JPH0995500A - モノクローナル抗体および血栓溶解促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規有用なモノクローナル抗体および血栓溶
解促進剤の提供 【解決手段】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよび
ヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのクリングルＫ５ドメ
インを認識し、かつε−アミノカプロン酸によって結合
を阻害されない、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよ
びヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノクロー
ナル抗体、および上記の性質に加え、ヒトーＧｌｕ−プ
ラスミノーゲンのフィブリン分解産物への親和性を増大
させるが、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラスミ
ンへの活性化速度を促進しないという性質を有するモノ
クローナル抗体を有効成分として含有する血栓溶解促進
剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明はヒトプラスミノーゲンを
抗原として作成されたハイブリドーマの産生するモノク
ローナル抗体、および該モノクローナル抗体を有効成分
として含有する血栓溶解促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】プラスミノーゲンは肝臓で生産され、ヒ
ト血漿中には１０〜１７ｍｇ／ｄｌ、すなわち１．２〜
２μＭ含まれ、７９１個のアミノ酸からなる一本鎖糖蛋
白質で糖含量は約２％と報告されている。プラスミノー
ゲンにはＮ−末端にグルタミン酸をもつＧｌｕ−プラス
ミノーゲン（Ｇｌｕ−Ｐｇ）とＮ−末端にリジンをもつ
Ｌｙｓ−プラスミノーゲン（Ｌｙｓ−Ｐｇ）があるが、
前者は天然のプラスミノーゲンで、後者は、活性化の過
程でＮ−末端のペプチドがプラスミンにより切り出され
た中間的産物である。詳細には、Ｇｌｕ−プラスミノー
ゲンのＮ−末端から７６番目のＬｙｓと７７番目のＬｙ
ｓの結合箇所が、プラスミンによって切断される。１〜
７６番目のペプチドが遊離され、７７番目以降のものが
Ｌｙｓ−プラスミノーゲンである。一方、プラスミノー
ゲンは、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−Ｐ
Ａ）あるいはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（ｕ−ＰＡ）などのアクチベータにより、５６０番
目のＡｒｇと５６１番目のＶａｌの結合箇所が限定分解
を受け、２本鎖のプラスミンになる。

【０００３】このプラスミンのＮ−末端側をＨ鎖、Ｃ−
末端側をＬ鎖と呼び、Ｈ鎖にそれぞれが３５％近いホモ
ロジーを有し、３個のＳ−Ｓ結合で結ばれた５つの繰り
返し構造（クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）構造、Ｋ１、
Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５）が存在する（Ｗｉｒｎ，Ｅ．
Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
４，５７９〜５８６，１９８０）。Ｋ１〜Ｋ４には、リ
ジンセファロースなどに強い親和性のあるリジン結合部
位（ＬＢＳ）があり、フィブリンの特定のリジン残基、
プラスミノーゲンの活性化に伴い遊離されるペプチド、
あるいはα２−プラスミンインヒビターなどと結合する
（Ｍｏｒｉ，Ｍ．ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５９５６〜５９６５，１９７
６）。抗線溶薬のε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は
リジンと類似した構造をもち、プラスミノーゲンのＬＢ
Ｓに結合してその分子構造を変化させ、プラスミノーゲ
ンのフィブリンへの結合およびα２−プラスミンインヒ
ビターへの結合を阻止する（Ｍａｒｋｕｓ，Ｇ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５３，７２７〜
７３２，１９７８）。ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲン
およびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノク
ローナル抗体として特定の性質を有するものが知られて
いる（特公平７−４２７０号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ヒト血液中のプラスミ
ノーゲン量を、測定できれば、生体内の凝固線溶の状態
を把握し、また血栓症等を診断するのに有効であると考
えられ、上記特公平７−４２７０号公報には該モノクロ
ーナル抗体をそのために使用し得ることが記載されてい
る。しかしながら、該モノクローナル抗体とは異なるヒ
トプラスミノーゲン上の抗原決定基を認識するモノクロ
ーナル抗体を提供できれば、測定を多様化できる。ま
た、ヒトプラスミノーゲンに対するモノクローナル抗体
自体が、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよびヒトー
Ｌｙｓ−プラスミノーゲンの少なくとも１つのフィブリ
ン分解産物への親和性を増大させることができ、ヒトー
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラス
ミノーゲンの少なくとも１つのプラスミンへの活性化速
度を促進せず、フィブリンおよびフィブリン分解産物の
少なくとも１つに結合したヒトーＧｌｕ−プラスミノー
ゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンの少なくと
も１つのプラスミンへの活性化を阻害しなければ、プラ
スミノーゲンをフィブリン上に濃縮でき、効率的に血栓
上でプラスミノーゲンをプラスミンに活性化することが
できる。すなわち、血栓溶解促進剤として利用すること
ができる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かかる課題を解決する本
発明は、（１）ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよび
ヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのクリングルＫ５ドメ
インを認識し、かつε−アミノカプロン酸によって結合
を阻害されない、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよ
びヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノクロー
ナル抗体、（２）ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのフ
ィブリン分解産物への親和性を増大させる上記（１）の
モノクローナル抗体、および（３）ヒトーＧｌｕ−プラ
スミノーゲンのプラスミンへの活性化速度を促進せず、
フィブリン分解産物に結合したヒトーＧｌｕ−プラスミ
ノーゲンのプラスミンへの活性化を阻害しない上記
（１）または（２）のモノクローナル抗体に関する。本
発明はさらに（４）ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンお
よびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのクリングルＫ５
ドメインを認識し、かつε−アミノカプロン酸によって
結合を阻害されない、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲン
およびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノク
ローナル抗体であって、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲ
ンのフィブリン分解産物への親和性を増大させるが、ヒ
トーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
速度を促進しないモノクローナル抗体を有効成分として
含有する血栓溶解促進剤に関する。

