DK155333B - Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser samt laboratorieanvendelse af samme - Google Patents
Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser samt laboratorieanvendelse af samme Download PDFInfo
- Publication number
- DK155333B DK155333B DK535377AA DK535377A DK155333B DK 155333 B DK155333 B DK 155333B DK 535377A A DK535377A A DK 535377AA DK 535377 A DK535377 A DK 535377A DK 155333 B DK155333 B DK 155333B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- ile
- gly
- arg
- pna
- substrate
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title description 33
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 2
- 229960002887 deanol Drugs 0.000 claims description 2
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZYECEUZMVSGTMR-LBDWYMBGSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZYECEUZMVSGTMR-LBDWYMBGSA-N 0.000 description 7
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- -1 β-naphthyl Chemical group 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 5
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYOUYNIRTMZPLG-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxyethyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC(O)[NH+](C)C HYOUYNIRTMZPLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- XUWVIABDWDTJRZ-UHFFFAOYSA-N propan-2-ylazanide Chemical compound CC(C)[NH-] XUWVIABDWDTJRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthylamine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=C1 RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOYWCEUVVIHJKD-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-(1h-pyrazol-5-yl)pyridine Chemical compound C1=NC(C)=CC=C1C1=CC=NN1 FOYWCEUVVIHJKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVMUPDOMGALPOW-UHFFFAOYSA-N 4-methoxynaphthalen-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(OC)=CC=C(N)C2=C1 JVMUPDOMGALPOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPWHTZKZQNXVAE-UHFFFAOYSA-N Tetracaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 PPWHTZKZQNXVAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N paraoxon Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000004992 toluidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940086542 triethylamine Drugs 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/28—Bound to a nonpeptide drug, nonpeptide label, nonpeptide carrier, or a nonpeptide resin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
i
DK 155333 B
Opfindelsen angår hidtil ukendte tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser.
De nye tetrapeptider er især egnede som substrater til bestemmelse 5 af faktor Xa (E.C. 3, 4, 21.6) eller til undersøgelse af reaktioner, som medfører, at Xa dannes, inhiberes eller forbruges, eller til bestemmelse af de faktorer, som influerer på eller deltager i sådanne reaktioner.
10 Faktor X er et nøglestof i den række af reaktioner, som fører til koagulering af blod. Aktivering af faktor X medfører dannelse af det proteolytiske enzym, faktor Xa, som er direkte ansvarligt for overføringen af prothrombin til thrombin. Omdannelsen af prothrombin til thrombin ved hjælp af faktor Xa medfører spaltning af to pep-15 tidbindinger i prothrombinmolekylet. Forud for disse to spaltningssteder går nøjagtig samme aminosyresekvens: -Ile-Glu-Gly-Arg-,
En enkel fremgangsmåde til bestemmelse af koaguleringsfaktor Xa er meget værdifuld til diagnostiske formål. De hidtil bedste reagenser 20 til bestemmelse af Xa-faktoren består af chromogene peptidsubstrater med en aminosyresekvens, -Ile-Glu-Gly-Arg-, svarende til den sekvens, der går forud for spaltningsstederne i det naturlige substrat, prothrombin.
25 Således kendes fra svensk fremlæggelsesskrift nr. 407.058 tetrapep-tidet benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2222), der har en aminosyresekvens, som er identisk med den ovenfor omtalte del af det naturlige substrat. Dette tetrapeptid har allerede fundet anvendelse som substrat ved kliniske analyser for f.eks. Xa-antifaktoren og 30 Heparin (A.N. Teien, M. Lie og U. Abildgaard, Thrombosis Research 8, 413, 1976). Metoderne er baseret på følgende reaktion:
Bz-Πe-Glu-Gly-Arg-pNA ^L» Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + pNA
35 Det frigivne p-nitroanilid (pNA) har et lysabsorptionsmaksimum, der afviger fra substratets, og den enzymatiske reaktion kan derfor let følges ved at måle forøgelsen i absorption ved 405 nm, hvilken forøgelse er proportional med mængden af den aktive faktor Xa.
DK 155333 B
2
Et stort antal syntetiske substrater for Xa-faktoren er blevet beskrevet af L. Aurell, G. Claeson, G. Karlsson og P. Friberger i Peptides 1976, side 191, Proc. from the XIVth European Peptide Symposium, Weipon, Belgien, 1976. Aminosyrerne i den naturlige 5 sekvens varieredes. De erstattedes igen af andre tilsvarende aminosyrer, men i intet tilfælde opnåedes et bedre substrat end med S-2222. Selv meget små forandringer i den naturlige sekvens, såsom udskiftning af Ile med Leu, giver substrater med meget lavere følsomhed.
