JPS60231624A - ヒト‐レニンに対するモノクローナル抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する
新規なモノクローナル抗体及びその誘導体、これらの抗
体及びその誘導体の製造方法、これらの抗体を産生ずる
ハイブリドーマセルライン、該ハイブリドーマセルライ
ンの製造方法、ヒト−レニン及び構造的に類似するレニ
ンの定性的及び定量的測定のだめのモノクローナル抗体
及びその誘導体の使用、このだめの試験キット、ヒト−
レニン及び構造的に類似するレニンの精製のためのモノ
クローナル抗体及びその誘導体、これらの抗体及びその
誘導体を含有する医薬、並びに高血圧及び心臓機能不全
の治療のためのモノクローナル抗体及びその誘導体の使
用に関する。 〔発明の背景〕 レニンは、アンジオテンシンによる血圧の調節において
役割を演する蛋白質分解酵素である。ヒト−レニンは約
４０，０００の分子量を有するグリコジル化蛋白質であ
る。ヒト−レニンの幾つかの構造的特徴が知られている
。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列は、レニンをコ
ードする相補的デオキシリが核酸（ｃＤＮＡ）の決定に
より解明されている。レニンは腎臓から不活性な形で、
すなわちグロレニンとして放出され、そして次に血流に
入り、ここでは２０〜１００　ｐｇβｌの濃度で存在す
ることが見出されている。ここで、レニンはアンジオテ
ンシノーダン（レニンの基質）を開裂せしめてデカベグ
チドであるアンジオテンシン■を生成せしめ、このアン
ジオテンシン■は今度は肺、腎臓及び他の器管でいわゆ
るアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）Ｋよシ開裂され
てオクタベゾチドであるアンジオテンシン■を生成する
。アンジオテンシン■は、心筋の収縮によシ直接的桜、
そして副腎からナトリウム−保持を惹起するホルモンで
あるアトロステロン（これは細胞外液容積と関連する）
を放出せしめることによって間接的に血圧を上昇せしめ
る。アンジオテンシン■はアンジオテンシナーゼによっ
て分解されてヘプタペグチドであるアンジオテンシンｍ
（このアンジオテンシン■はアンジオテンシン■と類似
の作用を示す）とｈす、そして一層小さい不活性断片と
なる。 レニン−アンジオテンシン系に影響を与えることによっ
て幾つかのタイプの高血圧及び心臓機能不全を治療する
ことが可能である。血圧の低下は、（ａ）アンジオテン
シンＩｔ（又はｌ１ｌ）のりセゾターに対するその作用
を阻害することにより、（ｂ）アンジオテンシン転換酵
素を阻害することにより、又は（ｃ）アンジオテンシノ
ーダンに対するレニンの作用を阻害することにより達成
することができる。レニン−阻害剤は、例えばベゾシ／
及びペゾシン類似体、アンジオテンシノーダン類似体、
及びレニン抗体である。これらのレニン−阻害剤はアン
ジオテンシノーダンからのアンジオテンシンＩの放出を
減少せしめ、そしてこれによって活性ペグチドホルモン
であるアンジオテンシン■を減少せしめる。既知のレニ
ン−阻害剤と比べて、この発明のレニン抗体は非常に低
い濃度においても非常に特異的にレニンの作用を阻害す
るという利点を有する。 診断及び治療における抗体の使用は、最近までその適用
範囲が非常に限定されていた。抗体は、種々の蛋白質の
複雑な混合物の形で動物血清から非常に少量得られてい
た。免疫された各個体動物、及び１つの動物でさえ、繰
シ返し免疫された場合には各場合において異る組成を有
する抗体を含有する血清を生成するため、抗体の標準化
は不可能であった。Ｋｏ　ｈ　１　ｅ　ｒ及びＭｉｌｓ
ｔｅｉｎ［：１：］によって開発された新しい技法を用
いることによシ、今や、細胞培養物から均一な形で理論
的に限少ない量の抗体、いわゆるモノクローナル抗体を
再現可能に得ることができるようになった。適当な骨髄
腫細胞と、抗原によって免疫された供与体からの抗体産
生リンパ球との融合によシ、イン−ビトロでの無限の細
胞分裂及び無限の増殖と均一な抗体の産生とを合わせ持
つハイブリドーマ細胞が生ずる。 従って、生物の免疫反応を特定の抗原から独立のものと
し、そしてバイブリド細胞の連続的培養によシモノクロ
ーナル抗体を製造することが可能となる。 ハイブリドーマ技法による特異的なモノクローナル抗体
の製造の例が多く知られておシ、そして一般的方法が原
理的に記載されているが、各新しい例においては前記の
技法を特定のケースに適合させるための特有の問題が生
ずる。このような適合なくしては、所望のハイブリドー
マ細胞を形成し、これらが遺伝的に安定であシ、そして
所望のモノクローナル抗体を産生じ、そしてこうして調
製されたモノクローナル抗体が所望の特異性を有するこ
とが保証され力い。成功の程度は、原理的には、リンパ
球供与体の免疫に使用される抗原のタイプ及び純度、免
疫化方法、細胞融合の技法、適当なハイブリドーマセル
ラインの選択方法、並びにモノクローナル抗体を単離し
そして精製する方法により影響される。 ヒト−レニンに結合するモノクローナル抗体は知られて
いる。Ｓｉｍｏｎ等〔２〕はヒト−レニンに対する低い
親和性を有するモノクローナル抗体を記載している。Ｄ
ｚａｕ等〔３〕はヒト−レニンに結合し、そして同時に
その酵素作用を阻害するモノクローナル抗体を記載して
いる。血液中のヒト−レニンを測定するために、基本的
に、２つの異る方法が使用される〔４〕。その１つにお
いては、血漿中のヒト−レニンの酵素活性が、アンジオ
テンシノーダンから放出されるアンジオテンシンＩの量
を決定することによシ測定される。次に、不活性々血漿
レニンを例えばＰＨ３〜４において酸で処理することに
よシ活性化した後に酵素活性を決定することによりレニ
ンの合計量の測定値が得られる。この間接的方法は低濃
度のレニンの測定を可能にするが、大きな不正確さを有
する。他の方法においては、既知のモノクローナル抗体
又は血漿からのポリクローナル抗体を用いるイムノアッ
セイによりヒト−レニンが測定される。しかしながら、
この直接法は、血漿中のヒト−レニンの非常に低い濃度
の信頼性ある測定のために十分な感度を有していなかっ
た。従って、既知の抗体に比べて相当′に強くヒト−レ
ニンに結合し、その結果ヒト−血漿中のレニンの正確な
測定をもたらすイムノアッセイにおいて使用することが
できるモノクローナル抗体の必要性が存在する。さらに
、高血圧の治療のために使用することができる程効果的
に酵素し二ンの作用を阻害するモノクローナル抗体の必
要性が存在する。この発明は、ヒト−レニンに強く結合
し、そして同時にその酵素活性を効果的に阻害するモノ
クローナル抗体を提供することによりこの問題に解決を
与えるものである。 〔発明の記載〕 この発明は、ヒト−レニンに対する高い親和性を特徴と
する、ヒト−レニン及び構造的に類似のレニンに対する
モノクローナル抗体、並びにその誘導体に関する。 ヒト−レニンに対するモノクローナル抗体は、表面に結
合したヒト−レニン又は溶解したヒト−レニンに対する
結合定数、ヒト−レニンの酵素活性を阻害する濃度、関
連抗原例えば他の種のレニンに対する交差反応性、免疫
グロブリンクラス又はサブクラス、及び？リペプチド鎖
のＮ−末端アミノ酸配列により特徴付けることができ・
る。 この発明は特に、３刈０−”　Ｍ　（ｍｏ　１／Ａ！　
）以下の濃度において表面結合ヒト−レニンに有意に結
合するモノクローナル抗体及びその誘導体、３　Ｘ　１
０”Ｍの濃度において限定された量で加えられた溶解し
たヒト−レニンの５０−以上と結合するモノクローナル
抗体及びその誘導体、並びに２Ｘ１０＝Ｍの濃度におい
てヒト−レニンの酵素活性を５０チ以上阻害するモノク
ローナル抗体及びその誘導体に関する。 ２　Ｘ　１０−’Ｍの濃度においてヒト−レニンの酵素
活性を５０％以上阻害するモノクローナル抗体及びその
誘導体が好ましい。５　Ｘ　１０−１１Ｍの濃一度にお
いてヒト−レニンの酵素活性を５０チ以上阻害するモノ
クローナル抗体及びその誘導体が最も好ましい。最も好
ましいモノクローナル抗体の例はセルラインＲ３−３６
−１６から産生されるＲ３−３６−１６と称する抗体で
ある。モノクローナル抗体Ｒ３−３６−１６は、ガンマ
−１カッＡ？−免疫グロブリンであって、との°ものは
ライトポリペブチ１♂鎖の第１超可変領域中Ｎ一端の２
８−３８位にアミノ酸２８セリン−２９バリン、３１セ
リン−３２チロシン−３３グリシン−３４リジン、及び
３６フエニルアラニンー　メチオニンを含有する。 との発明のモノクローナル抗体の誘導体は、例えば、ヒ
ト−レニンの抗原決定基に対する特異性を保持している
断片、例えばＦａｂ断片、Ｆｉｂ’断片、又はＦ　（ａ
　ｂ　’　）２断片；例えば放射性ヨウ素（１２５Ｎ、
１３１１　）、炭素（１４ｃ）、硫黄（”ｓ）、トリチ
ウム（３Ｈ）もしくはこれらに類するものによシラペル
された放射性ラベルモノクローナル抗体；又は酵素、側
光ばホースラディツシュパーオキシダーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、β−Ｄ−がラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カーゼニックアン
ヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム
、マレートデヒドロダナーゼ、又はグルコース−６−ホ
スフエードプヒドロダナーゼと接合したモノクローナル
抗体である。好ましい誘導体は、１２５ヨウ素でラベル
されたモノクローナル抗体、及びアルカリ性ホスファタ
ーゼとのモノクローナル抗体接合体である。 この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体は、それ
自体公知の方法によって次のようにして得られる。すな
わち、モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細
胞を、 ａ）イン−ビトロ培養し、そして培養上清液からモノク
ローナル抗体を単離し、又は、ｂ）適当な哺乳動物中で
イン−ビデ増幅し、そして該哺乳動物の体液からモノク
ローナル抗体を単離し、そして所望によシ、 Ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
る。 変法ａ）のイン−ビデ培養のために適当な培地は、常用
の標準的培地、例えば、ウシ胎児血清を補充されたドク
ルペコ変形イーグル培地（Ｄｏ　１ｂｅｃｃｏ’ｓＭｏ
ｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　）又はＲＰ
Ｍ１１６４０培地である。モノクローナル抗体の単離の
ために、培養上清液中の蛋白質を硫酸アンモニウム又は
これに類似するものによシ沈澱せしめ、そして常用クロ
マトグラフィー法、例えばグル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィ
ー、又はイムノアフィニティークロマトグラフィーによ
シ精製する。 変法ｂ）によシハイプリドーマ細胞をインービが増幅す
ることによシ所望のモノクローナル抗体を大量に得るこ
とができる。この目的のために、細胞クローンを同系（
ｓｙｎｇｅｎａｉｃ　）哺乳動物に注射しそして１〜３
週間後、これらの動物の体液から抗体を単離する。例え
ば、Ｂａ１ｂ／ｅマウス由来のハイブリドーマ細胞を、
炭化水素、例えばプリスタンによりあらかじめ前処理し
ておいたＢ　ａ　１　ｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そ
して８〜１０日間の後、これらの動物から腹水を採取す
る。目的とするモノクローナル抗体を体液から、それ自
体公知の方法に従って、例えば硫酸アンモニウム又はこ
れに類似するものにより沈澱せしめ、そしてクロマトグ
ラフィー、例えばＤＥＡＥ−セルロース又はイオン交換
樹脂上でのクロマトグラフィーにより、あるいはグル濾
過又はイムノアフィニティークロマトグラフィーによシ
単離する。 ヒトーレニ／の抗原決定基に対する特異性を保持してい
る、この発明のモノクローナル抗体の断片、例えばＦａ
ｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ’）ｚ断片は、そ
れ自体公知の方法により、例えば変法＆）又はｂ）に従
って調製されたモノクローナル抗体をペグシンもしくは
パパインのごとき酵素によシ処理するととによって、そ
して／又は化学還元によってジスルフィド結合を開裂せ
しめることによって製造される。 ヨウ素（１２５１，１５１１）によシ放射性ラベルされ
たモノクローナル抗体は、この発明のモノクローナル抗
体から、それ自体公知のヨウ素化法によって、例えば放
射性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウム及び化学酸化
剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等によ
り、又は酵素的酸化剤、例えばラクトバーオキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ及びグルコースにより得られ
る。この発明の放射性ラベルされたモノクローナル抗体
はまた、イン−ビトロ培養のための培地に、公知の方法
により、放射性炭素（”ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、硫
黄（５５ｓ）等を含有する放射性う村ルされた栄養素、
例えばＬ−（Ｃ）−ロイシン、Ｌ−（’Ｈ）−ロイシン
又はＬ　−（５５３）−メチオニンを加え、そして変法
ａ）に従ってモノクローナル抗体を得ることによっても
調製される。 この発明の酵素ラベルモノクローナル抗体は、それ自体
公知の方法に従って、変法ａ）又はｂ）に従って調製さ
れたモノクローナル抗体及び所望の酵素を、カップリン
グ剤、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、
Ｎ’−０−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイ
ミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−
（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンオキシ）−サク
シンイミド等と共に反応せしめることによシ得られる。 この発明はさらに、ハイブリドーマセルラインに関しこ
のセルラインはヒト−レニンに対して高い親和性を有す
るモノクローナル抗体を産生ずることを特徴とする。こ
の発明は特に３Ｘ１０−１０Ｍ（ｍｏ−１Ｏの濃度にお
いて、限定された量で加えられたヒト−レニンの５０％
以上と結合し、そして／又は２　Ｘ　１０−８Ｍの濃度
においてヒト−レニンの酵素活性を５０チ以上阻害する
モノクローナル抗体を産生ずるセルラインに関する。３
Ｘ１０−”Ｍの濃度においてヒト−レニンの５（１以上
と結合し、そして／又は２×１０−９Ｍの濃度において
ヒト−レニンの酵素活性を５０％以上阻害するモノクロ
ーナル・抗体を産生ずるセルラインが好ましい。５　Ｘ
　１０”Ｍの濃度においてヒト−レニンの酵素活性を５
０チ以上阻害するモノクローナル抗体を産生するセルラ
インが特に好ましい。 高親和性のモノクローナル抗体を産生ずる最も好ましい
ハイブリドーマセルラインの例として、）４すのノやス
ツール研究所の’　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌｓｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｏ　Ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅａ’　に−４１−２５３として、１９
８３年１１Ｊ”ｌ’７ＢＪＣ寄託されたＲ３−３６−１
６と称するセルラインを挙げることができる。ハイブリ
ドーマセルラインＲ３−３６−１６はマウス骨髄腫セル
ラインｓｐ　２１０−　Ａｇ　１４とＢａ１ｂ／ｃマウ
スの肺臓のＢ−リンパ球とのバイブリドである。Ｒ３−
３６−１６は、一定の特異性のモノクローナル抗体を分
泌し、そして解凍及び再クローニングによって深冷凍結
培養物から活性化することができる安定なセルラインで
ある。 この発明はさらに、ヒト−レニンに対して高い親和性を
有するモノクローナル抗体を産生ずるハイシリドーマ細
胞の製造方法に関し、この方法は適当な哺乳動物を精製
されたヒト−レニンによって免疫し、該哺乳動物から採
取した抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、得られ
たハイブリドーマ細胞をクローン化し、そしてヒト−レ
ニンに対する高い親和性を有する所望のモノクローナル
抗体を産生ずる細胞クローンを選択することを特徴とす
る。 高純度とトーレニンを用いて免疫するのが好ましい。こ
のようなヒト−レニンは、例えばそれ自体公知の方法に
よシ、ヒト−腎臓の抽出物から、イムノアフィニティー
クロマトグラフィーを用いて得られる。 免疫化のために好ましい哺乳動物は、マウス、特にＢａ
１ｂ／ｃマウスであるが、他の系統のマウスを使用する
こともできる。免疫処理は、それ自体公知の方法によシ
、例えば、１μｇ〜２０μｇずつの精製されたヒト−レ
ニンを含む３〜６回の注射を１〜６週間の間隔で、好ま
しくはリンｉ４球の生成を刺激する添加物、例えば完全
又は不完全フロインドアジュバントと共に、非経腸的に
、例えば腹腔内に、静脈内に及び／又は皮下に行うこと
Ｋよシ実施される。 最後の（追加）免疫処理の２〜６日間後、動物から免疫
された動物の抗体産生細胞、好ましくは牌細胞を採取し
、そして融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄
腫細胞と融合せしめる。幾つかの異る骨髄腫セルライン
及びそれらから誘導されたセルラインが適切な融合のパ
ートナ−として知られている。酵素ヒＩキサンチンーグ
アニンーホスホリ？ジルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ
Ｔ　）又は酵素チミジンキナーゼ（ＴＫ）を欠いておシ
、そしてそのためにヒボキサンチン、アミノグチリン及
びチミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）中で生存
しない腫瘍細胞が好ましい。ＨＡＴ培地中で生存せず、
そして免疫グロブリン又はその部分を分泌しない骨髄腫
細胞及びそれから調製されたセルライン、例えばセルラ
インＸ６３−Ａｇ３．６５３、及びＳｐ　２１０−　Ａ
ｇ　１４が特に好ましい。融合促進剤として、場合によ
ってはＵＶ−不活性化された形のセンダイウィルス又は
他のパラミクソウィルス、カルシウムイオン、界面活性
リピド、例えばリソレシチン、又はポリエチレングリコ
ールが考慮される。骨髄腫細胞を、好ましくは、１００
０〜４００００分子量を有する３０〜５０チのポリエチ
レングリコールを含有する溶液中で、免疫された動物か
らの肺臓細胞の３〜２０倍過剰量と融合せしめる。 融合後、細胞を分配しそして選択ＨＡＴ培地中で培養す
る。この場合、ハイブリドーマは骨髄腫細胞に由来する
イン−ビトロ増殖能力と、免疫された動物の抗体産生細
胞に由来するＨＧＰＲＴ又はＴＫ遺伝子の欠失及びそれ
に伴うＨＡＴでの生存能力を合わせ持つために、ハイプ
リドーマのみが生存する。 ハイプリドーマ細胞の増殖のための適当な培地は、常用
の標準的培地、例えば１０〜１５チのウシ胎児血清が補
充されたドゥルペコ変形培地又はＲＰＭＩ　１６４０培
地である。細胞増殖の初期において、好ましくは、いわ
ゆるフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔浸出細胞、
膵臓細胞、骨髄マクロファージ等を加える。一定の間隔
で前記培地に選択ＨＡＴ培地を補充することによシ、正
常な骨髄腫細胞によってハイプリドーマ細胞が覆われる
のを回避する。 ハイプリドーマ細胞の細胞培養土清液を試験してこれが
所望のモノクローナル抗体を含有するか否かを見る。好
ましくは、細胞上精液を、表面結合ヒト−レニンへのモ
ノクローナル抗体の結合のみならず、これと同時に、さ
らに、溶解したヒト−レニンへの結合及びヒト−レニン
の酵素活性の阻害をも決定するイムノアッセイにおいて
試験するのが好ましい。驚くべきことに、表面結合レニ
ンによく結合するモノクローナル抗体がレニンの酵素活
性をわずかにのみ阻害することが見出された。異る種類
の試験方法を組み合わせることによって、ヒト−レニン
に対する高い結合親和性及び強い酵素阻害作用の両方を
有するモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ細
胞を同足することが可能である。これらのハイプリドー
マ細胞は、その均一性を保証するために、限界稀釈法を
用いてそれ自体公知の方法でクローン化する。 この発明はさらに、特に生物学的液体中のヒト−レニン
