JPH0764878B2 - 抗血液凝固物質及びその製法 - Google Patents
抗血液凝固物質及びその製法Info
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- JPH0764878B2 JPH0764878B2 JP61243778A JP24377886A JPH0764878B2 JP H0764878 B2 JPH0764878 B2 JP H0764878B2 JP 61243778 A JP61243778 A JP 61243778A JP 24377886 A JP24377886 A JP 24377886A JP H0764878 B2 JPH0764878 B2 JP H0764878B2
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- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な抗血液凝固物質及びその製法に関す
る。
る。
血液凝固は、トロンボプラスチン活性の発現に始まり、
血中のX因子、V因子の活性化、次いでプロトロンビン
が活性化されてトロンビンを生じ、これがフイブリノー
ゲンをフイブリンに変換させることにより完成すると考
えられている。
血中のX因子、V因子の活性化、次いでプロトロンビン
が活性化されてトロンビンを生じ、これがフイブリノー
ゲンをフイブリンに変換させることにより完成すると考
えられている。
血液凝固に起因する疾患を治療するには、この血液凝固
機構に関与する種々の凝固因子を阻害若しくは失活させ
る物質、すなわち抗血液凝固物質を用いることが有効で
ある。この抗血液凝固物質としては、現在、ヘパリン、
ヘパリンコフアクター−II、アンチトロンビン−III、
α2−マクログロブリン、α1−トリプシンインヒビタ
ー、C1−エステラーゼインヒビター、プロテインC等が
知られている。また最近クリスP.M.リユーテリングスペ
ルガーら(Chris P.M.Reutelingsperger et al.)は、
臍帯動脈から、分子量32kDaの新規な抗凝固活性を有す
る物質を見い出し、報告している〔Eur.J.Biochem.151,
625〜629(1985)参照〕。
機構に関与する種々の凝固因子を阻害若しくは失活させ
る物質、すなわち抗血液凝固物質を用いることが有効で
ある。この抗血液凝固物質としては、現在、ヘパリン、
ヘパリンコフアクター−II、アンチトロンビン−III、
α2−マクログロブリン、α1−トリプシンインヒビタ
ー、C1−エステラーゼインヒビター、プロテインC等が
知られている。また最近クリスP.M.リユーテリングスペ
ルガーら(Chris P.M.Reutelingsperger et al.)は、
臍帯動脈から、分子量32kDaの新規な抗凝固活性を有す
る物質を見い出し、報告している〔Eur.J.Biochem.151,
625〜629(1985)参照〕。
しかしながら、これらの抗血液凝固物質の多くは単に存
在が確認された程度であり、医薬として実用に供されて
いるのはヘパリンのみである。しかし、ヘパリンには出
血傾向を招く副作用があるため、その使用方法及び使用
量等が極めて限定されており、抗血液凝固剤としては安
全性の面から満足すべきものではない。
在が確認された程度であり、医薬として実用に供されて
いるのはヘパリンのみである。しかし、ヘパリンには出
血傾向を招く副作用があるため、その使用方法及び使用
量等が極めて限定されており、抗血液凝固剤としては安
全性の面から満足すべきものではない。
また、リユーテリングスペルガーらの見出した物質は後
述するように本発明物質と異なるもので、しかも混合物
の状態で活性が測定されているにすぎず、到底実用に供
し得るものではない。
述するように本発明物質と異なるもので、しかも混合物
の状態で活性が測定されているにすぎず、到底実用に供
し得るものではない。
したがつて、更に優れた抗血液凝固剤の開発が望まれて
いた。
いた。
先に、本発明者らは、安全で副作用のない抗血液凝固剤
を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、組織トロンボプラ
スチン含有量が多く、XIII因子、線溶阻止因子等も含有
し、血栓形成傾向にあると考えられ、また血液凝固機構
からも特異な状態を保持している胎盤中、特に人胎盤ホ
モジネートを遠心分離してえられる沈渣並びに上清部分
を分画して得られるマイクロゾーム画分から新規な抗血
液凝固物質が得られることを見出し、特許出願した(特
願昭60-217512号)。
を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、組織トロンボプラ
スチン含有量が多く、XIII因子、線溶阻止因子等も含有
し、血栓形成傾向にあると考えられ、また血液凝固機構
からも特異な状態を保持している胎盤中、特に人胎盤ホ
モジネートを遠心分離してえられる沈渣並びに上清部分
を分画して得られるマイクロゾーム画分から新規な抗血
液凝固物質が得られることを見出し、特許出願した(特
願昭60-217512号)。
更に、検討を続けた結果、上記物質と異なる画分にも、
同様の抗血液凝固活性を有する特質が存在することを見
出し、該物質を単離することに成功し、本発明を完成し
た。
同様の抗血液凝固活性を有する特質が存在することを見
出し、該物質を単離することに成功し、本発明を完成し