10
Ud over ovennævnte tetrapeptid S-2222 kendes der fra ovenanførte svenske fremlæggelsesksrift nr. 407.059 også tetrapeptider, hvori GIu er erstattet med Gin, Asp eller Asn (jvf. efterfølgende forklaring af de heri benyttede forkortelser).
15
Det har imidlertid nu vist sig muligt at tilvejebringe tetrapeptider med en højere følsomhed som substrat for serinproteaser end de hidtil kendte, ovenfor omtalte glutamin- eller asparaginsyreholdige tetrapeptider, jvf. efterfølgende tabel 1 og 2.
20
Dette opnås ifølge opfindelsen med de hidtil ukendte tetrapeptider, der er ejendommelige ved, at de har den almene formel: R^Ile-A-Gly-Arg-NH-R2, 25 1 2 hvor R betegner acetyl eller benzoyl, R betegner p-nitrophenyl, /i-naphthyl eller 4-methoxy-j8-naphthyl, og A betegner Asp eller Glu, hvis carboxyl gruppe er forestret med en alkanol med 1-5 carbon- atomer, cyclohexanol eller dimethylaminoethanol eller er amideret 30 med piperidin, morpholin, diethanolamin eller en alkylamin med 1-5 carbonatomer.
De aromatiske grupper giver ved enzymatisk hydrolyse en chromofor eller fluorescerende forbindelse, hvis koncentration kan måles 35 spektrofotometrisk.
Egnede estere indeholder en kort al kyl-, dimethylaminoethyl- eller cyclohexylgruppe. Egnede amider indeholder en kort al kyl-, hydroxy-ethyl- eller en heterocyklisk gruppe, hvori amidnitrogenet udgør en
DK 155333 B
3 del af en piperidin- eller morpholinring.
Den naturlige γ-carboxygruppe i Glu, som ved biologiske pH-værdier har en negativ ladning og er hydrofil, er ifølge opfindelsen blevet 5 udskiftet med en betydeligt større gruppe, som er neutral eller lipolfil. Eftersom forandringer i den naturlige sekvens, -Ile-Glu-Gly-Arg-, hidtil kun har givet dårlige substrater (L. Aurell, G. Claeson, G. Karlsson og P. Friberger i Peptides 1976, side 191,
Proc. from the XIVth European Peptide Symposium, Weipon, Belgien, 10 1976), er det meget overraskende, at de forholdsvis store foran dringer, som-er blevet foretaget ifølge den foreliggende opfindelse, har resulteret i substrater med fundamentalt bedre egenskaber (se efterfølgende Tabel 1 og 2) end det hidtil bedste substrat, S-2222.
Det drastiske fald i værdien af Michael is-konstanten (Km) er den 15 mest slående, og i forbindelse med praktisk arbejde den mest betydningsfulde forbedring, der opnås med de nye substrater. Km Er defineret som den substratkoncentration, der kræves for opnåelse af halvdelen af den maksimale hastighed (Vmax). De tidligere substrater og også substraterne ifølge opfindelsen har begrænsede opløselig-20 heder, og af denne grund bør substratkoncentrationen være under 1 mM ved arbejde i pufferopløsning og blodplasma i praksis. Med S-2222, som har Km = 0,83 mM, kan man kun benytte Vmax/2 fuldt ud, hvorimod man med substraterne ifølge opfindelsen, som har en 2-5 gange lavere Km-værdi, kan udnytte den maksimale hastighed meget bedre. Der opnås 25 således indlysende fordele, når Xa-faktorens aktivitet måles med de nye substrater. Deres følsomhed er flere hundrede procent højere end følsomheden af S-2222, hvilket muliggør en meget større præcision, en fundamentalt lavere følsomhedsgrænse og et stærkt reduceret blodprøverumfang.
30
Enzymanalyser ved hjælp af tetrapeptiderne ifølge opfindelsen er særdeles velegnede til gennemførelse i autoanalysatorer, og den højere følsomhed af disse nye substrater medfører en kortere reaktionstid i apparatet og gør det dermed også muligt at analysere 35 flere prøver pr. tidsenhed.
Opfindelsen angår derfor også en anvendelse af tetrapeptiderne ifølge opfindelsen til laboratoriebestemmelse af serinproteaser.
DK 155333 B
4
De nye tetrapeptider ifølge opfindelsen kan fremstilles ud fra chromogene eller fluorogene forbindelser indeholdende aminosyrese-kvensen -Ile-Gly-Gly-Arg- eller Ile-Asp-Gly-Arg- ved esterificering eller amidering af den frie γ- eller ^-carboxylgruppe ved fremgangs-5 måder, som er velkendte og almindeligt anvendte inden for peptidkemien.
Nedenstående eksempler tjener til at belyse opfindelsen.