及び構造的に類似するレニ／の定量的及び定性的測定の
だめの、ヒト−レニンに対スる高い親和性を有するモノ
クローナル抗体及びその誘導体の使用に関する。例えば
、この発明のモノクローナル抗体及び抗体誘導体は、抗
原（ヒト−レニン）とモノクローナル抗体との間の結合
相互作用を用いるそれ自体公知のいずれのイムノアッセ
イにおいても使用することができる。このような測定法
の例として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザ
イムイムノア、セイ、免疫−螢光試験、ラテックス凝集
試験、又は血球凝集法が挙げられる。 この発明のモノクローナル抗体は、そのままの形で又は
放射性ラベル誘導体の形で、単独で又は組み合わせて、
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用すること
ができる。ＲＩＡの任意の公知の変法を用いることがで
き、例えば均一相でのＲＩＡ、固相ＲＩＡ又は不均−Ｒ
ＩＡ、又はシングルＲＩＡ又はダブル（サントイ、チ）
　ＲＩＡを用いてとトーレニンの直接又は間接（競争的
）測定を行うことができる。シングルＲＩＡが好ましく
、この方法においては、担体、例えばセリスチレン、Ｉ
すグロビレンもしくはポリビニルクロリド製のタイター
プレートもしくは試験管のプラスチック表面、ガラス製
もしくはプラスチック製ビーズ、Ｆ紙、又はデキストラ
ン、酢酸セルロースもしくはニトロセルロースのシート
、あるいはこれらに類似するものに１種類のモノクロー
ナル抗体、又は異るエピトープを認識する２種類のモノ
クローナル抗体の混合物を単純吸着によシ、又は例えば
グルタルアルデヒドもしくはシアノダンプロミドによシ
担体を活性化した後に被覆し、そして試験溶液及び１２
５Ｉにより放射性ラベルされた既知量のヒト−レニンの
溶液と共にインキュベートし、そして前記担体に結合し
た放射能を測定する。 サンドイッチラジオイムノアッセイが特に好ましく、こ
の方法においては、１種類又は２種類のモノクローナル
抗体によシ被覆された担体を試験溶液、及び　Ｉで放射
性ラベルされたモノクローナル抗体の溶液（この溶解し
たモノクローナル抗体は担体に結合しているモノクロー
ナル抗体が認識するヒト−レニンのエピトープとは異る
エビ、ト一）を認識する）とインキ−ベートし、そして
担体に結合した放射能を測定することにより試験溶液中
のレニンの量を決定する。第１図は、試験溶液中のヒト
−レニンの量に対する担体に結合した放射能の測定値を
示しておシ、これは例８．４に詳細に記載されているサ
ンドイッチＲＩＡによシ測定することができる。この試
験の感度は、４時間以内に、５０μノの試験溶液中のわ
ずかにｉ　ｐｇから１００９ｇ以上のヒト−レニンの信
頼性の高い定量的測定を可能にする。従って、レニンに
対する高い親和性を有するこの発明のモノクローナル抗
体を使用することによシ、生物学的液体、特に血液中に
通常存在する濃度におけるヒト−レニンの定量的測定が
可能となシ、そしてこのために、レニンによシ誘導され
る高血圧の迅速且つ信頼性の高い診断が可能となる。 この発明のモノクローナル抗体は、そのままの形で、又
は酵素に接合した誘導体の形で、単独で又は組み合わせ
て、エンデイムイムノアッセイにおいて使用することが
できる。このようなイムノアッセイには、この発明の酵
素ラベルモノクローナル抗体誘導体、この発明の抗ヒト
−レニン抗体もしくは他の抗ヒト−レニン抗体のエビド
ーグを認識しそしてそれと結合するそれ自体公知の酵素
ラベル抗体、又は酵素ラベルヒト−レニンを使用する試
験方法が含まれる。 ＥＬＩＳＡ　（エンデイムリンクドイムノアドゾルペン
トアッセイ）が好ましく、この方法においては、シング
ルＲＩＡ試験について前記した担体にこの発明の１種類
又は２種類のモノクローナル抗体な被覆し、ヒト−レニ
ンを含有する試験溶液と共にインキュベートし、そして
次にヒト−レニンに対するポリクロナール血清、例えば
ラビット血清、とインキュベートし、そして最後にポリ
クローナル血清の結合した抗体を、これを認識しそして
これに結合する酵素ラベル抗体によシ検出し、そして結
合したヒト−レニンの量を酵素−基質反応によシ決定す
る。このような酵素ラベル抗体は、例えばホスファター
ゼによシラベルされたヤギー抗−ラビット免疫グロブリ
ンである。 最も好ましいＥＬＩ　ＳＡにおいては、この発明の１種
類又は２種類のモノクローナル抗体により被覆された担
体を、ヒト−レニンを含有する試験溶液と、及び酵素と
接合したこの発明のモノクローナル抗体の溶液（この溶
解したモノクローナル抗体は、担体に結合したモノクロ
ーナル抗体が認識するヒト−レニンのエピトープとは異
るエビドーグを認識する）とインキュベートする。例え
ば色の変化をもたらしそして肉眼によシ又は光学測定装
置により観察することができる酵素−基質反応によシ、
酵素の量（これは試験溶液中のヒト−レニンの量に比例
する）を測定する。 第２図は、放出され発色した酵素基質の最大吸光におけ
る測定された光学濃度と試験溶液中のヒト−レニンの量
との関係を示しており、これは例９．３において詳細に
記載するＥＬ　Ｉ　ＳＡによシ測定することができる。 ＥＬＩＳＡの感度は、５時間以内に、５０μノの試験溶
液中１２ｇ未満から１０．Ｏｐｇまでのヒト−レニンの
信頼性の高い定量的測定を可能にする。上記の好ましい
サントイ、チＲＩＡに比べて、このＥＬＩＳＡは、同等
又はわずかに高い感度を有し、そして、放射能を測定す
る場合のような複雑な測定装置を必要とせず、そして放
射性物質を取り扱う場合に比べて厳重で寿い安全用、準
を満たせばよいという利点を有する。 この発明のエンザイムイムノアッセイにおける好ましい
酵素は、ホースラディッシュノ臂−オキシダーゼ（この
酵素は、例えば酵素基質５−アミノサリチル酸、０−７
エニレンジアミン、３．３’−ジメトキシベンズイミド
、２，２′−アジノービス−（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸等により発色させることができる
）、及び特にアルカリ性ホスファターゼ（この酵素は、
例えば酵素基’１ｌｐ−ニトロフェニルホスフェートか
らＰ−ニトロフェノールを放出する）である。 ヒト−レニンの定性的及び定量的測定のための、ヒト−
レニンに対して高い親和性を有するモノクローナル抗体
のこの発明の使用はまた、それ自体公知の他のイムノア
ッセイ、例えば螢光物質との抗体接合体又は抗原接合体
を用いるイムノフルオレッセンス試験、抗体で被覆され
たラテックス粒子もしくは抗原で被覆されたラテックス
粒子を用いるラテックス凝集法、又は抗体で被覆された
赤血球もしくは抗原で被覆された赤血球を使用する血球
凝集法、等が含まれる。 以上記載したイムノアッセイは、生物学的液体、特に血
液中のヒト−レニンの量を決定するため、そして従って
レニンによシ誘導される高血圧の診断のために使用する
ことができる。これらのイムノアッセイにおいては、活
性酵素としてアンジオテンシノーグン（レニン基質）　
ヲアンジオテンシンＩに転換するヒト−レニンの量のみ
ならず、抗体によって認識される同じ抗原決定基を有す
るすべての他の形のヒト−レニンの量を測定することが
できる。特に、記載されたイムノアッセイは、活性酵素
、不活性ヒト−レニン又はヒト−プロレニンを包含する
ヒト−レニンの全量を決定する。 イムノアッセイはさらに、霊長類レニン・、特にマルモ
セット（ｍａｒｍｏｇｅｔ　）カリスリクス・ジ五（Ｃ
ａｌｌユ月■１五−ＤＡ且りリー）のレニン、又は同一
もしくは類似の抗原決定基を有する他の動物のレニンの
測定に応用することができる。 この発明はさらに、ヒト−レニン及び構造的に類似する
レニンの測定のだめの試験キットに関し、このキットは
ヒト−レニンに対して高い親和性を鳴するモノクローナ
ル抗体及び／又はその誘導体、並び姉場合によっては付
属物を含んで成る。 ラジオイムノアッセイのためのとの発明の試験キットは
、例えば、適当未担体、この発明の１種類又は複数種類
のモノクローナル抗体の場合によっては凍結乾燥され又
は濃縮されている溶液、この発明の放射性ラベルされた
モノクローナル抗体の溶液又は放射性ラベルされたヒト
−レニンの溶液、ヒト−レニンの標準溶液、緩衝液、並
びに場合によっては、非特異的な吸着及び凝集の形成を
防止するだめの洗剤、ピペット、反応器、換算曲線等を
含む。 エンザイムイムノアッセイのためのこの発明の試験キッ
トは例えば、適描な担体、この発明の１よっては凍結乾
燥された又は濃縮された溶液、この発明の酵素ラベルさ
れたモノクローナル抗体の、酵素ラベルされたヒトーレ
ニ／の、？リフローナル抗−ヒトーレニン血清の、及び
／又はこの発明の抗−ヒト−レニン抗体もしくは他の抗
−ヒト−レニン抗体を認識しそしてそれと結合する酵素
ラベルされたモノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体の、場合によっては凍結乾燥された又は濃縮され
た溶液、固体の又は溶解した形の酵素基質、ヒト−レニ
ンの標準溶液、緩衝液、洗剤、ビ被ット、反応器、換算
曲線、色彩比較表等を含んで成る。 この発明はさらに、ヒト−レニン及び構造的に類似する
レニンのｙｒＰｌ製のだめの、モノクローナル抗体及び
その誘導体の使用に関する。例えば、ヒト−レニン及び
構造的に類似するレニンは、分離作用がモノクローナル
抗体とレニンとの間の相互作用に基くそれ自体公知の分
離法を用いて精製することができる。好ましい分離法は
イムノアフィニティークロマトグラフィーである。無機
又は有根性の適当な担体材料、例えば適当に官能化され
た形の架橋されたアガロース、デキストラン又はポリア
クリルアミドに、それ自体公知の方法により、この担体
を場合によっては活性化した後に、この発明のモノクロ
ーナル抗体又は抗体誘導体を負荷する。この目的のため
に、例えば、活性化されたエステル官能基を含有する担
体材料を水性緩衝液中に懸濁し、モノクローナル抗体の
溶液と混合し、次に未結合モノクローナル抗体を洗浄除
去し、そして担体材料の未結合反応性部位をブロックす
る。 この発明はさらに、ヒト−レニンに対する高い親和性を
有するモノクローナル抗体又はその誘導体、及び場合に
よっては医薬助剤を含んで成る医薬に関する。適当な誘
導体は、ヒト−レニンの抗原決定基に対する特異性を保
持しているモノクローナル抗体の断片、例えはＦａｂ断
片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ’）ｚ断片である。医
薬は例えば、有効量のモノクローナル抗体又はその断片
