JPS5877850A - エンドトキシンの定量に有用なペプチド型基質 - Google Patents

エンドトキシンの定量に有用なペプチド型基質

Info

Publication number
JPS5877850A
JPS5877850A JP57153357A JP15335782A JPS5877850A JP S5877850 A JPS5877850 A JP S5877850A JP 57153357 A JP57153357 A JP 57153357A JP 15335782 A JP15335782 A JP 15335782A JP S5877850 A JPS5877850 A JP S5877850A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
endotoxin
compound
group
chromogenic
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP57153357A
Other languages
English (en)
Inventor
ドナルド・エフ・ミルズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mallinckrodt Chemical Works
Original Assignee
Mallinckrodt Chemical Works
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mallinckrodt Chemical Works filed Critical Mallinckrodt Chemical Works
Publication of JPS5877850A publication Critical patent/JPS5877850A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般にペプチド型化合物に関するものであり、
さらに詳細にはリムルス・ポリペモス（Ｌｉｍｕｌｕｓ
　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）およびその他関連する種のご
ときカブトガニの血液の変形細胞溶菌液中に発見された
リボ多糖活性化された前凝固酵素の定量において発色性
基質または蛍光性基質として使用するのに適するペプチ
ド型化合物に関するものである。
カブトガニの血液から得られる変形細胞溶菌液ノ前凝固
酵素の、細菌エンドトキシンによる凝固現象はかなり以
前に報告され知られている。例えばレビン、Ｊ、および
パンゲスｓＦ、Ｂ”リムルス中の凝固性蛋白質：その局
在性とエンドトキシンによる凝固の動力学″（ＬｅＶｌ
ｎ＠Ｊ−＆　ＢａｎｇＳ、Ｆ、Ｂ、＋’　Ｃ１ｏｔｔａ
ｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｌｉｍｕｌｕ’ｉ　：
　ｉｔｓ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｋｉｎ
ｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　
ｂｙＥｎｄｏｔｏｘｔｎ　ｓ、　Ｔｈｏｒｎｂ、　Ｄｔ
ａｔｈ、　１（ａｅｒｎｏｒｔｈ、　ｓ　１９５１８６
頁（１９６８））参照。しかしながら、その凝固メカニ
ズムが詳しく研究されたのは極く最近のことである。例
えばナカムラ、Ｓ、らＫよる研究゛ゲル形成の際にカブ
トガニ凝固原から得られるフラグメントのアミノ酸配列
の研究：主フィブリノペプチドＢＫよる相同”バイオケ
ミカルアントノ（イオフイジカルリサーチコミュニケー
ション（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　５
ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌ’ｒａｇｍｅｎｔｓＰ
ｒｏｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　Ｃｒ
ａｂ　Ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｇｅｌ　
Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　：　Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｉ
ｔｈ　ｐｒｉｍａｔｅＦｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ　
Ｂ″ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（：ｏｍｎｕｎｉｃ
ａｔｉｏｎ、　７２（３ハｐ、　９０２（１９７６））
がある。これらの研究によって、リムルス変形細胞溶菌
液（以下ＬＡＬと称する）の凝固は、二価の陽イオン例
えばＣａｓＭｇｅＳｒ　　　またはＭｎ　　の存在下に
前凝固酵素のエンドトキシン活性化を含み、かくして得
られる活性化された酵素は含まれているグリシンとアル
ギニンユニットのＣ−カルボキシルにおいて凝固蛋白質
（凝固１［）を開裂−５″る。この開裂し１こ凝固原ユ
ニットはジスルフィドブリッジによって結合された状１
ｐＫあり重合して凝固を起こす。変形細胞溶菌液のこれ
らの既知の成分の他に、多数のその他の蛋白質およびリ
ボ蛋白質性の既知の阻害剤がある。この阻害剤およびそ
の他の蛋白質による凝固反応のモジュレーションはまた
測定されていない。
細菌エンドトキシン（発熱原）の存在下におけるＬＡＬ
の凝固特性の故に、ＬＡＬ製剤は一般に非経口投与され
る薬学ｉよび医学関連の各穫の流体の製造における品質
コントロールエンドトキシン検定に使用するための商業
的罠有用な試薬となっている。このような流体には注入
用の水；洗浄用の水；静脈注射用の脂質エマルジョン；
植物油ノ水性エマルジョン；塩の溶液１例えば注入ＵＳ
Ｐ用の塩化ナトリウム、洗浄ＵＳＰ用の塩化ナトリウム
、吸入用の塩化ナトリウムを含む非経口投与用の塩化す
）　ＩＪウム溶液および乳酸塩の入った（　１ａｃｔａ
ｔｅｄ）リンガ−液；および血液誘導体１例えば正常血
清アルブミン、血漿蛋白質フラクションおよび抗血友病
性因子ｕｓｐ、免疫グロブリン。
Ｒｈｏ　（Ｄ）免疫グロブリンおよび抗ヒトグロブリン
血清などが挙げられる。
ＬＡＬ試薬の製剤およびＬＡＬ操作の改良は、ＬＡＬ検
定が知られている最も感度のよ〜・寮際的なエンドトキ
シン試験であるというところまで進歩しているＯこのＬ
ＡＬ検定は凝塊の生成によって、１０　ｇ／ｍｌのエン
ドトキシンを検出することができる。最近ヘルスインダ
ストリーズアソシエーションスタディー（Ｄａｂｂａｈ
、　Ｓ、　’　ＨＴＭＡＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　
５ｔｕｄｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔ
ｙＢｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃ
ｅ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｂｙ　ｔｈｅＵ８Ｐ　Ｒａｂ
ｂｉｔ　Ｔｅ５ｔ　”ｍ　ＨＩＭＡ　Ｄｏｃｕｍｅｎｔ
　Ｎｎ　Ｌ　ｖｏｌ、１（Ｍａｙ、　１９〕９）〕　　
において、合衆国薬局方（ｔｌｓＰ）ウサギ発熱原検定
は約１０　　ｇ／ｍｌのエンドトキシンを検出すること
ができろということが立証されている。従ってこのＬＡ
Ｌ検定はＵＳＰウサギ発熱原検定の約１００倍の感度を
もっている。この優れた感度に加えて、ＬＡＬ検定は操
作が簡単でありウサギ検定が３時間かかるのに対して約
１時間で完了することができる。
発色性基質の使用は、人の複雑な凝固プロセスにおける
各種の酵素と阻害剤を研究しまた臨床的にモニターする
ための手段になっている。トリプシン、トロンビン、ト
ロンボプラスチン、プラスミン、プラスミンカリクライ
ア　（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）　。
ウロキナーゼ、およびプラスミノゲンのような酵素を測
定するための広範な種類の酵素特異性基質が市販されて
いる。これらの合成基質は試験管内における凝固プロセ
