DK155333B - Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser samt laboratorieanvendelse af samme - Google Patents

Description

i

DK 155333 B

Opfindelsen angår hidtil ukendte tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser.

De nye tetrapeptider er især egnede som substrater til bestemmelse 5 af faktor Xa (E.C. 3, 4, 21.6) eller til undersøgelse af reaktioner, som medfører, at Xa dannes, inhiberes eller forbruges, eller til bestemmelse af de faktorer, som influerer på eller deltager i sådanne reaktioner.

10 Faktor X er et nøglestof i den række af reaktioner, som fører til koagulering af blod. Aktivering af faktor X medfører dannelse af det proteolytiske enzym, faktor Xa, som er direkte ansvarligt for overføringen af prothrombin til thrombin. Omdannelsen af prothrombin til thrombin ved hjælp af faktor Xa medfører spaltning af to pep-15 tidbindinger i prothrombinmolekylet. Forud for disse to spaltningssteder går nøjagtig samme aminosyresekvens: -Ile-Glu-Gly-Arg-,

En enkel fremgangsmåde til bestemmelse af koaguleringsfaktor Xa er meget værdifuld til diagnostiske formål. De hidtil bedste reagenser 20 til bestemmelse af Xa-faktoren består af chromogene peptidsubstrater med en aminosyresekvens, -Ile-Glu-Gly-Arg-, svarende til den sekvens, der går forud for spaltningsstederne i det naturlige substrat, prothrombin.

25 Således kendes fra svensk fremlæggelsesskrift nr. 407.058 tetrapep-tidet benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2222), der har en aminosyresekvens, som er identisk med den ovenfor omtalte del af det naturlige substrat. Dette tetrapeptid har allerede fundet anvendelse som substrat ved kliniske analyser for f.eks. Xa-antifaktoren og 30 Heparin (A.N. Teien, M. Lie og U. Abildgaard, Thrombosis Research 8, 413, 1976). Metoderne er baseret på følgende reaktion:

Bz-Πe-Glu-Gly-Arg-pNA ^L» Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + pNA

35 Det frigivne p-nitroanilid (pNA) har et lysabsorptionsmaksimum, der afviger fra substratets, og den enzymatiske reaktion kan derfor let følges ved at måle forøgelsen i absorption ved 405 nm, hvilken forøgelse er proportional med mængden af den aktive faktor Xa.

DK 155333 B

2

Et stort antal syntetiske substrater for Xa-faktoren er blevet beskrevet af L. Aurell, G. Claeson, G. Karlsson og P. Friberger i Peptides 1976, side 191, Proc. from the XIVth European Peptide Symposium, Weipon, Belgien, 1976. Aminosyrerne i den naturlige 5 sekvens varieredes. De erstattedes igen af andre tilsvarende aminosyrer, men i intet tilfælde opnåedes et bedre substrat end med S-2222. Selv meget små forandringer i den naturlige sekvens, såsom udskiftning af Ile med Leu, giver substrater med meget lavere følsomhed.

10

Ud over ovennævnte tetrapeptid S-2222 kendes der fra ovenanførte svenske fremlæggelsesksrift nr. 407.059 også tetrapeptider, hvori GIu er erstattet med Gin, Asp eller Asn (jvf. efterfølgende forklaring af de heri benyttede forkortelser).

15

Det har imidlertid nu vist sig muligt at tilvejebringe tetrapeptider med en højere følsomhed som substrat for serinproteaser end de hidtil kendte, ovenfor omtalte glutamin- eller asparaginsyreholdige tetrapeptider, jvf. efterfølgende tabel 1 og 2.

20

Dette opnås ifølge opfindelsen med de hidtil ukendte tetrapeptider, der er ejendommelige ved, at de har den almene formel: R^Ile-A-Gly-Arg-NH-R2, 25 1 2 hvor R betegner acetyl eller benzoyl, R betegner p-nitrophenyl, /i-naphthyl eller 4-methoxy-j8-naphthyl, og A betegner Asp eller Glu, hvis carboxyl gruppe er forestret med en alkanol med 1-5 carbon- atomer, cyclohexanol eller dimethylaminoethanol eller er amideret 30 med piperidin, morpholin, diethanolamin eller en alkylamin med 1-5 carbonatomer.

