JP2701047B2 - 抗血液凝固作用を有するポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤を始めとするヒト組織より得られ
る抗血液凝固物質（以下、CPB IIと称する）と同様の抗
血液凝固活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするDNA、該DNAを含む組換えベクター、該組換え
ベクターを保持する形質転換体細胞、該ポリペプチドを
有効成分とする抗血液凝固剤および該ポリペプチドの製
造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、抗血液凝固物質としてはヘパリン、ヘパリンコ
ファクター−II、アンチトロンビン−III、α_２−マク
ログロブリン、α_１−トリプシンインヒビター、C₁−エ
ステラーゼインヒビター、プロテインＣ等が知られてい
るが、実用に供されているのはヘパリンのみである。し
かしヘパリンには出血傾向を招く副作用があるため、そ
の使用方法及び使用量が極めて限定されており、抗血液
凝固剤としては安全性の面から満足すべきものではなか
った。

斯かる状況の下で本出願人は、先にヒト胎盤からCPB
IIを分離精製することに成功し、特許出願した（特願昭
61−243778号）。

CPB IIは、下記の性質を有する医薬として有用な物質
である。

分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法、還元状態） 73,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 6.2〜6.6 安定性 イ． 50℃、30分加熱処理で失活 ロ． pH5.5〜8.5で安定（37℃） ハ． 血漿中37℃、15分で安定 作用 イ． カルシウム再加凝固時間を延長 ロ． プロトロンビン時間を延長 ハ． 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、シ
スチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン
及びアルギニンの存在が認められる。

さらに本出願人は、CPB IIに特異的なモノクローナル
抗体を作成し、特許出願した（時願昭63−86753号）。
このモノクローナル抗体を利用することにより、CPB II
の高感度検出、精製等を行うことができる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら現在CPB IIを得るためにはヒト胎盤を始
めとしたヒト組織を原材料とする必要があることから、
いくつかの問題があった。すなわちヒト組織中より得ら
れるCPB IIの量には限りがあること、原材料であるヒト
組織の入手には困難が伴い、安定して供給することは難
しいこと、ヒト組織中に存在し得る病原ウィルスの危険
性が無視できないこと等である。

従って、より安価に、より大量に、より安定して、か
つ、より安全にCPB II又はこれと同様な作用を有する物
質を供給する方法の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意研究
を重ねた結果、ヒト胎盤cDNAライブラリーよりCPB II特
異的抗体をプローブとして利用することによりCPB IIポ
リペプチドをコードするDNA断片が得られること、更に
このDNA断片を組み込んだ組換えベクターを用いて微生
物細胞を形質転換し、CPB II遺伝子を発現させることに
よりCPB II様ポリペプチドが製造できることを見い出
し、本発明を完成した。

本発明のポリペプチドをコードするDNA、組換えベク
ター、形質転換体細胞は、例えば次の如くして製造され
る。

すなわち、（１）ヒト胎盤cDNAライブラリーよりCPB
II特異的抗体を用いて抗体陽性クローンをスクリーニン
グし、（２）単離された抗体陽性クローンより組換えDN
Aを調製し、この組換えDNAよりcDNA断片を制限酵素処理
によって切出し、プラスミドベクターに組込む。（３）
得られたcDNA組換えベクターにより宿主細胞を形質転換
し、本発明の形質転換体細胞を得る。得られた本発明形
質転換体細胞を培養し、菌体中より本発明DNA断片を含
む本発明の組換えベクターを得る。更に得られた組換え
ベクターを適当な制限酵素で切断し、本発明のDNA断片
を得る。

次に上記各工程について更に詳しく説明する。

（１） ヒト胎盤cDNAライブラリーより抗体陽性クロー
ンのスクリーニング。

cDNAライブラリーはヒト胎盤よりmRNAを調製し、逆転
写酵素と適当なベクターを用いて作成する事ができる
が、市販のcDNAライブラリー、例えばクロンテック社製
ヒト胎盤cDNAライブラリー（λgt11）を利用する事がで
きる。

λgt11をベクターとして作成されたcDNAライブラリー
は特異抗体をプローブとしてヤングとデイヴィスの方法
（Huynh,T.V.,Young,R.A.and Davis,R.W.（1985）In:DN
A Cloning:A Practical Approach,vol.1,（D.M.Glover,
ed.）,pp49−78.IRL Press,Oxford.）を応用してスクリ
ーニングに付し、特異抗体陽性クローンを単離する事が
できる。

プローブとして用いる一次抗体としては、CPB II特異
抗体、例えば、抗CPB IIウサギポリクローナル抗体、抗
CPB IIマウスポリクローナル抗体、抗CPB IIモノクロー
ナル抗体を用いる事が出来るが、就中抗CPB IIモノクロ
ーナル抗体、特に抗CPB IIマウスモノクローナル抗体が
好ましい。抗体は、血清、腹水、細胞培養液、精製イム
ノグロブリン、いずれの状態でも使用できる。

抗原と結合した一次抗体の検出には、放射性ヨード（
¹²⁵I）ラベルしたプロテインＡ、放射性ヨード（¹²⁵I）
ラベルした抗イムノグロブリン抗体を用いてオートラジ
オグラフィーにより行う方法、パーオキシダーゼラベル
した抗イムノグロブリン抗体、又はアルカリ性フォスフ
ァターゼラベルした抗イムノグロブリン抗体を用いて酵
素抗体法により行う方法を利用する事が出来る。