を、有機又は無機の固体又は液体の医薬として許容され
る担体と一緒に又は混合されて含んで成る。 非経腸投与、例えば筋肉内投与、又は特に静脈内投与の
ための医薬が好ましい。乙のような製剤は等張水溶液又
は懸濁液であシ、これらは所望忙よシ凍結乾燥製剤又は
濃厚製剤であって使用直前に調製される。医薬は無菌化
することができそして／又は補助剤、例えば防腐剤、安
定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整
塩及ｙ又は緩衝剤を含有することができ、そしてそれ自
体公知の方法により、例えば常用の溶解法又は凍結乾燥
法により製造される。溶液又は懸濁液は、粘度増強剤、
例えばナトリウムカルブキシメチルセルロース、デキス
トラン、ポリビニル♂ロリドン又はゼラチンを含有する
ことができる。 注射薬は常法に従って抗微生物条件下で調製し、アンプ
ル又はバイアルに充填しそして容器を密封する。 この発明はさらに、高血圧又は心臓機能不全の治療のだ
めの、ヒト−レニンに対する高い親和性を有するモノク
ローナル抗体又はその誘導体の使用に関する。 この発明のモノクローナル抗体の血圧低下作用を検出す
るために、マルモセット（−々コＬ３」Ｌ之２ビー２工
丸乙）を用いるインービが試験が使用される。 この発明のモノクローナル抗体はマルモセ、トーレニン
をヒト−レニンとｔ１ホ同程度に阻害する。 すなわち、マルモセットーレニン及びヒト−レニン中の
同一の又は類似の抗原決定基を認識し、そしてそれと結
合する。 常用の試験方法において、約３００ｇの体重を有する雄
性及び雌性の正常血圧マルモセット（ｉリス１　ス・・
　ス）に、果物を補充した正常塩餌（ＮＡＦＡＧ、　Ｎ
ａ＋：　１００　ｍｍｏ　１／に！？、Ｋ”：２５０ｍ
ｍｏ　１／に９）を供与する。レニンの内因性放出を７
０セミドの静脈内封（５１＃／ｋｇ）Ｋより刺激する。 ４５分間後にモノクローナル抗体をカテーテルを介して
測量静脈に注入し、そして血圧及び心搏数に及はすその
効果を大腿動脈中のカテーテルによシ測定する。モノク
ローナル抗体を注射した２時するテグロチド（ｔｅｐｒ
ｏｔｉｄｅ　）を注射（１＃／Ｉｆ）し、そして血圧Ｅ
ＭＳ！すその効果を観察する。対照実験において、この
発明のモノクローナル抗ヒト−レニン抗体の代シにｌ　
ｍｌ／に９の生理的食塩水、又は非特異的モノクローナ
ル骨髄腫抗体ＭＯＰＣ２１（０，１１Ｖ／に！？　）を
注射する。 これらの実験条件下で、モノクローナル抗体Ｒ３−３６
−１６をＯ，Ｑ　ｌ　ｗｖ′に９　Ｇり投与量で１回静
脈内投与することによシ、心搏数の変化を伴わないで、
血圧が１８±５　ｍｍＨｇ　（ｎ＝４　）、２時間にわ
たって低下する。３０分間にわたり血漿レニン活性が完
全に阻害される。抗体を投与した後のテプロチドの注射
は血圧の追加の低下をなんら生じさせない。モノクロー
ナル抗体ｇ３−３６−１６の一層高い投与量（０，１〜
Ｍ１．マ、）は心搏数に影響を与えること々く同様の血
圧低下作用を示し、そして一層低い投与量（０，００１
■＃ｉ、ｖ、）は効果を有しない。 次に例によシこの発明をさらに具体的に説明すスーイ日
りとれによりとの登明の節回を限宗する本のではない。 例において使用する略号は次の意味を有する。 ８ＢＡ　：ウシ血清アルブミン； ＥＬＩＳＡ：エンザイムアッセイ（エンデイムリンクド
イムノアドゾルベントアッセイ）；ＨＡＴ’：ヒボキサ
ンチン／アミノグチリン／チミジン； ＩＣ５０：５０％の阻害が観察される濃度；ＰＢＳ　：
燐酸緩衝化生理的塩溶液； ＲＩＡ　ニラジオイムノアッセイ； ＳＤＳ　：　ドデシル硫酸ナトリウム；ｔｒｉｓ　：　
）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン； 単位 Ｍ　：ｍｏＡ／ｌ；、 ＧＵ：ゴールドブラット（Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ　）単位
；〕・イ千と宇ミロ 例１．　ヒト−レニンの精製 ヒト−レニンをヒト腎臓から得、そして免疫吸着法を用
いるそれ自体公知の方法にょシ精製する。 １ｋｇの機械的に細断した腎臓を水で抽出し、そして硫
酸により　ｐＨ２，８に酸性化する。ＮａＣ２濃度を０
．８Ｍに調整し、そしてレニンを硫酸アンモニウム（最
終濃度２．３Ｍ）にょ９沈澱せしめる。この沈澱ｔ−０
，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析する。蛋
白質〜当１１．１３Ｇυのレニン濃度を有する。サング
ルをアンジオテンシノーリンの給源としてのレニン不含
血漿（ＮＥＮ、ニューイングランド・ニューフレア・ア
ンノオテンシンＩラジオイムノアッセイ・キット）と共
にインキュベートした後アンジオテンシンＩｋ測定する
ことによってレニン含ａｔ測定し、そしてレニンの標準
（ＭＲＬ。 国際参考標準６８／３５６〔５〕）と比較することによ
ってゴールドプラット単位（ＧＵ）で表現する。 蛋白質濃度は、クマーシープルーを用いて着色し、そし
て標準としてのウシ血清アルブミン（ＢＡＡ　）と比較
することによシ決定する。 透析された腎臓抽出物を、６−のアシイーグル（Ａｆｆ
ｉ−Ｇｅｌ　）　１０　（商標）（ビオラド）に結合し
７’ｃ３８■のモノクローナル抗−ヒトーレニン抗体Ｆ
１５（クリンーミディー、モントベリア）［：６）を含
むイムノアフィニティーカラムに導入する。 血漿の未結合成分ｔ−０，１Ｍ燐酸緩衝液で洗浄除去し
、そして結合したレニンｔｏ、ＩＭクエン酸／燐酸緩衝
液（Ｉｋ４４．５）で溶出する。溶出液をアミコン−Ｐ
Ｍ−１０（商標）膜上で濃縮し、ＰＢＳ　（燐酸緩衝化
塩溶液）で稀釈し、凍結し、そして−８０℃にて保持す
る。こうして、粗腎臓抽出物中に存在するレニンの約７
０係を得る。このものは４００Ｇｔ／膚の比活性全刹し
、これは３０００倍濃縮に相当する。標品の純度は５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び高圧成体クロ
マトグラフィーによシ分析する。純度は８０％よシ高い
と算定される。 ｎ・ｌｈ／ｅマウスｔ、下記のようにして、例１からの
精製ヒト−レニンによシ免疫する。 マウス１及び２に、完全フロインドアシュパン）　（Ｃ
ＦＡ　）中１０　ＧＩＪ　（およそ１０　ｔｉｌｌに相
当する）のレニンを、後足に２回及び皮下に２回分散し
て注射する。その後２８日目にさらにＰＢＳ中２Ｇυの
レニンを静脈内注射し、そして４６日目にＰＢＳ中５Ｇ
υのレニンを静脈内注射する。５０日目に膵臓を取シ出
し融合のために使用する。 マウス３及び４に、ＣＦＡ中２０　ＧｔＪのレニンをマ
ウス１及び２の場合のようにして分散して注射し、３５
日目に不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中２Ｇ
Ｕのレニンを皮下投与し、６０日目にＰＢＳ中２Ｇ口の
レニンを腹腔内投与し、そして７８日目にＰＢＳ中５　
ＧＵのレニンを静脈内投与する。８２日目に、イン−ビ
トロレニン活性に対抗する高い血清力価を有するマウス
（マウス３）の膵臓を取ル出して融合のために使用する
。 ２．２　細胞融合 すべての融合実験は、実質上Ｋｏ　１ｅｒ及びＭｉｌｓ
ｔｅｉｎ〔１〕の方法に従って、ｓｐ２１０−Ａｇｔ４
セルライン〔７〕を用いて行う。例２．１からの１０個
ノ牌細胞を、５０係濃度のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ　１５００．セルバ）１ｆｎｔの存在下で、１０７
個の骨髄腫細胞と混合する。洗浄後、細胞を４８−の標
準ドゥルペコ最少必須培地（ギブコ屋０４２２５０１）
に再懸濁する。フィーダー細胞として融合ごとに１５係
ウシ胎児血清及び３Ｘ１０’正常マウス腹腔浸出細胞を
加える。細胞を、ＩＷＩｇずつ４８枚のカスターグレー
トに分配する。゛培養物に、３〜６週間にわたって１日
２回、標準ＨＡＴ選択培地（１）１に供与する。バイブ
リド細胞が増殖した後、培養上清液をレニンへの結合に
ついて（例４）、及びレニン活性の阻害について（例５
）試験する。ミクロタイターグレート中での限界稀釈に
よシハイプリドーマのクローニングを行う。すべてのセ
ルラインを少なくとも２回続けてりｏ　−ニングする。 １０個の異る母培養物からのクローンを選択し、そして
増殖せしめる。Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ、マウ
ス１．２、及び３の肺細胞の融合に由来するハイプリド
ーマ細胞及びこれらの細胞から得られる抗体を示す。ク
ローン番号及び幾つかのサブクローン番号をハイホンの
後に示す（第１表）。 例３．モノクローナル抗体の分離及び精製８〜１０　週
齢ＣＩ　Ｂａ　１　ｂ／　ｅマウス（シセルンアニマル
ファーム）′ｔ″、０．３−のプリスタン（アルドリッ
チ）によシ前処理（１，ｐ’−）する。２〜３週間後、
２〜５×１０　個のクローン化ハイプリドーマ細胞及び
０．２−のプリスタンを各マウスに注射（１，ｐ、）す
る。８〜１０日間の後、マウスから繰シ返して液を採取
し、そしてこうして得られた腹水１ｓｏｏｘｙにて遠心
分離し、セしてこうして得られた透明な上清液を一２０
℃にて集める。 解凍した腹水溶液ｔ５０，０００Ｘ、９にて６０分間遠
心分離し、浮上した脂肪を除去し、そして−当Ｊ）１０
〜１２■の蛋白質濃度を確立する。蛋白質濃度は、２８
０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ２８ｏ）全測定すること
によシ決定する。標準として、０Ｄ２８０＝１２（層の
厚さ１副）のネズミ免疫グロブリンの１％濃度の溶液（
Ｗ／Ｖ）を使用する。０℃にて攪拌しながら０．９容量
の飽和硫酸アンモニウム溶液をゆっく９満願することに
よル粗免疫グロブリン画分を沈澱せしめ、これ１に２０
　ｍｍｏｌのｔｒｉｓ−ＨＣ６／　５０　ｍｍｏｌのＮ
ａＣ２（ｐＨ７，９）に溶解し、そして透析する。次に
、２０ｍｍｏｌのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＩ−１７，９）
によ９２倍に稀釈し、セして全体をＤＥＡＥ−Ｄ５２セ
ルロースカラム（ワットマン）ニ導入する。免疫グロブ
リンＧ画分ｅ２０ｍｍｏｌのｔｒｉａ−ＨＣ２／　８０
　ｍｍｏｌのＮａＣ４（ＰＩ（７，９）の緩衝液を用い
てカラムから溶出し、そして硫酸アンモニウムによシ再
度沈澱を行った後（上記参照）、ＰＢＳ　ｉ用いて蛋白
質濃度ｔｔｏｍ９／ｍｌに調整する。 モノクローナル抗体沈澱物の純度ｉ　５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いて試験する。９５チ以上