De aromatiske grupper giver ved enzymatisk hydrolyse en chromofor eller fluorescerende forbindelse, hvis koncentration kan måles 35 spektrofotometrisk.

Egnede estere indeholder en kort al kyl-, dimethylaminoethyl- eller cyclohexylgruppe. Egnede amider indeholder en kort al kyl-, hydroxy-ethyl- eller en heterocyklisk gruppe, hvori amidnitrogenet udgør en

DK 155333 B

3 del af en piperidin- eller morpholinring.

Den naturlige γ-carboxygruppe i Glu, som ved biologiske pH-værdier har en negativ ladning og er hydrofil, er ifølge opfindelsen blevet 5 udskiftet med en betydeligt større gruppe, som er neutral eller lipolfil. Eftersom forandringer i den naturlige sekvens, -Ile-Glu-Gly-Arg-, hidtil kun har givet dårlige substrater (L. Aurell, G. Claeson, G. Karlsson og P. Friberger i Peptides 1976, side 191,

Proc. from the XIVth European Peptide Symposium, Weipon, Belgien, 10 1976), er det meget overraskende, at de forholdsvis store foran dringer, som-er blevet foretaget ifølge den foreliggende opfindelse, har resulteret i substrater med fundamentalt bedre egenskaber (se efterfølgende Tabel 1 og 2) end det hidtil bedste substrat, S-2222.

Det drastiske fald i værdien af Michael is-konstanten (Km) er den 15 mest slående, og i forbindelse med praktisk arbejde den mest betydningsfulde forbedring, der opnås med de nye substrater. Km Er defineret som den substratkoncentration, der kræves for opnåelse af halvdelen af den maksimale hastighed (Vmax). De tidligere substrater og også substraterne ifølge opfindelsen har begrænsede opløselig-20 heder, og af denne grund bør substratkoncentrationen være under 1 mM ved arbejde i pufferopløsning og blodplasma i praksis. Med S-2222, som har Km = 0,83 mM, kan man kun benytte Vmax/2 fuldt ud, hvorimod man med substraterne ifølge opfindelsen, som har en 2-5 gange lavere Km-værdi, kan udnytte den maksimale hastighed meget bedre. Der opnås 25 således indlysende fordele, når Xa-faktorens aktivitet måles med de nye substrater. Deres følsomhed er flere hundrede procent højere end følsomheden af S-2222, hvilket muliggør en meget større præcision, en fundamentalt lavere følsomhedsgrænse og et stærkt reduceret blodprøverumfang.

30

Enzymanalyser ved hjælp af tetrapeptiderne ifølge opfindelsen er særdeles velegnede til gennemførelse i autoanalysatorer, og den højere følsomhed af disse nye substrater medfører en kortere reaktionstid i apparatet og gør det dermed også muligt at analysere 35 flere prøver pr. tidsenhed.

Opfindelsen angår derfor også en anvendelse af tetrapeptiderne ifølge opfindelsen til laboratoriebestemmelse af serinproteaser.

DK 155333 B

4

De nye tetrapeptider ifølge opfindelsen kan fremstilles ud fra chromogene eller fluorogene forbindelser indeholdende aminosyrese-kvensen -Ile-Gly-Gly-Arg- eller Ile-Asp-Gly-Arg- ved esterificering eller amidering af den frie γ- eller ^-carboxylgruppe ved fremgangs-5 måder, som er velkendte og almindeligt anvendte inden for peptidkemien.

Nedenstående eksempler tjener til at belyse opfindelsen.

10 Ved tyndtlagschromatografiske analyser af eluater og produkter benyttedes glasplader med silicagel (Merck) som absorptionsmedium. Det anvendte opløsningsmiddel system er chloroform, methanol, eddikesyre og vand i volumenforholdet 34:4:9:2.