スのある局面の止血状態をモニターするための重要な道
具を研究者に提供するものである。
のカブトガニの血液から調整されたＬＡＬ中のエンドト
キシン活性化凝固酵素の濃度を測定することができると
いうことがイワナガらＫよって最近報告された〔１カブ
トガニ凝固酵素の発色性基質：細菌エンドトキシンの検
定への応用”ヘモスタシス７　：　１８３−１８８　（
１９７８）　（”Ｃｈｒｏｍ。
ｇｅｎｉｃ　８ｕｂｓｔｒｉｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｈｏｒｓ
ｅｓｈｏｅ　Ｃｒａｂ　ＣｌｏｔｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ
　：　Ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈ
ｅ　Ａｓ５ａｙ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉａｓ　Ｅｎｄｏｔ
ｏｘｉｎ　’、　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　７：　１８３
−１８８（１９７８））。ＬＡＬ検定において基質を使
用することは活性化凝固酵素の量を定量化することがで
きるという点で一般のＬＡＬゲル化試験の場合より有利
である。さらＫＬＡＬ検定にお（・て細菌エンドトキシ
ンを定量的に測定するある種の合成ペプチド型基質を使
用することが米国特許第４１８８２６５号に記載されて
いる。この特許に＆−！。
このペプチド基質はＬ−アミノ酸からなる構造をもたな
ければならず、とのＬ−アミノ酸＆ｉ活性イヒ前凝固酵
素によって開裂されるようにアルギニンがＣ−カルボキ
シル末端アミノ基であり、アルギニンがグリシンに続く
順序で結合されていることが開示されている。
上記基質はエンドトキシンのＬＡＬ型検定に用途を見出
しているが、エンドトキシンの定量用の別の基質を開発
することが望ましい。このような基質は活性化されたＬ
ＡＬ前凝固酵素によって再現性よくかつ比例して容易に
開裂される能力をはじめとする多数の特性をもたなけれ
ばならない。
前凝固酵素が活性°化されるメカニズムが不明でありか
つ複雑であること、およびこの酵素が開裂反応において
働く性質がはっきりわかっていないためＫ、ある特定の
基質がＬＡＬ型検定において好ましく作用するかどうか
を予言することは、不可能ではない圧しても、困難なこ
とである。
本発明に含まれるペプチド化合物は次の一般式を有する
ことを特徴としている。
Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ａ５−ＡＩＩ−Ｂ−Ｒ２上記式中、
Ｒ１は水素または保護芳香族炭化水素または保護アシル
を示し；Ａ１　はイソロイシン（１１ｅｕ）、バリン（
ｖａｌ　）またはロインｙ　（１，ｅｕ）から選ばれた
ＬまたはＤ−アミノ酸を示し：Ａ２はグルタミン（Ｑｌ
ｕ　）またはアスパルチン（Ａｓｐ）を示し；Ａ５はア
ラニン（Ａｌａ　）またはシスティン（Ｃｙｓ　）を示
し；Ａ、はアルギニン（Ａｒｇ　）を示し％Ｂはアミド
またはエステル結合を示し、Ｒ２は上記アミド結合また
はエステル結合によってアルギニンのＣ−カルボキシル
末端に共有結合している発色性または蛍光性の基を示し
これらの発色性または蛍光性の基は、活性化ＬＡＬ＃凝
固酵素によって上記ペプチド型化合物の残基から酵素加
水分解によって式Ｒ２−Ｂ−Ｈで表わされる発色性また
は蛍光性標識化合物を生じろ。上記一般式においてＲ１
保護基は、Ｎ−ｔｅｒｔブトキシカルボニル、炭素原子
数ｌ〜１２のアルカノイル、シクロヘキシルカルボニル
および一個以上のノ＼ロゲンで置換されたＮ−ベンゾイ
ル、アセチルおよびベンゾイル、低級アルキル、例えば
メチルおよびエチル、アミノ、またはフェニルであり、
上記ペプチド構造のＮ−末端Ｌ−アミノ酸がＮ−末端Ｄ
−アミノ酸で置換されている場合にはＨであることがで
きる。適当な発色性基または蛍光性基としてはニトロフ
ェニル、メチルニトロフェニル、ジニトロフェニル、ナ
フチル、ニトロナフチル、メトキシナフチル、インドキ
シル、メチルインドキシル、（４−メチル）ウムペリフ
エリル（ｕｒＩｔｈｅｌｌｉｆｅｒｙ＋　）およびレゾ
ルフィン（ｒｅｓｏｒｆｉｎ）が挙げられる。
本発明にはまた上記ペプチド型化合物の酸付加塩も含ま
れる。適当な酸の塩と゛しては、塩酸、臭化水素酸９重
硫酸および重リン酸（ｂｙｄｒｏｐｈｏｓｐｈ。
ｒｉｃ　）のような鉱酸、または蟻酸、酢酸、しゆ５酸
、酒石酸、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸
のような有機酸の塩がある。
前記の通り、本発明のペプチド型化合物はＬＡＬ型検定
における発色性基質または蛍光性基質として有用である
。このような検定の際ＫＬＡＬ中の前凝固酵素（セリン
プロテアーゼ）はエンドトキシンによって活性化され、
このペプチド鎖をアルギニンのＣ−カルボキシルで開裂
して発色性基または蛍光性基を遊離し、分光光度計のよ
うな装置によって容易Ｋ　８１定できるような標識化合
物を生成する。
上記米国特許第４１８８２６４号に記載されている規準
によれば、ペプチド結合中のアルギニンに隣接してアラ
ニンまたはシスティンを有する基質なＬＡＬ検定に使用
して、活性化されたＬＡＬ凝固酵素の活性に影醤を与え
ることなくアルギニンのＣ−末端から発色性基または蛍
光性基を開裂することができるということは予想されな
かった。
さらに、活性化されたＬＡＬ凝固酵素によって開裂され
る本発明の基質の活性は、前凝固酵素が活性化される機
構が複雑なもので十分に理解されていないために、予想
することができなかったＯこの機構を理解する際の問題
の中には、この酵素がプロテアーゼとして分類されるが
、ペプチドから蛍光性基または発色性基を開裂する際に
は明らかにアミダーゼとして作用しているということが
ある。
本発明の特に好ましいペプチド型化合物としては以下の
ものが挙げられる。
ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルメミル−Ｌ　
−７５ニル−Ｌ−アルギニル−−ニトロアニリド ベンゾイル−Ｌ−インロイシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アルギニル−４−メトキシ−β−ナフチ
ルアミド ベンゾイル−Ｌ−インロイシル−し−グルタミル−Ｌ−
システイニル−アルギニル−−二トロアニリド ペンゾイルーＬ−イソロイシル−し一グルタミルーＬ−
システイニルーＬ−アルギニル−４−メトキシ−β−ナ
フチルアミド 本発明のペプチド型化合物の合成には保護基とカップリ
ング方法を使用することができる。これらの方法はペプ
チド化学分野に知識を有するものによく知られており１
例えばボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ　　）らの１ペ
プチド合成”、インターサイエンス・パプリケーション
（１９６６）を参照されたい・例えば本発明の基質は次
の方法の１つＫよって合成することができる： １、　蛍光性基または発色性基（Ｒ２）をアルギニンに
結合し、所望のアミノ酸（すなわちアラニンまたはシス
ティン）を段階的に付加させて所望のペプチド構造を得
る。この方法では、発色性基または蛍光性基はアルギニ
ンのＣ−末端カルボキシルをブロックすることＫより保
瞳基として働く。
２、段階的合成を完全に行って所望のペプチド構造をつ
くった後に発色性基または蛍光性基（Ｒ２）を結合する
。この方法によれば、段階的合成の際に他の周知のペプ
チド化学保護基を用い、次いで発色性基または蛍光性基
をカップリングさせる前にラセミ化しない（ｒａｃｅｍ
ｉｚａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ）酵素開裂によってこれを脱
離する。
３、　発色性基または蛍光性基處、）をアルギニンに結
合してモノペプチドを合成し、これを別に合成した所望
の配列のトリペプチドに結合する。
この方法は、モノペプチドとトリペプチド配列をカップ
リングする直前に脱離することができるような周知のペ
プチド化学保護基を使用するものである。
アミノ酸またはペプチド構造のアミノ（α−Ｎ−アミン
）基を保護するのにペプチド化学分野で一般的に使用さ
れる保護基としてはＣｂｏ　（カルボヘア　ソ’Ｆ　シ