なお、抗CPB IIモノクローナル抗体は、例えばケーラ
ーとミルスタリンの報告（Nature,256巻,495〜497頁.19
75年）に記載の方法によって製造することができる。す
なわち、ヒト胎盤より抽出、精製したCPB IIでマウスを
免疫し、該マウスより脾細胞を採取し、これとマウス骨
髄腫細胞を細胞融合させる。融合処理を施した細胞をHA
T選択培地を用いて培養し、ハイブリドーマのみを増殖
させる。ハイブリドーマが増殖した培養液に対してCPB
IIを抗原として酵素抗体法によりスクリーニングを行
い、CPB IIに特異的なモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを得た。得られたハイブリドーマを培養し
た培養液又は接種したマウスの腹水からモノクローナル
抗体が得られる。

（２） CPB II cDNA組換えベクターの作成 単離された抗体陽性クローンよりヤングとデイヴィス
の方法（Huynh,T.V.,Young,R.A.and Davis,R.W.（198
5）In:DNA Cloning:A Practical Approach,vol.1,（D.
M.Glover,ed.）,pp49−78.IRL Press,Oxford.）により
組換えλgt11ファージDNAを抽出精製する。精製された
組換えλgt11ファージDNAを制限酵素EcoR Iで消化する
事によりcDNAをベクターDNAより分離する事が出来る。
得られたcDNAを同じくEcoR I消化した種々のクローニン
グ用プラスミドベクターと再結合し、組換えプラスミド
ベクターを作成する。利用出来るプラスミドベクターと
しては、例えば、pBR322、pBR325、pUC18、pUC118、pTZ
18Rなどが挙げられる。

（３） CPB II cDNA組換えベクターによる宿主細胞の
形質転換、本発明組換えベクターおよび本発明DNAの調
製。

得られたCPB II cDNA組換えベクターをその組換えベ
クターの持つ遺伝子マーカーを最大限に利用できる種々
の宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換せしめる。
宿主細胞としては、大腸菌が好ましく、E.coli:K12株の
種々の変異株、例えばHB101、C600K、JM101、JM105、χ
1776、MV1304などが利用でき、組換えベクターの導入に
はカルシウム処理によるコンピテント細胞法などが用い
られる。

形質転換細胞をベクターの遺伝子マーカーに応じた選
択培地中で培養し、菌体中から本発明の組換えベクター
が採取される。

又、pCU118、pTZ18Rをベクターとして用いた場合、得
られた組換えベクターを保持する形質転換体大腸菌にヘ
ルパーファージM13K07を感染させる事により一本鎖DNA
を調製する事ができる。得られた一本鎖DNAは、ジデオ
キシシーケンス法（Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulson,
A.R.DNA senquencing with chain terminating inhibit
ors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463−5467,1977）に
よりDNA塩基配列を決定する事ができる。

その塩基配列のうち、本発明で目的とするポリペプチ
ドをコードする部分の塩基配列は例えば第２図の通りで
ある。

本発明のDNA断片は、前記アミノ酸配列をコードする
能力を有すれば、上記の塩基配列には限定されるもので
はない。また本発明の組換えベクターも、前記アミノ酸
配列をコードする塩基配列を有し、かつ複製可能であれ
ば、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来等いずれのベク
ターとの組換えでもよい。

本発明ポリペプチドは、前記本発明組換えベクターを
保持する形質転換細胞を培養し、その培養物から採取、
製造することができる。しかし、本発明ポリペプチドを
効率よく生産するためには、転写の下流方向へ順に次の
〜の塩基配列、 プロモーターとして作用する塩基配列 リボソーム結合部位である塩基配列 開始コドンである塩基配列 本発明ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩
基配列 終止コドンである塩基配列 転写ターミネーターとして作用する塩基配列 を含む発現用組換えベクターを構築し、これを用いて宿
主細胞を形質転換することが好ましい。

このような発現用組換えベクターを得るためのベクタ
ーの宿主としては、細菌のごとき単細胞微生物、特に大
腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）が好ましい。大腸菌を宿主とした
場合には、E.coli K12株の種々の変異株、例えばHB10
1、C600K、JM101、JM105、JM109、χ1776、MV1304など
が利用できる。

ベクターとして利用するDNAは、プラスミドが好まし
い。例えば、大腸菌を宿主とした場合、プラスミドDNA
は、大腸菌細胞中にてプラスミドが増殖する為に必要な
DNA配列、例えばColE1系のプラスミドの複製起点のDNA
配列を有し、更にプロモーター、転写ターミネーターと
して働くDNA配列を有し、更に好ましくは形質転換大腸
菌の選択マーカーとなる遺伝子を含む。プロモーターと
しては、例えばλPL、lac、trp、tac、trc、lppなどの
プロモーターが、転写ターミネーターとしては、例えば
rrnBリボゾーマルRNA転写ターミネーターなどが挙げら
れる。選択マーカー遺伝子としてはアンピシリン耐性遺
伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性
遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げら
れ、これらの遺伝子の１種または２種以上が用いられ
る。

