JP2896605B2 - 新しいペプチド基質，調整法及びプロティンｃ定量における用途 - Google Patents

新しいペプチド基質，調整法及びプロティンｃ定量における用途

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は新工業製品として、下記の式Ｉのペプチド基
質及びそれらの付加塩に関するものである。
これは更に、これら新製品の調整法ならびに、プロテ
ィンＣの定量の分野でのそれらの用途に関するものであ
る。
先行技術 公知の如く、多くのペプチド基質が、止血の継続機構
に含まれる多くの物質の識別と分析のため既に過去にお
いて提言されている。
特に公知の如く、下記の基質 〔ここにPryはピログルタミニル残基（すなわち５−オ
キソプロリルまたはピロリジン−２−１−５−カルボニ
ル）でありpNAはｐ−ニトロアニリン基である〕はヨー
ロッパ公開特許公報0004256に、セリンプロテアーゼやS
Hプロテアーゼの定量用のクロモゲン基質として記述さ
れていて、最近、プロティンＣの定量に効果があること
が立証された。
また、公知のように、下記の基質 は既にプロティンＣの定量の分野で使用されているが、
その効果は前記の化合物II aの効果に劣る。
発明の目的 従って、プロティンＣの定量用としては、特定のペプ
チド基質が必要である。実際、前記の基質II aとII bを
除いて、市販で入手できるプロティンＣ用の他の特定基
質はない。
この要求に応えるため、本発明によれば、先行技術で
公知の式II aとII bによる前記物質の構造とは異なる構
造を有するペプチド基質を用いる新しい技術的解決策が
提案されている。
発明の主題 本発明の第一の特徴によれば、下記からなる基から選
ぶペプチド基質が、新しい工業的製品として推奨され
る。
（ｉ）次式によるトリペプチド ここに、ＹはＨまたはＮ−末端基を保護する適当な基
であり、 A1は（２−オキソチアゾリジン−４−イル）カルボニ
ル〔THCと略す〕，（２−オキソテトラヒドロ−1,3−チ
アジン−５−イル）カルボニル〔TZCと略する〕，チア
ゾリジン−４−カルボニル〔ATCと略する〕，及び（テ
トラヒドロ−1,3−チアジン−５−イル）カルボニル〔A
ZCと略す〕残基からなる基から選定したアミノ酸残基で
あり、 A2は残基Pro,3Hyp及び4Hypからなる基から選んだアミ
ノ酸残基であり、ここに3Hypと4HypのOH側基がエーテル
またはエステル保護基で保護することができる。
A3はArgとLys残基からなる基から選んだアミノ酸残基
であり、また、 Ｒは標識手段であり、かつ、 （ii）これらの付加塩類。
本発明の第二の特徴によれば、プロティンＣの定量の
ため式Ｉのトリペプチド化合物及びそれらの付加塩類を
用いることが推奨される。この目的で、プロティンＣの
分析すなわち確認のための一つの定量法が推奨される
が、これは、式Ｉのトリペプチドまたはその付加塩類の
一つを体液（特に、プラズマまたは血清、または尿）ま
たは、プロティンＣを含むであろう天然または合成系
の、任意の別のサンプルと接触させることからなってい
る。
最後に、本発明の第三の特徴によれば、式Ｉのトリペ
プチド化合物、及びそれらの付加塩類の調整法が推奨さ
れる。
略号 便利のために、本発明では下記の略号を使用してい
る。
−アミノ酸残基： Arg＝アルギニル ATC＝チアゾリジン−４−カルボニル（またはチオプロ
リル） AZC＝（テトラヒドロ−1,3−チアジン−５−イル）カル
ボニル 3Hyp＝３−ヒドロキシプロリル（または３−ヒドロキシ
ピロリジン−２−カルボニル） 4Hyp＝４−ヒドロキシプロリル（または４−ヒドロキシ
ピロリジン−２−カルボニル） Lys＝リシル Pro＝プロリル Pyr＝ピログルタミニル（またはピロリジン−２−１−
カルボニル） THC＝２−オキソチアゾリジン−４−イル）カルボニル TZC＝（２−オキソテトラヒドロ−1,3−チアジン−５−
イル）カルボニル −他の略号としては： Ac＝アセチル AcOH＝醋酸 Adoc＝アダマンチルオキソカルボニル Aoc＝ｔ−アミルオキシカルボニル Boc＝ｔ−ブトキンカルボニル Bop＝（ベンゾトリアゾル−１−イル）オキシトリス