10 Ved tyndtlagschromatografiske analyser af eluater og produkter benyttedes glasplader med silicagel (Merck) som absorptionsmedium. Det anvendte opløsningsmiddel system er chloroform, methanol, eddikesyre og vand i volumenforholdet 34:4:9:2.
15 Efter tyndt!agschromatograferingen undersøgtes pladerne først i UV-lys (254 nm) og derefter under anvendelse af chlor/toluidinreak-tionen (G. Pataki, Dunnschichtchromatografie in der Aminosåure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co., Berlin, side 125, 1966) som fremkaldel sesmetode.
20
Betydningen af de heri anvendte forkortelser er følgende:
Aminosyrer: 25 Disse forkortelser refererer til aminosyrerester. Den fri aminosyre eller det frie peptid angives ved et H- ved aminogruppen og -OH ved carboxylgruppen. Aminogruppen er altid angivet til venstre og carboxylgruppen til højre.
30 Med mindre andet angives, har alle anvendte aminosyrer L-konfigura-tion.
ARG = Arginin Asp = Asparaginsyre 35 Glu - GIutaminsyre Gly = Glycin Ile = Isoleucin Leu = Leucin Asn = Asparagin
DK 155333 B
5
Gin = Glutamin
Yderligere forkortelser: 5 Ac = Acetyl
AcOH = Eddikesyre (eng.: Acetic acid)
Bz = Benzoyl DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid DMF = Dimethylformamid 10 EtjN = Tri ethylamin HOBT = a-Hydroxybenzotriazol HOSu = N-Hydroxysuccinimid
MeOH = Methanol OEt = Ethyloxy 15 OMe = Methyloxy
OpNp = p-Nitrophenoxy
OisoPr = i so-Propyloxy pNA = p-Nitroanilid
ArgiNOg) = Nw-nitroarginyl 20 OBzl = Benzyloxy NA = Naphthyl amid TFA = Tri fluoreddikesyre QAE - Kvaternært aminoethylsepharose (eng.: Quarternary amino-ethylsepharose) (Pharmacia Fine Chemicals) 25 S0C1g = Thionylchlorid
Eksempel 1
Bz-Ile-GlufOMel-Glv-Ara-oNA . HC1 (molekylvægt 748.21 30
Under fugtfrie betingelser, ved 0°C, tilsættes 30 /il destilleret SOC12 til 0,5 ml absolut methanol. Efter den første livlige reaktion henstår opløsningen i ca. 15 minutter ved stuetemperatur, og 75 mg (0,10 mmol) Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 ($-2222) tilsættes. Opløs-35 ni ngen omrøres i 5 timer og inddampes derefter. Den fremkomne olie opløses i en lille mængde ethanol og renses ved gelchromatografi på en søjle indeholdende "Sephadex LH-20" (Pharmacia Fine Chemicals) i methanol med methanol som elueringsmiddel. Den rene methylester, som fremkommer efter afdampning af methanol en, opløses i vand og
DK 155333 B
6 frysetørres. Udbytte 30 mg (40%). Homogen ifølge TLC, = 0,33.
[α]ρ° -40,3° (c 0,5, 50% HOAc/HgO)
Eksempel 2 5
Bz-Ile-GluiOEtl-Glv-Ara-pNA . HC1 Molekylvægt 762.21
Under fugtfrie betingelser, ved -10°C, tilsættes 60 /il destilleret SOClg til 1,0 ml absolut ethanol. Efter 30 minutter ved stuetempe-10 ratur tilsættes 150 mg S-2222. Når reaktionen er forløbet til ende efter ca. 15 timer (ifølge TLC) inddampes opløsningen. Den fremkomne olie opløses i en lille mængde 30% HOAc i HgO og renses ved chroma-tografi på en søjle indeholdende "Sephadex G 15" (Pharmacia Fine Chemicals) i 10% HOAc i HgO. Den rene ethyl ester fra eluatet fryse-15 tørres.
Udbytte: 70 mg (46%)
Homogen ifølge TLC, R^ = 0,40 [a]p° -37,7° (c 0,5, 50% H0Ac/H20) 20 Eksempel 3
Bz-Ile-GlufOisoPrl-Glv-Ara-oNA . HC1 fmolekvlvæat 776.31
Syntesen gennemføres ifølge fremgangsmåden ifølge eksempel 2, men 25 absolut isopropanol benyttes i stedet for ethanol. Reaktionen er forløbet til ende efter 16 timer. Chromatografi og frysetørring gennemføres ved procedurerne ifølge eksempel 2.
Udbytte: 90 mg (58%)
Homogen ifølge TLC, Rf = 0,44 ?0 T
30 [a]p -36,4° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Eksempel 4
Bz-Ile-GlufO-cvclohexvll-Glv-Ara-pNA » HC1 fmolekvlvæat 833.31 35 60 /il S0C1 g sættes til 1,0 ml tør cyclohexanol, og efter 1 time ved stuetemperatur tilsættes 200 mg S-2222. Når reaktionen er forløbet til ende efter ca. 12 timer inddampes opløsningen og chromatogra-feres ved procedurerne ifølge eksemplerne 2 og 3, hvorefter
DK 155333 B
7 produktet frysetørres.