）　ｓ　ＭｅＯＣｂｏ　（ｐ−メトキシカルボベンゾキ
シ）　、　Ｎｏ２Ｃｂｏ（ｐ−ニトロカルボベンゾキシ
ン。
ＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブチル＃＊シカｈＭ二ｈ　）　＊　
ＴＦＡ　（トリフルオロアセチル）、ホルミル、トシル
およびエチルメルカグトエステルがある。アミノ酸のα
−カルボキシ基はＰ−ニトロンエニルエステル。
）　ＩＪ　ｌロロフェニルエステル、ペンタクロロフェ
ニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、酸アジドまた酸無水物（これらは対称であっても
非対称であってもよい）をつくることＫより活性化する
ことができる。さらにＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカル
ボジイミドなどのようなカルボジイミドによって活性化
することもできる。
一般に保護基を使用する場合にはα−Ｎ−アミノ基はＬ
型である。
ペプチド結合の生成に関与しないアミノ酸の反応性基は
、所望のペプチドの段階的合成の際に保護基などＫより
一般に保護しなければならない。
適当な方法はペプチド化学において一般的なものテア’
）、Ｎ０２ｔたハｐ　−）ルエンスルホニルによる。あ
るいはまたプロトネーション（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ
Ｊによるアルギニンのグアニジノ基の保護；メチルまた
はベンジルエステルまたはｐ−メトキシベンジルまたは
アリルの形成によるグルタミン酸のα−０Ｈ３の保護；
および−８Ｒ基のチオエチルメルカプトエステルの生成
によるシスティンのβ−８Ｒ基の保護を挙げることがで
きる。合成の各段階においてゲルｒ過および結晶化の一
方または両方を用いて精製を行うことが所望のペプチド
型化合物の合成を５まく行うのに重要であることは。
この技術分野に精通するものＫとって理解されるであろ
う。
さらに、完成品、中間体、溶出液は段階的合成のＩＩＫ
厳重な純度および性能試験を受ける必要がある。この純
度チェックは吸収媒体としてシリカゲルＦ２５４（メル
ツク）を塗布した薄層クロマトグラフィープレートを用
いて行うことができる。
セファデックス（登碌商標）ＬＨ−２０またはＧ−１５
を用いたゲル透過を用いて不要な反応体から所望の生成
物溶出液を分離することができる。
この層クロマトグラムは次の溶媒系で展開することがで
きる。
Ａ、　りｏｔ＝＋ホルム／メタノール／酢酸（９０：３
０：１５）Ｂ、　　ｎ−ブタノール／酢酸／水　（４：
１：５ＪＣ，テトラヒドロフラン／シクロヘキサン／酢
酸／水（１８６：１４：１０：２０） Ｄ、　りｍロホルム／メタノール（９：１）最終ペプチ
ドの純度のＴＬＣによるチェックの他Ｋ、ペプチドの純
度はＵＶ検出器および次の溶媒移動相を用いた高圧液体
クロマトグラフィーによりチェックすることもできる。
水／メタノール（５０：　５０　）　（０，０１Ｍ　Ｋ
Ｈ２ＰＯ，。
ｐＨ３，５−４，０） 簡単にするために、明細書の詳細な説明、実施例および
特許請求の範囲において次の略語を使用する。これらの
略語は次の意味を有する。
Ａｌａ　　−アラ二ン Ａｒｇ　　＝アルギニン Ａｌｐ　　−アスパルチン Ｃｙｓ　　＝システィン Ｇｌｕ　　＝グルタミン １１ｅｕ＝イソロイシン Ｌｅｕ　　−ロイシン Ｖａｌ　　−バリン ＡＣ＝アセチル ＡｃＯＨ＝酢酸 ＡＣ２０＝無水酢酸 ｔＢＯｃ　＝　Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボキシルＢｚ　
　＝ベンゾイル Ｂｚｌ　　＝ベンジル Ｂｉ１２　＝安息香酸無水物 Ｃｂｏ　　＝カルボベンゾキシ ＤＣＣＩ　＝ジシクロへキシルカルボジイミドＤＭＦ　
　＝ジメチルホルムアミド ＨＰＬＣ−高圧液体クロマトグラフイー０ｐＮＰ　＝　
１）−二トロンエノキシｐＮＡ＝ｐ−ニトロアニリド ＴＬＣ＝薄層クロマトグラム ＴＦＡ＝）リフルオロ酢酸 Ｅｔ、Ｎ　＝　）リエチルアミン ＨＭＰＴＡ＝　　Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−へキサメチ
ルリ糧トリアミドＭｅＯＨ−メタノール ＣＨ２Ｃｌ２−メチレンクロライド ＴＨＦ　　−テトラヒドロフラン ＨＦ　　　＝フッ化水素 ＥｔｏＡｃ＝酢酸エチル 特に明記しないかぎり、ペプチド構造中のすべてのアミ
ノ酸はＬ型装置のものである。
さらに具体的には１本発明の基質は以下に例示する試薬
を用いた反応順序に従って合成することができる。Ｎ保
護基としてＮ−ベンジルオキシカルボニルの代わりＫＮ
−ｔ−ブトキシカルボニルを使用することができること
、ならびにその開裂はＨＢｒ　、酢酸またはＴＦＡ中で
起こるということが理解されよう。ＴＦＡはまたＮ−ベ
ンジルオキ１゜ ジカルボニル基を開裂するのに使用することができる。
合成反応 Ａ、方法１ １、反応工程１：Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ
町ニトロアルギニン−ｐ−ニト ロフェニルアミドの合成 この化合物は次の方法の１つＫより合成することができ
る。
ａ、Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎｏ−ニトロア
ルギニンをＤＭＦ　、囮ＰＴＡ　ｅ　ＣＨ２Ｃｌ２゜Ｔ
ＨＦ　、ジオキサン、またはこれらの混合物のような適
当な溶媒に加える。この溶媒系に適当なペプチド活性化
剤１例えばインブチルクロロホルメートまたはジフェニ
ルホスホリルアジド、またはＤＣＣを単独で、あるいは
Ｎ−ヒド四キシスクシンイミドまたはＮ、Ｎカルボニル
ジイミダゾールと組合せて加え、さらに適当な塩基例え
ばトリエチルアミンまたはＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチ
ルアミン、またはＮ−メチルモルホリンまたはピリジン
、または４−ジメチルアミノピリジン（これらはその他
の塩基と組合せて使用することもできる）を加える。次
にこれＫｐ−二）ロアニリンを加える。ＴＬＣまたはＨ
ＰＬＣＫよって完了するまで反応を続け、次いでこれを
終了して生成物を常法により単離する。精製は、　ＨＰ
ＬＣゲルｒ過、イオン交換、結晶化またはこれらの結合
により行われる。
”ｂ、　　Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎｏ−ニ
トロアルギニンｐ−ニトロフェニルエステルを適当な溶
媒１例えばＤＭＦ　、　ＨＭＰＴＡ　、　ＣＨ２Ｃｌ２
゜ＴＨＦまたはこれらの混合物に加える。これＫｐ−ニ
トロアニリンと適当な塩基例えばトリエチルアミンＩ　
Ｎ　、Ｎ−ジイソプロプルエチルアミン、Ｎ−メチルモ
ルホリン、ピリジンまたは４−ジメチルアミノピリジン
（これらはその他の塩基と併用することもできる）を加
える。ＴＬＣまたはＨＰＬＣＫよって完了するまで反応
を続け１次いでこれを終了して生成物を常法により単離
する。ＨＰＬＣ、ゲルｆ過。
イオン交換、結晶化またはこれらの結合により精製を行
う。
Ｃ，Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎｏ−ニトロア
ルギニンを適当な溶媒１例えばＤＭＦ　。
ＨＭＰＴＡ　、　ＣＨ２Ｃｌ２．　ＴＨＦまたはこれら
の混合物に加える。次いでこれにトリエチルアミン。
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモル
ホリン、ピリジンまたは４−ジメチルアミノピリジン（
これらはその他の塩基と併用することができる）のよう
な適当な塩基とｐ−ニトロフェニルイソシアネートを加
える。ＴＬＣまたはＨＰＬＣＫより終了するまで反応を
続け、次いで反応を終了して生成物を常法により単離す
る。ＨＰＬＣ＊ゲル濾過、イオン交換、結晶化またはこ
れらの結合により精製を行う。
２、反応工程２：Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニ
ル−Ｎ−ニトロアルギニン ｐ−ニトロフェニルアミドの合成 Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎｏ−ニトロアルキ
ニンｐ−ニトロフェニルアミドを酢酸中ＨＢｒで処理し
てベンジルオキシカルボニル保獲基を脱離する。溶媒を
真空留去すると遊離塩基に転換した生成物が得られろ。