【０００６】本発明のモノクローナル抗体は、ケーラー
とミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１
９７５）によって産生することができる。すなわち、ヒ
トプラスミノーゲンで免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細
胞（以下、「ミエローマ」という）とを細胞融合させ、
得られたハイブリドーマからヒトプラスミノーゲンに対
して特異的な抗ヒトプラスミノーゲンモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを選択し、選ばれたハイブ
リドーマからクリングルＫ５ドメインを認識し、かつε
−アミノカプロン酸によって結合を阻害されない抗ヒト
プラスミノーゲンモノクローナル抗体（１）、または
（１）の性質に加え、上記（２）もしくは（３）の性質
を有する抗ヒトプラスミノーゲンモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマ
を大量培養あるいは動物の腹腔内で増殖させ、この培養
液あるいは腹水から該モノクローナル抗体を分離するこ
とにより製造することができる。

【０００７】以下、本発明のモノクローナル抗体を得る
ための方法について詳細に説明する。 （１）抗原と免疫工程 抗原ヒトプラスミノーゲンはウオーレンとウイーマンの
方法（Ｗａｌｌｅｎ＆ Ｗｉｍａｎ， Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２５７， １２
２−１３４， １９７２）に従い、リジンセファロース
カラムクロマトとイオン交換カラムクロマトにより、ヒ
ト血漿中から分離精製される。ただし、抗原は必ずしも
精製標品である必要はない。上記のようにして得られる
ヒトプラスミノーゲンは通常ヒトーＧｌｕ−プラスミノ
ーゲンである。ヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンを得る
には、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンをプラスミンと
混合すればよい。なお、ヒトプラスミノーゲンもヒトー
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンも市販品がある。免疫される
哺乳動物は、細胞融合しようとする骨髄腫細胞株との組
み合わせを配慮して、一般には、マウス、ラット等が好
ましい。

【０００８】抗原は、哺乳動物の皮下、皮内、腹腔ある
いは静脈等に注射等により投与することができる。具体
的には、ヒトプラスミノーゲンをリン酸緩衝液（以下、
ＰＢＳという）や生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、
これに通常はアジュバントを混合し、１〜３週間毎に数
回投与する。投与量は、毎回１匹当たり、ヒトプラスミ
ノーゲンとして、１〜２００μｇ程度とすることが好ま
しい。また、最終投与は、融合に使用する３〜５日前
に、アジュバントを用いない静脈注射による投与とする
ことが好ましい。最終免疫の数日後に脾臓細胞を取り出
す。