Udbytte: 170 mg (75%)
Homogen ifølge TLC, R^ * 0,50 [a]ø° -38,6® (c: 0,5, 50% H0Ac/H20) 5
Eksempel 5
Bz-Ile-Glu(0-CH2CH2N(CH3)2)-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 859,8) 10 75 mg (0,10 mmol) S-2222 Og 100 mg (0,8 mmol) dimethylaminoethanol-hydrochlorid opløses i 1,0 ml tørt destilleret DMF, hvorefter 10 μΐ pyridin, 10 mg HOBT (0,074 mmol) og til slut 25 mg (0,12 mmol) DCCI tilsættes. Det dannede dicyclohexyluri nstof filtreres efter ca. 24 15 timer, og DMF-opløsningen inddampes under reduceret tryk. Den tilbageblevne olie opløses derefter i en lille mængde 95% MeOH - 5%
HgO og renses på en søjle indeholdende QAE-25 ionbytter på chlorid-form. Den samme opløsningsmiddelblanding benyttes som elueringsmid-del. Ved denne fremgangsmåde fremkommer hydrochloridet af dimethyl -20 aminoethylesteren fri for andre peptider, men det indeholder nogle mindre urenheder, f.eks. dimethyl aminoethanolhydrochlorid. Fraktionen, som indeholder dimethyl aminoethylesteren, inddampes og renses ved chromatografi på en søjle indeholdende "Sephadex G15" (Pharmacia Fine Chemicals) i 10% H0Ac/H20. Opløsningen af den rene ester 25 frysetørres.
Udbytte: 60 mg (58%)
Homogen ifølge TLC, = 0,50 [a]p° -35,0° (c: 0,5, 50% H0Ac/H20) 30 Eksempel 6
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 775,3) conh-ch(ch3)2 35 240 mg (0,33 mmol) S-2222 Og 45 mg (0,39 mmol) HOSu opløses i 1 ml tørt destilleret DMF. Opløsningen afkøles til -5®C, og 120 mg (0,58 mmol) DCCI tilsættes. Temperaturen får lov at stige til stuetemperatur, og efter 4 timer køles opløsningen igen ned til 0®C, og det
DK 155333 E
8 udfældede dicyclohexylurinstof frafiltreres og vaskes. DMF-Opløs-ningen (ca. 2 ml) afkøles til 0eC, og der tilsættes 0,1 ml rent isopropylamin. Efter ca. 70 timer ved stuetemperatur inddampes opløsningen under reduceret tryk, blandes med 5 ml vand og inddampes 5 igen. Produktet opløses i ca. 4 ml 50% HOAc/F^O og renses ved chromatografi på en søjle indeholdende "Sephadex G 15" (Pharmacia Fine Chemicals) i 33% HOAc/HgO. Samme blanding af opløsningsmidler benyttes som elueringsmiddel. Den fraktion, som indeholder det rene isopropyl amid, inddampes og ionbyttes på en søjle indeholdende 10 kvaternært aminoethylsepharose, QAE25, (Pharmacia Fine Chemicals) på chloridform i 95% MeOH, 5% Η,,Ο. Eluatet inddampes, opløses i vand og frysetørres.
Udbytte: 120 mg (47%)
Homogen ifølge TLC, = 0,39 15 [a]p5 -30,6° (c: 0,5, MeOH)
Eksempel 7
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 802,3)
" “O
25 Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 6, men piperidin benyttes i stedet for isopropylamin.
Udbytte: 105 mg (40%)
Homogen ifølge TLC, = 0,50 [a]|5 -34° (c: 0*5, MeOH) 30
Eksempel 8
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 822,3) 35 CON(CH2-CH2-OH)2
Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 6, men di ethanolamin benyttes i stedet for isopropylamin.
DK 155333 B
9
Udbytte: 120 mg (45%)
Homogen ifølge TLC, = 0,25 [α]β5 -31° (c: 0,5, MeOH) 5 Eksempel 9
Bz-Ile-AspiOisoPrl-Glv-Ara-pNA . HC1 (molekylvægt, 762.31 30 μΐ Destilleret S0C12 sættes til 0,5 ml tør isopropanol, og efter 10 30 minutter ved stuetemperatur tilsættes 73 mg (0,10 mmol) Bz-Ile-
Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 720,2). Når reaktionen er forløbet til ende efter ca. 18 timer inddampes opløsningen, chromatografe-res og frysetørres ved fremgangsmåderne ifølge eksemplerne 2, 3 og 4.