Ｎａ−ベンジル、オキシカルボニル−Ｎ−ニトロアルギ
ニこの代ワリに、化合物Ｎａ−ベンジルオキシカルボニ
ルアラニンを使用し、かつｐ−ニトロアニリンに代えて
上記のとおり合成したＮ″′−ニトロアルギニンｐ−ニ
トロフェニルアミドを使用して操作１−ａを行う。
代わりに、操作１−ｂＫ従い、Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｎ−ニトロアルギニンｐ−ニトロフェニルエス
テルの代わりに、化合物Ｎ−ベンジルオキシカルボニル
アラニンｐ−ニトロフェニルエステルヲ用い、かつｐ−
ニトロアニリンの代わりに上記のとおり合成したＮ”−
二）ｔｙ　７　、ｂ　キニンｐ−ニトロフェニルア？）
”Ｌｌ用する。
３、反応工程３：Ｎ−１−ブトキシカルボニル−ｒ−０
−ベンジルグルタミルアラニ ルーＮ町ニトロアルギニンｐ−二 トロフェニルアミド Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニル−Ｎｏ−ニトロ
アルギニンｐ−ニトロフェニルアミドを酢酸中ＨＢｒで
処理してベンジルオキシカルボニル保護基を脱離する。
溶媒を真空留去すると遊離塩基に転換した生成物が得ら
れる。次いでＮａ−ヘンシルオキシカルボニル−Ｎ（Ｉ
Ｊ−ニトロアルギニンを、化合物Ｈ−ｔ−ブトキシカル
ボニル−〇−ベンジルグルタミンｌｌＫ代ｔ、ｐ−”ト
ロアニリンの代わりに上記のとおり合成したアラニル−
ＮｏＪ−ニトロアルギニンｐ−ニトロフェニルアミドを
使用して操作１−ａを行う。
４、反応工程４：Ｎ−ベンゾイルイソロイシル−ｒ−０
−ベンジルグルタミルアラニ ルＮ″Ｊ−ニトロアルギニンｐ−ニト ロフェニルアミドの合成 Ｎ−ｔ−））キシカルボニル−ｒ−０−ベンジルグルタ
ミルアラニル−Ｎ−ニトロアルギニンｐ−ニトロフェニ
ルアミドをＴＦＡ　Ｋ加えて鬼−ブトキシカルボニル基
を脱離する。溶媒な真空留去すると遊離塩基に転換した
生成物が得らレル。Ｎａ−ヘンシルオキシカルボニル−
Ｎｏ−ニトロアルギニン圧伏えて、化合物Ｎ−ベンゾイ
ルイソロイシンを用い、ｐ−ニトロアニリンの代わりに
上記のとおり合成したｒ−ｏ−ベンジル−グルタミルア
ラニル−Ｎ″−ニトロアルギニンｐ−ニトロフェニルア
ミトラ用いて操作１−ａを行う。
代ワりに、Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ（ＩＪ
−ニトロアルギニンｐ−ニトロフェニルエステルの代わ
りに、化合物Ｎ−ベンゾイルイソロイシンｐ−ニトロフ
ェニルエステルヲ用い、ｐ−二トロアニリンの代わりに
上記のとおり合成しりｙ　−ｏ−ベンジルグルタミルア
ラニル−ＮＷ−二トロアルギニンｐ−ニトロフェニルア
ミトヲ用いて操作１−ｂを行う。
（ｔｂ’）に、Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎｏ
−ニトロアルギニンの代わりＫ、化合物Ｎ−ペンソイル
イソロイシル−γ−０−ベンジルクルタミン酸を用い、
ｐ−ニトロアニリンの代わりに３．で説明したように合
成したアラニル−Ｎ−二トロアルギニンｐ−ニトロフェ
ニルアミドを使用し【方法１−　ａによりこの化合物を
合成することができる。
代わりに、この化合物はＮ−ベンゾイルイソロイシンの
代わりＫＮ−ｔ−ブトキシカルボニルイソロイシンを用
いて上記のように合成することができる。次いでこの生
成物は、ＴＦＡによりＮ−１−ブトキシカルボニルを脱
離し１次ＫＴＦＡを除去し、得られた化合物を適当な溶
媒中でベンゾイルクロライドと適当な塩基により処理す
ることによって最終生成物に転換される。
５、反応工＠５：Ｎ−ベンゾイルイソロイシルグルタミ
ルアラニルアルギニルｐ−二 トロフェニルアミド塩酸塩の合成 Ｎ−ベンゾイルイソロイシル−ｒ−０−グルタミルアラ
ニル−？−ニトロアルギニンｐ−二トロフェニルアミド
をアニソールまたをまチオアニソールの存在下において
ＨＦまたはボロン−トリス−トリフルオロアセテートと
反応させる。
溶媒を真空留去し、生成物をＨＰＬＣ、ゲル１過。
イオン交換、結晶化またはこれらの結合により精製する
。
Ｂ・　方法２ この方法ではアルギニンのグアニド基はその塩酸塩とし
て保躾されている。次にこれをω−ニトロアルギニンの
代わりに方法１において説明したように使用する。すな
わち方法１の反応工程ＩＫおいテ、Ｎａ−ベンジルオキ
シカルボニル−Ｎ−二トロアルギニンの代わりＫ　Ｎａ
−ベンジルオキシカルボニルアルギニン塩酸塩が使用さ
れる。これはＮｏ−ベンジルオキシカルボニルアルギニ
ンｐ−二トロフェニルアミド塩酸塩を与える。この塩酸
塩は方法１の反応工程２において、Ｎａ−ベンジルオキ
シカルボニル−Ｎｏ−ニトロアルギニンの代わりに使用
することができる。これはＮ−ベンジルオキシカルボニ
ルアラニルアルギニンｐ−ニトロフェニルアミド塩酸塩
を与え、この塩酸塩は方法１の反応工８３においてＮ−
ベンジルオキシカルボニルアラニル−Ｎｏ−ニトロアル
ギニンｐ−ニトロフェニルアミドの代わりに使用するこ
とができる。
これはＮ−１−ブトキシカルボニル−γ−０−ベンジル
グルタミルアラニルアルギニンｐ−ニトロフェニルアミ
ド塩酸塩を与え、この塩酸塩は方法１の反応工程４にお
いてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−ｒ−Ｏ−ペンジルグ
ルタミルアラニＡ　−Ｎ−ニトロアルギニンｐ−ニトロ
フェニルアミ）”（７）代わりに使用することができる
。これはＮ−ベンゾイルイソロイシル−Ｔ−Ｏ−ベンジ
ルグルタミルアラニルアルギニンｐ−ニトロフェニルア
ミド塩酸塩を与え、この塩酸塩は方法１の反応工程５に
おいてＮ−ベンゾイルイソロイシル−γ−〇−ベンジル
グルタミルアラニル−Ｎ町ニトロアルギニンｐ−ニトロ
フェニルアミドの代わりに使用することができる。これ
は所望の生成物、Ｎ−ペンソイルイソロイシルクルタミ
ルアラニルアルキニンｐ−ニトロフェニルアミド塩酸塩
を与える。
Ｃ・　方法３ 代ｂｅ）Ｋ、　ｐ　−）ルエンスルホニルまたはメシチ
レン−２−スルホニルのような他の酸性の不安定な保護
基を、ニトロあるいは塩化水素の代わりに、アルギニン
のグアニジンを保護するのに使用することができる。こ
れらのＮｏ−アナログを上記のごとく置換して同じ生成
物を得ることができる。
Ｄ、方法４ 代わりに、ペプチド配列の最後にアルギニンを付加する
ことができる。この場合忙は、標準的なペプチド合成法
によってトリペプチドＮ−ベンゾイルイソロイシル−ｒ
−ｏ−ベンジルグルタミルアラニンを合成する。これを
ここに説明されている方法によりアルギニンｐ−ニトロ
フェニルアミド塩酸塩に結合するとＮ−ベンゾイルイソ
ロイシル−ｒ−０−ベンジルグルタミルアルギニンｐ−
二トロフェニルアミド塩酸塩が得られ、この塩酸塩はこ
こに説明されている方法により最終生成物に転換される
。
上記詳細な反応順序は本発明の特定の基質に対するもの
であるが１本発明の他の基質も同様の反応順序によって
合成できるということは当業者に明らかであろう。
前記の通り、本発明のペプチド型化合物はエンドトキシ
ンを検出するＬＡＬ型検定における基質として使用する
のＫ特に適している。この検電において、エンドトキシ
ンが活性化しｆ、：ＬＡＬ（７）凝固酵素はこの基質を
フルギニン基のＣ−カルボキシルにおいて開裂してｐ−
ニトロアニリンのような蛍光性基または発色性基を放出
する。エンドトキシン活性剤と前凝固酵素との間の比例
関係はほぼｌ：１であるので、この開裂によってエンド
トキシンの間接的な分光光度法による測定が可能となる
。さらに具体的には、＃集的に加水分解すなわち開裂し
た化合物の末端発色性基または末端蛍光性基の量は、あ
る範囲内において試料中のエンされた末端基の量はエン
ドトキシン含量の増加に比例して増加する。
活性剤（エンドトキシン）の定量は過剰の基質の存在に
よって影譬な受けない。元の基質の極大吸収は２７５−
３２５ｎｍの範８にあるが、開裂例えば約３６０〜約３
８７　ｎｍである。従ってこの標識化合物は元のペプチ
ド基質の妨害や感度の実質的な低下を伴うことな（４０
５ｎｍにおいて暑み取ることができる。
元のペプチドの吸収極大は３１２　ｎｍにおけるモル吸
光係数が約１１，９８４であるが％４０５ｎｍＫおける
その吸収は２００以下である。しかしながらｐ−ニトロ
アニリドのような開裂したＲ２ＢＨ残基のモル吸光係数
は３８０　ｎｍにおいて１ｏ、５００であり４０５　ｎ
ｍ　において８，４３８である。
