JPH0545600B2

JPH0545600B2 -

Info

Publication number: JPH0545600B2
Application number: JP59055792A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Aoki; Shinichiro Kurosawa
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1984-03-23
Publication date: 1993-07-09
Also published as: JPS60199819A; US4638050A; EP0155852B1; DE3577399D1; EP0155852A3; EP0155852A2

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規トロンビン結合性タンパク性物質
（以下、単にトロンビン結合性物質という）およ
びその製法に関する。血液凝固調節機構の中で、蛋白分解酵素として
のトロンビンの果たす役割については種々研究が
なされ、凝固系のメカニズムに関してはほぼ解明
されている。近年、生体内において、線溶系、抗凝固系に作
用すると言われているプロテインＣをトロンビン
が活性化すること、その機構に補酵素的に働く因
子がウサギ肺組織抽出物に存在していることが、
N.L.Esmon等により報告されている〔J.
Biological Chemistry，257(2)859〜864（1982）〕。本発明者らは、ヒトの凝固、線溶系におけるト
ロンビンの役割、特に線溶系に及ぼす作用につい
て研究を重ねたところ、ヒトの血管中において
も、トロンビンがプロテインＣの活性化に関与し
ていること、さらにトロンビンと結合してその活
性化機構に働く因子が存在することを見い出し、
当該因子をヒト胎盤より分離精製することに成功
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ヒト由来のトロンビン結
合性物質及びその製法を提供するものである。本発明のトロンビン結合性物質は、トロンビン
と結合してプロテインＣの活性化を特異的に増強
し、血液凝固時間を延長することから、線溶促進
剤、抗凝固剤として有用である。このトロンビン結合性物質は、例えばヒト胎盤
破砕物を非イオン界面活性剤を含む緩衝液で抽出
し、その抽出物より、トロンビン−担体結合物を
用いるアフイニテイクロマトグラフイーまたは
（および）ゲル過法によつて分離精製すること
により製造される。すなわち、ヒト胎盤をシユークロース、ベンズ
アミジン塩酸を含むトリス塩酸緩衝液等で洗浄し
た後、破砕して均質化する。次いでこれを遠心分
離等に付して沈澱物を集め、これを上記緩衝液に
トリトンＸ−100、ルブロールPX（Lubrol PX）
等を加えたもので抽出する。この抽出物をジイソ
プロピルフオスフオロートロンビン−アガロース
等のトロンビン−担体結合物を充填したカラムに
通して活性区分を吸着させ、塩化ナトリウム、
EDTA、ベンズアミジン塩酸、トリトンＸ−100
を含むトリス塩酸緩衝液で溶出すれば本発明物質
が得られる。また上記抽出物をゲル過に付して
活性区分を採取する方法、あるいは両者を組合せ
る方法を採用することもできる。斯くして得られる本発明のトロンビン結合性物
質は次の性質を有する。 (a) 分子量還元状態で88000±10000 非還元状態で71000±10000 測定法： Laemmliの方法（Nature227680−6851970）
に準じて、7.5％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）ポリアクリルアミドゲルを用いた電気
泳動法により測定した。標準蛋白としては、バイオラツドSDS−
PAGEスタンダード高分子用（日本バイオラツ
ドラボラトリー社製）を用いた。還元処理は、
２％ジチオスレイトールを用い、100℃で３分
間処理した。 (b) 等電点 PH4.2±0.5 アンフオライトを用いる等電点電気泳働法に
より等電点分画を測定した。 (c) 親和性トロンビンに対し強い親和性を有する。ジイ
ソプロピルフオスフオロートロンビン−アガロ
ース〔J.Biological Chemistry：245、3059−
3065、（1970）参照〕を用いるクロマト処理で
本発明物質はほぼ100％吸着した。 (d) 活性トロンビンと結合してプロテインＣを活性
化する。測定法１：プロテインＣ（7.32μM）5μ、本発明物質
溶液5μ（0.055A₂₈₀／ml）、トロンビン
（4U／ml）50μを、0.1M塩化ナトリウム及
び3.5ｍＭ塩化カルシウムを含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5）40μに溶解し、37℃
で０〜30分間インキユベートする。アンチト
ロンビン（16.1μM）150μを加え、37℃
で15分間インキユベートし反応を停止させ
る。これにBoc−Leu−Ser−Thr−Arg−
MCA100μM（蛋白奨励会製）を含む緩衝液
溶液250μを加え、37℃で10分間反応させ
た後、20％酢酸500μを加え反応を停止さ
せ、遊離したAMC濃度を励起波長380nｍ、
発光波長460nｍで螢光分光光度計により測
定し、活性化されたプロテインＣ濃度を求め
た。その結果を第１図に示す。測定法２：プロテインＣ（7.32μM）5μ、本発明物質
０〜5μ（0.055A₂₈₀／ml）、0.1M塩化ナト
リウムと0.5％LubrelPX（シグマ社製）を含
有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）５
〜0μ及びトロンビン（4U／ml）50μを、
0.1M塩化ナトリウム、3.5ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）
40μに溶解し、37℃で30分間インキユベー
トする。次いでアンチトロンビン150μ
を加え37℃で15分間インキユベートし反応を
停止させる。以下測定法１と同様にして
MCA基質を用いて遊離したAMC濃度を測定
した。その結果を第２図に示す。これらの結果から、本発明物質はトロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進するこ
とがわかる。血液の凝固時間を延長する。測定法：本発明物質溶液（0.、2.5、5.0、10.0μ）
（0.055A₂₈₀／ml）をフイブロカツプに分注
し、0.1mlのカオリン添加活性化セフアロプ
ラスチン（アクチン；Dade社製）を添加し、
37℃に加温する。１分後に、37℃に加温した
クエン酸添加乏血小板血漿0.1mlを加える。
更に、３分後に、37℃に加温した0.025M塩
化カルシウム溶液を添加し、フイブロメータ
ー（ベクトン・デイツキンソン社製）を作動
させ、凝固時間を測定した。その結果を第１
表に示す。