15 Efter tyndt!agschromatograferingen undersøgtes pladerne først i UV-lys (254 nm) og derefter under anvendelse af chlor/toluidinreak-tionen (G. Pataki, Dunnschichtchromatografie in der Aminosåure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co., Berlin, side 125, 1966) som fremkaldel sesmetode.

20

Betydningen af de heri anvendte forkortelser er følgende:

Aminosyrer: 25 Disse forkortelser refererer til aminosyrerester. Den fri aminosyre eller det frie peptid angives ved et H- ved aminogruppen og -OH ved carboxylgruppen. Aminogruppen er altid angivet til venstre og carboxylgruppen til højre.

30 Med mindre andet angives, har alle anvendte aminosyrer L-konfigura-tion.

ARG = Arginin Asp = Asparaginsyre 35 Glu - GIutaminsyre Gly = Glycin Ile = Isoleucin Leu = Leucin Asn = Asparagin

DK 155333 B

5

Gin = Glutamin

Yderligere forkortelser: 5 Ac = Acetyl

AcOH = Eddikesyre (eng.: Acetic acid)

Bz = Benzoyl DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid DMF = Dimethylformamid 10 EtjN = Tri ethylamin HOBT = a-Hydroxybenzotriazol HOSu = N-Hydroxysuccinimid

MeOH = Methanol OEt = Ethyloxy 15 OMe = Methyloxy

OpNp = p-Nitrophenoxy

OisoPr = i so-Propyloxy pNA = p-Nitroanilid

ArgiNOg) = Nw-nitroarginyl 20 OBzl = Benzyloxy NA = Naphthyl amid TFA = Tri fluoreddikesyre QAE - Kvaternært aminoethylsepharose (eng.: Quarternary amino-ethylsepharose) (Pharmacia Fine Chemicals) 25 S0C1g = Thionylchlorid

Eksempel 1

Bz-Ile-GlufOMel-Glv-Ara-oNA . HC1 (molekylvægt 748.21 30

Under fugtfrie betingelser, ved 0°C, tilsættes 30 /il destilleret SOC12 til 0,5 ml absolut methanol. Efter den første livlige reaktion henstår opløsningen i ca. 15 minutter ved stuetemperatur, og 75 mg (0,10 mmol) Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 ($-2222) tilsættes. Opløs-35 ni ngen omrøres i 5 timer og inddampes derefter. Den fremkomne olie opløses i en lille mængde ethanol og renses ved gelchromatografi på en søjle indeholdende "Sephadex LH-20" (Pharmacia Fine Chemicals) i methanol med methanol som elueringsmiddel. Den rene methylester, som fremkommer efter afdampning af methanol en, opløses i vand og

DK 155333 B

6 frysetørres. Udbytte 30 mg (40%). Homogen ifølge TLC, = 0,33.

[α]ρ° -40,3° (c 0,5, 50% HOAc/HgO)

Eksempel 2 5

Bz-Ile-GluiOEtl-Glv-Ara-pNA . HC1 Molekylvægt 762.21

Under fugtfrie betingelser, ved -10°C, tilsættes 60 /il destilleret SOClg til 1,0 ml absolut ethanol. Efter 30 minutter ved stuetempe-10 ratur tilsættes 150 mg S-2222. Når reaktionen er forløbet til ende efter ca. 15 timer (ifølge TLC) inddampes opløsningen. Den fremkomne olie opløses i en lille mængde 30% HOAc i HgO og renses ved chroma-tografi på en søjle indeholdende "Sephadex G 15" (Pharmacia Fine Chemicals) i 10% HOAc i HgO. Den rene ethyl ester fra eluatet fryse-15 tørres.

Udbytte: 70 mg (46%)

Homogen ifølge TLC, R^ = 0,40 [a]p° -37,7° (c 0,5, 50% H0Ac/H20) 20 Eksempel 3

Bz-Ile-GlufOisoPrl-Glv-Ara-oNA . HC1 fmolekvlvæat 776.31

Syntesen gennemføres ifølge fremgangsmåden ifølge eksempel 2, men 25 absolut isopropanol benyttes i stedet for ethanol. Reaktionen er forløbet til ende efter 16 timer. Chromatografi og frysetørring gennemføres ved procedurerne ifølge eksempel 2.