た。
すなわち、本発明は下記性質を有する人胎盤由来の新規
な抗血液凝固物質及びその製法を提供するものである。
な抗血液凝固物質及びその製法を提供するものである。
分子量(SDS−ポリアクリルアミトゲル電気泳動
法,還元状態及び非還元状態) 73,000±2,000 等電点(アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法) 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定(37℃) ハ 血漿中37℃、15分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 本発明の抗血液凝固物質(以下「本発明物質」という)
は、例えば次の如くして調製される。
法,還元状態及び非還元状態) 73,000±2,000 等電点(アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法) 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定(37℃) ハ 血漿中37℃、15分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 本発明の抗血液凝固物質(以下「本発明物質」という)
は、例えば次の如くして調製される。
まず、ヒト胎盤から胎盤ホモジユネートを調製し、遠心
分離をおこなう。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等
を切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリング
ブレンダー及びポリトロンを用いておこなう。得られた
ホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
分離をおこなう。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等
を切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリング
ブレンダー及びポリトロンを用いておこなう。得られた
ホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩衝液で充
分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以後
の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、EDTA、EGTA、シ
ユウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリウム、リン酸
等のキレート剤を含む緩衝液に浸し、4℃〜8℃にて一
晩放置後、遠心分離して上清を集め、抽出液を得る。こ
の場合、抽出はトリトンX-100、ルブロール、SDS、デオ
キシコール酸等の界面活性剤の存在下に行なうこともで
きる。
分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以後
の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、EDTA、EGTA、シ
ユウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリウム、リン酸
等のキレート剤を含む緩衝液に浸し、4℃〜8℃にて一
晩放置後、遠心分離して上清を集め、抽出液を得る。こ
の場合、抽出はトリトンX-100、ルブロール、SDS、デオ
キシコール酸等の界面活性剤の存在下に行なうこともで
きる。
一方、胎盤ホモジネート上清は、更に50,000〜100,000g
の超遠心分離して沈渣部分であるマイクロゾーム分画を
得る。このマイクロゾーム分画からも上記と同様にし
て、キレート剤及び/又は界面活性剤抽出を行なつた
後、超遠心分離して上清を集めることによつて本発明物
質を含む抽出液が得られる。
の超遠心分離して沈渣部分であるマイクロゾーム分画を
得る。このマイクロゾーム分画からも上記と同様にし
て、キレート剤及び/又は界面活性剤抽出を行なつた
後、超遠心分離して上清を集めることによつて本発明物
質を含む抽出液が得られる。
このようにして得られた抽出液は、硫安分画に付され
る。硫安分画は、先づ上記抽出液に35%飽和となるよう
に固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次い
で、上清に対し85%飽和となるように硫安を加えて遠心
分離し、沈渣を分取することによりおこなわれる。
る。硫安分画は、先づ上記抽出液に35%飽和となるよう
に固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次い
で、上清に対し85%飽和となるように硫安を加えて遠心
分離し、沈渣を分取することによりおこなわれる。
得られた硫安分画は、更に公知の分離・精製手段、例え
ば透析、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着クロマトグラフイー、疎水性クロマトグラフイー、等
電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたアフ
イニテイー・クロマトグラフイー等を単独又は組合せ用