15 Udbytte: 32 mg (42%)
Homogen ifølge TLC, R^ = 0,46 [a]p3 -22,7* (c: 0,5, 50% H0Ac/H20)
Eksempel 10 20
Bz-Ile-AspiOEtl-Glv-Ara-pNA » HC1 (molekylvægt 748.21
Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 9, men ethanol benyttes i stedet for isopropanol.
25 Udbytte: 28 mg (37%)
Homogen ifølge TLC, R^. = 0,40 [a]p3 -23,5° (c: 0,5, 50% H0Ac/H20)
Eksempel 11 30
Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 761,3) :onh-ch(ch3)2 35
Syntesen gennemføres med fremgangsmåden ifølge eksempel 6, men Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 benyttes som udgangsmateriale i stedet for $-2222.
Udbytte: 100 mg (40%)
DK 155333 B
10
Homogen ifølge TLC, = 0,40 [a]p5 -20,1° (c: 0,5, MeOH)
Eksempel 12 5
Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA · HC1 (molekylvægt 818,3) I /~Λ
CON O
W
10 _
Syntesen gennemføres ved fremgangsmåden ifølge eksempel 11, men morpholin benyttes i stedet for isopropylamin.
Udbytte: 95 mg (35%) 15 Homogen ifølge TLC, Rf = 0,46 [a]p5 -24,2e (c: 0,5, MeOH)
Eksempel 13 20 Bz-Ile-GlufOMel-Glv-Arg-fl-NA » HC1 (molekylvægt = 753.31
Til 400 mg (0,53 mmol) af methyl esteren af S-2222 (fra eksempel 1) opløst i 240 ml 0,1M NaHCO^ (aq.), (pH = 8,2) sættes 0,1 mg trypsin (porcint trypsin, Novo). Efter 30 minutter er pNA fraspaltet, og der 25 tilsættes 3 ml koncentreret HOAc (pH = 4,2). Det hele frysetørres, og det frysetørrede produkt opløses i MeOH og chromatograferes på Sephadex LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmiddel. Hydrochloridet af den rene syre, Bz-Ile-Glu(OMe)-Gly-Arg-OH (13.a), frysetørres.
Udbytte: 286 mg (87%).
30 TLC(R^ - 0,14)· udviser kun en enkelt plet.
Til en opløsning af 158 mg (0,11 mmol) j3-napthylamin i 5 ml tør pyridin sættes under afkøling i isbad 50 /il PCI^ (0,055 mmol) opløst i 1 ml tør pyridin. Reaktionen får lov til at forløbe under omrøring 35 i 30 minutter. Til 1/10 af den klare reaktionsopløsning sættes 58,2 mg (0,10 mmol) af 13.a. Reaktionen får lov til at forløbe i 2 døgn og inddampes derefter til en olie. Olien opløses i nogle ml 90% Et0H/10% HgO og chromatograferes og ionbyttes på en søjle med QAE · 25 i chloridform i 90% EtOH/10% HgO.
DK 155333B
11
Fraktionen med rent Ø-naphthylamid frysetørres efter først at være blevet inddampet og opløst i H20.
Udbytte: 16 mg (21%) af 13.
TLC (Rp - 0,43) udviser en enkelt plet.
5 [a]p5 -41,3° (c: 0,5, 50% H0Ac/H20)
Eksempel 14
Bz-Π e-Gl u-Gly-Arg-4-Me0-jS-NA . HC1
10 I
C0NH-CH(CH3)2 (molekylvægt = 810,4) 15 400 mg (0,51 mmol) Af isopropyl amidet af S-2222 (fra eksempel 6) behandles med trypsin analogt med methyl esteren af S-2222 i eksempel 13, og Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH (14.a.) i soleredes svarende til eksem- C0NH-CH(CH3)2 20 pel 13.
Udbytte af 14.a: 295 mg (88%).
TLC (Rf = 0,12) udviser kun en plet.
25 Til en opløsning af 231 mg (0,11 mmol) 4-MeO-Ø-NA - HC1 i 5 ml tør pyridin sættes under afkøling i isbad 50 øl PC13 (0,055 mmol) i 1 ml tør pyridin. Reaktionen får lov til under omrøring at forløbe i 30 minutter. Til 1/10 af den klare reaktionsopløsning sættes i isbad 65,5 mg (0,10 mmol) af 14.a. Reaktionen får lov til at forløbe i 2 30 døgn og inddampes derefter til en olie. Olien opløses i nogle ml 90% EtOH/10% H20 og chromatograferes og ionbyttes på en søjle af QAE · 25 i chloridform i 90% EtOH/10% H20.
Fraktionen med rent 4-methoxy-^-naphthylamid frysetørres efter først 35 at være inddampet og opløst i H20.