従って試験の感度は実質的に影畳な受けない口このよう
に既知のエンドトキシン活性剤の濃度は標準曲線をつく
ることができるような一連の既知濃度において分元元度
的に測定することができる。
従って、このような曲線を用いて未知の試験試料中のエ
ンドトキシンの相対的な濃度を測定することができる。
ペプチド型化合物についての上記説明は、主としてＬＡ
Ｌ検足検電ける。Ｒ２ＢＨ＠識化合物自体の検出ならび
に定量に関してなされているが、開裂した標識化合物を
別の化合物と結合させ得られた結合化合物を測定するこ
とも本発明の範囲内圧ある◎例えば、蛍光分析法により
測定することができる標・識化合物４−メトキシナフチ
レンを５−ニトロサリチル−アルデヒドに結合させ、約
４２０〜５９０　ｎｍ　において分光測定法により読み
取るか、あるいはＯ−ジアニシジン（ファストブルーＢ
）Ｋ結合させて約５２０　ｎｍ　において分光測定法に
より読み取ることができる。
ＬＡＬは英国特許＠１，５２２，１２７号に記載の方法
に従って駒整することができるのでこの特許を参照され
たい。例えばりムルスボリペモスの健康な試料から血リ
ンパをレビンらにより。
’　Ｃｊｏｔｔａｂ３ｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｌｉ
ｍｕｌｕｓ　：　Ｉｔｓ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　
ａｎｄ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｔｓ　Ｃｏａｇｕ
ｌａｔｉｏｎ　ｂｙ、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　’　、　Ｔ
ｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ　　１
９　：１８６−１９７（１９６８） に、一般的に述ぺられている抗凝固剤の食塩水溶液に集
める。変形細胞を集めて抗凝固剤食塩水溶液でジし遠心
する。分離した変形細胞を次に水にサスペンドし、機械
的攪拌を何回も行って細胞を浸透圧により完全に破砕す
る。遠心により溶菌液から細胞片を分離し、溶菌液フラ
クションを集めて０〜４℃で貯蔵する。
エンドトキシンに対する溶菌液の感度は異なる感度を有
する別のバッチの溶菌液と混合することＫより、あるい
は希釈することにより所望レベルの感度に１１節される
。この溶液は一般に適当な緩衝剤１例えばトロメタミン
〔トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕および
トロメタミン塩酸塩によってＩ）Ｈ６，５〜７．５に調
整される。上記のごと＜　ｐＨ調節した溶菌液を血清バ
イアルに小分けし、この小分けした溶液を凍結乾燥する
。凍結乾燥した後、バイプルをシールし冷凍保存する。
凍結乾燥した溶菌液は白色粉末または白色のもろいベレ
ットの形をしている。
エンドトキシンに対するＬＡＬの感度は低濃度の、カル
シウムイオンのよ５な二価の陽イオンおよびナトリウム
イオンのような一価の陽イオンを含ませることによって
高くすることができる。他の塩も使用することができる
が１例えばＣａ　ＣＩ　２およびＮａＣｌのような塩化
物の塩はこれらの添加イオン源として便利である。エン
ドトキシンに対するＬＡＬの感度は強化剤としてスルホ
ペタイン界面活性剤のようなある種の両性界面活性剤を
加えることによっても高くすることができる。
本発明のペプチド型化合物の製造方法ならびにその化合
物をＬＡＬ型検足検電質として使用する方法は以下の実
施例に記載されている。これらの実施例は例示を目的と
するものであってこれまでＫＩＩ！明した本発明を制限
するものではないということが理解されなければならな
い。
−施例Ｉ ペプチド基質Ｎ−ベンゾイルイソロイシルグルタミルア
ラニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩（ＢｌＬ
−口ｅｕ−（、Ｉｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　ＨＣｌ
３は次の反応によって合成される。
一ベンジルーＬ−グルタミルーＬ−アラニ／１、　　ｔ
−ＢＯＣ−Ｌ−７ラニン２，２　２−）す― ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−７５＝７をＤＭＦ　中Ｎ、Ｎ’　−カ
ルボニルジイミダゾールで処理し１次いで２゜２．２−
トリクロロエタノールで処理した。反応終了後溶媒を除
去し、残渣をＥｔＯＡＣＫ溶解し％ＥｔＯｈｃ層を水、
希塩酸および５チ炭酸水素す）　ＩＪウムで洗浄した。
ＥｔＯＡｃ層を硫酸マグネシウムで乾燥し１次いで溶媒
を留去して生成物を得た。
工程ｌで得られた生成物にトリクロロ酢酸（ＴＦＡ　）
を加えた。反応終了後ＴＦＡを留去した。別の容器に冷
却しながらｔ　−ＢＯＣ−ｉ　−〇−ベンジルーＬ−グ
ルタミン酸、ＴＨＦ、Ｎ−メチルモルホリンとインブチ
ルクロロホルメートを加えた。次Ｋ　ＴＦＡ反応によっ
て得られた残漬を上記ＴＨＦ溶液に加えた。反応終了後
溶媒を留去し、ＥｔＯＡｃを加えＥｔＯＡＣ層を工程１
と同様に処理すると生成物が得られた。
工程２で得られた生成物をＴＦＡで処理した。
反応路、了後ＴＦＡを留去した。別の容器に冷却しなが
らｔ　−ＢＯＣ−Ｌ−イソロイシン、ＴＨＦ％Ｎ−メチ
ルモルホリンおよびインブチルクロロホルメートを加え
た。次Ｋ　ＴＦＡ反応で得られた残渣を上記ＴＨＦ　＠
−液に加えた。反応終了“後溶媒を留去し、ＥｔＯＡｃ
を加え、Ｅ　ｉ　ＯＡＣ層を工程１と同ｓＫ処理すると
生成−が得られた。
工程３で得られた生成物をＴＦＡ　Ｋ加えた。
反応終了後ＴＦＡを留去した。別の容器に冷却しながら
安息香ａｌ　Ｉ　ＴＨＦ　−Ｎ−メチルモルホリンおよ
びインブチルクロロホ□”ルメートを加えた。次いでこ
のＴＨＦ溶液にＴＦＡ反応で得られた残渣を加えた。反
応終了後溶媒を留去し、ＥｔＯＡｃを加え、このＥｔＯ
Ａｃ層を工程１のＥｔＯＡｃ層と同様に処理すると生成
物が得られたＯ 乙 工程４で得られた生成物に酢酸、水および亜鉛ヲ加えた
・反応終了後固形物をＰ別し。
溶媒を留去すると上記生成物が得られた０塩酸塩 工程５で得られた生成物に冷却しながらＤＭＦ。
Ｎ−メチルモルホリン、イソブチルクロロホルメートを
加え１次いでＬ−アルギニンｐ−ニトロ７エ二ルアミド
２塩酸塩を加えた。反応終了後溶媒を留去し、りｐロホ
ルムを加え、りＯ口ホルム層を順に水、希塩酸、５％炭
酸水素ナトリウムで洗浄し１次いで硫酸マグネシウムで
乾燥した。次に溶媒を・留去すると生成物が得られ′ｒ
−Ｏ 工程Ｂで得られた生成物に臭化水素の酢酸浴液な加えた
。反応終了後溶媒を留去すると生成物が得られた。
実施例■ リムルス溶菌液の調製 英国特許第１５２２１２７号に記載されたレビンらの方
法を改良した方法により　’　ＩＪムルス変変形細胞溶
液液　ＬＡＬ　）製剤を調製した。この溶菌液に約０−
０１　Ｍ　ＭｎＣｌ２およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　
３−１４という商標で販売されている洗剤的０．０３　
％を加えて改質した。この製剤を１．２　ｍｌ　またｔ
！５．２ｍｌの単位で凍結乾燥する。
実施例１ ＬＡＬ検定における各種基質の活性 合衆国食品医薬品局から入手したＢ、ｃｏｌｉのエンド
トキシンＬＯ１ＥＣに水を加えて戻し、これを注射用の
水で約１００　ｐｇ／ｍｌ　Ｋ希釈した。このエンドト
キシンを用い、水を加えて戻したＬＡＬ約０．１ｍｌと
エンドトキシン約Ｑ、１ｍｌを混合し、約３７℃で約１
５分間インキュベートｊることによりＬＡＬを活性化す
る。得られるアミダーゼ活性を本発明の基質、ならびに
ＬＡＬ製検定に有効な米国特許第４１８８２６５号に報
告されている基質によつ℃測定する。
活性化したＬＡＬの酵素活性の測定に用いた方法は、約
ｏ、ｏ　４　Ｍ　ＣａＣｌ２を含みかつ０．０５　Ｍ　
）リス−イミダゾール緩衝液によってＩ）Ｈ約８．２に
調節した基質の０．１　ｍＭ　ｌ液約０．５　ｍｌに、
ＬＡＬ溶液約０．１　ｍｌを加えることからなる。この
溶液を混合し約３７℃でインキュベートする。約６分間
インキエペートした後、氷酢酸の５０％溶液約０．１ｍ
ｌを加えて反応を終了させろ。次いでこの溶液の吸光度
を４０５　ｎｍで測定する。
表Ｉは加水分解されたｐＮＡの濃度によって測定した各
種基質による活性化ＬＡＬの結果を示して℃・る。基質