いることにより精製され、本発明物質が得られる。例え
ば、キレート剤抽出液を硫安分画して得られた画分を充
分透析し、この透析液をDEAE−トヨパールを用いる直線
濃度勾配法により溶出させると、アルブミンの溶出直後
に活性画分が溶出する。得られた活性画分を透析した
後、活性画分を濃縮し、セフアデツクスG-100を用いる
ゲル過に付すこと、またはコラーゲン、エラスチン、
ゼラチン、アクチン等を用いるアフイニテイカラムに付
すことにより本発明物質を得る。
ば透析、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着クロマトグラフイー、疎水性クロマトグラフイー、等
電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたアフ
イニテイー・クロマトグラフイー等を単独又は組合せ用
いることにより精製され、本発明物質が得られる。例え
ば、キレート剤抽出液を硫安分画して得られた画分を充
分透析し、この透析液をDEAE−トヨパールを用いる直線
濃度勾配法により溶出させると、アルブミンの溶出直後
に活性画分が溶出する。得られた活性画分を透析した
後、活性画分を濃縮し、セフアデツクスG-100を用いる
ゲル過に付すこと、またはコラーゲン、エラスチン、
ゼラチン、アクチン等を用いるアフイニテイカラムに付
すことにより本発明物質を得る。
斯くして得られた本発明物質は、前記の性質を有するも
のであるが、更に具体的に測定方法及び結果について説
明すれば以下の如くである。
のであるが、更に具体的に測定方法及び結果について説
明すれば以下の如くである。
分子量測定 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(10%ポリア
クリルアミドゲル;還元状態及び非還元状態)により測
定した結果、73,000±2,000であつた。
クリルアミドゲル;還元状態及び非還元状態)により測
定した結果、73,000±2,000であつた。
等電点測定 アンフオライトを用いる等電点カラム電気泳動法(pH3.
5〜10.4℃)により300Vで48時間泳動して測定した結
果、6.2〜6.6であつた。
5〜10.4℃)により300Vで48時間泳動して測定した結
果、6.2〜6.6であつた。
本測定は、等電点測定カラム(LKB 8100-1,110ml)を用
い、上側を陽極、下側を陰極とし、終濃度0.83%のアン
フオライト(pH3.5〜10.0)を含むシヨ糖濃度勾配を作
製し、1.3mgの本発明物質を300V、48時間(4℃)で泳
動させることにより行なつた。泳動中タンパク質の不溶
化が認められたが、溶出後不溶物は消失し、pH6.2〜6.6
の範囲内に溶出した物質にプロトロンビン時間延長活性
およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において
本発明物質の染色バンドが確認された。不溶物が生じた
ことが、等電点測定上影響を及ぼしていないかどうか確
認する目的で、上述の条件下さらに終濃度0.1%になる
ようTritonX-100を含むシヨ糖濃度勾配を用いて、14時
間および62時間泳動し、等電点を測定した。いずれの場
合も泳動中に不溶物が生じたが、溶出後これは消失し、
プロトロンビン時間延長活性およびSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動上で、pH6.2〜6.6の範囲に本発明物
質が検出された。62時間の条件ではさらにpH5.4〜5.8の
範囲に弱い活性とSDS−ポリアクリルアミドゲル上での
染色バンドが検出された。
い、上側を陽極、下側を陰極とし、終濃度0.83%のアン
フオライト(pH3.5〜10.0)を含むシヨ糖濃度勾配を作
製し、1.3mgの本発明物質を300V、48時間(4℃)で泳
動させることにより行なつた。泳動中タンパク質の不溶
化が認められたが、溶出後不溶物は消失し、pH6.2〜6.6
の範囲内に溶出した物質にプロトロンビン時間延長活性
およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において
本発明物質の染色バンドが確認された。不溶物が生じた
ことが、等電点測定上影響を及ぼしていないかどうか確
認する目的で、上述の条件下さらに終濃度0.1%になる
ようTritonX-100を含むシヨ糖濃度勾配を用いて、14時
間および62時間泳動し、等電点を測定した。いずれの場
合も泳動中に不溶物が生じたが、溶出後これは消失し、
プロトロンビン時間延長活性およびSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動上で、pH6.2〜6.6の範囲に本発明物
質が検出された。62時間の条件ではさらにpH5.4〜5.8の
範囲に弱い活性とSDS−ポリアクリルアミドゲル上での
染色バンドが検出された。
安定性試験 イ 加熱処理に対する安定性 各設定温度(0〜80℃)で30分間処理した後の抗血液凝
固活性をプロトロンビン時間法により測定した結果、50
℃以上の温度において該活性は完全に消失した。
固活性をプロトロンビン時間法により測定した結果、50
℃以上の温度において該活性は完全に消失した。
ロ pH安定性 pH3.5〜11.0の種々の緩衝液を加え、4℃又は37℃で18
時間処理した後、残存する抗血液凝固活性をプロトロン
ビン時間法により測定した結果、4℃ではpH5.5〜10.