【０００９】（２）細胞融合工程 この工程においては、免疫した動物の脾臓から取り出し
た抗体産生細胞とミエローマとを融合させ、融合細胞を
生じさせる。上記の脾細胞と融合させるミエローマとし
ては、公知の細胞株、例えば、マウスでは、「ＮＳ−１
／１−Ａｇ−１」（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
６，５１１〜５１９（１９７６））、「ＳＰ−２／Ｏ
−Ａｇ１４」（Ｎａｔｕｒｅ２７６，２６９〜２７０
（１９７８））、「ＦＯ」（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ３５，１〜２１（１９８０））、「Ｐ３
−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１」（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉ
ｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１，１〜７（１９７８））等、ラ
ットでは、「ＹＢ２／０」（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１））等のミエローマを使
用できる。細胞混合比は、脾細胞：ミエローマ＝３〜２
０：１、好ましくは５〜１０：１で行うのが適してい
る。

【００１０】融合の際には、通常、融合促進剤としてポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等
が使用され、また同じ目的でさらにジメチルスルホキシ
ド等を適宜添加することもできる。このＰＥＧの分子量
は、通常、１０００〜６０００位のものが好ましい。融
合時の培地としては、牛胎児血清（ＦＣＳ）等を含有し
ない、ミエローマの増殖に使用されるＭＥＭ（Ｅａｇｌ
ｅ´ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄ
ｉｕｍ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ
Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ´ｓ
Ｍｅｄｉｕｍ １６４０）培地等が用いられる。融合
操作は、上記した混合比による脾細胞とミエローマの所
定量と、例えば３７℃に温めておいた、３０〜５０％
（ｗ／ｖ）程度のＰＥＧを含有する、血清無添加の培地
とを混合し、数分間攪拌することにより行う。

【００１１】（３）ハイブリドーマの選択 上記操作で得られた細胞を、例えば数枚の９６穴マイク
ロプレートに分注し、ＨＡＴ培地（例えば、ＭＥＭ培地
あるいはＲＰＭＩ−１６４０培地に、ヒポキサンチン１
００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μ
ＭおよびＦＣＳ約１５％（ｖ／ｖ）となるように含有さ
せた培地）で培養することにより融合細胞を選択し、さ
らにそれらの培養上清から、ヒトプラスミノーゲンを固
相化したマイクロプレートによるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａ
ｓｓａｙ）により、ヒトプラスミノーゲンに特異的な抗
体を産生する細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニング
することができる。

【００１２】（４）クローニング 前記ハイブリドーマを限界希釈法または寒天法（例え
ば、９６穴マイクロプレートまたは寒天入りシャーレで
希釈して培養し、陽性のものを選ぶ）等に付して、モノ
クローンのハイブリドーマを取得することができる。こ
こで取得したハイブリドーマの培養上清を用いて、ヒト
プラスミノーゲンをエラスターゼ処理して得られる、ク
リングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン、クリングルＫ４お
よびそれ以外のミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ−Ｐ
ｇ）（クリングルＫ５ドメインを含有する）についても
アッセイを行い、培養上清中の抗体の認識部位を確認す
ることができる。また、これらのイムノグロブリンのタ
イプを、市販のアイソタイピングキットを用いて、決定
することができる。

【００１３】（５）モノクローナル抗体の調製 上記のようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを動
物の腹腔内に接種し、約１０〜１５日後に腹水を採取
し、その上清から、あるいはこのハイブリドーマを適当
な培地で培養し、その培養上清から、本発明のモノクロ
ーナル抗体を調製することができる。この際、必要に応
じて、モノクローナル抗体を塩析、アフィニティカラ
ム、ゲル濾過等により精製してもよい。

【００１４】このようにして得られた、ヒトーＧｌｕ−
プラスミノーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲ
ンのクリングルＫ５ドメインを認識する（ｍｉｎｉ−Ｐ
ｇ中のクリングルＫ５ドメインを認識することについて
は、後述の実施例３参照）、ヒトーＧｌｕ−プラスミノ
ーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対する
モノクローナル抗体中に、後述の実施例に示すごとく、
ε−アミノカプロン酸によってこれらのヒトプラスミノ
ーゲンへの結合を阻害されないモノクローナル抗体Ｆ１
Ｐ６が見出された。このモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６
は、後述の実施例に示すごとく、ヒトーＧｌｕ−プラス
ミノーゲンのフィブリンへの親和性を増大させ、かつヒ
トーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
速度を促進せず、また該活性化を阻害しない性質を有し
ていた。したがって、このモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６
はフィブリン分解産物に結合したヒトーＧｌｕ−プラス
ミノーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのプ
ラスミンへの活性化を阻害しないと推定される。