Udbytte: 90 mg (58%)

Homogen ifølge TLC, Rf = 0,44 ?0 T

30 [a]p -36,4° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)

Eksempel 4

Bz-Ile-GlufO-cvclohexvll-Glv-Ara-pNA » HC1 fmolekvlvæat 833.31 35 60 /il S0C1 g sættes til 1,0 ml tør cyclohexanol, og efter 1 time ved stuetemperatur tilsættes 200 mg S-2222. Når reaktionen er forløbet til ende efter ca. 12 timer inddampes opløsningen og chromatogra-feres ved procedurerne ifølge eksemplerne 2 og 3, hvorefter

DK 155333 B

7 produktet frysetørres.

Udbytte: 170 mg (75%)

Homogen ifølge TLC, R^ * 0,50 [a]ø° -38,6® (c: 0,5, 50% H0Ac/H20) 5

Eksempel 5

Bz-Ile-Glu(0-CH2CH2N(CH3)2)-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 859,8) 10 75 mg (0,10 mmol) S-2222 Og 100 mg (0,8 mmol) dimethylaminoethanol-hydrochlorid opløses i 1,0 ml tørt destilleret DMF, hvorefter 10 μΐ pyridin, 10 mg HOBT (0,074 mmol) og til slut 25 mg (0,12 mmol) DCCI tilsættes. Det dannede dicyclohexyluri nstof filtreres efter ca. 24 15 timer, og DMF-opløsningen inddampes under reduceret tryk. Den tilbageblevne olie opløses derefter i en lille mængde 95% MeOH - 5%

HgO og renses på en søjle indeholdende QAE-25 ionbytter på chlorid-form. Den samme opløsningsmiddelblanding benyttes som elueringsmid-del. Ved denne fremgangsmåde fremkommer hydrochloridet af dimethyl -20 aminoethylesteren fri for andre peptider, men det indeholder nogle mindre urenheder, f.eks. dimethyl aminoethanolhydrochlorid. Fraktionen, som indeholder dimethyl aminoethylesteren, inddampes og renses ved chromatografi på en søjle indeholdende "Sephadex G15" (Pharmacia Fine Chemicals) i 10% H0Ac/H20. Opløsningen af den rene ester 25 frysetørres.

Udbytte: 60 mg (58%)

Homogen ifølge TLC, = 0,50 [a]p° -35,0° (c: 0,5, 50% H0Ac/H20) 30 Eksempel 6

Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 775,3) conh-ch(ch3)2 35 240 mg (0,33 mmol) S-2222 Og 45 mg (0,39 mmol) HOSu opløses i 1 ml tørt destilleret DMF. Opløsningen afkøles til -5®C, og 120 mg (0,58 mmol) DCCI tilsættes. Temperaturen får lov at stige til stuetemperatur, og efter 4 timer køles opløsningen igen ned til 0®C, og det

DK 155333 E

8 udfældede dicyclohexylurinstof frafiltreres og vaskes. DMF-Opløs-ningen (ca. 2 ml) afkøles til 0eC, og der tilsættes 0,1 ml rent isopropylamin. Efter ca. 70 timer ved stuetemperatur inddampes opløsningen under reduceret tryk, blandes med 5 ml vand og inddampes 5 igen. Produktet opløses i ca. 4 ml 50% HOAc/F^O og renses ved chromatografi på en søjle indeholdende "Sephadex G 15" (Pharmacia Fine Chemicals) i 33% HOAc/HgO. Samme blanding af opløsningsmidler benyttes som elueringsmiddel. Den fraktion, som indeholder det rene isopropyl amid, inddampes og ionbyttes på en søjle indeholdende 10 kvaternært aminoethylsepharose, QAE25, (Pharmacia Fine Chemicals) på chloridform i 95% MeOH, 5% Η,,Ο. Eluatet inddampes, opløses i vand og frysetørres.