である。 細胞ハイブリダイゼーション（例２．２）後の目的モノ
クローナル抗体産生ノ・イブリドーマ細胞の選択のため
、及び精製されたモノクローナル抗体の場合にレニンへ
の結合の定量測定のために、それ自体公知のＥＬＩＳＡ
法〔８〕において、表面結合レニンへの反応性を用いる
。５０μｌの０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，６）中１１００ｎの精製レニン（例１）ｔ−プラ
スチックミクロタイタープレート中で３７℃にて２時間
及び４℃にて１５時間インキュベートする。ＰＢＳで洗
浄した後、プラスチック表面上になお存在する蛋白質反
応性部位を、１５０μｌのＰＢＳ−）ウィーン（商標）
緩衝液（０，２％ＮａＮ３’ｉ：含有するＰＢＳ中０．
０５％）ウィーン、ｐｌ−１７，４）と共に３７℃にて
２時間インキュベートすることによジ飽和し、そしてこ
のプレートをＰＢＳで洗浄する。モノクローナル抗−レ
ニン抗体について測定すべき溶液（細胞培養土清液又は
精製されたモノクローナル抗体溶液）及びその対応稀釈
物１００μｌ’Ｆｃ３Ｔ℃にて２時間インキュベートし
、そしてグレート全洗浄した後、結合したモノクローナ
ルマウス抗体ｔ、ホスファターゼでラベルされたラビッ
トＩｇＧ抗−マウス免疫グロブリンの標品の対応してあ
らかじめ定められた稀釈を行ったもの１００μノと共に
インキュベートすることによシ検出する。酵素基質ｐ−
ニトロフェニルホスフェートの溶液（０，５ｍｍｏｌ　
（ＤＭｇＣ１２１に含有する１０係ジエタノールアミン
緩衝液中１〜／−、Ｐｌ’１９．８　）　１００μｌと
共にインキュベートしく３０分間、３７℃）、そして反
応生成物０Ｏ４０５ｎにおける光学濃度（ＯＤ４ｏ５）
ｔ−マルチスキャンフォトメーター（フローイルビン、
スコツトラント）ｔ−用いて測定することによシ、取９
上けられた酵素の量を決定する。対照として、モノクロ
ーナル抗−レニン抗体を含有する溶液の代夛に、非−特
異的モノクローナル対照抗体ＭＯＰＣ２１の標品（ピオ
ネティクスラプス、ケンシントン・米国）、及びホスホ
リルコリンに対して特異的なモノクローナルハイプリド
ーマ抗体の標品を使用する。 表面結＆　ヒ）−レニンを用いるこの測定において０．
１の０Ｄ４０５　ｔ”もたらす精製モノクローナル抗体
の濃度を第１表に示す。見だされた濃度は５．８×１０
〜７．５Ｘ１０　Ｍの範囲内にあシ、この測定において
もモノクローナル対照抗体は１０−’Ｍのオーダーの値
をもたらすから１０　Ｍより高い濃度は特異的結合を示
ざない。固定されたレニ／への特に効果的な結合（ＥＬ
ＩＳＡ　）がモノクローナル抗体Ｒ３−１７−７及びＲ
３−１７−８の場合に認められたが、モノクローナル抗
体Ｒ３−４８、Ｒ３−２１、及びＲ３−２７も５Ｘ１０
−１０Ｍよシ低い濃度において結合した。 溶解レニンに対する反応性を決定するために、５０μｌ
のＲＩＡ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ　、　０．２％Ｎ
ａＮ３．ｐ）（７，４）中モノクローナル抗体サンプル
の種々の稀釈物に、同し緩衝液中１２５ニーラベル−レ
ニン（２，５ｎＪＦの蛋白質に相当する８００００ｅｐ
ｍ。 例８．ｔ）ｓｏμｌを加え、そしてポリビニルクロリド
ミクロタイタープレート中で３７℃にて２時間・及び４
℃にて１５時間インキュベーションを行なシ。３％ポリ
エチレングリコール６ｏｏＯ中対応する稀釈のラビット
−抗−マウス免疫グロブリン血清５０μノを添加し、そ
して３７℃にて３０分間及び４℃にて３０分間インキュ
ベートすることにより、モノクローナル抗体を免疫複合
体の形で沈澱せしめて、抗体結合１２５Ｉ−レニンの請
求める。 沈澱物を懸濁及び遠心分離によ多数回洗浄し、そしてタ
イターグレートを切断した後ガンマ−カウンター中で放
射能を測定する。１５Ｉ−レニン含有溶液から最大沈澱
可能放射能の５０ｑｂを沈澱せしめる精製モノクローナ
ル抗体の濃度（ＩＣ５０）が溶解レニンへの結合の測定
値であシ、これを第１表に示す。モノクローナル抗体Ｒ
３−３６−１６、及びＲ３−４７は、ＥＬＩＳＡ　（例
４．１）においては表向結合レニンに対してわずかな親
和性を示すのみであるが、溶解したレニンに対しては特
に強く結合する。 アンジオテンシノーグンを含有するレニン不含正常ヒト
血漿に精製ヒト−レニン（例１）を補充してレニン濃度
を２５０ｐＩ！／−とする。それぞれの場合に５０μｌ
ずつのこの前処理された血漿を、４℃にて２時間及び３
７℃にて１時間にわたり、５０μｌのＯ，１Ｍｔｒｉｇ
−酢酸緩衝液（ＰＨ７，４）中種種の稀釈の分析される
べきモノクローナル抗体サンプルと共に、アンジオテン
シンエのアンジオテンシン川への転換をブロックする２
、３−ジメルカプ）−１−フロパノール及び８−ヒドロ
キシキノリンの存在下で、インキュベートする。４℃に
冷却することによシ酵素反応を停止する。生成したアン
ジオテンシンＩの駄ｔｌ−ＲＩＡ　（ＮＥＮ　、ニュー
イングランドニュークレアアンジオテンシン■ラジオイ
ムノアッセイキット）を用いて決定する。この目的のた
めに、サンプルに１２５ニーラベル−アンジオテンシン
ｌ−トレーサー及びアンジオテンシンＩに対する抗血清
の対応量ヲ加え、そして４℃にて１５時間インキ−ベー
トした後、未結合アンジオテンシンＩｔ−活性炭素上に
吸着し、セして上清中の抗体結合１２５Ｉ−ラベル−ア
ンジオテンシンｉガンマーカウンターで測定する。この
系において、陽性対照（モノクローナル抗体を伴わない
サンプル）は１０　ｎＪ／ｄ時のアンジオテンシンＩを
もたらす。 ヒト−レニン活性の最大阻害の５（ｌが観察される精製
モノクローナル抗体濃度（ＩＣ５０）″４１．第１表に
示す。この値は１０−’　Ｍ以上から１．３×１０−”
　Ｍの範囲である。モノクローナル抗体Ｒ３−１７−７
及びＲ３−４８は、ＥＬＩＳＡ（例４．１）［オイてレ
ニンに強く結合するが、レニン活性を有意に１５１１害
しない。モノクローナル抗体Ｒ１−１９，Ｒ１−２０、
Ｒ３−１７−８、Ｒ２−１２、及びＲ３−２１は、レニ
ン活性の有意であるが弱い阻害を示す。モノクローナル
抗体Ｒ３−２７，Ｒ２−１、並びに特にＲ３−４７、及
びＲ３−３６−１６の場合にレニン活性の顕著な阻害が
認められる。 モノクローナル担体Ｒ３−２１及びＲ２−１は試験した
全濃度範囲（１０＝Ｍまで）にわたって６０％以下のみ
のレニン阻害を示し、他方Ｒ３−２７はわずかに３５％
の最大阻害を示す。これらノモノクローナル抗体は、お
そらくレニ７（Ｄ活性中心の近傍に存在するであろう抗
原決定基（エビ）−７’）？認識しそしてこれに結合す
る。これらの結合によシ、これらは立体的影響の結果と
して酵素活性を低下せしめ、又は一層小さい基質交換数
をなお許容するレニン分子のアロステリック配置を促進
する。強く阻害するモノクローナル抗体８１−１９及び
ＥＬｌ−２０は、他方において、高濃度においては最大
の親゛和性を有するモノクローナル抗体Ｒ３−４７及び
８３−３６−１６と全く同様に、レニンを完全に阻害す
る。 以下余白 ５．２　ヒト−レニンに対する結合及びヒトーレ二上記
のモノクローナル抗体はその結合性及び阻害性に関して
４つの異るグループに分けることができる。原理的に、
レニンに結合するだけのモノクローナル抗体、及びレニ
ンに結合しそして同時にその酵素活性を低下せしめるモ
ノクローナル抗体が予想される。グループ１（第１表）
は、レニ／と結合するがその触媒活性を阻害しないか非
常に弱く阻害するにすぎないモノクローナル抗体から成
る。これらのモノクローナル抗体はさらに、浴液中レニ
ンに対するこれらの親和性（ＲＩＡ）に比べて５表面結
合レニンに対する２０倍以上高い親和性（ＥＬＩＳＡ　
）　’に示す。他のすべてのグループのモノクローナル
抗体は表面結合レニンに対する好みを示さない。グルー
プ２のモノクローナル抗体は低い濃度においてもレニン
活性を阻害するがその阻害は部分的にすぎない。すなわ
ち、モノクローナル抗体に特徴的なあるパーセントでの
み阻害する。グループ３は、非常に低い濃度においてさ
えレニン活性を完全に阻害するモノクローナル抗体から
成る。これらの抗体は同時Ｋ、１〜３×１０１０の低濃
度において溶解したレニンに結合する。興味あることに
は、これらの抗体は表面結合レニンとわずかに結合する
に過ぎない。従って、これらのモノクローナル抗体はＥ
ＬＩＳＡ法に基礎を置く常用の一層スクリーニングにお
いては検出されないだろう。グループ４は、レニン活性
を完全に阻害するがグループ３のモノクローナル抗体よ
りも約１０００倍弱いモノクローナル抗体からなる。 さらに、これらは表面結合レニン（ＥＬＩＳＡ）及び８
％レニン（ＲＩＡ）におよそ同等に結合する。しかしな
がら、ＥＬＩＳＡにおける結合（約１０　Ｍ）は非特異
的モノクローナル抗体のそれと有意に異らない。 ５．３　ラット及ヒマルモセットーレニン活性の阻害の
測定 例５．１に記載したのと同様の方法で、分析されるべき
モノクローナル抗体サンプルをラット−レニン及ヒマル
モセットーレニンの活性のＩＩ害について試験した。し
かしながら、この目的のために、処理されたヒト血漿の
代シに、未処理ラット及びマルモセット血漿、すなわち
正常量のアンノオテンシノーグン及びレニンを含有する
ラット血漿及びマルモセット血漿を用いる。 第１表に挙けたモノクローナル抗体はいずれもラット−
レニンを阻害しない。 モノクローナル抗体Ｒ３−２７，８３−３６−１６゜Ｒ
３−４７、及びＲ１−２０は、ヒト−レニンと同程度に
マルモセットーレニンを阻害する（同じＩＣ５０値）。 従って、対応するモノクローナル抗体によりｇ識される
決定基は、ヒト−レニン及びマルモセットーレニンにお
いて同一であるか、又は少なくとも非常に類似している
。モノクローナル抗体Ｒ３−３６−１６、及びＲ３−４
７はヒト−レニンを非常に効果的に阻害する（第１表）
から、酵素ヒト−レニンとマルモセットーレニンの触ｍ
ｓ位。 類似性が示される。 モノクローナル抗体ａｌ−１９は、ヒト−レニンの活性
を阻害するのよりも３倍低い濃度（ＩＣ５０）において
マルモセットーレニンの活性を阻害する。 従って、このモノクローナル抗体は、免疫処理（例２．
１）のために使用されなかった分子と一層よく反応する
。 モノクローナル抗体Ｒ２−１は、ヒト−レニンの活性を
阻害するのよシも１５倍高い濃度（ＩＣ５０）において
のみマルモセノトーレニンの活性を阻害する。従って、
このモノクローナル抗体は、マルモセットーレニン及び
ヒト−レニンにおいて類似ではあるが同一ではない決定
