JPH01221395A - ポリペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト肺臓フィブリン分解酵素（以下ＳＦＰと略
す。）と特異的に反応する新規な合成基質に関するもの
である。

本発明者らはＳＦＰ、白血球中のエラスターゼ様酵素を
特異的に且つ感度よく測定できる新規合成基質サクシニ
ル−Ｌ−チロシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニ
トロアニリドについて先に特許出願（特願昭５５−１３
１７０９号）を行なっているが１本発明者らはさらに研
究を重さねた結果ＳＦＰに対しすぐれた特異性を有する
新規合成基質を見い出し９本発明を完成した。

ＳＦＰは特異的にフィブリンおよびフィブリノーゲンを
分解する中性プロティナーゼであり。

分子量約ａ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏの塩基性蛋白質である。Ｓ
Ｆ’Ｐは無菌動物には存在しない。細菌性内毒素投与に
より惹起した血管向凝固症候群においては血液凝固機能
亢進の発現と共に増加し、その消退と共に回復する。こ
の酵素は網内系（以下ＲＥＳと略す。）細胞における微
細血栓除去機構と密接　、な関連を有するものと考えら
れる。

本酵素は元来不溶性細胞類粒内酵素であるが。

活性増加時には溶性酵素として血中にも出現する。従っ
て本基質を使用しての血中酵素測定によりプラスミン作
用とは分離してＳＦＰが測定でき、Ｒ，ＥＳの活性光通
を推察することができる。本発明に係る新規なポリペプ
チド誘導体は次の一般式で示される。

（式中人は第三ブチルオキシカルボニル基またはサクシ
ニル基を示す。） 本基質によるＳＥＰの測定原理を化学式で示せば下記の
通りである。

（式中人は前記と同様である。） 即ち本基質をｐＨ７の緩衝液中被検血清と混合し、ＳＦ
Ｐの濃度に比例して生成するＰ−ニトロアニリンの吸光
度を測定する。なお、Ｐ−二・トロアニリンの代りに他
の発色性物質あるいは螢光性物質を使用し、可視部の吸
光度の変化。

螢光スペクトルの変化により直接測定したり。

あるいは芳香族アミノ化合物の定量で通常行なわれるジ
アゾ発色反応、インドフェノール発色反応等を応用し２
発色度を高めて測定することも可能である。以上の如く
測定系は臨床検査の分野で行なわれている公知方法を応
用して種々の組合せにより実施することができるが２本
発明の範囲がそれにより限定されるものではない。

なお、該ポリペプチド誘導体は次の如くして得ることが
できる。

例えば保護されたアミノ基をもつＬ−アラニン（以下Ｌ
−Ａｌａと略す。）とＬ−チロシル−し−ロイシル−Ｌ
−バリン−Ｐ−ニトロアニリド（以下Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−
Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｌ　−ＰＮＡと略す。）をＮ、Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド法、　Ｎ、　Ｎ’−ジ
シクロへキシルカルボジイミドと添加剤による方法、ア
チド法あるいは混合酸無水物性等常法により縮合させ、
Ｎ−保護ポリペプチド誘導体即ち保護基−Ｌ−Ａｌａ−
Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｌ−ＰＮＡを得るこ
とができる。なお、該縮合物のアミノ保護基を常法によ
り脱離させ、遊離ポリペプチド誘導体１−１−　Ｌ　−
Ａｌａ　−Ｌ−Ｔｙｒ　−Ｌ二Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｔ−Ｐ
ＮＡを得１次いてこの遊離したアミノ基をトリエチルア
ミン存在下、酢酸エチルまたはピリジン中無水コハク酸
にてサクシニル化しサクシニｔｖ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔ
ｙｒ　−Ｌ−Ｌｅｕ　−Ｌ　−Ｖａ１７ＰＮＡとするか
、またはアミノ保護基を脱離させた該ポリペプチド誘導
体にさらに保護されたアミノ基をもつＬ　−Ａｌａを前
記と同様の方法で縮合させ保護基−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａ
ｌａ　−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｌ−ＰＮＡ
を得。

該ポリペプチド誘導体を前記同様常法により保護基を脱
離させ遊離ポリペプチド誘導体Ｈ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａ
ｌａ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ　−Ｖａｌ−ＰＮＡ
を得た後、さらにこの遊離したアミン基を前記同様にし
てサクシニル化しサクシニル−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ａ
ｌａ　−Ｌ−Ｔｙｒ　−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｔ　−Ｐ
ＮＡとすればよい。

なお９本発明で使用するＬ−Ａｌａは市販品が利用でき
る。一方、保護されたアミン基を持つＬ−Ａｌａ−Ｌ−
Ｔｙｒ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｔ−ＰＮＡは本発明者ら
・が出願した特許願昭５６−４４７４５号に記載の方法
で合成することができる。なお。