0、37℃ではpH5.5〜8.5の範囲においては該活性の低下
は見られなかつた。
時間処理した後、残存する抗血液凝固活性をプロトロン
ビン時間法により測定した結果、4℃ではpH5.5〜10.
0、37℃ではpH5.5〜8.5の範囲においては該活性の低下
は見られなかつた。
ハ 血漿中における安定性 血漿中に本発明物質を加え、37℃で15分インキユベート
した後、残存する抗血液凝固活性をカルシウム再加凝固
時間法により測定した結果、活性の低下は見られなかつ
た。
した後、残存する抗血液凝固活性をカルシウム再加凝固
時間法により測定した結果、活性の低下は見られなかつ
た。
作用 イ カルシウム再加凝固時間に対する作用 標準血漿(オーソ社製)100μlと本発明物質溶液100μ
lを混和し、3分後に0.025M塩化カルシウム溶液100μ
lを添加し、凝固時間を測定した。その結果、表1に示
す如く、強力なカルシウム再加凝固時間延長作用が認め
られた。
lを混和し、3分後に0.025M塩化カルシウム溶液100μ
lを添加し、凝固時間を測定した。その結果、表1に示
す如く、強力なカルシウム再加凝固時間延長作用が認め
られた。
ロ プロトロンビン時間(PT)に対する作用20mM塩化カ
ルシウムで希釈したPT試薬(リオプラスチン:持田製薬
社製)100μl及び本発明物質溶液100μlを混和し、3
分後に標準血漿100μlを添加し、凝固時間を測定し
た。その結果、表2に示す如く、強力なPT延長作用が認
められた。
ルシウムで希釈したPT試薬(リオプラスチン:持田製薬
社製)100μl及び本発明物質溶液100μlを混和し、3
分後に標準血漿100μlを添加し、凝固時間を測定し
た。その結果、表2に示す如く、強力なPT延長作用が認
められた。
ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間 (APTT)に対する作用 APTT試薬(活性トロンボフアツクス:オーソ社製)10μ
lと本発明物質溶液90μlを混和し、2分後に標準血漿
100μlを混和する。6分後に0.025M塩化カルシウム溶
液100μlを添加し、凝固時間を測定した。その結果、
表3に示す如く、強力なAPTT延長作用が認められた。
lと本発明物質溶液90μlを混和し、2分後に標準血漿
100μlを混和する。6分後に0.025M塩化カルシウム溶
液100μlを添加し、凝固時間を測定した。その結果、
表3に示す如く、強力なAPTT延長作用が認められた。
アミノ酸組成 本発明物質を5.7N塩酸で110℃、24、48及び72時間加水
分解処理し、ベツクマン6300E型アミノ酸分析装置を用
いて測定した。結果を表4に示す。
分解処理し、ベツクマン6300E型アミノ酸分析装置を用
いて測定した。結果を表4に示す。
表中、無印の分析値は、24時間加水分解により得られた
値である。*の分析値は0時間補外して得られた値であ
る。**の分析値は、72時間加水分解により得られた値
である。
値である。*の分析値は0時間補外して得られた値であ
る。**の分析値は、72時間加水分解により得られた値
である。
N末端及びC末端アミノ酸配列 (1)N末端アミノ酸配列 本発明物質を変性後、還元処理し、アミノ酸シークエン
サーにより予備分析した結果、N末端アミノ酸は保護さ
れていた。
サーにより予備分析した結果、N末端アミノ酸は保護さ
れていた。
以下、常法に従って、トリプシン処理、エドマン分解し
てPTH−アミノ酸を同定し、N末端が保護されているペ
プチドを分離精製した。これをピコタグアミノ酸分析法
により分析し、Ala3残基、Lys2残基、Pro、Glu、Gly各
1残基の8残基からなるペプチドであることを確認し
た。
てPTH−アミノ酸を同定し、N末端が保護されているペ
プチドを分離精製した。これをピコタグアミノ酸分析法
により分析し、Ala3残基、Lys2残基、Pro、Glu、Gly各
1残基の8残基からなるペプチドであることを確認し
た。
N末端保護基については、FAB-MASS分析結果がMH+812で
あることから、アセチル基であると推定した。
あることから、アセチル基であると推定した。
得られた8残基のN末端ペプチドをリジルエンドペプチ
ダーゼ処理し、N末端アミノ酸配列を以下の通り確定し
た。
ダーゼ処理し、N末端アミノ酸配列を以下の通り確定し
た。
Ac-Ala-Lys-Pro-Ala-Glu-Gly-Ala-Lys- (2)C末端アミノ酸配列 本発明物質をヒドラジン分解方法に従い分析した結果,C
末端アミノ酸としてAspを同定した。次いで、本発明物
質をリジルエンドペプチダーゼ処理し、C末端がAspで
あるフラグメントを分取した。これをピコタグアミノ酸
分析法により分析し、Ala2残基、Leu3残基、Gly2残基、
Cys,Glu,Asp各1残基からなるペプチドであることを確
認した。
末端アミノ酸としてAspを同定した。次いで、本発明物
質をリジルエンドペプチダーゼ処理し、C末端がAspで
あるフラグメントを分取した。これをピコタグアミノ酸