【表】この結果に示されるように、本発明物質の
濃度が高くなるに従つて凝固時間が延長する
ことから、本発明物質は血液の抗凝固作用を
有することがわかる。 (e) 安定性条件残存活性１％β−メルカプトエタノール還元処理 29％変性剤１％SDS 92％ 8M尿素 100％ 6Mグアニジウムクロリド 77％ PH２ 95％ PH10 99％ペプシン処理 89％加熱処理 20分測定法：本発明物質（0.073A₂₈₀／ml）を上記各処理
条件下、25℃で150分処理した。処理後トリス
−緩衝食塩水で100倍に希釈し活性を測定した。
非処理の活性値から残存活性を算出した。尚、
ペプシンは、終濃度2.5μｇ／ml×PH2.5を用い
37℃で２時間処理した。加熱処理は100℃、PH
7.5で処理し、半減期で示した。実施例１ (1) ヒト胎盤約1.0Kg（２個分）を、0.25Mシユ
クロース、１ｍＭベンズアミジン塩酸を含む
0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）で洗浄した
後、破砕し均質化する。均質化した溶液を
30000×ｇで40分間遠心分離して得られる沈澱
物を分取し、上記緩衝液に懸濁させ、再度遠心
分離して沈澱物を分取する。以上の操作を５回
行つて分取した沈澱物を0.25Mシユクロース、
１ｍＭベンズアミジン塩酸及び0.5％（ｖ／ｖ）
トリトンＸ−100（シグマ社製）を有する0.02M
トリス塩酸緩衝液（PH7.5）300mlで抽出する。
得られた粗抽出液315mlの蛋白質濃度は、
OD700値1.17であつた。粗抽出液315mlを、0.1M塩化ナトリウム、
0.5ｍＭ塩化カルシウム、0.1ｍＭベンズアミジ
ン塩酸及び0.5％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100を
含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）で平衡
化したジイソプロピルフオスフオロートロンビ
ン−アガロース（以下、DIP−トロンビン−ア
ガロースと略称する）カラム〔直径2.5cm、長
さ20cm〕に付し、平衡化に用いた緩衝液1500ml
で洗浄する。洗浄液を16.7mlづつフラクシヨン
コレクターを用い分取した。次いで溶出液として、1M塩化ナトリウム、
0.1ｍMEDTA、１ｍＭベンズアミジン塩酸及
び0.5％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100を含む
0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）350mlを用い
て溶出した。溶出液を6.7mlづつ分取した。洗
浄液及び溶出液の蛋白質濃度及び活性を測定し
た結果を第３図に示す。尚第３図中、●−●は
吸光度、○…○は活性を示す。蛋白質濃度は、Lowry法により測定し、活
性は(d)項の測定法１に記載した方法により測定
した。 (2) 上記溶出液のフラクシヨン第16画分から第29
画分94mlを用い、カラム平衡化に用いた緩衝液
で透析して得られる溶液103mlを、(1)と同様に
処理したDIP−トロンビン−アガロースカラム
に付した。次いで、0.4M塩化ナトリウム、0.5ｍＭ塩化