合成方法については後にも参考例として記載した。

本発明を実施するに必要な保護基はベンジルオキシカル
ボニル基、第三ブチルオキシカルボニル基などペプチド
合成に際し慣用されているアミン基の保護基をあげるこ
とができる。

また、保護基を脱離するにはペプチド合成の際にアミ７
基の保護基を脱離するのに慣用されている手段に従って
容易に行なうことができる。

この様にして得た本発明の新規合成基質はＳＦＰの酵素
作用によってＰ−ニトロアニリンが生成せられるので、
このものを比色定量することによりＳＦＰ活性を求める
ことができる。

本基質は以下に記載の如（８ＦＰを測定するためのすぐ
れた新規合成基質である。

Ａ：サクシニル−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｌ
　−ＰＮＡ口：サクシニル−Ｌ−Ａｌａ”Ｌ−Ａｌａ−
Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｖａｌ　−ＰＮＡ次に参
考例及び実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

参考例１゜ Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
チロシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニ
リド Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−チロシル−し−
ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド１、２　ｇ
　（０，００２モ／ｌ／　）に７．５規定塩化水素ジオ
キサン溶液１．８　ｍｌを加え、４０分間攪拌した後エ
ーテル５０ｍ１を加え、生じた白色沈殿を遠心分離して
集めた。デシケータ−中水酸化カリウム上で乾燥り、４
られたＬ−チロシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリンーＰ−
ニトロアニリドの塩化水素塩をＮ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍ／に溶解し
、トリエチルアミンでｐＨ８に調節した後Ｎ−第三ブチ
ルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン０．３８ｇ（０，０
０２モル）、ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．２
７　ｇ　（０，００２モル）を加え溶解し、氷−食塩に
て冷却し、Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド
０．４５　ｇ　（０，００２２モル）を加えて室温にて
１８時間攪拌した。生じた沈殿を涙去し、溶媒を減圧下
留去した。残留物を酢酸エチルに溶解し。

水冷下ｌＯ％クエン酸、５％炭酸ナトリウム続いて水で
洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸すＩ−ＩＪウム上で
乾燥し、酢酸エチルを留去。残渣オイルにエーテルを加
え、粗生成物を得た。シリカゲルクロマトグラフィーで
精製し、クロロホルム−エーテルより結晶化し、融点１
５３〜１５５℃旋光度〔α〕％Ｆ　−６５，９°（メタ
ノール、　Ｏｍｌ、３８）の目的化合物を得た。収量５
４０ｍｇ（収率３９．４％）、　このものはシリカゲル
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：
酢酸＝９０：８：Ｚ；クロロホルム：メタノール：水＝
８：３：ｌの下層）にて単一のスポットを示した。

元素分析値（Ｏｘ　Ｈ４８ＮＴ　ｅｌ＋として）計算値
；　Ｃ５９，６４Ｈ７，０６Ｎ　１２．２７実測値；　
Ｃ５９，４４Ｈ７，０１Ｎ　１２．２３参考例２゜ サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−口イシ
ル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドＮ−第三ブチルオ
キシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−口
イシル−Ｌ−バリン−ｐ−ニトロアニリＩ’　３４０ｍ
ｇ　（０，５０ミリ−Ｅ／Ｌ／）　Ｉｃ　７．５規定塩
化水素ジオキサン溶液１．２　ｍｌを加え、室温で攪拌
した。２０分後玉−テル５ｏｍｌを加え生じた沈殿を吸
引濾過テ集め、デシケータ−中水酸化カリウム上で乾燥
した。この化合物を水１０ｍ／に溶解し炭酸ナトリウム
を加えｐＨ８〜９とした。

生じたオイルを酢酸エチルにて抽出するとＬ−アラニル
−Ｌ−チロシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニト
ロアニリドが結晶として析出する。

これを吸引濾過で集めピリジン１０ｍ／に溶解し。

トリエチルアミン０．０７ｍ１（０，５０ミリモル）を
加え氷冷し攪拌した。無水コハク酸１５０ｆｆ１ｇ（１
，５−：　ＩＪモル）を５回に分けて１５分間隔で加え
、さらに３時間攪拌した。反応液を留去し、残留物を１
０％酢酸−酢酸エチル（ｌｏｍｌ＋１ｏｍｌ）に溶解し
。

酢酸エチル層を分離後水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム
で乾燥後酢酸エチルを留去した。残渣にエーテルを加え
生じた白色沈殿を吸引濾過で集めた。