分析法により分析し、Ala2残基、Leu3残基、Gly2残基、
Cys,Glu,Asp各1残基からなるペプチドであることを確
認した。
これを液相アミノ酸シークエンサーにより分析した結
果、C末端アミノ酸配列を以下のとおり確定した。
果、C末端アミノ酸配列を以下のとおり確定した。
‐(Lys)‐Ala-Leu-Leu-Ala-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Asp 叙上の如くして得られた物質は、前出のリユーテリング
スペルガーらには得られた物質のSDS-PAGEで測定した分
子量と、56℃の熱処理により失活する蛋白質であること
のみ記述され、物質を単離同定するには至つていないの
で明らかではないが、先行文献の化合物が臍帯からトリ
ス−塩化緩衝液で抽出される物質であること、等電点及
び分子量も異なることから、これと異なると判断され
る。
スペルガーらには得られた物質のSDS-PAGEで測定した分
子量と、56℃の熱処理により失活する蛋白質であること
のみ記述され、物質を単離同定するには至つていないの
で明らかではないが、先行文献の化合物が臍帯からトリ
ス−塩化緩衝液で抽出される物質であること、等電点及
び分子量も異なることから、これと異なると判断され
る。
本発明物質を抗血液凝固剤の有効成分として使用する場
合の剤型としては、注射剤が挙げられる。注射剤として
は、凍結乾燥粉末を用時、注射用蒸留水、生理食塩水等
に溶解して投与する形態が好ましい、投与部位として
は、静脈内が適当である。
合の剤型としては、注射剤が挙げられる。注射剤として
は、凍結乾燥粉末を用時、注射用蒸留水、生理食塩水等
に溶解して投与する形態が好ましい、投与部位として
は、静脈内が適当である。
投与量は、疾患の重症度、患者の体重等により異なる
が、通常10μg〜10mg/kg・dayであることが好ましい。
尚、本発明物質は、上記投与量の範囲内においては全く
異常が認められず、安全である。なお、本発明物質を注
射剤として製剤化する際には安定化剤として、例えばア
ルブミン、ゼラチン、マンニトール等を添加することが
でき、こうすることによつて製剤化工程での分解、吸着
等による失活が防止でき、また、製剤の保存安定性が向
上する。
が、通常10μg〜10mg/kg・dayであることが好ましい。
尚、本発明物質は、上記投与量の範囲内においては全く
異常が認められず、安全である。なお、本発明物質を注
射剤として製剤化する際には安定化剤として、例えばア
ルブミン、ゼラチン、マンニトール等を添加することが
でき、こうすることによつて製剤化工程での分解、吸着
等による失活が防止でき、また、製剤の保存安定性が向
上する。
本発明物質は、強力な抗血液凝固活性を有し、特に組織
トロンボプラスチン活性の亢進している状態、すなわ
ち、凝固亢進状態において、より強い活性を示すことか
ら、これを有効成分として含有する抗血液凝固剤は、副
作用が少なく安全である。
トロンボプラスチン活性の亢進している状態、すなわ
ち、凝固亢進状態において、より強い活性を示すことか
ら、これを有効成分として含有する抗血液凝固剤は、副
作用が少なく安全である。
次に実施例を挙げ、本発明を説明する。
実施例1 (i)ヒト胎盤5個(約2500g)より、膜等を除去し、
生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに50mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7.4)2lを加え、ワーリングブレンダ
ーを用いて破砕し、次いで更に、ポリトロン(Polytro
n)で磨砕する。得られたホモジネートを7,000rpm15分
間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣に再度50
mMトリス−塩化緩衝液(pH7.4)2lを加え、ポリトロン
でホモジナイズし、7,000rpm15分間遠心分離して洗浄沈
渣を得た。この操作を数回繰り返し、血液成分を除去し
て、洗浄沈渣約900gを得た。
生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに50mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7.4)2lを加え、ワーリングブレンダ
ーを用いて破砕し、次いで更に、ポリトロン(Polytro
n)で磨砕する。得られたホモジネートを7,000rpm15分
間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣に再度50
mMトリス−塩化緩衝液(pH7.4)2lを加え、ポリトロン
でホモジナイズし、7,000rpm15分間遠心分離して洗浄沈
渣を得た。この操作を数回繰り返し、血液成分を除去し
て、洗浄沈渣約900gを得た。
(ii)(i)で得た沈渣900gに、50mM EDTAを含む50mM