カルシウム、0.1ｍＭベンズアミジン塩酸及び
0.5％トリトンＸ−100を含む0.02Mトリス塩酸
緩衝液（PH7.5）10mlを用いて洗浄し、更に塩
化カルシウムの代りに１ｍＭ・DTEAを用い
た以外は上記と同一の緩衝液（PH7.5）10mlで
洗浄する。溶出溶液として、0.1ｍＭ EDTA、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸及び0.5％トリトンＸ−100
を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）に、
塩化ナトリウム（0.4M〜1M）を加えた溶液
100mlを用い、濃度勾配法で溶出液を4.4mlづつ
分取した。溶出液の蛋白質濃度及び活性を(1)と
同様にして測定した結果を第４図に示す。尚第
４図中●−●は吸光度、○…○は活性を示す。溶出フラクシヨン第38画分〜第57画分を分取
し、蛋白質濃度OD₇₀₀値0.057の本発明物質溶液
88mlを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明トロンビン結合性物
質のトロンビンによるプロテインＣの活性化促進
作用を、第３図はヒト胎盤抽出物をアフイニテイ
クロマトグラフイーに付したときの溶出パターン
を、第４図は上記溶出液の第16〜29画分をアフイ
ニテイカラムクロマトグラフイーに付したときの
溶出パターンを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１次の性質を有するヒト組織由来のトロンビン
結合性タンパク性物質。 (a) 分子量：還元状態で88000±10000 非還元状態で71000±10000 (b) 等電点：PH4.2±0.5 (c) 親和性：トロンビンに対し強い親和性を有す
る。 (d) 活性：トロンビンと結合してプロテインＣ
を活性化する。血液の凝固時間を延長する。 (e) 安定性：PH２〜10で安定。変性剤（ドデシル
硫酸ナトリウム、尿素）及びペプシン処理に対
して安定。２ヒト組織を非イオン界面活性剤を含む緩衝液
で抽出し、その抽出物より、トロンビン−担体結
合物を用いるアフイニテイクロマトグラフイーま
たは（および）ゲル濾過法によつて分離精製する
ことにより得られるものである特許請求の範囲第
１項記載のトロンビン結合性タンパク性物質。３ヒト組織が、ヒト胎盤である特許請求の範囲
第１項又は第２項記載のトロンビン結合性タンパ
ク性物質。４ヒト胎盤破砕物を非イオン界面活性剤を含む
緩衝液で抽出し、その抽出物より、トロンビン−
担体結合物を用いるアフイニテイクロマトグラフ
イーまたは（および）ゲル濾過法によつて分離精
製することを特徴とする次の性質を有するトロン
ビン結合性タンパク性物質の製法。 (a) 分子量：還元状態で88000±10000 非還元状態で71000±10000 (b) 等電点：PH4.2±0.5 (c) 親和性：トロンビンに対し強い親和性を有す
る。 (d) 活性：トロンビンと結合してプロテインＣ
を活性化する。血液の凝固時間を延長する。 (e) 安定性：PH２〜10で安定。変性剤（ドデシル
硫酸ナトリウム、尿素）及びペプシン処理に対
して安定。