上記ベクターに、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列
をコードし得る塩基配列を有するDNA、すなわち本発明D
NA断片を組み込むには、これを含むDNAを適当な制限酵
素で切断し、必要であれば適当なリンカーを付加した
後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させるこ
とにより行われる。用いられる制限酵素としては、例え
ばEcoR I、Sph I、Pst I、Hind III、BamH I、Xho I、X
ba I、Ban III、Sma I、Nco Iなどが挙げられる。エキ
ソヌクレアーゼIII、Bal31、S1ヌクレアーゼ、エキソヌ
クレアーゼVII、ムングビーンヌクレアーゼ、DNAポリメ
ラーゼＩなどの核酸修飾酵素も利用できる。用いられる
リンカーとしては、EcoR Iリンカー、Sma Iリンカー、N
co Iリンカー、BamH Iリンカー、Xho Iリンカー、Hind
IIIリンカー、Pst Iリンカー、Sph Iリンカー、Xba Iリ
ンカーなどが利用できる。

得られた発現用組換えベクターをコンピテント細胞
法、プロトプラスト法、カルシウム共沈法、電気パルス
法などを用いて宿主細胞に導入すれば、本発明ポリペプ
チドを効率的に生産する能力を有する形質転換体細胞が
得られる。

本発明ポリペプチドは、得られた形質転換体細胞を培
養し、該培養細胞及び／又は培養液から抽出、分離する
ことにより製造される。

形質転換体細胞の培養に際しては、種々の天然培地、
合成培地が用いられる。培地は、糖類、アルコール類、
有機酸塩などの炭素源；蛋白質混合物、アミノ酸類、ア
ンモニウム塩などの窒素源；無機塩類を含んでいる事が
望ましい。更に、ビタミン類、選択マーカー遺伝子に対
応した抗生物質類を添加する事が望まれる。発現の制御
が可能なベクターであれば、培養途中で遺伝子発現を誘
導する操作を加える必要がある。培養後、遠心処理を行
い培養液と培養細胞とに分別する。本発明ポリペプチド
が培養細胞中に蓄積する様な場合には、例えば凍結融
解、超音波処理、フレンチプレス、酵素処理、ホモジナ
イザーなどを用いて細胞を破壊した後に、例えばEDTA、
界面活性剤、尿素、塩酸グアニジンなどを用いて本発明
ポリペプチドを可溶化する必要がある。

得られた本発明ポリペプチドを含む培養液又は培養細
胞抽出液を種々のカラムクロマトグラフィーに付すこと
により、精製された本発明ポリペプチドを得ることがで
きる。カラムクロマトグラフィーとしては、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲルクロマトグラフィーを単独又は組合せて用いる
ことができる。

かくして得られた本発明ポリペプチドは、次の性質を
有する。

アミノ酸配列 本発明DNA断片の塩基配列より翻訳される本発明ポリ
ペプチドのアミノ酸配列は第１図の如くであると判断さ
れる。

分子量 75,700（アミノ酸配列より推定） 73,000±2,000（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法、還元状態） 本発明ポリペプチドを抗血液凝固剤の有効成分として
使用する場合の剤型としては、注射剤が挙げられる。注
射剤としては、凍結乾燥粉末を用時、注射用蒸留水、生
理食塩水等に溶解して投与する形態が好ましい。投与部
位としては、静脈内が適当である。

投与量は疾患の重傷度、患者の体重等により異なる
が、通常10μｇ〜10mg/kg/dayであることが好ましい。
尚、本発明ポリペプチドは、上記投与量の範囲内におい
ては全く異常が認められず、安全である。

〔発明の効果〕

本発明ポリペプチドは、強力な抗血液凝固活性を示す
ことから、これを有効成分として含有する抗血液凝固剤
は、血液凝固活性亢進に起因する種々の疾患、例えば脳
梗塞、心筋梗塞等の脳、心臓、末梢血管における血栓症
あるいはDIC（播種性血管内凝固）等の予防及び治療に
有用である。

また、本発明ポリペプチドは、ヒト胎盤由来の抗血液
凝固物質（CPB II）と同様の性質を有することから、ヒ
トに対し抗原性を有さない安全な物質である。さらに、
CPB IIは抗血液凝固剤として有用であるにもかかわら
ず、ヒト胎盤の入手の困難性等から大量に生産すること
ができないという欠点があったが、本発明ポリペプチド
は大量かつ安価に製造できるものである。

〔実施例〕

次に参考例および実施例を挙げて本発明を説明する。

参考例１ 抗CPB IIモノクローナル抗体の調製： （１）抗原（CPB II）の精製 （i ）ヒト胎盤５個（約2500g）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに50mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ワーリング
ブレンダーを用いて破砕し、次いで更に、ポリトロン
（Polytron）で磨砕する。得られたホモジネートを7,00
0rpm15分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣
に再度50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、
ポリトロンでホモジナイズし、7,000rpm15分間遠心分離
して洗浄沈渣を得た。この操作を数回繰り返し、血液成
分を除去して、洗浄沈渣約900gを得た。

（ii ）（ｉ）で得た沈渣900gに、50mM EDTAを含
む50mM−トリス塩酸緩衝液（pH7.4）を約２加え、ワ
ーリングブレンダーでホモジナイズする。このホモジネ
ートを４℃にて、一夜撹拌後7,000rpm15分間遠心分離し
て、抽出液２を得た。

（iii）（ii）で得た抽出液に固形硫安を加え、3
5％飽和とし、４℃で30分〜数時間放置後、7,000rpm15
分間遠心分離し上清を分取した。この上清に更に硫安を
加え、85％飽和とし、４℃で２時間放置した後7,000rpm
15分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣を20
mMトリス−塩酸緩衝液の少量に溶かし、同緩衝液に対
し、４℃で一夜、充分に透析した。透析中に生じた沈澱
は、7,000rpm15分間遠心分離して除き、透析液390mlを
得た。

