JPH05505385A - 溶液、特に発酵溶液から精製ｅｐｉ蛋白質の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 溶液、特に発酵溶液から精製ＥＰＩ蛋白質の回収方法本発明は、ＥＰＩＷ白質の 単離及び精製方法に関する。

発明の背景 血液凝固は、多くの活性化および不活性化凝固因子を巻き込んだ複雑なプロセス である。抗凝固性の蛋白質は、凝固プロセスの調節に対し重要であることが知ら れている。

凝固阻害物質および凝固の調節に関するレビューに対しＬＭｍｍｌｅ　ａｎｄ　 Ｊ、Ｇｒｉｆｆｉｎ　（Ｃ１ｉｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇ　１４＋ 　２８１〜３４２頁、１９８５年）を参照のこと 従って、ヘパリンは、抗トロンビン■およびヘパノン補因子■の活性を増加させ るため臨床的に用いられる。抗トロンビン■は、因子Ｘａおよびトロンビンの抑 制のために用いられる。ヒルンビンは、トロンビンの抑制のために用いられる。

蛋白質Ｃは、因子Ｖおよび■の抑制のために用いられる。

凝固は、組織因子の放出により外因性経路を通って開始し得る（Ｊ、Ｈ，モリセ イ等：　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｒｅｓ　５０　ｐ、４８１〜９３．１９８８）。

外因性経路による凝集活性は、異なる機構により抑制され得る（Ｐ、Ｍ、サンプ セット等：　Ｔｈｒｏｏ＋ｂ　Ｒｅｓ　４７．　ｐ、３８９−４００．１９８７ 　；Ｂ、Ｊ、ワーンークラマー等：　Ｔｈｒｏａ＋ｂ　Ｒｅｓ　４８＋　ｐ、１ １−２２＋　１９８７　；Ｓ、７ンドーおよび−、キジエル：　Ｂｌｏｏｄ　７ ０．　ｐ、１９４７−５４．１９８７　；Ｓ、Ｄ、カルノン：　Ｊ、Ｂｉｏｌ　 Ｃｈｅｗ　２６２．　ｐ、７１Ｂ−２１，１９８７；　Ｇ、Ｊ、ブロゼ等：　Ｂ ｌｏｏｄ　７７、　ｐ、３３５−４３．１９８８　；　Ｓ、コンド−等：　Ｔｈ ｒｏｍｂＲｅｓ　４８．　ｐ、４４９−５９．　１９８７）。

多くの凝集疾患における基本的トリガは、組織因子の放出であり従って因子Ｘ■ −組織因子により因子Ｘの活性化である。

手術中に、組織因子は放出されそして血栓が形成される。

心臓発作において、第一の血栓が形成され次いでこの血栓が放出されるとき、組 織因子は暴露され次いで凝固が開始され、第二の、おそらく致命的血栓を生じさ せる。セプシス中、細菌性内毒素は、組織因子の全身的放出を誘発する。これは 、散在性静脈内凝固（ＤＩＣ）を導き得る。ＤＩＣ↓よ、凝固カスケードにおけ る後期工程を抑制する抗トロンビン■で処理できる（Ｔ、Ｅ、エマージン等：　 Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒｙ　５ｈｏｃｋ　２１＋　１〜１３頁、１９８７年）凝固 カスケードの中期において抑制する活性化蛍白’Ｊｉ’Ｃはまた、ＤＩＣの治療 に対しても使用できる（Ｆ、Ｂ、テーラ−等：　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　 ７９．９１８−２５頁、１９８７年）。

外因性凝固経路抑制剤（ＥＰＩ）活性を示す蛍白質が回収されてきておりそして ヒト細胞から単離されてきている。ＥＰＩは、ＦＸの活性を触媒化された因子■ −組織因子を抑制することが知られている。しかし、ＥＰＩが凝固を抑制する正 確な機構は、知られていない。ヒト血漿はＥＰＩ活性を示す３種の分子種を含有 する。分子量は、それぞれ５００３Ｄａ以上、２００１Ｄａおよび４０＋ｃＤａ である（Ｐ、ｌ’１．サンセット等：　Ｔｈｒｏｍ　Ｒｅ５４７、３８９〜４０ ０頁、１９８７年）。

本発明の目的は、蛋白質ＥＰＩを′ａ縮した形で又は純粋な形で単離する改善さ れた方法に関する。

発明の詳細な説明 定義：ＥＰＩはＥｘｔｒｉｎｓｉｃ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｐａｔｈｗａｙ 　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（外因性凝固経路抑制剤）である。ＥＰＩは、サンセット 等によって記載された分析において、活性を示す蛋白質である（Ｔｈｒｏｆｆｉ Ｒｅｓ　４７．３８９〜４００頁、１９８７年）、ＥＰＩの１単位は、正常なヒ ト血漿ｌ　、ｉ中に見出されたＥＰＩ活性の量である。