Udbytte: 120 mg (47%)

Homogen ifølge TLC, = 0,39 15 [a]p5 -30,6° (c: 0,5, MeOH)

Eksempel 7

Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 802,3)

" “O

25 Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 6, men piperidin benyttes i stedet for isopropylamin.

Udbytte: 105 mg (40%)

Homogen ifølge TLC, = 0,50 [a]|5 -34° (c: 0*5, MeOH) 30

Eksempel 8

Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 822,3) 35 CON(CH2-CH2-OH)2

Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 6, men di ethanolamin benyttes i stedet for isopropylamin.

DK 155333 B

9

Udbytte: 120 mg (45%)

Homogen ifølge TLC, = 0,25 [α]β5 -31° (c: 0,5, MeOH) 5 Eksempel 9

Bz-Ile-AspiOisoPrl-Glv-Ara-pNA . HC1 (molekylvægt, 762.31 30 μΐ Destilleret S0C12 sættes til 0,5 ml tør isopropanol, og efter 10 30 minutter ved stuetemperatur tilsættes 73 mg (0,10 mmol) Bz-Ile-

Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 720,2). Når reaktionen er forløbet til ende efter ca. 18 timer inddampes opløsningen, chromatografe-res og frysetørres ved fremgangsmåderne ifølge eksemplerne 2, 3 og 4.

15 Udbytte: 32 mg (42%)

Homogen ifølge TLC, R^ = 0,46 [a]p3 -22,7* (c: 0,5, 50% H0Ac/H20)

Eksempel 10 20

Bz-Ile-AspiOEtl-Glv-Ara-pNA » HC1 (molekylvægt 748.21

Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 9, men ethanol benyttes i stedet for isopropanol.

25 Udbytte: 28 mg (37%)

Homogen ifølge TLC, R^. = 0,40 [a]p3 -23,5° (c: 0,5, 50% H0Ac/H20)

Eksempel 11 30

Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 761,3) :onh-ch(ch3)2 35

Syntesen gennemføres med fremgangsmåden ifølge eksempel 6, men Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 benyttes som udgangsmateriale i stedet for $-2222.

Udbytte: 100 mg (40%)

DK 155333 B

10

Homogen ifølge TLC, = 0,40 [a]p5 -20,1° (c: 0,5, MeOH)

Eksempel 12 5

Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 818,3) I /~Λ

CON O

W

10 _

Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 11, men morpholin benyttes i stedet for isopropylamin.

Udbytte: 95 mg (35%) 15 Homogen ifølge TLC, Rf = 0,46 [a]p5 -24,2e (c: 0,5, MeOH)

Eksempel 13 20 Bz-Ile-GlufOMel-Glv-Arg-fl-NA » HC1 (molekylvægt = 753.31

Til 400 mg (0,53 mmol) af methyl esteren af S-2222 (fra eksempel 1) opløst i 240 ml 0,1M NaHCO^ (aq.), (pH = 8,2) sættes 0,1 mg trypsin (porcint trypsin, Novo). Efter 30 minutter er pNA fraspaltet, og der 25 tilsættes 3 ml koncentreret HOAc (pH = 4,2). Det hele frysetørres, og det frysetørrede produkt opløses i MeOH og chromatograferes på Sephadex LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmiddel. Hydrochloridet af den rene syre, Bz-Ile-Glu(OMe)-Gly-Arg-OH (13.a), frysetørres.

Udbytte: 286 mg (87%).

30 TLC(R^ - 0,14)· udviser kun en enkelt plet.

Til en opløsning af 158 mg (0,11 mmol) j3-napthylamin i 5 ml tør pyridin sættes under afkøling i isbad 50 /il PCI^ (0,055 mmol) opløst i 1 ml tør pyridin. Reaktionen får lov til at forløbe under omrøring 35 i 30 minutter. Til 1/10 af den klare reaktionsopløsning sættes 58,2 mg (0,10 mmol) af 13.a. Reaktionen får lov til at forløbe i 2 døgn og inddampes derefter til en olie. Olien opløses i nogle ml 90% Et0H/10% HgO og chromatograferes og ionbyttes på en søjle med QAE · 25 i chloridform i 90% EtOH/10% HgO.