（iv ）得られた透析液を、20mMトリス−塩酸緩
衝液（pH7.4）で平衡化したDEAE−トヨパール（φ5.5×
19cm）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄した後、０〜
0.3M塩化ナトリウムを含む同緩衝液４を用い、直線濃
度勾配により１分画20mlとなる様に溶出させた。活性画
分は、ほぼ0.2M塩化ナトリウム濃度付近にて溶出され、
200mlの活性画分を得た。

（v ）得られた活性画分をダイアフローメンブ
ランフィルターYM−10を用いて濃縮した。

濃縮液をセファデックスＧ−100を用いるゲル過
（φ4.5×75cm）に付し、生理食塩水で１分画8mlになる
ように溶出させ、活性画分70〜82を集め、これを限外
過により濃縮して、CPB II 14ml（蛋白重量59.3mg、Low
ry法）を得た。

（２）免疫脾細胞の調製 上述の如く精製したCPB II 100μｇをフロイント・コ
ンプリート・アジュバントに乳濁化させBALB/C系マウス
の腹腔内に投与した。

以後、２週間の間隔で50μｇのCPB IIとアジュバント
乳濁液を２回投与し、最後にCPB II 50μｇのみを投与
し免疫を完了した。

３日後にマウスを殺し、脾臓を摘出、細断した後100
メッシュのナイロン網で過し、脾臓の単離細胞を得
た。

（３）ハイプリドーマの調製 得られた免疫脾細胞に低張液（155mM塩化アンモニウ
ム）を加え赤血球を溶血した後Iscove's Modified Dulb
ecco's Medium（IMDM）で細胞を洗った。マウス骨髄腫
細胞PAIはIMDMで２回洗った。両細胞数を計測し、脾細
胞とPAI細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣に融合用緩衝液（マンニトール0.25M,CaCl
₂0.1mM,MgCl₂0.1mM,Tris−HCl 0.2mM,pH7.2）を加えよ
く撹拌した後遠心する。この操作を２回繰返した。細胞
沈渣に融合用緩衝液を加え細胞密度を４×10⁷/mlに調製
した。細胞融合装置（島津製作所SSH−１型）の電極間
に100〜200μ滴下し、1MHz、40Vで10秒間電圧をかけ
た後300V、1/60秒で数回電気パルスをかけた。５分間静
置した後IMDMで電極間の細胞を洗い出し遠心管に移した
後1,000rpm8分間遠心した。

沈渣を10％FCS添加IMDMで浮遊し再度遠心して上清を
捨てた。

ヒポキサンチン 10^-4M、アミノプテリン ４×10^-7M
及びチミジン 1.6×10^-5Mを加えた（HAT−）10％FCS添
加IMDMを用い沈渣を４×10⁶/mlに再浮遊し、96ウエルマ
イクロプレートに100μずつ分注した。３〜４日ごと
に培地50μ追加し、細胞の増殖を見た。

HAT選択により、ハイブリドーマのみ増殖することを
確認した。

（４）抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウエルの培養液を採取し酵
母免疫法によりCPB IIに対する抗体産生ハイブリドーマ
を調べた。まず、96ウエルマイクロプレート（イムノプ
レートＩ、ヌンク社製）にCPB IIを0.1μg/100μ／ウ
エル分注し、25℃で18時間静置し吸着させる。次いで検
体である培養液を100μ／ウエル注入し、25℃で２時
間反応させる。0.05％Tween20を含むリン酸緩衝食塩水
（PBS−Tween）で３回洗浄後、ワサビパーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウスIgG（カペル社製）を100μ／ウエル
加え、２時間後PBS−Tweenで３回洗浄する。これに、0.
001％過酸化水素、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン
（シグマ社製）の0.1Mクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH4.0）を加え、波長492nmの吸光度を測定した。

検体中、CPB IIに対する抗体が存在したウエルにのみ
発色が観察されるので、発色したウエルの細胞を採取し
た。

（５）CPB IIに対するモノクローナル抗体産生細胞のク
ローニング マウスの腹腔にIMDMを注射して採取した腹腔細胞をフ
ィーダー細胞として使用した。

10％FCS添加IMDMに浮遊した腹腔細胞（１×10⁵個/m
l）を96ウエルマイクロプレートに100μずつ分注し
た。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個/mlに調製
し、各ウエルに100μずつ分注した。３日ごとに培地
を交換し適当な量まで細胞が増殖したウエルから順に培
養上清を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を
確認した。陽性のウエルは再度クローニングし、抗CPB
IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これ
らのハイブリドーマは、４種類得られ、それぞれ産生す
る抗CPB IIモノクローナル抗体の種類により、CPB II−
H29、CPB II−H76、CPB II−H311、CPB II−H511と命名
した。

参考例２ 抗CPB IIモノクローナル抗体の調製： ７週令以上のBALB/C系マウスにプリスタン（アルダリ
ッチ社製）0.5mlを腹腔内投与し、約１週間後、上記で
得たハイブリドーマ１×10⁶個／マウス腹腔内接種し
た。約10日後、マウス腹腔より腹水を採取した。これを
3,000rpm、10分間遠心分離し、上清を分取しその5mlに
硫酸アンモニウムを終濃度が50％飽和になるように加
え、４℃で60分間撹拌する。次いで、10,000rpm、20分
間遠心分離し、沈渣を0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8）
に溶かし同緩衝液に対して透析した。これに等量の1.5M
グリシン−3M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.9）を加えた
同緩衝液で平衡化したProtein A Sepharose CL−4B（フ
ァルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに付した。