トリス−塩酸緩衝液(pH7.4)を約2l加え、ワーリング
ブレンダーでホモジナイズする。このホモジネートを4
℃にて、一夜攪拌後7,000rpm15分間遠心分離して、抽出
液2lを得た。
トリス−塩酸緩衝液(pH7.4)を約2l加え、ワーリング
ブレンダーでホモジナイズする。このホモジネートを4
℃にて、一夜攪拌後7,000rpm15分間遠心分離して、抽出
液2lを得た。
(iii)(ii)で得た抽出液に固形硫安を加え、35%飽
和とし、4℃で30分〜数時間放置後、7,000rpm15分間遠
心分離し上清を分取した。この上清に更に硫安を加え、
85%飽和とし、4℃で2時間放置した後、7,000rpm15分
間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣を20mMト
リス−塩酸緩衝液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、4
℃で一夜、充分に透析した。透析中に生じた沈殿は、7,
000rpm15分間遠心分離して除き、透析液390mlを得た。
和とし、4℃で30分〜数時間放置後、7,000rpm15分間遠
心分離し上清を分取した。この上清に更に硫安を加え、
85%飽和とし、4℃で2時間放置した後、7,000rpm15分
間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣を20mMト
リス−塩酸緩衝液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、4
℃で一夜、充分に透析した。透析中に生じた沈殿は、7,
000rpm15分間遠心分離して除き、透析液390mlを得た。
(iv)得られた透析液を、20mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.4)で平衡化したDEAE−トヨパール(φ5.5×19cm)に
吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄した後、0〜0.3M塩化
ナトリウムを含む同緩衝液4lを用い、直線濃度勾配によ
り1分画20mlとなる様に溶出させた。活性画分は、ほぼ
0.2M塩化ナトリウム濃度付近にて溶出され、200mlの活
性画分を得た。
7.4)で平衡化したDEAE−トヨパール(φ5.5×19cm)に
吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄した後、0〜0.3M塩化
ナトリウムを含む同緩衝液4lを用い、直線濃度勾配によ
り1分画20mlとなる様に溶出させた。活性画分は、ほぼ
0.2M塩化ナトリウム濃度付近にて溶出され、200mlの活
性画分を得た。
(v)得られた活性画分をダイアフローメンブランフイ
ルターYM-10を用いて濃縮した。
ルターYM-10を用いて濃縮した。
濃縮液をセフアデツクスG-100を用いるゲル過(φ4.5
×75cm)に付し、生理食塩水で1分画8mlになるように
溶出させ、活性画分70〜82を集め、これを限外過によ
り濃縮して、本発明物質14ml(蛋白重量59.3mg、Lowry
法)を得た。
×75cm)に付し、生理食塩水で1分画8mlになるように
溶出させ、活性画分70〜82を集め、これを限外過によ
り濃縮して、本発明物質14ml(蛋白重量59.3mg、Lowry
法)を得た。
実施例2 ヒト胎盤5個を実施例1に従つて処理し、DEAEトヨパー
ルから0.2M塩化ナトリウム濃度付近に溶出される活性画
分約200mlを得た。
ルから0.2M塩化ナトリウム濃度付近に溶出される活性画
分約200mlを得た。
これを5mM塩化カルシウムを含む50mMトリス−塩酸緩衝
液(pH7.4)で一晩透析後、このうちの100mlを用い、あ
らかじめ同緩衝液で平衡化しておいたコラーゲンカラム
(Sigma,タイプIアキレス腱由来5g,2.5×8cm)に吸着
させ、同緩衝液でA280の吸収が0.05以下になるよう充分
洗浄後、10mM EDTAを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.4)で1分画5mlとなるよう溶出し、蛋白ピーク部分を
集め本発明物質40ml(蛋白質15mg)を得た。
液(pH7.4)で一晩透析後、このうちの100mlを用い、あ
らかじめ同緩衝液で平衡化しておいたコラーゲンカラム
(Sigma,タイプIアキレス腱由来5g,2.5×8cm)に吸着
させ、同緩衝液でA280の吸収が0.05以下になるよう充分
洗浄後、10mM EDTAを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.4)で1分画5mlとなるよう溶出し、蛋白ピーク部分を
集め本発明物質40ml(蛋白質15mg)を得た。
実施例3 実施例2の5mM塩化カルシウムを含む50mMトリス−塩酸
緩衝液(pH7.4)に透析した試料10mlをエラスチンカラ