Ｎｎ　１　（Ｂ２−１１ｅＢ２−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒを標準とし発色団ｐＮＡに対して１００チ開裂
可能であるものとした・ 表　　Ｉ 各種基質を用いて測定したエンドトキシン活性化リムル
ス変形細胞酵素　　　　。
Ｉ　　Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
　　　７．４８　　１００．００２　　Ｂ！−１１ｅ−
Ｇｌｕ−Ａｌｌ−Ａｒｇ−１）ＮＡ　　　７．０６　　
　９４．３８３　　Ｂ！−１１１−Ｇｌｕ−Ｃ）ｌｉｔ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　１２．７０　　１６７．７８４　
　Ｃ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　　　　７．
２８　　　９７．！３２５　　Ｈ−ＴｈＶａｌ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　　　５．３７　　　７１．９２６
　　ＣｂＯ−Ｍａｌ−Ｇｌ）ｒ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　　
　＜０．０１　　　　＜１．０７１１０ｃｍＡｌａ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ　　　　＜　、０１　　　＜１．０基質番
号２および３は本発明にかかわるものである。加水分解
されたｐＨＪＡの量によって、これらの基質はエンドト
キシン活性化ＬＡＬによって容易に開裂されることが明
らかである。基質１および４は血液凝固ファクターＸａ
およびウロキナーゼをそれぞれ検出するように設計され
ている。基質番号４および６の活性の結果から、　Ｖａ
Ｌ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ　−ＰＮＡ配列のＮ−末端保農
基をベンゾイルかラカルボベンゾキシに代えると、活性
化Ｌル酵素のアミダーゼ活性を妨げる傾向があるという
ことが明らかである。
実施例■ 各種基質の活性定数の測定 注射用の水で０．２５０　ｎｇ／ｍｌ　　Ｋ希釈した大
腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）エンドトキシン０５５：Ｂ５
（ディフコ・ラボラトリーズ）を用いて、ＬＡＬを活性
化し、これを用いて本発明の各種基質についてＫｍ（ミ
ハｈｓ　＋）　ｘ　−、ｌ　ｙテン定数（Ｍｉｃｈａｅ
ｌｉｓ　−）Ａｅｎｔｅｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ））およ
びｖｍａｘを測定した。
ｖｍａｘはすべての酵素が次の反応式で表わされるよう
な酵素−基質コンプレックスとして反応混合物中に存在
する際の測定し得る最大の速度として定義される。
’Ｆ、＋Ｂモ；ＥＳヨ丑Ｅ＋Ｐ Ｅ　＝酵素 Ｓ　＝基質 ＥＳ＝酵素−基質コンプレックス Ｐ　＝生成物 １（ｍは最大速度の１７２を与えるような基質濃度を示
しており、特定の基質に対する酵素の親和性の尺度であ
る。Ｋｍは次の式を用いて計算することができる。
代わりに、ＫｍおよびＶｍａｘは、活性化された酵素を
緩衝液でｐＨ調節した基質と混合し、基１ｊＩｉ１１１
度を変えてこの反応を分光光学的に追っていくことＫよ
り測定することができる。この変法を用いて本発明の基
質ならびに比較例として２つの別の基質についてＫｍお
よびＶｍａＸを測定した・ＫｍおよびＶｍａｘを測定す
る場合、エンドトキシン活性化ＬＡＬの７リコート０．
２　ｍｌを基質的０．７　ｍｌ　と混合する。この基質
の濃度範囲は約７〜２０００μＭであり、０．０５　Ｍ
　）リス−イミダゾールでｐＨ約８．３に調節され約０
．０４　Ｍのｃａｃ１２を含んでいる。この活性化ＬＡ
Ｌと基質を約３７℃で約３分間インキュベートし、次い
で氷酢酸５０チ溶液約帆２ｍｌを加えてこの反応を終了
させる。１分当りの生成ｐＮＡのμＭとして表される初
期速度の逆数１７ψを古典的なラインライ−バー・バー
ク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋ）の図面におい
て１／（ｓ）　Ｋ対してプロットする。このプロットか
らｖｍａｘとＫｍが決定された。その結果を表ＩＩＫ示
すＯ 表　　ｍ 基質親和性（Ｋｍ）と酵素速度（Ｖ晶ａｒ）Ｋよって測
定されたエンドトキシン活性化ＬＡＬの動活性Ｉ　　Ｂ
ｘ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡｌ、１１
ｘ１０　　　　４０４ ２　　Ｂｚ−ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２Ｊ）８
ｘｌＯ４６４ ３Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｉｕ−ＡＩａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２．
３８ｘｌＯ２４０４ ４Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ６
！ｌ＋　ＸＩＯ１１７表ＩＫ示された結果から明らかな
ようＫ、本発明の基質１番号３および４は比較基質より
大きなＶｍａｘをもっている。
実施例Ｖ Ｌ　Ａ　’Ｌ検定用標準曲線の作成 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）エンドトキシン（０１１１
：Ｂ４）および基質Ｂｚ−Ｉ　ｌｅ−にｌｕ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ　およびＢｚ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
　ｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いてエンドトキシン濃度と開
裂ｐＮＡの関係を各基質について測定した。先ずエンド
トキシンの９個の試料を水で希釈し約α００１９〜約０
．５００　ｎｇ／ｍｌの濃度範囲を有する溶液をつくっ
た。各エンドトキシンＭ液約Ｑ、ｌ　ｍｌを活性化して
いないＬＡＬ約０．１　ｍｌ　と混合し、約１２〜１８
分間インキュベートする０この混合物に、約０．０４Ｍ
のＣａＣｌ　２を含み、０．０５Ｍのトリス−イミダゾ
ールでｐＨ８，１に調節した２ｍＭの基質溶液的０．７
　ｍｌを加える。混合物を約３７℃で約３分間インキュ
ベートし１次いで氷酢酸５〇−溶液０．２　ｍｌを加え
て反応を終了させる。
次いで各溶液の吸光度を４０５　ｎｍで測定する。
胃さ− 表蓋は各種のエンドトキシン濃度と吸光度の結果を示し
ている。
表１ 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）エンドトキシンの各種濃度
において、活性化リムルス溶菌液によって基質から開裂
したＩ）ＮＡの吸光度 基質：　１３ｚ−１１ｅ−Ｑｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡエンドトキシン濃度（ｐ　ｍｌ）　　Ｏ，Ｄ、（４
（’５ｎｍ）１．９　　　　　　　０．００２ ３．９　　　　　　　０．００３ ７・８　　　　　　　０．００９ １５．１　　　　　　　０．０２４ ３１．２　　　　　　　０．０４２ ６２．５　　　　　　　０．１０４ １２５．０　　　　　　　０．３５０ ２５０．０　　　　　　　０．７５０ ５００．０　　　　　　　１．０８６ １．２８０ １・９　　　　　　　０．０２８ ３．９　　　　　　　０．０３８ ７．８　　　　　　　０．０６０ １５．１　　　　　　　　０．１４３ ３１．２　　　　　　　０．２５１ ６２−５　　　　　　　０．４７１ １２５．８　　　　　　　０．９９８ ２５０．０　　　　　　　１．３５５ ５００・Ｏ１、７５８ 表ＩＫ示されたデータをプロットするとある範囲のエン
ドトキシン濃度においてｐＮＡ吸光度が直線性を示す。
さらに具体的には、このような曲縁は、本発明の基質を
用いて少なくとも約７〜１２５ｐｇ／ｍ　ｌの濃度範囲
においてエンドトキシンを定量的に検出することができ
ることを示している。
本発明はその特定の実施態様について説明したが、特許
請求の範囲に記載された本発明の精神ならびに範囲から