モノクローナル抗体の溶出は0.1Mクエン酸緩衝液（pH
4）で行い、抗CPB IIモノクローナル抗体を得た。CPB I
I−H29を用いた場合は、CPB II−A29 22.2mg、CPB II
−H76を用いた場合は、CPB II−A76 7.8mg、CPB II−H
311を用いた場合は、CPB II−A311 16mg、CPB II−H51
1を用いた場合はCPB II−A511 29mgをそれぞれ得た。

参考例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによるCPB IIの精製： （１）抗CPB IIモノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セファロース4B（0.4g）を1mM塩
酸、0.1mM重炭酸ナトリウム−0.5M塩化ナトリウム（pH
8.3）緩衝液で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファ
ロース4Bのカップリング緩衝液（1.5ml）溶液を調製し
た。

これに、精製モノクローナル抗体CPB II−A76 2mgの
カップリング緩衝液（1ml）溶液を加え、室温で２時間
振とうしグラスフィルターで脱水した。更に、0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（pH8.0）10mlを加え、室温で２時間振
とうし、残った活性部位をブロックした。

得られた抗体結合セファロース4Bを、0.1Mトリス−塩
酸−0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.3）、0.1M酢酸−
0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH4.0）で交互に３回洗浄
し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）で平衡化し、抗
体カラム76を得た。

（２）抗体カラムによるCPB IIの精製 上記で作成した抗体カラム76に、参考例１−（１）−
（ii）で得た粗CPB II溶液をかけ、平衡化に用いた緩衝
液は充分洗浄した。

CPB IIの溶出は、 0.1M酢酸−0.5M塩化ナトリウム
緩衝液（pH3.5）を用いる方法あるいは、 0.2Mグリ
シン−塩酸緩衝液（pH2.3）を用いる方法で行うことが
できる。

CPB IIは、素通り画分には認められず、溶出画分から
80％以上の回収率で精製することができた。

CPB IIの測定は、参考例４の方法で行った。

参考例４ 抗CPB IIモノクローナル抗体を用いるCPB IIの測定 S.ヨシタケらの方法〔J.Biochem.92,1413−1424,198
2）に準じてホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオ
キシターゼ（以下HRPと略す）を、抗CPB IIモノクロー
ナル抗体に結合させた。このHRP標識抗CPB IIモノクロ
ーナル抗体を用いて、以下の如くELISA法によりCPB II
の測定を行った。96ウエル平底マイクロプレートの各ウ
エルに0.05M炭酸ナトリウム（pH9.6）に溶解したモノク
ローナル抗体を100μずつ添加し、25℃で２時間コー
ティングした。PBS−Tweenで洗浄後、試料の0.1M Tris
−HCl、25mM EDTA、0.05％Tween 20（pH7.4）緩衝液溶
液100μを加えた。25℃で一晩反応させた後、PBS−Tw
eenで洗浄し、HRP標識モノクローナル抗体のPBS−Tween
希釈溶液を100μ加え、25℃で２時間反応させた。PBS
−Tweenで洗浄後、100μの基質溶液（オルトフエニレ
ンジアミン0.4mg/mlおよび0.01％過酸化水素の0.1Mクエ
ン酸リン酸緩衝液、pH5.0）を添加し、25℃で30分間反
応させた。4.5M硫酸50μを加えて反応を停止させた
後、492nmにおける吸光度を測定した。その結果、コー
ティング用モノクローナル抗体としてCPB II A29を用
い、標識用モノクローナル抗体としてCPB II A−76、CP
B II−A311、CPB II−A511を用いた場合、及びコーティ
ング用モノクローナル抗体としてCPB II−A511を用い、
標識用モノクローナル抗体としてCPB II−A29、CPB II
−A76を用いた場合には、１〜100ng/mlの範囲のCPB II
を検出できる。

またコーティング用モノクローナル抗体としてCPB II
−A29を用い、標識用モノクローナル抗体として、CPB I
I−A511を用いた場合の検量線は、極めて感度が高く、
しかも良好な直線性を示した。

実施例1. 抗CPB IIポリクローナル抗体の調製： （１） ウサギ抗血清の調製 参考例１にて作成したCPB II 0.8mgをフロイント完全
アジュバントに乳濁化させ、ウサギ（白色在来種、雄
性）の足蹠に投与した。以後、２週間の間隔で0.8mgのC
PB IIとアジュバント乳濁液を２回投与し、最後に同量
のCPB IIをフロイント不完全アジュバントに乳濁化さ
せ、皮下投与し免疫を完了した。免疫の完了したウサギ
を全採血し、80mlの血清を得た。CPB IIを抗原としてオ
クタロニー法で本血清の抗体価を測定したところ、８倍
の抗体価が得られた。