（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホス
フエート（別名：カストロ試薬）で式は下記の通りであ
る。
Bu＝ｎ−ブチル Bz＝ベンゾイル Bzl＝ベンジル Cho＝カルボベンゾキシ ｏ−Cl−pNA＝ｏ−クロロ−ｐ−ニトロアニリノ〔また
は（２−Cl）pNA〕 DCCI＝シサイクロヘキシルカルボジイミド DIEA＝ジイソプロピルエチルアミン DMF＝ジメチルフオルムアミド Et＝エチル Et3N＝トリエチルアミン Eto＝エトキシ Fmoc＝フルオレン−９−イルメトキシカルボニル Foc＝フルフリルオキシカルボニル HMPT＝N,N,N′,N′,N″,N″−ヘキサメチルホスホロト
リアミド HOBT＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾル HPLC＝高性能液体クロマトグラフィ Ｈ−TFA＝三弗化醋酸（またはHTFA） Iboc＝イソボルニルオキシカルボニル iPr＝イソプロピル Me＝メチル MW＝分子量 OD＝光学密度 Ph＝フエニル pH＝H+イオン濃度の余対数 pNA＝ｐ−ニトロアニリノ〔または（４−NO2）C6H4NH〕 Pr＝ｎ−プロピル RT＝室温（15−20℃） tBu＝ｔ−ブチル THF＝テトラヒドロフラン TLC＝薄層クロマトグラフィー Tos＝ｐ−トルエンスルホニル（ないしトシル） Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル Ｚ（ｐ−Cl）＝ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル Ｚ（ｐ−OMe）＝ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル 発明の詳細な説明 上記の式Ｉにおいて、アミノ酸残基A1は次の構造式で
代表することができる。すなわち ここに、Ｂは単結合ないしCH2基であり、 また、ＸはCH2ないしCOである。
式IIIの対（B;X）が（−;CO），（CH2;CO），（−;CH
2）ないし（CH2;CH2）である場合、A1は夫々THC,TZC,AT
C、またはAZCである。
本発明によれば、アミノ酸残基A1はＤまたはＬの形態
を有するか、または、別途、これら２形態のラセミ混合
物（DL）であるだろう。A1は好ましくはＤ−THC,D−TZ
C,D−ATC及びＤ−AZCであるだろうし、更に好ましく
は、Ｌ−THC,L−TZC,L−ATC及びＬ−AZCであるだろう。
本発明によれば最も貴重と考えられるアミノ酸残基A1は
Ｌ−THCである。
水素原子と、ヨーロッパ公開特許公報0110306,米国特
許公開4480030,仏国公開特許公報2293439及び米国特許
公報4440678に記述されているもののようなペプチドの
Ｎ−末端基をブロックする基とは適当なＹ基に属すると
いえよう。下記のものは、特にＨ以外に、当該Ｎ−末端
基をブロックするＹ基に属するといえよう。すなわち、
C1−C4アルキル基（特に、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBu）、置
換または非置換アリル基（特に、Ph,トリル、キシリ
ル、クロロフェニル，トリフルオロメチルフェニル，メ
トキシフェニル）、置換または非置換アラルキル基（特
に、Bzl,クロロベンジル、ジクロロベンジル，トリフル
オロメチルベンジル，ジフルオロベンジル，メトキシベ
ンジル，エトキシベンジル,3,4−メチレンジオキシベン
ジル）及び従来のペプチドのＮ−末端基用の保護基〔特
に、Ac,Tos,Adoc,Aoc,Bz,Cbo,Fmoc,Foc,Iboc,Z,Z（ｐ−
Cl）及びＺ（ｐ−OMe）〕。
Ｈ以外のＹ基は下記の２反応略図の一つに従って、式
Ｉのトリペプチド内に持込まれる。
図Ａ ここにA1のCO末端基に結合されたOH基（カルボキシル
酸基の）はもし適当であれば、保護される。また、 図Ｂ 図Ａを選ぶかＢを選ぶかはブロッキンググループの性
質（ｉ）ならびにA1の環の位置３にあるＮ−末端基の水
素原子の活性（ii）次第である。このことを念頭におい
て、A1がTHCまたはTZCである場合は、図Ａを用いる方が