基を認識する。 モノクローナル抗体Ｒ３−２１，８２−１，及びＲ３−
２７の場合に高濃度においてさえ観察されるヒト−レニ
ンの明らかに部分的な阻害（第１表最下８）Ｕ、マルモ
セソトーレニンについてモ同様に認められる。 クローン化ハイブリドーマ細胞によシ産生されたモノグ
ローナル抗体のクラス又はサブクラスをＥＬＩ　ＳＡに
おいて決定する。ミクロタイターゾレートをそれぞれ、
５０μノのＰＢＳ中クチクラス特異的サブクラス特異的
血清のラビット免疫グロブリン標品１μｇによシ被覆し
、プレートの遊離結合部位ｌ　ＲＩＡ緩衝液（ＰＢＳ中
１９６　ＢＳＡ、　０．２％ＮａＮ　５、−７．４）に
よって飽和し、そして分析すべきサンプルをウェル中で
３７℃にて１時間インキュベートする。プレートを洗浄
した後、結合したモノクローナルマウス抗体金、グレー
トの被覆に使用した血清標品のホスファターゼ−ラベル
−ラビット免疫グロブリンの標品と共に３７℃にて１時
間インキュベートし、そして取シ上けられた酵素の鼠を
例４．１に記載したようにして゛決定する。この結果を
第１表に示す。 ６．２　アミノ酸配列の分析 モノクローナル抗体を４−ジメチルアミノ−４′−イオ
ドアセタミドーアゾベンゼンを用いて誘導体化し、そし
てセファロースＧ−１００カラムを用いるクロマトグラ
フィーによりヘビー鎖とライト鎖を分離する。電気透析
によ９画分をグルから浴出し、そして公知の方法

〔９〕
により、ペックマン８９０６シーケンサーでのアミノ酸
配列分析Ｋかける。 モノクローナル抗体Ｒ３−３６−１６のライト鎖のＮ一
端アミノ酸配列（２８〜３８位の第１超可変領域を含む
）は次の通シである。 Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−８
ｏｒ−Ｐｒｏ−８ｏｒ−０ Ｓｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−
（Ａｒｇ）−Ｇｌｎ−（Ａｒｇ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ（１
ｅ−８ｅｒ−Ｃｙ＋−（Ａｒｇ）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇ
ｌｕ−８ｅｒ−Ｖａｌ−（Ａｓｐ）−８ｅｒ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｙ−Ｔｒｐ−Ｔ
ｙｒカッコ内のアミノ酸は明確には知られていない。 Ｘ及びＹは特定されていないアミノ酸である。 例７．モノクローナル抗体の交差阻害の決定ミクロタイ
タープレートを、例４．１と同様にして、ウェル当Ｊ１
５０Ｊのモノクローナル抗体が結合するように、グルー
プト３のモノクローナル抗体（第１表）によシ被覆する
。グループト３からの同じモノクローナル抗体又は異る
モノクローナル抗体の３μｇ（２０倍過剰）Ｆｉｏμｌ
の溶液中５ｎｇの　ニーラベル−レニン（例８．１）と
４℃にて１５時間又は３７℃にて４時間前インキエペー
トし、セして次に被覆されたミクロタイタープレートの
ウェル中で３７℃にて２時間及び４℃にて１５時間イン
キュベートする。次にグレート１−洗浄し、そして放射
能を測定することによシ結合したレニンを決定する。 この交差阻害実験の結果を第２表に示す。表面結合モノ
クローナル抗体へのレニンの結合が、溶液中同じモノク
ローナル抗体との前インキーベーションによシ完全に（
９５％以上）阻害される（第２表対角線）。モノクロー
ナル担体Ｒ３−３６−１６及びＲ３−４７は相互に完全
に阻害し、従ってレニン分子上の同一のエピトープを認
識する。 Ｒ３−２７と交差反応するモノクローナル抗体Ｒ３−２
１は同様にモノクローナル抗体Ｒ３−１７−７によ）交
差反応されるが、Ｒ３−２７とＲ３−１７−７とは相互
になんらの効果も有しない。従ってこれら３種類のモノ
クローナル抗体はレニン分子上の部分的にオーバーラツ
プする続く複数のエピトープ會認識する。他のすべての
抗体の対は相互効果を示さない。従ってこれらのモノク
ローナル抗体はレニン分子上の空間的に離れたエピトー
プと結合する。 Ｊシ！、下余白 例８．血漿中のヒト−レニンの測定のためのラジ例１か
らの１０μｇのヒト−レニンを、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ及
びＨｕｎｔｅｒ　（，１０１の標準法に従って、■−ヨ
ウ化ナトリウム（０，３ｍＣ）及びクロラミンＴを用い
てヨウ素化する。反応生成物をイオン交換カラムビオラ
ドＡＧ（商標）１×８上で精製し、セしてＰＢＳによシ
活性１．６　Ｘ　１０　ｃｐｍ／艷に調整する。 ８．２　シングルＲＩＡによるヒ）−Ｌｚ：ンノ測定）
ｉ＜　ＩＪ　ヒニルクロリドミクロタイターグレート（
ダイナチク・ラプス社）を、１０μｇ／−ずつのモノク
ローナル抗体Ｒ２−１及びモノクローナル抗体Ｒ３−２
７を含有するＰＢＳ中溶液１００μｌと共に３７℃にて
２時間及び４℃にて１５時間インキュベートすることに
よシ被覆する。このグレー）ｉＰＢｓで洗浄し、そして
なお存在する蛋白質反応性部位金、２２５μｌのＲＩＡ
緩衝液（Ｐｕｓ中１％ＢＳＡ、０．２％ＮａＮ５　、ｐ
１′１７．４　）と共に３７℃にて２時間インキュベー
トすることにより飽和する。 レニン不含ヒト血漿１０係を含有するＲＩＡ緩衝液中試
験溶液の１連の稀釈物及びレニン標準溶液それぞれ場合
に５０μノずつをミクロタイタープレートのウェル中に
導入し、例８．１からの　Ｉ−フベルーレニンの溶液５
０μ／（２，５℃ｇに相当する８　０．０００　ｃｐｍ
　）を加え、そして３７℃にて２時間及び４℃にて１５
時間インキュベーションを行う。 プレー）ｉＰＢｓで洗浄し、そして放射能を測定する。 試験溶液中のヒト−レニンの濃度金、標準溶液を用いて
作成した換算曲線によシ決定する。 同様にして、ミクロタイターグレートを１種類のモノク
ローナル抗体によシ、又は異るエビ）　−プ（第２表）
全認識２ｆｍ類のモノクローナル抗体によシ被覆し、セ
してシングルＲＩＡのために使用する。 ｓ、　３１２５１によるモノクローナル抗体Ｒ３−３６
−１６のラベル化 例８．１と同様にして、３０μｓのモノクローナル抗体
Ｒ３−Ｒ３−３６−１６ｅ１２５Ｉ（１によｐヨウ素化
し、そして精製する。 モノクローナル抗体Ｒ３−２７？同様にしてレベルする
。 ８．４　サンドイッチＲＩＡによるヒト−レニンの測定
例８．２と同様にして、ミクロタイタープレートをモノ
クローナル抗体Ｒ３−２７の溶液（１０μＩ／ｆｎｌ）
１５０μｌによシ被覆し、そして蛋白質反応性部位を飽
和する。レニン不含ヒト血漿中試験溶液（例えは、患者
からの血漿）のｌ連の稀釈物又はレニン標準溶液５０μ
！、５０μｌのＲＩＡ緩衝液、及び例８．３からの１２
５Ｉ−ラベル−抗体Ｒ３−３６−１６の溶９５０　ｆｉ
ｌｌ　（６ｎ、！ｉ’に相当する１２０，０００ｃｐｍ
）を、ミクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて
２時間及び４℃にて１５分間インキュベートする。シレ
ーｋｉＰＢｓで洗浄し、そして放射能を測定する。試験
浴液中のヒト−レニンの濃度を、標準溶液を用いて作成
した換算曲線（第１図）によシ決定する。 この試験の感度は、５０μｌの試験溶液中１　ｐｙのヒ
ト−レニン（２０ｐｇ／ｍｔ）の測定を可能にする。レ
ニン１〜１００ｐ＆（５０μｌのサンプル中）の全範囲
にわたって直線関連が存在する。 同様にして、モノクローナル抗体Ｒ２−１又はＲ２−１
とＲ３−２７との混合物がミクロタイタープレートの被
覆に使用される場合、あるいは抗体が相互に交換される
場合、すなわちモノクローナル抗体Ｒ３−３６−１６が
被覆のために使用され。 そして例ｔは１２５■−ラベル−モノクローナル抗体Ｒ
３−２７が検出のために使用される場合にも、ヒト−レ
ニン’ｔ−Ｉ１１定することができる。 ８．５　シングルＲＩＡのための試験キット例８．２に
記載したシングルＲＩＡのための試験キットは次のもの
を含む。 Ｑポリビニルクロリドのミクロタイターグレート；〇七
ツクローナル抗−ヒトーレニン抗体Ｒ２−１及びＲ３−
２７の溶液（それぞれ１０　ｔｔ＆／ｍｔｔ）　２ｔｎ
１．；Ｑ燐酸緩衝化生理的塩溶液（ＰＢＳ）　１００　
ｍｌｌ　；ＱＲＩＡ緩衝ｇ（ｐＢｓ中１％ＢＳＡ、０．
２％ナトリウムアシド）ｘｏｏ−； ○レニン不含ヒト血漿２−； ０活性１．６　Ｘ　１０６ｃｐｍ／−の１２５Ｎ’−ラ
ベル−ヒト−レニンの浴液２−； ○レニン不含ヒト血漿中２Ｏｎ５’／−のヒト−レニン
を含有する標準溶液２ｍｌ； Ｏ換算曲線。 ８．６　サンドインチＲＩＡ用試験キット例８．４に記
載したサンドイッチＲＩＡ用試験キットは次のものを含
む。 ○ポリビニルクロリドのミクロタイタープレート；０−
ｆ＝／ｌローナル抗−ヒト−レニン抗体Ｒ３−２７の溶
液（１０μｙ／ｍｅ）６ｍｌ：Ｏ燐酸緩衝化生理的塩溶
液（ＰＢＳ）　１００　ｄ　；ＯＲＩＡ緩衝液ＣＰＢＳ
中１％ＢＳＡ　、　０．２％ナトリウムアット）１００
ゴ； ○レニン不含ヒト血漿２　ｍｌ　＋。 ○活性２．４　Ｘ　１０６ｃｐｍ／−の１２５■−ラベ
ル−モノクローナル抗−ヒトーレニン抗体Ｒ３−３６−
１６（例８．３）の浴液２−； Ｑレニン不含ヒト血漿中２０ｎＪ７／ｍｇのヒト−レニ
ンを含有する標準溶液２−； ○換算臼ｉ（第１図）。 例９．血漿中ヒト−レニンを測定するための二ンいるＥ
ＬＩＳＡ 例８．２と同様にして、ミクロタイタープレートを、１
０μｙ／−のモノクローナル抗体Ｒ３−３６−１６を含
有する溶液１００μｌにより被覆し、そして蛋白質反応
性部位を飽和する。このプレー）１１０係のレニン不含
ヒト血漿を含有するＲＩＡ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ
　、　０．２％ＮａＮ５　、ｐＨ７，４）中試験溶液の
一連の稀釈物又はレニン標準溶液いずれも５０μｌと共
に３７℃にて２時間インキュベートし、そして洗浄し、
そして次に１　：５００の比率で前稀釈しておいたポリ
クローナルラビット抗−ヒトーレニン血清［１１）５０
μノと共に３７℃にて１時間インキュベートする。プレ
ートラ洗浄した後、結合したラビット抗体を、１　：　
１ｏｏｏの比率で前稀釈しておいたホスファターゼ−ラ
ベル−ヤギ抗−ラビット免疫グロブリンの標品と共にイ
ンキュベート（３７℃にて１時間）することによシ検出
スる。ｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液（０，５
ｍｍｏｌのＭｇＣｌ２を含有する１０％ジェタノールア
ミン緩衝液中１７Ｗ／ｄ　、　ｐＨ９，８）　１００μ