（２） 抗体の精製 （１）で得られた抗血清80mlにヒト・アルブミン溶液
（4mg/ml）を2.5ml加え、室温・２時間放置後、14,000r
pm、10分間遠心し、抗ヒト・アルブミン抗体を吸収し
た。得られた上清78mlに78mlのPBS（0.29％リン酸二ナ
トリウム、0.02％ リン酸一カリウム、0.8％ 食塩、
0.02％ 塩化カリウム）を加え、更に156mlの飽和硫安
溶液を加えた。４℃で一晩放置後、10,000rpmで10分間
遠心し、沈澱を得た。得られた沈澱をPBSに溶解し、充
分量のPBSに対して透析した。得られた透析液を10,000r
pmで10分間遠心したのち、PBSで平衡化したProtein A−
セルロファインカラムに吸着させた。PBSで洗浄後、0.1
5M食塩を含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（pH2.7）で溶
出、トリス溶液でpHを中性に調製し、Calphobindin（真
木ら、産婦血液12（１）,41〜48,1988）を固定化したセ
ファロースカラムを通過させた。通過液にヒト胎盤より
調製したリポコルチン画分（Huangら、Cell、46巻、191
頁、1986年）を加え４℃で一晩放置後、15,000rpmで10
分間遠心し、抗リポコルチン抗体を吸収した。遠心上清
をCPB IIを固定したセファロースカラムに吸着させ、PB
Sで洗浄後、0.15M食塩を含む0.1M グリシン−塩酸緩衝
液（pH2.7）で溶出、トリス溶液でpHを中性に調製し
た。溶出液を蒸溜水に透析後、凍結乾燥し精製抗CPB II
ポリクローナル抗体10.3mgを得た。

実施例2. CPB II cDNAのクローニング： （１）ヒト胎盤cDNAライブラリーのスクリーニング： cDNAライブラリー ヒト胎盤cDNAライブラリーは、クロンテック社製（Cl
ontech laboratories,Inc.）でλgt11ファージのEcoR I
部位に平均1.8kbのヒト胎盤mRNAより逆転写酵素を用い
て作製されたcDNAがEcoR Iリンカーを介して結合されて
いる。ライブラリーは、1.0×10⁶個の独立クローンより
成る組換えλgt11ファージである。

宿主大腸菌Y1090（ATCC 37197）を使用し、アン
ピシリン（100μg/ml）とマルトースを含むLB寒天平板
（バクトトリプトン10g、バクトイーストエキストラク
ト5g、食塩5g、マルトース2g、寒天15g、蒸溜水１、p
H7.5）にストリークし、37℃で一夜培養した。生じた単
コロニーをアンピシリン（100μg/ml）とマルトースを
含むLB培地（バクトトリプトン10g、バクトイーストエ
キストラクト5g、食塩5g、マルトース2g、蒸溜水１、
pH7.5）に移植し、37℃で一夜振盪培養した。

ファージライブラリーの感染 0.2mlの宿主大腸菌Y1090の一夜培養液とλ稀釈液（10
mMトリス塩酸緩衝液、10mM塩化マグネシウム、pH7.5）
で5.5×10⁵pfu/mlとなるように調製したライブラリー0.
1mlを混ぜ、室温で20分間放置してファージを宿主菌に
吸着させた。45℃に保温しておいたマルトースを含むLB
上層寒天培地（バクトトリプトン10g、バクトイースト
エキストラクト5g、食塩5g、マルトース2g、寒天7.2g、
蒸溜水１、pH7.5）2.5mlを加え混合した後、マルトー
スを含む直径9cmのLB寒天平板上に撤き42℃、３時間半
培養した。

ニトロセルロースフィルターへの転写 10mMイソプロピルβ−Ｄガラクトピラノシド（IPTG）
で飽和後、乾燥した滅菌ニトロセルロースフィルターを
42℃で３時間半培養したλgt11ファージプラークの生じ
たLB寒天平板に被せた。更に37℃、３時間半培養した
後、フィルーターを剥がし、ファージプラークの生じた
平板は４℃に保存した。フィルターをTBST（10mMトリス
塩酸緩衝液、150mM食塩、0.05％ Tween20、pH8.0）で洗
浄後、１％ウシ血清アルブミン/TBSTで室温、30分間ブ
ロッキングを行った。

一次抗体の結合 フィルターを一次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪し
ながら室温で60分間反応させた。一次抗体としては、TB
STに溶かした抗CPB IIウサギポリクローナル抗体（実施
例1.で得られたもの）溶液を室温30分間放置し、不純抗
体の吸収を行ってから用いた。抗CPB IIウサギポリクロ
ーナル抗体溶液は、0.1μg/mlの抗CPB IIウサギポリク
ローナル抗体、1mg/mlウシ血清アルブミン、0.25μg/ml
の大腸菌エキストラクト（Promega Corporation製）を
含むものを用いた。

一次抗体反応後、TBSTでフィルターを10分間ずつ３回
洗浄した。

二次抗体の結合 フィルターを二次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪し
ながら室温30分間反応させた。二次抗体としては、アル
カリ製フォスファターゼ結合抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）（P
romega Corporation製）をTBSTで1/7,500倍に稀釈した
ものを用いた。

TBSTでフィルターを10分間ずつ３回洗浄、AP緩衝液
（100mMトリス塩酸緩衝液、100mM食塩、5mM塩化マグネ
シウム、pH9.5）で一回洗浄した。

発色 5mlのAP緩衝液に33μのニトロブルーテトラゾリウ
ム溶液（50mg/ml）と66μの５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリルフォスフェート溶液（50mg/ml）を混
ぜた発色基質溶液にフィルターを浸した。