ム(NBC製,0.5g,1.3×1cm)へ吸着させた。カラムの平
衡化、洗浄、溶出は実施例2のコラーゲンカラムと同様
に行ない、本発明物質15ml(蛋白質2mg)を得た。
緩衝液(pH7.4)に透析した試料10mlをエラスチンカラ
ム(NBC製,0.5g,1.3×1cm)へ吸着させた。カラムの平
衡化、洗浄、溶出は実施例2のコラーゲンカラムと同様
に行ない、本発明物質15ml(蛋白質2mg)を得た。
Claims (2)
- 【請求項1】下記性質を有する人胎盤由来の抗血液凝固
物質。 分子量(SDS−ポリアクリルアミトゲル電気泳動
法,還元状態及び非還元状態) 73,000±2,000 等電点(アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法) 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定(37℃) ハ 血漿中37℃、15分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 - 【請求項2】ヒト胎盤をホモジナイズし、このホモジユ
ネートを遠心分離に付し、得られた遠心分離沈渣をキレ
ート剤を用いて抽出し、該抽出物を分離精製することを
特徴とする下記性質を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固
物質の製法。 分子量(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法,還元状態及び非還元状態) 73,000±2,000 等電点(アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法) 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定(37℃) ハ 血漿中37℃、15分で安定 作用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61243778A JPH0764878B2 (ja) | 1986-10-14 | 1986-10-14 | 抗血液凝固物質及びその製法 |
US07/103,686 US4873222A (en) | 1986-10-14 | 1987-10-02 | Placenta-derived anticoagulating substance |
CA000548666A CA1297634C (en) | 1986-10-14 | 1987-10-06 | Anticoagulating substance and preparation process thereof |
ES198787114662T ES2038147T3 (es) | 1986-10-14 | 1987-10-07 | Una sustancia anticoagulante derivada de la placenta humana y su procedimiento de preparacion. |
DE8787114662T DE3775512D1 (de) | 1986-10-14 | 1987-10-07 | Antikoagulans und sein verfahren zur herstellung. |
EP87114662A EP0264060B1 (en) | 1986-10-14 | 1987-10-07 | Anticoagulating substance and preparation process thereof |
KR1019870011391A KR960004021B1 (ko) | 1986-10-14 | 1987-10-14 | 항혈액 응고제 및 그의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61243778A JPH0764878B2 (ja) | 1986-10-14 | 1986-10-14 | 抗血液凝固物質及びその製法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6396132A JPS6396132A (ja) | 1988-04-27 |
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---|---|---|---|
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EP (1) | EP0264060B1 (ja) |
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CA (1) | CA1297634C (ja) |