ＥＰＩＷ白質は、沈殿法および因子Ｘａに対するアフィニイティクロマトグラフ ィーを用い細胞系の上澄みから回収できる。しかし、この精製手順は、因子Ｘａ の極めて限られた適用性のため大規模で用いることはできない（Ｇ、Ｊ、ブロー ゼおよびＪ、Ｐ、ミレチケ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ 　８４＋　１８８６〜１８９０頁、１９８７年）。

今や以下の事実が見出された。すなわち、ＥＰＩ蛋白質を含有する溶液をヘパリ ンと結合したマトリックスに適用した場合、極めて有用の精製が得られる。

本発明は、ＥＰＩ分子が、ヘパリンに対し親和性を有する特異的部位を有すると いう知見に基礎を置く。

好ましいマトリックスは、ヘパリン−セファ０−スであり、これよりＥＰＩ蛋白 質が溶出する。

従って、１容量ヘパリン−セファロースに１００容量培地を適用することが可能 であり、８０％のＥＰＩ活性が溶離液中に見出される。

一方、アニオンもしくはカチオン交換を用いると、結果はより劣ったものとなる であろう。１容量の２．速流セファロースに適用される蛋白質を有しない２５容 量の培地は、溶離液中に１％ＥＰＩ活性を与えるのみである。

ＥＰＩの精製に対し第１の工程としてＣｄＣｆ□による沈殿法を用いることも可 能であるが、この方法はわずかに比活性８．５Ｕ／■を与えるのみである（Ｇ、 Ｊ、プローゼおよびＪ、Ｐ、ミ本発明は、次の実施例によりより詳しく説明され るであろう。

実施例１ １０％の胎児の子ウシ血清を含有するダルベコ−変性イーグルス培地（ＤＭＥＭ ）中で、ヒ）　ＨｅＬａ細胞系を融合するまで増殖した。細胞層を血清のないＤ ＭＥＭで血漿蛍白質のな（なるまで洗浄し次いで５％ＣＯ２の雰囲気中３７°Ｃ でこの培地中でインキュベートした。培地を取り代え次いで消費した培地を２日 又は３日毎に凍結させた。

血清を有しないＤＭＥＭ培地を上述の如（ＨｅＬａ細胞系から集めた。　５５０ ．ｄの培地を緩衝液Ａ（２０ＩＩＭトリス、１０％グリセロール、０．１　Ｍ　 ＮａＣｌ、ｐＨ７，５）で平衡化した４Ｉ１１のヘパリン−セファロースを含む カラムに４°Ｃで一夜適用した。カラムを６０−のＡで洗浄し次いで勾装置２０ ｄ　（Ａ−Ｂ）で溶出させた。

緩衝液Ｂは２０ｍＭ　）リス、１０％グリセロール、０．７ＭＮａＣｆ、ｐＨ７ ，５であった。分画を集め次いで高活性の分画からプールを調製した。プールは 、蛋白質１■に対し１５３単位のＥＰＩを含有していた。ヘパリン溶出液４ｄを 、緩衝液Ｃ（０，１％ＴＦＡ）中で平衡化したミクロボア（ａ＋１ｃｒｏｂｏｒ ｅ）　（登録商標）ＰＲ４カラムで更に分別した。緩衝液Ｃ中の緩衝液Ｄ　（６ ０％イソプロパツール、０．０８％ＴＦＡ）を２５％から６０％に変えたこう配 溶離によりＥＰＩを溶離した。溶出は、流速０．１５ｍ／分で２０分にわたった 。ＥＰＩは、比活性３６００単位／蛍白ｆ１■でもって溶離された（表１）。