室温、１時間発色後、反応停止液（20mMトリス塩酸緩
衝液、5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、pH8.0）
に移し、発色を停止した。

陽性プラークの調製、純化 発色の認められた陽性スポットに対応するプラークを
寒天培地ごと取り、0.1mlのTMG緩衝液（10mMトリス塩酸
緩衝液、10mM塩化マグネシウム、100μm/mlゼラチン、p
H7.4）に移し、クロロホルムを２滴加え、４℃で4,000r
pm、15分間遠心し、上清にクロロホルムを１滴加えて４
℃に保存した。

約１×10⁶個のプラークについて上記のスクリーニン
グを行ったところ、26株の陽性プラークを得た。

発色の強かった４株についてファージ液を適当に稀釈
し、更に２回スクリーニング操作を繰返し純化ファージ
株、Ｃ−1,C−4,C−5,C−６を得た。

（２）組換えファージDNAの調製 得られた４株の組換えファージを宿主大腸菌Y1088（A
TCC 337195）に感染させ、42℃でファージを誘発させ、
λファージの調製法（Bernard Perbal,PREPARATION OF
λ PHAGE DNA.in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLO
NING,pp175−184、A Wiley−Interscience Publicatio
n,1984,New York,U.S.A.）に準じて、プレート法による
少量調製、大量調製、液体培養による大量調製を経て、
10⁹pfu/mlの組換えファージを得た。

λDNA調製法（Bernard Perbal,PURIFICATION OF λ D
NA.in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING,pp184
−187,A Wiley−Interscience Publication,1984,New Y
ork,U.S.A.）に従い、ポリエチレングリコール沈澱法に
より10¹¹pfu/mlに濃縮したファージ液をグリセリンのス
テップワイズ遠心（Bernard Perbal著、小林成保監訳、
遺伝子操作実験実用ハンドブック、pp175,1985,ジャテ
ック出版）により精製した。

精製組換えファージを用いて、同じくλDNAの調製法
に従って、組換えファージDNAの調製を行い、300mlの培
養液から約50〜100μｇのDNAが得られた。

（３）cDNAのサブクローニング ベクターとしてpUG118（宝酒造株式会社製）を用い
た。pUG118をEcoR Iで切断し、同じくEcoR Iで切断した
４株の組換えλgt11ファージDNAとDNAライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。

宿主大腸菌MV1304（宝酒造株式会社製）に得られた組
換えベクターを導入したところ、得られた形質転換体MV
1304より４株の組換えλgt11ファージに対応する挿入方
向と分子量の異なる組換えベクターが得られた。Ｃ−１
からは組換えベクターpKS I 11,pKS I 12,pKS I 13が、
Ｃ−４からはpKS I 41が、Ｃ−５からはpKS I 51,pKS I
53が、Ｃ−６からはpKS I 61,pKS I 63,pKS I 64がそ
れぞれ得られた。

種々の制限酵素を用いて各種組換えベクターを切断
し、第３図に示した様に制限酵素地図を作製した。CPB
II cDNAは挿入断片中にEcoR I部位を含み、サブクロー
ニングにより大断片を保持するサブクローンと小断片を
保持するサブクローンが得られる。最も長いcDNA断片を
含む組換えファージＣ−６より得られたpKS I 64とpKS
I 61を第４図に示した。pKS I 64とpKS I 61の分子量
は、それぞれ5.1Kbと3.7kbであった。

（４）CPB II cDNA塩基配列の確認 得られたCPB II cDNA組換えベクターを様々な制限酵
素、エキソヌクレアーゼIII、ムングビーンヌクレアー
ゼを用いて処理し、cDNAの短鎖化を行い、pUC118をベク
ターとして短鎖化プラスミドを再構築した。得られた短
鎖化プラスミドを用いて宿主大腸菌MV1304を形質転換し
た。得られた形質転換体細胞培養液にヘルパーファージ
M13K07（宝酒造株式会社製）を感染させ増殖したファー
ジ粒子より一本鎖DNAを調製し、ジデオキシーケンス法
（SANGER,F.,NICKLEN,S and COULSON,A.R.Proc.Nat.Aca
d.Sci.U.S.A.,74,5463〜5467,1977）により第３図に示
した計画に従い、DNA塩基配列を決定した。

第５図にCPB II cDNAの全塩基配列を示したが、CPB
IIポリペプチドを完全にコードする2,425bpのcDNAを得
る事ができた。オープンリーディングフレームの検索を
行った結果、４塩基目のGCCから始まり、2,019塩基目で
終わるGACまでの2,016塩基がCPB IIの672アミノ酸残基
よりなるポリペプチドをコードしている事が判明した。

本発明ポリペプチドをコードしているcDNAはEcoR I切
断部位を１個含む為、２種のプラスミドに別れてクロー
ニングされている。本cDNAを接続し一本のDNAとする目
的で、第６図に示した様に種々の制限酵素、DNA修飾酵
素、DNAリンカーを用いてpKS I 64とpKS I 61より、本
発明ポリペプチドを完全にコードするオープンリーディ
ングフレーム含むpKS I 73を構築した。本組換えベクタ
ーpKS I 73を保持するE.coli MV1304/pKS I 73は、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第
1952号として寄託した。