ノと共にインキュベート（３７℃にて３０分間）した後
、結合した酵素がｐ−ニトロフェノールを放出せしめる
。４０５ｎｍにおける光学濃度を測定することにより放
出されたｐ−二トロフェノールの量を決定する。この量
は結合した酵素ホスファターゼの量に比例し、そして従
って試験溶液中のヒト−レニンの社に比例する。 モノクローナル抗体Ｒ２−１もしくは８３−２７゜又は
２種類のモノクローナル抗体の混会物をミクロタイター
プレートの被覆のために使用する場合、同様にしてヒト
−レニン全測定することができる。 １．４−のＰＢＳＢｉ１２りのモノクローナル抗体Ｒ３
−３６−１６を、グルタルアルデヒド（ｏ、２ｖ　／ｖ
　％　）を用いてＶｏｌｌｅｒ等〔１２〕の標準的方法
に従って、５■のアルカリ性ホスファターゼ（ＳＩＧＭ
Ａ−Ｐ６７７４　、タイプ■−Ｔ）を含有する溶液と、
２時間にわたシカツブリングせしめ、そして１ｍｍｏｌ
のＭｇＣ／！、２．１　％　＋７）　ＢＳＡ及び０．０
２％のＮ　ａＮ　ｓを含有するｔｒｉｓ緩衝液（０，０
５Ｍ　、　ｐＨ８，０）５−に導入する。この溶液を暗
中４℃にて保持する。 ９．３２種類の異るモノクローナル抗体を用いるＥＬＩ
ＳＡ ポリエチレン性ミクロタイターｆ　＋／　−）　（ダイ
ナチク・ラズス社）を、緩衝液（Ｐ）１８．６）（０，
０２係のナトリウムアジドを含有する炭酸塩緩衝化０．
９チ食塩浴液）中モノクローナル抗体Ｒ３−２７（１０
μＦ／ｍ／りの溶液１５０μＪにより３７℃にて２時間
被覆する。このグレー）　ｉ　ＰＢＳによシ５回洗浄し
、そしてなお存在する蛋白質反応性部位全２５０μｌの
ＰＩＡ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．２チＮａＮ５
　、ＰＨ７，４）と共に３７℃にて１時間インキュベー
トすることにより飽和する。 レニン不含ヒト血漿中試験溶液（例えは、患者の血漿）
の一連の稀釈物又はレニン標準溶液いずれも５０μノ、
５０μｌのＲＩＡ緩衝液、及びＲＩＡ緩衝液によＬｌ：
１００に稀釈しておいたホスファターゼ−ラベル−抗体
Ｒ３−３６−１６（例９．２）の浴液５０μノを混合し
、そしてミクロタイタープレートのウェル中で３７℃に
て２時間及び４℃にて３０分間インキュベートする。こ
のプレートをＰＢＳで５回洗浄し、そしてｐ−ニトロフ
ェニルポスフェートの溶液１５０μ４と共にインキュベ
ート（３７℃にて３０分間）した後、結合した酵素を例
９．１に記載したようにして測定する。試験溶液中のヒ
ト−レニンの濃度を、標準溶液を用いて作成した換算曲
線（第２図）によシ計算する。 このＥＬＩＳＡの感度は、５０μｌの試験溶液中１ｐｇ
（２０ｐｙ／１ｎｔ）未満のヒト−レニンの測定を可能
にする。レニン１〜１００ｐＩＩ（５０μ）のサンプル
）の範囲において直線関係が存在する。 ９．４　ＥＬＩＳＡ用試験キット 例９．３に記載し７’ｎＥＬＩＳＡ用試験キツトは次の
ものを含む。 ○ポリゾロピレン製ミクロタイタープレート；００．０
２％のＮａＮ３　’ｌ：含有する炭酸塩緩衝化（０，０
７２９／ｌのＮ　ａ　２　ＣＯｓ及び４．２１／ｌのＮ
ＩＬＨＣＯ３）　０．９　％塩溶液中モノクローナル抗
−ヒトーレニン抗体Ｒ３−２７（１０μＩ／−）の溶液
６−； ○燐酸緩衝化生理的塩溶液（ＰＢＳ）　１００　ｒｎｔ
：○ＲＩＡ緩衝液（ＰＢＳＢｉ１２Ｉｙ　ＢＳＡ　、０
．２　％　ＮａＮｇ　）１００ｔｎｔ： ○レニン不含ヒト血漿２ｄ； ０ｔｒｉｓ緩衝液（０，０５Ｍ　、　ｐＨｓ、ｏ　、　
１　ｍｍｏｌのＭｇＣｌ２．１　％のＢＳＡ　、　０．
０２％のＮａＮ５　）中アルカリ性ホスファターゼーラ
ベル−モノクローナル抗−ヒトーレニン抗体Ｒ３−３６
−１６の溶液（抗体濃度０．３１Ｗ／ｍ／り　０．２ｄ
；○ジェタノールアミン緩衝液（１０％のノエタノール
アミン、０．５ｍｍｏｌのＭｇＣｌ２．０．０２　％の
ＮａＮ３．ＨＣｌによ、９　ｐＨ８，９に調整）中ｐ−
ニトロフェニルホスフィートの溶液（１ｍｐ／＋＋＋／
　）１０ｆｎｌ；Ｑレニン不含ヒト血漿中２０ｎＪ／ｄ
のヒト−レニンを含有する標準溶液２−； Ｏ換算曲ｌＲ（第２図）； ○放出されたｐ−二トロフェノールの量を肉眼的に決定
するための色度スケール。 アフイーグル（商標）１０（ビオラド）ｔ−製造者の指
示に従って冷蒸留水及びカップリング緩衝液Ｐ’　８．
０　（０−Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　溶液）で洗浄する。 カップリング緩衝液（１−）中グルの５０％濃度の懸濁
液全プラスチックチューブに導入し、そして１０■の蛋
白質を含有する精製モノクローナル抗体浴液の同容域と
混会し、そして混合物を室温にて４時間回転せしめる。 次にグルをカップリング溶液で洗浄する。なお遊離して
いる活性部位をブロックするために、グルを１−のグル
当シ０，１ｍｌの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐ１
４８．０）によシ室温にて２時間処理し、次にＰＢＳ　
（１０ｍｍｏｌのナトリウムアットを含有する）で洗浄
し、そしてその中に４℃にて保持する。カンシリングの
程度を、２８０ｎｍにおける光学濃度全測定することに
よって決定する。１　ｍｌのグル当シ約８ｍｇのモノク
ローナル抗体である。 １０．２　マルモセット又はヒトーレニンノ精製モノク
ローナル抗体Ｒ２−１’に用いて例１０，１に従って調
製したアミノアフィニティーグル１００μｌｋ、５−の
ファルコンチ５．−プ中で、マルモセット（カリスリカ
ス・ジャカス）からの腎臓抽出物１−と共に、定期的な
振とうを伴って室温にて３０分間インキュベートする。 上清を除去し、そしてグル′（ｉ：ＰＢＳで洗浄し、セ
して１−のグリシン塩酸緩衝液ｐｉ−１３，０により抽
出する。抽出物ｅｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８，５により中和
する。こうして、粗抽出物中に存在するレニンの７０％
（５〜６ｎＪｉ’）ｋ純粋な形で得る。 同様にして、ヒト−レニンを精製することができる。 ヒト又はマルモセットーレニンｋＮＲするために、同様
にしてモノクローナル抗体Ｒ３−２１、Ｒ１−１９、又
はＲ１−２０全含有するイムノアフィニティーグルを使
用することができる。 例１１．非経腸投与のための医薬 例３に従って調製した７、　０　ｍ９のモノクローナル
抗体Ｒ３−３６−１６ｉ２０−の生理的塩溶液に溶解す
る。この溶液を細菌フィルターに通し、そしてＦ液を分
けて無菌条件下で１０本のアンプルに導入する。これら
のアンプルは、非経腸投与に適当なモノクローナル抗体
ｏ、’７ｍｇ’（ｒ含有している。 このアンプルは、好ましくは低温、例えば−２０℃にお
いて貯蔵する。 文献 ［１）　Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎネ
イチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６．４９５（１９７５
）。 （２）　Ｄ、　Ｓｉｍｏｎ＋　Ｆ、Ｘ、　Ｇａ１ｅｎ＋
　Ｃ，Ｄｅｖａｕｘ＋Ｆ。 ５ｏｕｂｒｉｅｒ＋　Ｂ、　Ｐａｕ＋　Ｊ、　Ｍｅｎａ
ｒｄ及びＰ。 ＣｏｒｖｏＬ　ジャーナル・オグ・クリニカル・エンド
クリノロジー・アンド・メタボリズム（Ｊ。 Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒ、　Ｍｅｔ、）５３．４５３
（１９８１）。 （３）　Ｖ、Ｊ、Ｄｚａｕ＊Ｄ、Ｄｅｖｌｎｅ＋Ｍ、Ｍ
ｕｄｇｅｔｔ−）Ｉｕｎｔｅｒ　＋　Ｒ，Ｉ　、　Ｋｏ
ｐｅ　１ｍ１ｋｎ＋　Ａ、Ｃ，Ｂａｒｇｅｒ及びＥ　−
Ｈａ　ｂ　ｅ　ｒ　＊　クリニカル・アンド・エクスペ
リメンタル・ハイパーテンション（Ｃ１１ｎｉｃａｌａ
ｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ
ｉｏｎ）Ａ５゜１２０７（１９８３）。 （４）　Ｆ、　５ｏｕｂｒｉｅｒ＋　Ｔ、Ｔ、　Ｇｕｙ
ｅｎｎｅ　＋　Ｍ、Ｆ。 Ｇｏｎｚａｌｅｓ＋　Ｐ、　Ｃｏｒｖｏｌ及びＪ、Ｍ；
ｎａｒｄ。 １ｎＩＩへテロケゞナイティー・オン・レニン・アンド
・レニンスブストレート（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉ　ｔ
ｙｏｆ　Ｒｅｎ１ｎ　ａｎｄ　Ｒｅｎ１ｎ−８ｕｂｓｔ
ｒａｔｅ　）　＋（Ｍ、Ｐ、　Ｓａｍｂｈｉ編）、エル
セビールノースホランド社１９８１　、２３７頁。 （５）　Ｄ、Ｒ，Ｂａｎｇｋａｎ＋’１．　Ｒｏ？＋ｒ
ｔｓｏｎ＋　Ｊ、１．Ｓ。 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ＋　Ｃ，Ｊ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及び
Ｍ、　Ｉｒｅｅ＋クリニカル・サイエンス・アンド・モ
ノキュラー・メディシン（ＣＩｉｎ、Ｓｃｉ、Ｍｏ１．
Ｍｅｄ、）４８＋１３５（１９７５）。 ［６）　Ｂ、Ｐａｕ＋　Ｄ、Ｓｉｍｏｎ＋　Ｆ、Ｘ、Ｇ
ａ１ｅｎ＋　Ｃ。 Ｄｅｖａｕｘ＋　Ｆ、　５ｏｕｂｒｉｅｒ、　Ｊ、　Ｍ
ｅ’ｎａｒｄ　及びＰ、　ＣｏｒｖｏＬ　クリニカル・
サイエンス（Ｃ１ｉｎ。 Ｓｃｉ、）６１．２３９（１９８１）。 （７３Ｍ、Ｓｈｕｌｍｉｎ、　Ｃ，Ｄ、Ｗｌｌｄｅ及び
Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒｖネイチュア＝（Ｎａｔｕｒｅ）２７
６．２６９（１９７８）。 ［８）　Ｅ、Ｅｎｇｖａｌｌ　及びＰ、　Ｐｅｒ１ｍａ
ｎｎ＋　ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ　、　Ｉ
ｍｍｕｎ　ｏ　ｌ　−）　１０９＋１２９（１９７２）
。 ［９’）　Ｊ、−Ｙ、Ｃｈａｎｇ、Ｈ，Ｈｅｒｂｓｔ＋
Ｒ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ及びり、Ｇ、Ｂｒａｕｎ＋　ビ
オケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）２１
１，１７３（１９８３）。 （１０）　Ｆ、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ＋　Ｗ、Ｍ、　
Ｈｕｎｔｅｒ及びＪ、Ｓ。 Ｇ１ｏｖｅｒ＋　ビオケミカル・ジャーナル（Ｂｉ　ｏ
ｅｈｅｍ。 Ｊ、）８９，１１４（１９６３）。 ［１１）　Ｆ、Ｘ、　Ｇａ１ｅｎ＋　Ｔ、Ｔ、　Ｇｕｙ
ｓｎｎａ＋　Ｃ，Ｄｅｖａｕｘ＋Ｃ，Ａｕｚａｎ＋　Ｐ
、　Ｃｏｒｖｏｌ及びＪ、Ｍｅｎａｒｄ。 ジャーナル・オン・クリニカル・エンドクリノロジー・