Udbytte af 14: 24 mg (30%).
TLC (Rf = 0,42) udviste kun en plet.
[a]p5 -31,2° (c: 0,5, MeOH).
DK 155333 B
12
Eksempel 15
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 I ^ ^ 5 CON^ p (molekylvægt 803,3)
Udførelsen og mængderne var nøjagtig som i eksempel 6, men under 10 anvendelse af morpholin som amin i stedet for isopropylamin.
Udbytte: 145 mg (55%) af 15.
TLC (Rf = 0,35) udviste kun en plet.
[a]*5 -31,Γ (c: 0,5, 50% HOAc/HgO).
15 Eksempel 16
Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 ίθΐ/""”\ (molekylvægt = 845,4) 20 1,69 g (2 mmol) H-Ile-Glu(0Bzl)-Gly-Arg-(N02)-pNA · TFA Opløstes i 4 ml DMF og neutraliseredes i kulde (-10°C) med EtgN, indtil man med 25 et pH-papir opnåede basisk reaktion for reaktionsopløsningen. Til den frigjorte amin sættes 435 mg (2,2 mmol) AcOpNp. Efter et døgn inddampes reaktionsopløsningen til en olie, som krystalliseres fra MeOH + H20. Den opnåede Ac-Ile-Glu(0Bzl)-Gly-Arg-(N02)pNA (16.a.) er ved TLC ren.
30 Udbytte: 1,40 g (89%).
1,0 g (1,25 mmol) Af 16.a afbeskyttes med 30 ml HF ved 0°C i 1 time.
Efter inddampning opløses produktet i 10% H0Ac/H20 og chromatografe- res på en søjle af Sephadex G 15 i 10% HOAc/HgO med 10% H0Ac/H2O som 35 elueringsmiddel.
Fraktionen med det rene afbeskyttede produkt frysetørres. Det frysetørrede produkt ionbyttes derefter på en søjle af QAE · 25 i
DK 155333 B
13 chloridform i 90% EtOH/10% H20 med samme opløsning som elueringsmid-del. Det rene produkt, Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA · HC1 (16.b.}, frysetørres .
Udbytte: 660 mg (75%).
227 mg (0,33 mmol) Af 16.b. behandles på samme måde som S-2222 i eksempel 7.
Udbytte: 117 mg (42%) af 16.
TLC (Rf = 0,47) udviser kun en enkelt plet.
[<*]p3 -31 °C (c: 0,5, MeOH).
Bestemmelse af Km oa Vmax
Km og Vmax opnås ud fra Lineweaver-Burk-ligningen: _!__Km_ 1_ . 1_
Vrt _ Vmax * S Vmax o o
Enzym og substrat blandes i en pufferopløsning, og hydrolysehastigheden måles spektrofotometrisk. Substratkoncentrationen (SQ) varieres, medens enzymkoncentrationen holdes konstant. Den reciprokke hastighed _L_ afbildes derefter mod den reciprokke substratkoncen-Vo tration _1_, og Km og Vmax estimeres. so (Tabel 1) ud fra det fremkomne Lineweaver-Burk-diagram.
Reagenser
Puffer Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan) 0,05 mol/1, pH = 8,3, I = 0,25 (NaCl)
Enzvm Diagen (6,4 Denson U) (Diagnostic Reagents), 1 ampul opløses i 2 ml vand.
Substrat Substratet opløses i vand til 2 mmol/1.
Fremgangsmåde Puffer, +37eC, 2400 - 1850 øl ^
Enzym, +20°C 50 øl Τ' 2500 øl
Substrat, +37°C 50 - 600 øl blandes og absorbansændringen (AOD/min.) aflæses ved 405 nm og 37°C.
DK 155333 B
14
Sammenlignende akti- Puffer, +37®C 2200 μΐ vitetsbestemmmelse enzym, +20°C 50 μΐ substrat, +37eC 250 μ\
Der blandes og absorbansændringen (AOD/min.) 5 aflæses ved 405 nm og 37°C.
Tabel 1
Km oa Vmax for sammen!igninassubstrat S-2222 oa substrater ifølge 10 opfinde! sen
Substrat Km · 10^ Vmax · 10®
(eksempel)_mol /1_mol /min . U
15 S-2222 8,3 8,6 1 2,6 8,1 2 2,9 7,5 3 2,1 7,1 20 6 5,6 20,0 7 1,7 8,6
Tabel 2 25 Sammenlignende afprøvning af forbindelserne ifølge opfindelsen oa kendte substrater
Eksempel Sammen!igninassubstrat Relativ aktivitet 30 1 A 230 2 A 200 3 A 220 4 A 180 5 A 150 35 6 A 340 6 C 280 7 A 300 7 C 250 8 C 130
DK 155333 B
15 9 B 400 10 B 350 11 D 170 12 D 130 5 13 F 160 14 G 200 15 C 240 16 C 210 16 E 230 10
Sammenligninossubstraterne er: A = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA = (S-2222)
B = Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA 15 C = Bz-Ile-Gln-Gly-Arg-pNA D = Bz-Ile-Asn-Gly-Arg-pNA E = Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA F = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-/?-NA G = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-4-MeO-/J-NA
20
Det fremgår af ovenstående sammenlignende afprøvning, at ikke blot har forbindelserne ifølge opfindelsen en bedre aktivitet i forhold til det kendte tetrapeptid Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA men også i forhold til tilsvarende asparaginsyreholdigt tetrapeptid.