DK 155333B

11

Fraktionen med rent Ø-naphthylamid frysetørres efter først at være blevet inddampet og opløst i H20.

Udbytte: 16 mg (21%) af 13.

TLC (Rp - 0,43) udviser en enkelt plet.

5 [a]p5 -41,3° (c: 0,5, 50% H0Ac/H20)

Eksempel 14

Bz-Π e-Gl u-Gly-Arg-4-Me0-jS-NA . HC1

10 I

C0NH-CH(CH3)2 (molekylvægt = 810,4) 15 400 mg (0,51 mmol) Af isopropyl amidet af S-2222 (fra eksempel 6) behandles med trypsin analogt med methyl esteren af S-2222 i eksempel 13, og Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH (14.a.) i soleredes svarende til eksem- C0NH-CH(CH3)2 20 pel 13.

Udbytte af 14.a: 295 mg (88%).

TLC (Rf = 0,12) udviser kun en plet.

25 Til en opløsning af 231 mg (0,11 mmol) 4-MeO-Ø-NA - HC1 i 5 ml tør pyridin sættes under afkøling i isbad 50 øl PC13 (0,055 mmol) i 1 ml tør pyridin. Reaktionen får lov til under omrøring at forløbe i 30 minutter. Til 1/10 af den klare reaktionsopløsning sættes i isbad 65,5 mg (0,10 mmol) af 14.a. Reaktionen får lov til at forløbe i 2 30 døgn og inddampes derefter til en olie. Olien opløses i nogle ml 90% EtOH/10% H20 og chromatograferes og ionbyttes på en søjle af QAE · 25 i chloridform i 90% EtOH/10% H20.

Fraktionen med rent 4-methoxy-^-naphthylamid frysetørres efter først 35 at være inddampet og opløst i H20.

Udbytte af 14: 24 mg (30%).

TLC (Rf = 0,42) udviste kun en plet.

[a]p5 -31,2° (c: 0,5, MeOH).

DK 155333 B

12

Eksempel 15

Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 I ^ ^ 5 CON^ p (molekylvægt 803,3)

Udførelsen og mængderne var nøjagtig som i eksempel 6, men under 10 anvendelse af morpholin som amin i stedet for isopropylamin.

Udbytte: 145 mg (55%) af 15.

TLC (Rf = 0,35) udviste kun en plet.

[a]*5 -31,Γ (c: 0,5, 50% HOAc/HgO).

15 Eksempel 16

Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 ίθΐ/""”\ (molekylvægt = 845,4) 20 1,69 g (2 mmol) H-Ile-Glu(0Bzl)-Gly-Arg-(N02)-pNA · TFA Opløstes i 4 ml DMF og neutraliseredes i kulde (-10°C) med EtgN, indtil man med 25 et pH-papir opnåede basisk reaktion for reaktionsopløsningen. Til den frigjorte amin sættes 435 mg (2,2 mmol) AcOpNp. Efter et døgn inddampes reaktionsopløsningen til en olie, som krystalliseres fra MeOH + H20. Den opnåede Ac-Ile-Glu(0Bzl)-Gly-Arg-(N02)pNA (16.a.) er ved TLC ren.

30 Udbytte: 1,40 g (89%).

1,0 g (1,25 mmol) Af 16.a afbeskyttes med 30 ml HF ved 0°C i 1 time.

Efter inddampning opløses produktet i 10% H0Ac/H20 og chromatografe- res på en søjle af Sephadex G 15 i 10% HOAc/HgO med 10% H0Ac/H2O som 35 elueringsmiddel.

Fraktionen med det rene afbeskyttede produkt frysetørres. Det frysetørrede produkt ionbyttes derefter på en søjle af QAE · 25 i

DK 155333 B

13 chloridform i 90% EtOH/10% H20 med samme opløsning som elueringsmid-del. Det rene produkt, Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (16.b.}, frysetørres .

Udbytte: 660 mg (75%).

227 mg (0,33 mmol) Af 16.b. behandles på samme måde som S-2222 i eksempel 7.

Udbytte: 117 mg (42%) af 16.

TLC (Rf = 0,47) udviser kun en enkelt plet.

[<*]p3 -31 °C (c: 0,5, MeOH).

Bestemmelse af Km oa Vmax

Km og Vmax opnås ud fra Lineweaver-Burk-ligningen: _!__Km_ 1_ . 1_

Vrt _ Vmax * S Vmax o o

Enzym og substrat blandes i en pufferopløsning, og hydrolysehastigheden måles spektrofotometrisk. Substratkoncentrationen (SQ) varieres, medens enzymkoncentrationen holdes konstant. Den reciprokke hastighed _L_ afbildes derefter mod den reciprokke substratkoncen-Vo tration _1_, og Km og Vmax estimeres. so (Tabel 1) ud fra det fremkomne Lineweaver-Burk-diagram.

Reagenser

Puffer Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan) 0,05 mol/1, pH = 8,3, I = 0,25 (NaCl)

Enzvm Diagen (6,4 Denson U) (Diagnostic Reagents), 1 ampul opløses i 2 ml vand.

Substrat Substratet opløses i vand til 2 mmol/1.

Fremgangsmåde Puffer, +37eC, 2400 - 1850 øl ^

Enzym, +20°C 50 øl Τ' 2500 øl

Substrat, +37°C 50 - 600 øl blandes og absorbansændringen (AOD/min.) aflæses ved 405 nm og 37°C.

DK 155333 B

14

Sammenlignende akti- Puffer, +37®C 2200 μΐ vitetsbestemmmelse enzym, +20°C 50 μΐ substrat, +37eC 250 μ\

Der blandes og absorbansændringen (AOD/min.) 5 aflæses ved 405 nm og 37°C.

Tabel 1

Km oa Vmax for sammen!igninassubstrat S-2222 oa substrater ifølge 10 opfinde! sen

Substrat Km · 10^ Vmax · 10®

(eksempel)_mol /1_mol /min . U

15 S-2222 8,3 8,6 1 2,6 8,1 2 2,9 7,5 3 2,1 7,1 20 6 5,6 20,0 7 1,7 8,6

Tabel 2 25 Sammenlignende afprøvning af forbindelserne ifølge opfindelsen oa kendte substrater

Eksempel Sammen!igninassubstrat Relativ aktivitet 30 1 A 230 2 A 200 3 A 220 4 A 180 5 A 150 35 6 A 340 6 C 280 7 A 300 7 C 250 8 C 130

DK 155333 B

15 9 B 400 10 B 350 11 D 170 12 D 130 5 13 F 160 14 G 200 15 C 240 16 C 210 16 E 230 10

Sammenligninossubstraterne er: A = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA = (S-2222)

B = Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA 15 C = Bz-Ile-Gln-Gly-Arg-pNA D = Bz-Ile-Asn-Gly-Arg-pNA E = Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA F = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-/?-NA G = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-4-MeO-/J-NA

20

Det fremgår af ovenstående sammenlignende afprøvning, at ikke blot har forbindelserne ifølge opfindelsen en bedre aktivitet i forhold til det kendte tetrapeptid Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA men også i forhold til tilsvarende asparaginsyreholdigt tetrapeptid.

25 1 35

Claims (2)

1. Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser, kendetegnet ved, at de har den almene 5 formel: R^Ile-A-Gly-Arg-NH-R2, 1. hvor R betegner acetyl eller benzoyl, R betegner p-nitrophenyl, 10 /J-naphthyl eller 4-methoxy-/}-naphthyl, og A betegner Asp eller Glu, hvis carboxyl gruppe er forestret med en alkanol med 1-5 carbon- atomer, cyclohexanol eller dimethylaminoethanol eller er amideret med piperidin, morpholin, diethanolamin eller en alkylamin med 1-5 carbonatomer. 15

2. Anvendelse af tetrapeptiderne ifølge krav 1 til laboratoriebe-stemmelse af serinproteaser. 20 25 30 35