好ましいだろう。
更に、THCとAZCの環は一般には高温での環化によって
求められるので、環化はＨ以外の基Ｙの存在によって摂
動されるしかつ／または収率が低下するし、特に、熱分
解反応機構においては、Ｙ＝アルキル，アリルまたはア
ラルキルである。すなわち したがって有利なのは、熱分解によって、酸Ｈ−THC
−OHとＨ−AZC−OHを調整し、次に前記の図Ａに従って
Ｎ−末端基のＨ原子を置換してＹがＨ以外である式Ｉの
化合物を得るようにすることである。
本発明による好ましい基Ｙはである。早い話が、基Ｙ
＝Ｈはもし、プロティンＣに対する基質Ｙ−A1−A2−A3
−Ｒの特異性がこのような置換によって本質的に強化さ
れるなら、かつ、そうしさえすれば、Ｈ以外のＹ基で置
換されるだろう。
上に示したように、3Hyp及び4HypのOH側基はエーテル
またはエステルの形で保護することができる。当該OH基
のＨ原子を置換する保護基は特にC1−C4アルキル基（特
に、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBu）または置換または非置換ア
リル基（特に、Ph,トリル，キシリル，クロロフェニ
ル，トリフルオロメチルフェニル，メトキシフェニル）
または置換または非置換アラルキル基（特にBzl,クロロ
ベンジル，ジフルオロベンジル，トリフルオロメチルベ
ンジル，ジクロロベンジル，メトキシベンジル，エトキ
シベンジル,3,4−メチレンジオキシベンジル）であり、
これはエーテル状の保護という面ではＹの定義上考えら
れることであり、あるいは、エステル状の保護という面
では、C2−C5脂肪族アシル基（特にAc,プロピオニル，
ブタノイル，ペンタノイル）または芳香族基（特にBz,
トルオイル，クロロベンゾイル，メトキシベンゾイル,
3,4−メチレンジオキシベンゾイル）であってもよろし
い。もし適当なら、当該Ｈ原子も、Tosまたはトリアル
キルシリル基（特に、トリメチルシリルまたはトリエチ
ルシリル）といったようなもので置換してもよい。
有利には、アミノ酸残基A2とA3の形態はＬであろう
し、また、本発明によるA2とA3用の好ましい基はＬ−Pr
o,L−3Hyp及びＬ−4Hypで、夫々、Ｌ−ArgとＬ−Lysで
あろう。
標識手段Ｒは生物学的分析及び微生物学的分析の技術
において公知であり、これに関しては上に引用された先
行技術及び特に、文献米国特許公報4448715が参考にな
る。当該標識手段は、アミノ化基NH−Ｒ′からなる基か
ら選定するのが好ましく、これらの基は（ｉ）変色を起
こし、（ii）蛍光変化を起こし、あるいは（iii）少な
くとも１種の放射性元素（例えば、14Cまたは3Hラジオ
アイソトープで標識したアニリン基またはベンジルアミ
ノ基）を含んでいる。酵素反応中または後、検出のため
増幅可能な（例えば、与えられた波長における光学密度
の測定によってまたは放射能の測定によって）信号を与
える任意のアミノ基NH−Ｒ′は、本発明の目的にかなっ
ている。高速加水分解における開裂によって得られる物
質Ｈ−Ｒの量は使用酵素の量に比例する。当該Ｈ−Ｒの
量は高度測定、分光測光法、蛍光分光測光法または電気
化学法によって定量可能である。
本発明による、好ましい基Ｒは発色性の基で、代表的
にはニトロフェニルアミノ基（このフェニル基はCOOH,
H,Cl,Br,CH3,OCH3,CN,CF3及び／またはSO3Hといった基
で置換することができる）あるいは、蛍光発生性の基、
代表的には、ナフチルアミノ基（このナフチル基は、OC
H3,COOH,SO3HまたはCH3基で置換することができる）
や、４−メチルクマリル−７−アミノ,4−トリフルオロ
メチルクマリル−７−アミノ及び類似の基である。
本発明により適当な発色性ならびに蛍光発生性のアミ
ノ化基の中から特に下記のものを挙げることができる。
すなわち、ｐ−ニトロアニリン（pNAと略す）,2−カル
ボキン−４−ニトロアニリン及び３−カルボキシ−４−
ニトロアニリン,2−ハロゲン−４−ニトロアニリン及び
３−ハロゲン−４−ニトロアニリン（このハロゲンはF,
ClまたはBr）,2−メトキシ−５−メチル−４−ニトロア
ニリン,2−ヒドロキシスルホニル−４−ニトロアニリ