アンド・メタボリズム（Ｊ、Ｃ１１ｎ。 Ｅｎｄｏｅｒ　、　Ｍｅｔ、　）　４８．１０４１（１
９７９）。 （１２）　Ａ、　Ｖｏｌｌｅｒ、Ｄ−Ｅ、　Ｂｉｄｗｅ
ｌｌ及びＡ、Ｂａｒｔｌｅｔｔ＋プレチン・オン・ザ・
ワールド・レルス・オーガナイゼーション（Ｂｕｌｌ、
　Ｗｏｒｌｄ　ＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎ、）　５３．５
５（１９７６）。

【図面の簡単な説明】

第１図はサンドイッチ−ＲＩＡによるヒト−レニンの測
定のための標準曲線全示し； 第２図はサンドイッチ−ＥＬＩ８Ａによるヒト−レニン
の測定のための標準曲線を示す。 特許出願人 チバーガイギーアクチェングゼルシャフト特許出願代理
人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　゛ す／ドイツチーＲＪＡによるヒト−レニンの測定のだめ
の標準曲線 ｐｍ 第１図 す／ドイツチーＢＬＩＳＡによるヒトーレニ／の測定の
ための標準曲線 ０５ ０、Ｄ ２０　６０　２００　６００　２．０００　６，０００
　２０，０００ヒト−レニンｐｇ／ｍｊ 焔　２　Ｒ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４識別記号 ０発　明　者　ジャネット　ウッド 庁内整理番号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヒト−レニンに対する高い親和性を特徴とスル、
   ヒト−レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノ
   クローナル抗体、並びにその誘導体。 ２、　３　Ｘ　１０−１０Ｍ０−１Ｏ／ｌ）以下の濃度
   において、表面結合ヒト−レニンと有意に結合すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノクローナ
   ル抗体及びその誘導体。 ３、　３Ｘ１０　Ｍの濃度において、制限された量で添
   加されたヒト−レニンの５０％以上と結合することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗
   体及びその誘導体。 ４、　２Ｘ１０−８Ｍの＃度において、ヒト−レニンの
   酵素活性を５０％以上阻害することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体及びその誘導
   体。 ５、　２ＸＩＦ’Ｍにおいて、ヒト−レニンの酵素活性
   を５０％以上阻害することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載のモノクローナル抗体及びその誘導体。 ６、　５Ｘ１０　Ｍの濃度において、ヒト−レニンの酵
   素活性を５０チ以上阻害することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載のモノクローナル抗体及びその誘導体
   。 ７、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体Ｒ
   ３−３６−１６゜ ８、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記
   載の　ニーラベル−モノクローナル抗体。 ９、特許請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体Ｒ
   ３−３６−１６の１２５Ｉ−ラベル−誘導体。 １０、アルカリ性ホスファターゼと接合している特許請
   求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のモノク
   ローナル抗体誘導体。 １１、特許請求の範囲第１０項記載のアルカリ性ホスフ
   ァターゼと接合したモノクローナル抗体Ｒ３−３６−１
   ６の誘導体。 １２．　ヒト−レニンに対する高い親和性を特徴とする
   、ヒト−レニン及び構造的に類似するレニンに対するモ
   ノクローナル抗体、並びにその誘導体の製造方法であっ
   て、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細
   胞を ａ）イン−ビトロで培養し、そして培養土清液からモノ
   クローナル抗体を単離し、又は、ｂ）適当々哺乳動物中
   で±ヱユヱｌ増幅し、そして哺乳動物の体液からモノク
   ワ−ナル抗体を単離し、そして所望によシ、 Ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
   ることを特徴とする方法。 １３、Ｂａ１ｂ／ｅマウスに由来しそして目的とするモ
   ノクローナル抗体を産生ずるハイツリドーマ細胞を、場
   合によっては炭化水素によって前処理しておいたＢａ１
   ｂ／ｅマウスに腹腔内注射し、そして８〜１０日後に該
   マウスから腹水を採取し、そして該腹水から硫酸アンモ
   ニウムを用いる沈澱によりモノクローナル抗体を分離し
   そしてクロマトグラフィー忙よシ精襄することを特徴と
   する特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する、ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体を産生ずることを特徴とするハイブリドーマ
   セルライン。 １５、／４’りのパスツール研究所の”　Ｃｏ１１＠ｃ
   ｔｉｏｎＮａｔｌｏｎａｌ＊　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ
   　ｄｅ　Ｍｉｅｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｓ’にＡｌ−２
   ５３として寄託されており、Ｒ３−３６−１６と称され
   る特許請求の範囲第１４項記載の７・イブリドーマセル
   ライン。 １６、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する、ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体を産生ずるハイブリドー４セルラインの製造
   方法であって、適当な哺乳動物を精製されたヒト−レニ
   ンで免疫し、該哺乳動物から採取した抗体産生細胞を骨
   髄腫細胞と融合せしめ、得られたハイツリドーマ細胞を
   クローン化し、そしてヒト−レニンに対する高い親和性
   を有する目的とするモノクローナル抗体を産生ずる細胞
   クローンを選択することを特徴とする方法。 １７、それぞれ１μｇ〜２０μｇの精製されたヒト−レ
   ニンを含有する３〜６回の非経腸注射を１〜６週間の間
   隔で行うことによｐ　Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫し、そ
   して最後の追加免疫から２〜６日後に該動物から肺臓細
   胞を採取し、そして融合促進剤の存在下で適当なセルラ
   インの骨髄腫細胞と融合せしめることを特徴とする特許
   請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、Ｂａ１ｂ／ｅマウスのモノクローナル抗体産生細
   胞をセルラインＸ６３−Ａｇ３．６５３、又はＳｐ２１
   ０−Ａｇ１４の骨髄腫細胞と融合せしめることを特徴と
   する特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １９、骨髄腫細胞を、１０００〜４０００の分子量を有
   する３０〜５０％のポリエチレングリコールを含有する
   溶液中で、免疫された動物由来の肺臓細胞の３〜２０倍
   過剰量と融合せしめるととを特徴とする特許請求の範囲
   第１６項記載の方法。 ２０、モノクローナル抗体の表面結合ヒト−レニンへの
   結合、溶解したヒト−レニンへの結合、及びとトーレニ
   ンの酵素活性の阻害について同時的に細胞上清を試験す
   ることにより細胞クローンを選択することを特徴とする
   特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２１、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する。ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体並びにその誘導体の。 ヒト−レニン及び構造的に類似するレニンの定性的及び
   定量的測定のための使用。 ２、特許請求の範囲第２１項の、ラジオイムノアッセイ
   におけるモノクローナル抗体及びその誘導体の使用。 ２、特許請求の範囲第２１項の、エンザイムイムノアッ
   セイにおけるモノクローナル抗体及びその誘導体の使用
   。 ２４、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する。ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体、及び／又はその誘導体、並びに場合によっ
   ては付属物を含んで成る、ヒト−レニン及び構造的に類
   似するレニンを測定するだめの試験キット。 ２５．　ラジオイムノアッセイのための特許請求の範囲
   第２４項記載の試験キット。 ２６、エンデイムイムノア、セイのだめの特許請求の範
   囲第２４項記載の試験キット。 ２７、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する、ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体並びにその誘導体の、ヒト−レニン及び構造
   的に類似するレニンの精製のための使用。 ２８、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する、ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体又はその誘導体を、場合によっては医薬助剤
   と共に含んで成る医薬。 ２９、ヒト−レニンに対する高い親和性を有する、ヒト
   −レニン及び構造的に類似するレニンに対するモノクロ
   ーナル抗体又はその誘導体の、高血圧及び心臓機能不全
   の治療のための使用。