実施例3. 発現用組換えベクターの構築及び該組換えベクターによ
る宿主細胞の形質転換： （１）発現ベクターの選択 実施例2.にて構築したpKS I 73は本発明ポリペプチド
の翻訳開始部位ATGの上流にマルチクローニングサイト
を持ち、適当な制限酵素で本発明ポリペプチドをコード
するcDNA断片を切出す事が出来る。かくして切り出した
cDNA断片を強力なプロモーターの下流にEcoR I、Sph
I、Pst I、sal I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac
Iなどの制限酵素部位を持つ発現ベクターに連結する事
により容易に発現し得る。そこで大腸菌の強力なプロモ
ーターであるtacプロモーターを含み、リボソーム結合
部位の下流にEcoR I、Sma I、BamH I、Sal I、Pst I、H
ind IIIの制限酵素部位を持つ発現ベクターpKK223−３
（ファルマシア社製）を用いることにした。

（２）発現用組換えベクターの構築 実施例２で構築したベクターpKS I 73をPst IとHind
IIIで切断し、pKK223−３のPst I−Hind III間にDNAラ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて接続
し、発現用組換えベクターpKS I X266を構築した。しか
しながら、pKS I X266はリボソーム結合部位と翻訳開始
部位ATGとの距離が離れており、発現効率が悪い事が予
想された。そこでpKS I X266をSma Iで切断後、再結合
し、pKS I X226を更にpKS I X226をEcoR I切断後、再結
合し、pKS I X205を構築した。この手順を第７図に示
す。

（３）発現用組換えベクターによる宿主細胞の形質転換 （２）で構築された発現用組換えベクターpKS I X26
6、pKS I X226、pKS I X205をヴィースタース・シマニ
スの方法（Hanahan,D.（1985）In:DNA Cloning:A Prac
tical Approach.vol.1,（D.M.Glover.ed.）,pp121.IRL
Press.Oxford.）により調製した宿主大腸菌JM105（C.Ya
nisch−Perron,J.Vieira and J.Messing.Improved M13
phage cloning vectors and host strains:nucleotide
sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors.Gene 3
3,103−119.1985）コンピテント細胞に導入した。形質
転換体細胞E.coliの選択は、アンピシリン100μg/mlを
含むLB寒天平板（バクトトリプトン １％、バクトイー
ストエクストラクト 0.5％、食塩１％、寒天1.5％）上
で行った。

得られた形質転換体細胞のうちE.coli JM105/pKS I X
205は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄1953号として寄託した。

実施例4. ウエスタンブロッティング法による本発明ポリペプチド
の発現の確認 実施例3.にて作製されたE.coli JM105/pKS I X205を
アンビシリン100μg/mlを含むLB寒天平板上にて37℃、
１夜培養し、生じたコロニーを500ml三角フラスコに分
注した50mlのMM培地（1.05％ リン酸二カリウム、0.45
％ リン酸一カリウム、0.1％ 硫安、0.05％ クエン
酸ナトリウム、0.02％ 硫酸マグネシウム、0.2％ グ
ルコース、５μg/ チアミン塩酸）に接種し、37℃で
３時間振盪培養した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシドを最終濃度1mMとなる様に加えて、更に1
2時間振盪培養を続けた。集菌後、0.5mlのTE（10mM ト
リス塩酸緩衝液、25mM EDTA、pH8.0）に懸濁した。ドラ
イアイス／エタノール中で凍結し、続けて解凍した、凍
結融解を更に二度繰り返した後、４℃にて15,000rpm、1
0分間遠心し菌体破砕液上清を得た。菌体破砕液上清を
ミリポアフィルターを通過させ、E.coli JM105/pKS I X
205抽出液を得た。

得られた抽出液15μをβ−メルカプトエタノールに
て還元後、SDSポリアクリルアミド電気泳動（10％ゲ
ル）に付し、抗CPB IIモノクローナル抗体CPB II A−2
9、CPB II−A311、CPB II−A511、各１μg/mlの混合液
とウエスタンブロッティングAPシステム（Promega Biot
ec製）を用いてウエスタンブロッティングを行ったとこ
ろ、CPB IIに相当する分子量を持った本発明ポリペプチ
ドの発現を確認出来た（第８図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図
面である。 第２図は、本発明cDNAの塩基配列を示す図面である。 第３図は、本発明cDNA挿入断片の制限酵素地図を示す模
式図である。 第４図は、本発明組換えベクターpKS I 64とpKS I 61の
制限酵素地図を示す模式図である。 第５図は、本発明cDNAの全塩基配列及びこれに対応する
アミノ酸配列を示す図面である。 第６図は、本発明組換えベクターpKS I 73の構築方法を
示す説明図である。 第７図は、本発明のペプチド発現用組換えベクターpKS
I X205の構築方法を示す説明図である。 第８図は、本発明ポリペプチドのSDSポリアクリルアミ
ド電気泳動上におけるウエスタンブロッティングの結果
を示す図面である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ. Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，（1988），ｐ. 21〜27 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．85，（1988）, ｐ．664〜668

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列
   を有するDNA断片。
2. 【請求項２】請求項１記載のDNA断片と、複製可能なベ
   クターからなる組換えベクター。
3. 【請求項３】転写の下流方向へ順に次の〜の塩基配
   列、 プロモーターとして作用する塩基配列 リボソーム結合部位である塩基配列 開始コドンである塩基配列 請求項１記載の塩基配列 終止コドンである塩基配列 転写ターミネーターとして作用する塩基配列 を含有する組換えベクター。
4. 【請求項４】請求項３記載の組換えベクターを保持する
   形質転換体細胞。