ン,4−トリフルオロメチル−２−ニトロアニリン,4−ト
リフルオロメチル−３−ニトロアニリン,4−シアン−２
−ニトロアニリン，メフチル−２−アミノ,4−ヒドロキ
シスルホニルメフチル−１−アミノ，キノリルアミノ，
ニトロキノリルアミノ等である。
本発明によれば好ましいＲ基は発色性の基すなわち、
一方ではpNAであり、他方ではpNAのフェニル環が、２ま
たは３の位置において置換され、当該基の式が下記のよ
うなものである類似の基であり、 ここにＹ′はBr,Cl,F,CF3,COOH,COOW,CONH2,CONHW,CONW
2,CONH（CH2）mNMe2,OHまたはOWである。ここにＷはC3
−C6アルキル,C6−C10アリル,C7−C11アラルキル，また
はC3−C6脂環式の基であり、ｍは値が１から10までの整
数である。
pNA基のフェニル環が置換されている式VIのかような
基は特に、文献ヨーロッパ公開特許公報0110306に記載
されている。
本発明による付加塩類は本質的に式Ｉの化合物を無機
または有機酸と反応させて求めた酸付加塩類である。
ここでは推奨されている、本発明実施の最良の態様
は、下記からなる基から選定した基質を使用することに
ある。すなわち、 （ａ） 下式のトリペプチド化合物、すなわち ここに A1はＤ−THC,D−TZC,D−ATC,D−AZC,L−THC,L−TZC,L
−ATC,またはＬ−AZCであり、 A2はＬ−Pro,L−3HypまたはＬ−4Hypで A3はＬ−ArgまたはＬ−Lysで、また （ｂ） それらの付加塩類 本発明の最良の実施態様においては、更に詳しくは、
アミノ塩残基A1としてＬ−TZC,L−ATCまたは好ましくは
Ｌ−THCを用いることが推奨される。
便利のため、下記の記述においては、無形態で言及さ
れているアミノ酸残基（例えばPro）は、別途指示ない
限り、当該アミノ酸残基がＬ形態（すなわち、問題の例
のＬ−Pro）を有していることを表わす。
全く制限の意味ではなく本発明による幾つかのペプチ
ド化合物を下記の表Ｉに対照した。
式Ｉのトリペプチド化合物と、本発明によるそれらの
付加塩類はペプチド合成の従来の反応機構の応用によっ
てそれ自体公知の方法に従って調整することができる。
ここに推奨される調整方法は下式のジペプチド１モルを
反応させることにある。
ここにA2,A3及びＲの定義は上に示した通りであり、
下式のアミノ酸1.0ないし1.3モルを含んでおり、 ここにＹとA3の定義は上に示した通りでありかつ、Ｔ
はOH,F,ClまたはBrである。
有利には、反応VI＋Ｖ＝Ｉは、０ないし50℃の温度、
特に室温において、不活性溶媒、特にDMFまたはTHF中で
実施される。また、有利な方法は、反応媒体が、共存溶
媒として、かつプロトン受容体として作用するEt3Nまた
はDIEAのような過剰の塩基からなることであろう。当該
反応が行われる際、カプリング剤、特にBopまたはHOBT
も、当該反応媒体に混入されるだろうし、特にＴがOHで
ある場合そうであろう。HOBTをカプリング剤として用い
る場合、適量のDCCIを当該剤と結合するのは有利であろ
う。
実際上、IV/Et3NまたはIV/DIEAのモル比として1/2な
いし1/4が採用されるだろうし、Ｔ＝OHの場合、IV/HOBT
またはIV/Bopのモル比として1/1ないし1/5が採用される
だろう。DCCIを使用する場合、IV/DCCIのモル比のオー
ダは1/1.5〜1/2となろう。カプリング剤HOBTとBopの目
的はCO末端基（Ｔ＝OHの場合）のカルボキシル基COOHを
活性化することであり、また、これらの特長はラセミ化
を起こさないことである。薬剤BopはpH7〜８で使用され
るだろうし、薬剤HOBTはpH5ないし８で使用されるだろ
う。そのカプリング特性に関しては、Bopの方がHOBTよ
りも好まれるだろう。式Ｉのトリペプチドは、下記の段
階に応じて、反応IV＋Ｖ＝Ｉの反応媒体から単離され
る。すなわち −真空下で、不活性溶媒を蒸発乾固する。
−エーテル（MeOMeまたはEtoEt）で、出来た蒸発残渣を
沈澱させ、次に濾過によって沈澱物を回収する。
−最小量のCHCl3/MeOH/Acoh混合物中に濾過した沈澱を
溶解させる。