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JP2701047B2 (ja) * | 1988-07-21 | 1998-01-21 | 興和株式会社 | 抗血液凝固作用を有するポリペプチド |
US5179081A (en) * | 1988-07-21 | 1993-01-12 | Kowa Co., Ltd. | Method of treatment using an anticoagulant polypeptide |
US5202421A (en) * | 1988-12-27 | 1993-04-13 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Anticoagulant substance obtained from urine and process for the preparation thereof |
CA2096520C (en) * | 1990-11-20 | 2000-12-19 | Hiroshi Nakao | Therapeutic agent for skin or corneal disease |
KR101118017B1 (ko) * | 2009-09-04 | 2012-02-24 | (주)차바이오앤디오스텍 | 태반 추출물을 제조하는 방법 및 태반 추출물 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4585654A (en) * | 1983-04-29 | 1986-04-29 | Armour Pharmaceutical Co. | Process for pasteurizing fibronectin |
JPS60199819A (ja) * | 1984-03-23 | 1985-10-09 | Kowa Co | トロンビン結合性物質およびその製法 |
EP0182929A1 (de) * | 1984-11-26 | 1986-06-04 | American Hospital Supply Corporation | Koaktivator zur Aktivierung von Protein C |
CA1265446A (en) * | 1985-09-30 | 1990-02-06 | Masahiro Maki | Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component |
-
1986
- 1986-10-14 JP JP61243778A patent/JPH0764878B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-10-02 US US07/103,686 patent/US4873222A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-06 CA CA000548666A patent/CA1297634C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-07 EP EP87114662A patent/EP0264060B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-07 DE DE8787114662T patent/DE3775512D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-07 ES ES198787114662T patent/ES2038147T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-14 KR KR1019870011391A patent/KR960004021B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J.Biol.Chem.vol.259No.19(1984)P.12246−12251 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6396132A (ja) | 1988-04-27 |
EP0264060A3 (en) | 1988-07-27 |
KR880004816A (ko) | 1988-06-27 |
DE3775512D1 (de) | 1992-02-06 |
EP0264060A2 (en) | 1988-04-20 |
CA1297634C (en) | 1992-03-17 |
EP0264060B1 (en) | 1991-12-27 |
ES2038147T3 (es) | 1993-07-16 |
KR960004021B1 (ko) | 1996-03-25 |
US4873222A (en) | 1989-10-10 |
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