実質上逸脱することなく当業者であれば多数の変形をす
ることが可能であることが理解されるであろう。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１３下記の一般式を有する、ＬＡＬ型検定により試料
    中のエンドトキシンを定量する際に有用な発色性または
    蛍光性ペプチド聾化合物。 Ｒ１−Ａｌ　−４２−Ａ５−Ａ、−Ｂ−Ｒ２上記式中、
    Ｒ１は水素、保護芳香族炭化水素または保護アシルを示
    し；Ａ１はｌ１ｅｕ　、　Ｖａｌ　　または１、ｅｕか
    ら選ばれたＬまたはＤ−アミノ酸を示し；Ａ２はＧｌｕ
    またはＡＳＩ）を示し；Ａ５はＡｌａまたはｃｙｓ　ｔ
    を示し；Ａ、はｈｒｇを示し；Ｂはエステル結合基およ
    びアミド結合基から選ばれた結合基を示し；Ｒ２は結合
    基ＢＫよってアルギニンのＣ−カルボキシル末端に共有
    結合している発色性基または蛍光性基を示す。 （２）Ｂがアミド結合である特許請求の範囲第１項に記
    載の化合物。 （３１Ａ、がＡｌａである特許請求の範囲第２項に記載
    の化合物。 ＋４１Ａ３がＣｙｓｔである特許請求の範囲第２項に記
    載の化合物。 ＋５１Ａ２がＧｌｕであ、る特許請求の範囲′ｍ３項ま
    たは第４項に記載の化合物。 （６）Ａ２がＡｌｐである特許請求の範囲第３項または
    第４項に記載の化合物。 Ｔ７１Ａｌがｌ１ｅｕ　　である特許請求の範囲第５項
    に記載の化合物。 １８１Ａ１がＶａｌである特許請求の範囲第６項に記載
    の化合物。 ＋９１Ｒ２がニトロフェニルである特許請求の範囲第８
    項に記載の化合物。 （１０）試料中のエンドトキシンの測定方法において、
    前記試料を、リムルス変形細胞溶菌液から得られる前凝
    固酵素ならびに式： ％式％ で表わされる発色性または蛍光性ペプチド型化合物と接
    触させ（上記式中８１は水素、保護芳香族炭化水素また
    は保護アシルを示し；Ａ１は１ｌｅｕ。 ＶａｌまたはＬｅｕから選ばれたＬまたはＤ−アミノ酸
    を示し；Ａ２゛はＧｌｕまたはＡＳＩ）を示し；Ａ、は
    ＡＬａまたはＣｙｓｔを示し；Ａ、ｌはＡｒｇを示し；
    Ｂはエステル結合基およびアミド結合基から選ばれる結
    合基を示し；Ｒ２は結合基ＢＫよってアルギニンのＣ−
    カルボキシル末端に共有結合している発色性基または蛍
    光性基を示す。前記発色性基または蛍光性基はエンドト
    キシンと前凝固＃素の存在下に前記ペプチド型化合物の
    残基部分から酵素的に開裂されて少なくとも一部の標識
    化合物を形成することができる）かつ、前記試料中の標
    識化合物の存在または不存在を検出することを特徴とす
    る上記方法。 （１１）Ｂがアミド結合である特許請求の範囲第１Ｏ項
    に記載の方法。 （１２）　Ａ　５　がＡｌｍである特許請求の範囲＠１
    １項に記載の方法。 （１３）Ａ　、がＣｙｓｔである特許請求の範囲第１１
    項に記載の方法。 （１４）Ａ２　がＧｌｕである特許請求の範囲＠１２項
    または第１３項に記載の方法。 （１５）、Ａ２　がＡＳＩ）である特許請求の範囲第１
    ２項または第１３項に記載の方法。 （１６）　Ａ　ｌ　がｌ　ｌｅｕである特許請求の範囲
    第１４項に記載の方法。 （１７）　Ａ　ｌ　　がＶａｌである特許請求の範囲第
    １５項に記載の方法。 （１８）Ｒ，がＰ−ニトロフェニルである特許請求の範
    囲第１７項に記載の方法。
JP57153357A 1981-09-03 1982-09-02 エンドトキシンの定量に有用なペプチド型基質 Pending JPS5877850A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/298,994 US4406832A (en) 1981-09-03 1981-09-03 Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US298994 1981-09-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS5877850A true JPS5877850A (ja) 1983-05-11

Family

ID=23152894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP57153357A Pending JPS5877850A (ja) 1981-09-03 1982-09-02 エンドトキシンの定量に有用なペプチド型基質

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4406832A (ja)
EP (1) EP0074761B1 (ja)
JP (1) JPS5877850A (ja)
AU (1) AU551146B2 (ja)
CA (1) CA1239395A (ja)
DE (1) DE3268135D1 (ja)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4505852A (en) * 1982-11-29 1985-03-19 Enzyme Systems Products 7-Amino-4-trifluoromethylquinolone derived substrates and method for determining enzymes and inhibitors
EP0128118B1 (de) * 1983-06-03 1991-08-14 Pentapharm A.G. Peptidderivate und deren Verwendung als Substrate zur quantitativen Bestimmung von Enzymen
DE3411574A1 (de) * 1984-03-29 1985-10-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Glycoside von resorufin-derivaten, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der aktivitaet von glycosidasen
DE3412939A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-17 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrate fuer hydrolasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US4855407A (en) * 1985-04-11 1989-08-08 Alpha-1 Biomedicals, Inc. Solid phase process for synthesizing peptides
US4717658A (en) * 1985-12-03 1988-01-05 Miles Inc. Gram negative bacteria screening method with horseshoe crab amebocyte lysate (LAL)
GB8727796D0 (en) * 1987-11-27 1987-12-31 Radiometer Corporate Developme Urine assay process and kit
DE68926178T2 (de) * 1988-05-10 1996-11-28 Alpha 1 Biomedicals Inc Festphase-Verfahren zur Gewinnung von Thymosin-alpha-1
EP0426395B1 (en) * 1989-10-30 1997-01-22 Biowhittaker, Inc. Kinetic assay for endotoxin using limulus amebocyte lysate and chromogenic substrate
JP2944721B2 (ja) * 1990-08-22 1999-09-06 生化学工業株式会社 エンドトキシンの測定剤
JP2957251B2 (ja) * 1990-09-28 1999-10-04 生化学工業株式会社 エンドトキシンの測定法
JPWO2008004674A1 (ja) * 2006-07-07 2009-12-10 生化学工業株式会社 プロクロッティングエンザイム、並びに、これを用いたエンドトキシン又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5415797A (en) * 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
JPS5635994A (en) * 1979-08-30 1981-04-08 Seikagaku Kogyo Co Ltd Apparatus for detecting and measuring toxin in bacteria and its preparation

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4137225A (en) * 1975-07-11 1979-01-30 Ab Kabi Novel chromogenic enzyme substrates
SE437153B (sv) * 1976-12-01 1985-02-11 Kabi Ab Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4229528A (en) * 1978-11-13 1980-10-21 Smith Robert E Fluorescence method for enzyme analysis which couples aromatic amines with aromatic aldehydes
US4216142A (en) * 1978-12-18 1980-08-05 Abbott Laboratories Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
US4217269A (en) * 1979-03-23 1980-08-12 Abbott Laboratories Dipeptide chromogenic substrates
US4221706A (en) * 1979-06-14 1980-09-09 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
US4301245A (en) * 1980-05-29 1981-11-17 Dynasciences Corporation Chromogenic method of detecting endotoxins in blood

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5415797A (en) * 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
JPS5635994A (en) * 1979-08-30 1981-04-08 Seikagaku Kogyo Co Ltd Apparatus for detecting and measuring toxin in bacteria and its preparation

Also Published As

Publication number Publication date
AU8778182A (en) 1983-03-10
EP0074761A1 (en) 1983-03-23
CA1239395A (en) 1988-07-19
EP0074761B1 (en) 1985-12-27
US4406832A (en) 1983-09-27
AU551146B2 (en) 1986-04-17
DE3268135D1 (en) 1986-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0046742B1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
US4440678A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
EP0873417B1 (en) Compositions for the detection of proteases in biological samples and methods of use thereof
McRae et al. Mapping the active sites of bovine thrombin, factor IXa, factor Xa, factor XIa, factor XIIa, plasma kallikrein, and trypsin with amino acid and peptide thioesters: development of new sensitive substrates
CA1136124A (en) Easily split substrates for the quantification of proteases
US4508644A (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
US4510241A (en) Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
JP2000503533A (ja) 蛍光消光基質を用いたタンパク質分解酵素のアッセイ方法
Bond et al. Relationship between the individual collagenases of Clostridium histolyticum: evidence for evolution by gene duplication
US4190574A (en) Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators
JPS5877850A (ja) エンドトキシンの定量に有用なペプチド型基質
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
GB2126720A (en) A method for determination of enzyme activity
Signor et al. Structural features of neutral protease from Bacillus subtilis deduced from model‐building and limited proteolysis experiments
EP1962091B1 (en) Methods and kits for detecting and measuring ADAMTS13/FX1 complexes
Kerr [6] The second component of human complement
Turkington Degradation of human factor X by human polymorphonuclear leucocyte cathepsin G and elastase
JP2887765B2 (ja) ポリアルキレングリコール残基を含む対称ビペプチド、その製造方法およびプロテアーゼの検定における使用
DK168574B1 (da) Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase
US4569907A (en) Thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase
JP2896605B2 (ja) 新しいペプチド基質，調整法及びプロティンｃ定量における用途
Mannhalter Biochemical and functional properties of factor XI and prekallikrein
Williams et al. [28] Peptide chloromethyl ketones as labeling reagents
HU197757B (en) Process for producing chromogen compounds
JP4298500B2 (ja) 新規の色素形成基質およびカルボキシペプチダーゼ活性を分析する際のその使用