【００１５】上記から理解されるごとく、本発明のモノ
クローナル抗体は、例えばヒト血液中のプラスミノーゲ
ン量を特異的に測定するために用いることができる。ま
た、本発明のモノクローナル抗体を利用する別の一態様
として、かかる性質を有するモノクローナル抗体を有効
成分として含有する血栓溶解促進剤が挙げられる。すな
わち、本モノクローナル抗体は非経口的（静脈注射、直
腸投与等）または経口的に投与し、各投与方法に適した
形態に製剤化することができる。注射剤としての製剤形
態は、通常滅菌水水溶液を包含する。上記形態の製剤は
また、常用される緩衝剤、等張化剤、保存剤等の水以外
の製薬補助剤を含有することができる。経口投与剤は胃
腸器官による吸収に適した形態に製剤化する。錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤、粉末剤等は、常用の製薬補助剤、例
えば結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤等を含有
することができる。本血栓溶解促進剤は血栓症、汎発生
静脈血栓症等の治療または予防に用いることができる。
本血栓溶解促進剤の投与量は有効成分として１〜２００
ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが適当である。以下実施例によって
本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれによ
って限定されるものではない。

【００１６】

【実施例】

実施例１（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作
製） （１）抗原ヒトプラスミノーゲンの取得 抗原ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンはウオーレンとウ
イーマンの方法（文献名：前出）にしたがって分離、精
製した。すなわち、１００ｍｌのヒト血漿（健常人）
を、トリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、ｐＨ７．
４緩衝液（以下、「ＴＢＳ」という）で平衡化したセフ
ァロース４Ｂカラム（５ｍｌベッド容）に通し、通過し
たヒト血漿をリジンーセファロースカラム（３０ｍｌベ
ッド容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．
０２５Ｍ ＥＡＣＡ（εーアミノカプロン酸）含有ＴＢ
Ｓでヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、イオ
ン交換クロマト法（ＤＥＡＥ−セルロースカラム）で精
製して、ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン８ｍｇを得
た。さらに、ヒト−Ｌｙｓ−プラスミノーゲンをＦ．
Ｊ．Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．Ｐｏｗｅｌｌ，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．８０，ｐ３６５（１９８１）に記載された方法に準
じて製造した。すなわち、０．３ｍｌ（０．９ｍｇ／ｍ
ｌ）のプラスミンと３ｍｌ（１１．５ｍｇ／ｍｌ）のヒ
ト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンとを混和し、緩衝液Ａ
（０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液−０．１Ｍ Ｌ−Ｌｙ
ｓ，ｐＨ８．０）中で３０℃、２時間反応させた。加え
たプラスミンをダイズトリプシンインヒビターカラムで
除いた後、緩衝液Ｂ（０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液−
０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に十分透析し、上記
と同様にしてリジンーセファロースカラムに吸着、溶出
させて、精製ヒト−Ｌｙｓ−プラスミノーゲンを得た。

【００１７】（２）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの作製 上記（１）で得たヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまた
はヒト−Ｌｙｓ−プラスミノーゲン１００μｇとフロイ
ント完全アジュバント等容量との混合物をマウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ）１匹、１回当たりの投与量とし、これを２週
間毎に計３回背部に皮下注射した。抗体価の上昇を、抗
原ヒトプラスミノーゲンを固相化したプレートを用い
て、免疫マウス血清のＥＬＩＳＡにより確認した。皮下
免疫終了後、最終免疫として、生理食塩水に溶解した、
始めに使用したのと同じ型のヒトプラスミノーゲン５０
μｇを尾静脈に投与し、免疫感作脾細胞を作製した。３
日後に脾臓を取り出し、２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入
りＤＭＥＭ培地にほぐして懸濁し、洗浄した。