この粗すクシニルーＬ−アラニル〜Ｌ−チロシル−Ｌ−
口イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド２４０ｍｇ
（０，３５ミリモル）をメタノ−／Ｌ／　１５　ｍｌに
溶解し、■規定水酸化すＩ−ＩＪウム０．７０　ｍｌ　
（０，７０ミリモル）を加え室温にて４０分間攪拌した
。酢酸で中和の後メタノールを留去し、残渣を酢酸エチ
ル−１０％酢酸（ｌ　Ｏｍｌ　−１Ｏｍｌ　）に溶解し
た。

有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後
、酢酸エチルを留去した。残渣にエーテルを加え、生じ
た白色結晶を吸引濾過で集め目的化合物を得た。収量１
８０ｍｇ（収率５６．２％）、融点２３０〜２３４°Ｃ
１旋光度（ｃｃ）％５−２８．００（メタノール。

Ｃ＝１．０）、薄層クロマトグラフィー上（クロロホル
ム：メタノール：酢酸＝９０＋８：２；クロロホルム：
メタノール：水＝８：３：ｌの下層）で単一スポットを
示した。

元素分析値（０３３Ｈ４４Ｈ６０１０）計算値；　Ｃ５
７，８８Ｈ６，４７Ｎ　１２．２７実測値；　０５７．
７１　　Ｈ６，７７Ｎ　１１．９７実施例１゜ Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−し−バリン−
Ｐ−ニトロアニリド Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
チロシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニ
リド４９０ｍｇ（０，７２ミリモル）に７．５規定塩化
水素ジオキサン溶液０．２８　ｍｌ　（２，１ミリモル
）を加え室温にて３０分攪拌した。エーテル５０ｍ／を
加え、生じた白色沈殿を吸引濾過で集めた。この化合物
を水に溶解し、炭酸ナトリウムを加え。

ｐ　）（９とし吸引濾過にて沈殿を集めた。これを２０
ａｔのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２０ｍ／に溶解し
、Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニンＯ，
１４ｇ（０，７２ミリモル）、　１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール０．１０　ｇ　（０，７２ミリモル）を加
え９食塩−氷で冷却した。これにＮ、Ｎ’−ジシクロへ
キシルカルボジイミド０．１６ｇ（０，８０ミリモル）
を加え、室温で１８時間攪拌した。生じた沈殿を吸引濾
過で除き、溶媒を留去した後残渣に酢酸エチルを加え、
生じた沈殿を吸引濾過て集め次いでシリカゲルクロマト
グラフィーで精製し目的物を得た。収量３７０ｍｇ（収
率６８．０％）、融点２３８〜２４１　’Ｃ，ｋ光Ｌ　
（ａ）％’−１５，２０（ＤＭＦ、　Ｏ＝０．４８）。

薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：
酢酸：９０：８：２；クロロホルム：メタノール水＝８
：３：ｌの下層）上にて単一スポットを示した。

元素分析値（０３７Ｈｓｓ　Ｈ７０１Ｇとして）計算値
；　Ｃ５８，７９Ｈ７，０６Ｎ　１２．９７測定値：　
Ｃ５８，６８Ｈ７，２１Ｎ　１２．９８実施例２゜ サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシ
ル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−バリアー
Ｐ−ニトロアニリド２７０ｍｇ（０，３６ミリモル）に
７．５規定塩酸ジオキサン溶液２．４７　ｍｌ（１８，
７８１７モル）を加え、室温で３０分間攪拌した。エー
テル５０ｍ１を加え、吸引濾過して沈殿を集めた後デシ
ケーター中水酸化カリウム上で乾燥した。得られた化合
物を水１ｏｍｔに溶解し、炭酸ナトリウムでｐＨ８〜９
とした。生じた沈殿を吸引濾過で集め、水、酢酸エチル
で洗浄した。

水晶をピリジン２０ｍ１に溶解し、トリエチルアミン０
．０５　ｍｌ　（０，３６ミリモル）を加え０℃で攪拌
した後、無水コハク酸１００１００ｆｆ１．０ミリモル
）を２０分おきに５回に分けて加えた。さらに１時間θ
℃で攪拌を続けた。溶媒を留去し残渣オイルを酢酸エチ
ル２０ｍ１，１０％酢酸２０ｍ１に溶解後分液した。

酢酸エチル層を取り、水で洗浄するとゲルが析出する。

このゲル状物質を吸引濾過で集め目的物質を得る。収量
２２０１１１ｇ　（収率８１，６％）、融点２１４〜２
１８℃、旋光度（ａ）％’−３５．７°（メタ／−／Ｌ
／、０＝０．８５）、薄層クロマトグラフィー（クロロ
ホルム：メタノール：酢酸＝＝９０：８：２；クロロホ
ルム：メタノール：水＝８：３：ｌの下層）上にて単一
スポットを与えた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ａは第三ブチルオキシカルボニル基またはサクシ
   ニル基を示す。）で表わされるポリペプチド誘導体。