表１ 血清のないＲｅＬａ培地からのＥＰＩ蛋白質の精製培地　０．５６　５５０　１ ００　５．６”　４００ａ：血清のない培地はＩＮ１当たり０．１■の蛍白質を 含有ｂ　：　Ｅｚｓｅ（ｔ％）を１０に設定した実施例２ 血清のないＤＭＥＭ培地を例１で記載した如（１ｅＬａ細胞系から集めた。６０ ０ｄの培地を、緩衝液Ａ　（２０１１Ｍのトリス、１０％グリセロール、０．１ 　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５）で平衡化したヘパリン−セファロース５．５　ｄ を含有するカラムに一夜適用した。カラムを２０−の緩衝液Ａおよび８０ｄの緩 衝液Ｂ　（２０Ｉ！ＩＭのトリス、１０％グリセロール、０．２　Ｍ　ＮａＣｌ 、ｐＨ７，５）で洗浄した。カラムを緩衝液Ｃ（２０ｍＭのトリス、１０％グリ セロール、０．７ＭＮａＣｊ！　、　ｐＨ７，５）で溶離した。ＥＰＩを有する １２．ｄの溶出液をプールした。８ｄのプール緩衝液Ｄ　Ｃ２０＠ＩＭのトリス 、１０％グリセロール、ｐＨ７，４９）で８０−に希釈した。７５ｄを、緩衝液 りで平衡化したモノ−Ｓカラムに１５０分にわたって適用した。

ＥＰＩを、緩衝液Ｅ　（２（ｂａＭのトリス、１０％グリセロール、０．５ＭＮ ａＣｆ、ｐＨ７，４）の０％から１００％に変えたこう配溶離法で溶離した。溶 出は、０．５ｄ／分の流速で４５分にわたった。３ｄ中に溶離したＥＰＩは、ト ップ分画内で１０３０単位／■の比活性を有していた（表２）。

表２ 血清のないＨｅＬａ培地からＥＰＩ蛋白質の精製培地　０．４６　６００　１０ ０　４．６”　３２６ａ：血漿のない培地は１Ｍ１当たりＯ，１■の蛋白質を含 有ｂ：Ｅｘ＊。（１％）は１０に設定 実施例３ 血清のないＤＭＥＭ培地からのＥＰＩを例２で記載した如くヘパリン−セファロ ースおよびモノ−Ｑを用いて精製した。７５単位の七ノーＱ　ＥＰＩ溶出液を、 ミクロボアＲＰ−４カラム（ブラウムリ２Ｘ３０ｍ）で分別した。カラムを７５ ％緩衝液（０，１％ＴＦＡ　）および２５％緩衝液Ｂ　（０，０８％ＴＦＡ、　 ６０％イソプロパツール）で平衡化した。ＥＰＩを、流速０．１５ｄ／分で２４ ％から６０％の緩衝液Ｂに変えて２０分にわたって溶離した。

適用した活性の１７％が、分画から回収されたが、この分画はゲルアーチファク トは別として５Ｏ５−ＧＡＧＥから検出された如く１種のみの蛍白質を含有して いた。分画は、蛋白！１■当たり、２３．０００単位のＥＰＩ活性を含んでいた 。蛋白質成分を、アプライド　バイオシステム光度計を用いＥ　ｚｌｌｏ　（Ｅ ２８０．１％＝１０）を測定することにより分析した。減少した５ＯＳ−ＰＡＧ Ｅの分子量は、４３ｇＤａと推定されたが、アプライド　バイオシステムガス相 シークエネーターを用いたＮ−末端配列決定により次の配列が与えられた：　Ａ ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ）１ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｉ ｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｘ　Ｘ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　、ここでＸでのアミ ノ酸は同定できなかった。

実施例４ 血清のないＤＭＥＭ培地からのＥＰＩを、例３で記載した如くヘパリン−セファ ロースおよびモノＱを用いて精製した。４ｄのモノＱ溶出液を、１５１ｄの緩衝 液Ａ　（２Ｏｎ＋ＭのＮａ、−シトレート、１０％グリセロール、ｐＨ５）で希 釈した。希釈サンプルを流速０．４ｄ／’分で、緩衝液Ａで平衡化したｌｄのモ ノ−Ｓカラムに適用した。カラムを１０ｄの緩衝液Ａで洗い次いで５０分中に、 緩衝液Ａから緩衝液Ｂ　（５０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０． ６　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＦ［７，４７）に変えてこう配溶離法を行った。流速は０ ．５分／ｄであった。適用した量の５８％のＥＰＩを、比活性１２．０００単位 ／■をもって回収した。蛍白質含量を、ファルマシア光度計を用いＥ　ｚ　ｓ　 ｏ　（Ｅ２８０．１％＝１０）を測定することにより分析した。

ＥＰＩは、分子量４３ＫＤａを有する蛍白質として現われる。

補正書の翻訳文提出畜 （特許法第１８４条の８） 平成３年７月ｑ　日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．クロマトグラフィー技術を用いて溶液からＥＰＩ蛋白質を単離しかつ精製す る方法において、ＥＰＩを含有する溶液をヘパリンと結合したマトリックスに適 用することを含んでなる、前記方法。
2. ２．マトリックスが、ヘパリン−セファロースである、請求項１記載の方法。
3. ３．溶液が発酵溶液である、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。