25 1 35
Claims (2)
1. Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser, kendetegnet ved, at de har den almene 5 formel: R^Ile-A-Gly-Arg-NH-R2, 1. hvor R betegner acetyl eller benzoyl, R betegner p-nitrophenyl, 10 /J-naphthyl eller 4-methoxy-/}-naphthyl, og A betegner Asp eller Glu, hvis carboxyl gruppe er forestret med en alkanol med 1-5 carbon- atomer, cyclohexanol eller dimethylaminoethanol eller er amideret med piperidin, morpholin, diethanolamin eller en alkylamin med 1-5 carbonatomer. 15
2. Anvendelse af tetrapeptiderne ifølge krav 1 til laboratoriebe-stemmelse af serinproteaser. 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7613463 | 1976-12-01 | ||
| SE7613463A SE437153B (sv) | 1976-12-01 | 1976-12-01 | Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK535377A DK535377A (da) | 1978-06-02 |
| DK155333B true DK155333B (da) | 1989-03-28 |
| DK155333C DK155333C (da) | 1989-09-04 |
Family
ID=20329625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK535377A DK155333C (da) | 1976-12-01 | 1977-12-01 | Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser samt laboratorieanvendelse af samme |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4207232A (da) |
| JP (1) | JPS5369693A (da) |
| AT (1) | AT358203B (da) |
| AU (1) | AU514768B2 (da) |
| BE (1) | BE861295A (da) |
| CA (1) | CA1098428A (da) |
| CH (1) | CH637627A5 (da) |
| DD (1) | DD136896A5 (da) |
| DE (2) | DE2753653C2 (da) |
| DK (1) | DK155333C (da) |
| ES (1) | ES464117A1 (da) |
| FI (1) | FI773242A7 (da) |
| FR (1) | FR2372798A1 (da) |
| GB (1) | GB1565154A (da) |
| HU (1) | HU176983B (da) |
| IL (1) | IL53187A (da) |
| IT (1) | IT1092154B (da) |
| NL (1) | NL178600C (da) |
| NO (1) | NO774092L (da) |
| PL (2) | PL110803B1 (da) |
| SE (1) | SE437153B (da) |
| SU (1) | SU736889A3 (da) |
| ZA (1) | ZA776460B (da) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE7801373L (sv) * | 1978-02-07 | 1979-08-08 | Kabi Ab | Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| US4409140A (en) * | 1979-04-23 | 1983-10-11 | Smith Robert E | Substrates and method for determining enzymes |
| CA1161432A (en) * | 1980-02-12 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes |
| WO1982000641A1 (en) * | 1980-08-25 | 1982-03-04 | Ab Kabivitrum | Peptide substrates for determination of protease activity |
| US4510241A (en) * | 1981-09-03 | 1985-04-09 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| US4406832A (en) * | 1981-09-03 | 1983-09-27 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| US4448715A (en) * | 1981-11-02 | 1984-05-15 | University Of Miami | Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein |
| DE3211254A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| JPH04501460A (ja) | 1988-09-30 | 1992-03-12 | ザ ユニバーシティ オブ バーモント アンド ステイト アグリカルチュラル カレッジ | 触媒活性セリンプロテアーゼに関する免疫検定法 |
| WO1995004281A1 (en) * | 1993-07-27 | 1995-02-09 | THE UNITED STATES GOVERNMENT, represented by THE ADMINISTRATOR OF THE NATIONAL AERONAUTICS AND SPACE ADMINISTRATION | Quantitative method of measuring cancer cell urokinase and metastatic potential |
| US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
| US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
| US20050159362A1 (en) * | 2003-04-22 | 2005-07-21 | Sircar Jagadish C. | Mediators of reverse cholesterol transport for the treatment of hypercholesterolemia |
| MXJL05000046A (es) * | 2003-04-22 | 2005-12-22 | Avanir Pharmaceuticals | Mediadores de transporte reverso de colesterol para el tratamiento de hipercolesterolemia. |
| US8329168B2 (en) | 2005-11-15 | 2012-12-11 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
| EP2712423A4 (en) * | 2011-02-25 | 2015-06-10 | Wellstat Diagnostics Llc | Assays for detecting enzymatic activity |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE407058B (sv) * | 1974-12-05 | 1979-03-12 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2527932C2 (de) * | 1974-07-02 | 1983-04-21 | Pentapharm AG, 4052 Basel | Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein |
| CH622286A5 (da) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag | |
| US4061625A (en) * | 1975-07-11 | 1977-12-06 | Ab Kabi | Novel chromogenic thrombin substrates |
| US4137225A (en) * | 1975-07-11 | 1979-01-30 | Ab Kabi | Novel chromogenic enzyme substrates |
-
1976
- 1976-12-01 SE SE7613463A patent/SE437153B/xx unknown
-
1977
- 1977-10-21 IL IL53187A patent/IL53187A/xx unknown
- 1977-10-27 NL NLAANVRAGE7711791,A patent/NL178600C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-10-31 FI FI773242A patent/FI773242A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1977-10-31 ZA ZA00776460A patent/ZA776460B/xx unknown
- 1977-11-14 ES ES464117A patent/ES464117A1/es not_active Expired
- 1977-11-14 IT IT51808/77A patent/IT1092154B/it active
- 1977-11-16 US US05/852,006 patent/US4207232A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-11-18 AU AU30771/77A patent/AU514768B2/en not_active Expired
- 1977-11-21 GB GB48288/77A patent/GB1565154A/en not_active Expired
- 1977-11-29 PL PL1977216410A patent/PL110803B1/pl unknown
- 1977-11-29 BE BE183005A patent/BE861295A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-11-29 DD DD77202299A patent/DD136896A5/xx unknown
- 1977-11-29 FR FR7735870A patent/FR2372798A1/fr active Granted
- 1977-11-29 PL PL1977202501A patent/PL109588B1/pl unknown
- 1977-11-29 CH CH1461877A patent/CH637627A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-11-30 SU SU772548501A patent/SU736889A3/ru active
- 1977-11-30 NO NO774092A patent/NO774092L/no unknown
- 1977-11-30 CA CA292,077A patent/CA1098428A/en not_active Expired
- 1977-12-01 DE DE2753653A patent/DE2753653C2/de not_active Expired
- 1977-12-01 HU HU77KA1497A patent/HU176983B/hu unknown
- 1977-12-01 DE DE2760116A patent/DE2760116C2/de not_active Expired
- 1977-12-01 DK DK535377A patent/DK155333C/da not_active IP Right Cessation
- 1977-12-01 JP JP14334077A patent/JPS5369693A/ja active Granted
- 1977-12-01 AT AT859677A patent/AT358203B/de not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-10-22 US US06/086,970 patent/US4276375A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE407058B (sv) * | 1974-12-05 | 1979-03-12 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK155333B (da) | Tetrapeptider til anvendelse som specifikt, chromogent substrat for serinproteaser samt laboratorieanvendelse af samme | |
| EP0097630B1 (en) | New thrombin inhibiting compounds | |
| US4070245A (en) | Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes | |
| US4508644A (en) | Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use | |
| US4016042A (en) | Substrate for the quantitative determination of enzymes | |
| SU1277904A3 (ru) | Способ получени трипептидов | |
| NO135245B (da) | ||
| NO135362B (da) | ||
| JPH032879B2 (da) | ||
| US4190574A (en) | Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators | |
| US4428874A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4217269A (en) | Dipeptide chromogenic substrates | |
| US4568636A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4443367A (en) | Peptide and peptolide substrates for mammalian collagenase | |
| US4797472A (en) | New peptide derivatives | |
| US4425428A (en) | Novel peptide and peptolide substrates for mammalian collagenase | |
| JP2560058B2 (ja) | 新規なペプチド誘導体 | |
| DK171845B1 (da) | Tripeptidderivater og fremgangsmåde til fremstilling af samme samt fremgangsmåde til bestemmelse af serinproteaser eller komponenter, der kan samvirke med serinproteaser | |
| JP2929555B2 (ja) | 色素原基質 | |
| CN111233973A (zh) | 一种精氨酸衍生物Pro-Phe-Arg-AMC的合成方法及用途 | |
| CN111269206A (zh) | 一种精氨酸衍生物Bz-Arg-AMC的合成方法及应用 | |
| CN111196838A (zh) | 一种精氨酸衍生物Cbz-Phe-Arg-AMC的合成方法及应用 | |
| Ide et al. | A Novel Synthesis of l-Pyroglutamyl-glycyl-l-arginine-p-nitroanilide Hydrochloride | |
| Penny | THE DESIGN, SYNTHESIS AND EVALUATION OF ACTIVE SITE DIRECTED, FLUORESCENT, PEPTIDYLCHLOROMETHANE AFFINITY LABELS OF PROTEINASES. | |
| JPS6342638B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |