthylgruppe,

ρ 1 oder 2, und die Gruppe -COX eine

Esterfunktion der allgemeinen Formel

-CO-OR³