−当該溶媒CHCl3/MeOH/Acohを用いて、できた混合物を
クロマトグラフィーにかける。
−当該クロマトグラフィーから得られた均質部分をプー
ルし、当該溶媒を蒸発する。
式Ｉのトリペプチド化合物とそれらの付加塩類はプロ
ティンＣ用の特定の基質を構成する。プロティンＣの推
奨される定量法においては、式Ｉのトリペプチドの一定
量、またはその付加塩類の一つの一定量（濃度のオーダ
が10mg/mlの場合）を、緩衝した等張液のような適当な
水性液体媒体中で、プロティンＣを含んでいるかもしれ
ないテストサンプル（適当であれば希釈する）と、少な
くとも0.5時間、室温ないし40℃の温度で、特に37℃で
接触させる。
本発明によるトリペプチドのプロティンＣに対する活
性は、従来の方法、例えば特許公報ヨーロッパ公開特許
公報0280160（14頁参照）、によって測定したし、加水
分解率を光学密度の経時変化で評価した（ΔOD/分）。
等モル投薬で求めた結果を下記の表IIで対照したがこの
場合、式II aの参考物質の活性は便利の面から100％に
等しいと指定している。
表IIの比較結果の示すところでは、本発明によるトリ
ペプチドは少なくとも参考物質CP1と同じ活性である。
式Ｉのトリペプチドまたはその付加塩類の一つ及びも
し適当ならプロティンＣの標準サンプル（人間または牛
の）及び緩衝希釈媒体の標準サンプルのはいったプロテ
ィンＣ定量用の分析装備一式も本発明の推奨するところ
である。
本発明のこの他の特長と特徴は下記の調整実施例の記
述から更に明確に理解されることになろう。これらのデ
ータには制限の意味は全くなく、例示として示すもので
ある。
調整１ Ｌ−THC−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.H−TFAの調整（実施
例１） ａ）Ｚ−Ｌ−Arg−pNA.HCl 3.44g（0.01モル）のＺ−Ｌ−Arg−OH.HClを室温で20
mlの無水HMPTに溶解し、1.39ml（0.01モル）のEt3Nを、
次に、室温で、撹拌しながら添加する。2.46g（0.015モ
ル）のイソシアン酸ｐ−ニトロフェニルを出来た溶液に
添加する。出来た反応媒体を室温で24時間撹拌し、次
に、真空蒸発を行い、残渣は最小限の量のAcOHで溶解
し、次にAcOEtで希釈する。出来た溶液は、その後、３
回、連続して、少量の0.5モルのNaHCO3で、次に３回50g
/lのKHSO4溶液で、そして次にNaClで半飽和したH2Oで、
数回抽出する。次に有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させる。濾過（Na2SO4の除去）した後、溶媒は蒸発し
てしまい蒸発残渣はAcOEt/MeOMe混合液（3/7v/v）から
再結晶させて、白粉状の予定の物質3.5gを得る。融点＝
128〜130℃ 分析（シリカゲル上のTLC）すなわち Rf＝AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1v/v）中0.5 Rf＝CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1v/v）中0.69 ｂ）Ｈ−Ｌ−Arg−pNA.2HBr 1g（2.15ミリモル）のＺ−Ｌ−Arg−pNA.HClをガラス
／テフロン装置に装入する。8mlの氷醋酸、2mlのアニゾ
ル及び10mlのHBr溶液（w/vが33％の）を、次々にフェニ
ル活性雰囲気において添加する（窒素流）。反応は放置
して、窒素雰囲気中で、室温で、１時間進行させる。こ
の時間が経過したら、脱保護の間、均質になった反応混
合物をエーテル中で沈澱させる（MeOMeまたはEtOEt）。
傾瀉の後、上澄み液は放棄し、沈澱又は数回エーテルで
洗滌する。沈澱は濾過捕集し、24時間、KOH上で真空乾
燥すると0.95グラムの初期の物質が得られる。
分析（シリカゲル上のTLC）、すなわち Rf＝AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1.5v/v）中0.
04 Rf＝BuOH/AcOH/H2O（3/1/1v/v）中0.38 ｃ）Boc−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.HBr 1g（2.19ミリモル）のＨ−Ｌ−Arg−pNA.2HBrを10ml
のDMFに溶解し、次に0.854ml（6.57ミリモル）のDIEAを
添加するＱ別の容器中で50mlのDMF中の4.71mg（2.19ミ
リモル）のBoc−Ｌ−Pro−OH溶液を0.285mlのDIEAで中
和する。両溶液を混合し、次に970mgのBopを添加し、そ
の間、できる混合物は撹拌して室温に保ち、pHは小量の
DIEAを添加して、反応中7.0ないし8.0に維持する。１時
間後、反応は完結し、反応混合物は真空中で蒸発乾燥
し、蒸発残渣はAcOEt/MeOH混合物で溶解し、NaHCO3の0.
5モル水溶液で抽出する。有機相は硫酸ナトリウム上で
乾燥し、濃縮しエーテル（MeOMeまたはEtOEt）中で沈澱
させて、877mg（収率:70％）の初期の物質を得る。
分析（シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー） Rf＝CHCl3/MeOH/AcOH（20/3/1v/v）中の0.27 Rf＝CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1v/v）中の0.71 ｄ）Ｈ−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 850mg（1.485ミリモル）のBoc−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−p
NA.HBrを、次に6mlのCH2Cl2及び6mlのＨ−TFAを次々と
反応器に装入する。0.25時間の反応時間後、反応混合物
を直接、エーテル中に沈澱させる。できた沈澱を乾燥し
た後837mgの初期の物質が得られる。
分析（シリカゲル上のTLC） Rf＝BuOH/AcOH/H2O（3/1/1v/v）中0.56 Rf＝CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1v/v）中0.13 ｅ）Ｌ−THC−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.H−TFA 上記のｃ）項で述べた操作プロトコールに従って
（ｉ）800mg（1.3ミリモル）のＨ−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−
pNA.2H−TFAと（ii）（90mg（1.3ミリモル）Ｈ−THC−O
Hと（iii）1mlのDIEAと（iv）5.75mg（1.3ミリモル）の
Bopからなる反応混合物を、撹拌しつつ室温で、1.5時間
DMF中で反応させる。反応混合物はその後、真空蒸発
し、残渣を、次にEtOEt中で沈澱させる。得られる白色
沈澱は最小量の溶媒系CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1v/v）に
溶解させ、そして同じ溶媒系を用いてシリカゲル上でク
ロマトグラフィーにかける。均質な部分を回収し、プー
ルし蒸発すると、410mg（収率:54％）の初期の物質が得
られる。
分析（シリカゲル上のTLC） Rf＝CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1v/v）中0.28 Rf＝CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1v/v）中0.33 調整II Ｌ−THC−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.AcOHの調整（実施例
２） 調整Ｉに従って求めたＬ−THC−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−p
NA.H−TFAから出発して、実施例２の物質、すなわちＬ
−THC−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.AcOHをAMBERLITE（登録
面積）IRA 401S樹脂上で（予めアセチル化した）イオン
交換により調整し、溶離剤はMeOH/H2O混合物（3/2v/v）
である。
調整III 実施例１の物質を調整するがIe段階のシリカゲル上ク
ロマトグラフィーはHDLC（粒子の大きさ３ミクロンのハ
イパーシルC18カラム）で代行する。求めた物質の純
度は調整Ｉで求めたものより高い。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 5/097 C12Q 1/37 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記で構成する基から選定されるペプチド
    化合物、すなわち （ｉ）式が のトリペプチド ここにＹはＨまたはＮ−末端基をブロックする適当な基
    であり、 A1は（２−オキソチアゾリジン−４−イル）カルボニル
    〔THCと略す〕、（２−オキソテトラヒドロ−1,3−チア
    ジン−５−イル）カルボニル〔TZCと略す〕、チアゾリ
    ジン−４−カルボニル〔ATCと略す〕及び（テトラヒド
    ロ−1,3−チアジン−５−イル）カルボニル〔AZCと略
    す〕残基からなる基から選定したアミノ酸残基で、 A2はPro,3Hyp及び4Hyp残基からなる基から選んだアミノ
    酸残基で、ここに3Hypと4HypのOH側基がエーテルまたは
    エステル保護基で保護できるもので A3はArgとLys残基からなる基から選んだアミノ酸残基で
    あり、かつ、 Ｒは発色性の基または蛍光発生性の基であり、かつ、 （ii）これらの付加塩類。
  2. 【請求項２】請求項１記載のペプチド化合物においてア
    ミノ酸残基A1の形態がＤまたはＬでありかつ、アミノ酸
    残基A2とA3の形態がＬである化合物。
  3. 【請求項３】請求項１記載のペプチド化合物において、
    ＹがＨであるもの。
  4. 【請求項４】請求項１記載のペプチド化合物において、
    A1がＬ−THCであるもの。
  5. 【請求項５】下記からなる基から選定される請求項１記
    載のペプチド化合物、すなわち （ａ） 下記の式のトリペプチド化合物 ここに A1はＤ−THC,D−TZC,D−ATC,D−AZC,L−THC,L−TZC,L−
    ATCまたはＬ−AZCであり、 A2はＬ−Pro,L−3HypまたはＬ−4Hyp A3はＬ−ArgまたはＬ−Lysである。 （ｂ） それらの付加塩類。
  6. 【請求項６】請求項５記載のペプチド化合物において Ｈ−Ｌ−THC−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAからなる基から選
    定する化合物とその付加塩類。
  7. 【請求項７】プロティンＣの定量法において、請求項１
    記載のペプチド化合物のある一定の量を、水性生物学媒
    体中で、プロティンＣを含むテストサンプルと接触させ
    る方法。
  8. 【請求項８】請求項７記載の方法において、請求項１記
    載のペプチド化合物の一定量を水性生物学媒体中で、プ
    ロティンＣを含むテストサンプルと、少なくとも0.25時
    間、15ないし40℃の温度で接触せしめる方法。
  9. 【請求項９】式Ｉのペプチド化合物またはその付加塩類
    の一つの調整法において、ペプチド合成の機構を採用す
    る当該方法が、次式のジペプチド１モルを反応させるこ
    とからなり、 ここにA2,A3及びＲが、上記の請求項１に示すように定
    義され、次式のアミノ酸1.0ないし1.3モルを有し ここにＹとA3は上記請求項１に示すように定義され、か
    つ、 ＴはOH,F,ClまたはBrである。
  10. 【請求項１０】プロティンＣの定量用装備一式におい
    て、請求項１記載の式Ｉのトリペプチドから選定する少
    なくとも一種の化合物及びそれらの付加塩類を有するも
    の。
  11. 【請求項１１】請求項10記載のプロティンＣの定量用装
    備一式において、プロティンＣの標準サンプルと緩衝し
    た希釈媒体とを更に有するもの。
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