【００１８】一方、細胞融合に供するミエローマとして
マウスミエローマＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ１４を使用し、こ
れを２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭＥＭ培地中で
増殖させた。得られた２種類の細胞を次の要領で融合し
た。すなわち、４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコー
ル（分子量１５４０）と１２．５％（ｖ／ｖ）ジメチル
スルホキシドとを含有するＤＭＥＭ培地０．５ｍｌ中
で、遠心分離で集めた上記脾細胞２×１０⁷ 個と、遠
心分離で集めた対数増殖期にある上記骨髄腫細胞４×１
０⁶ 個とを混合して細胞融合を行った。細胞融合の温
度は３７℃近傍で時間は４分であった。

【００１９】融合された細胞から融合用培地を除去後、
９６穴マイクロプレート４枚に分注して、ハイブリドー
マの選択培養を行った。すなわち、融合細胞を各２％
（ｗ／ｖ）のヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジンを添加した２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭ
ＥＭ培地で培養した。１〜３日間隔で培地交換を行い、
２週間でハイブリドーマのコロニーの形成を認めた。培
養上清を、ヒトプラスミノーゲン５μｇ／ｍｌ濃度で固
相化したプレートにおけるＥＬＩＳＡ（第二抗体として
パーオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社
製）を使用）によって検査し、ヒトプラスミノーゲンに
強い反応性を示すコロニー６個を選択した。こうして得
られたコロニーを拡大培養した後、プレートのウェル１
穴当たり細胞が１個となるようＤＭＥＭ培地で限界希釈
を行った。２週間後、コロニーの形成を確認し、再びＥ
ＬＩＳＡにより、培養上清に産生された抗体のヒトプラ
スミノーゲンに対する反応性を確認した。さらに、ハイ
ブリドーマの限界希釈によるクローニングをもう一度行
うことにより得られるハイブリドーマを単一のハイブリ
ドーマ株であるとみなし、また産生した抗体のアイソタ
イピングを行った。その結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】表１ 産生抗体のアイソタイピング

【００２１】実施例２（モノクローナル抗体の反応性） 実施例１で得られたハイブリドーマ株のそれぞれをマウ
ス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内に接種し、１２日後に腹水
を採取し、遠心分離し、上清をアフィニティクロマト
（ＭＡｂ．ＴｒａｐＧ、ファルマシア社製）にて精製
し、モノクローナル抗体を得た。得られた各モノクロー
ナル抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った。すなわち、ヒト
プラスミノーゲン５μｇ／ｍｌ濃度、５０μｌ／ウェル
で固相化したプレートに、ヒトプラスミノーゲンのリジ
ン結合部位ＬＢＳＩ（Ｋ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン：ＳＩ
ＧＭＡ社製）、ＬＢＳＩＩ（Ｋ４ドメイン：ＳＩＧＭＡ
社製）またはｍｉｎｉ−Ｐｇ（Ｋ１〜Ｋ４ドメインを除
去したヒトプラスミノーゲン：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）を５μｇ／ｍｌになるよう、
５０ｍＭ ＥＡＣＡを含むＴＢＳまたはそれを含まない
ＴＢＳで希釈し、５０μｌ／ウェルで添加した。

【００２２】さらに、０．１μｇ／ｍｌ濃度に希釈した
精製モノクローナル抗体溶液を５０μｌ／ウェルで添加
し、室温で２時間反応させた。洗浄後、１％牛血清アル
ブミンを含むＴＢＳを用いて２０００倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社製）を５
０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。洗
浄後、１ｍｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ基質溶液を５０
μｌ／ウェルで添加し、５分経過後、１Ｎ硫酸を５０μ
ｌ／ウェルで添加し、波長４９０ｎｍにおける吸光度を
測定した。なお、発色される場合は、モノクローナル抗
体が固相ヒトプラスミノーゲンと結合し、ＬＢＳＩ、Ｌ
ＢＳＩＩまたはｍｉｎｉ−Ｐｇとは結合しないことを意
味する。 この結果、ヒトプラスミノーゲンのｍｉｎｉ
−Ｐｇを認識し、かつＥＡＣＡによって結合を阻害され
ないモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６を得た。その結果を表
２に示す。表２中のモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６が本発
明の抗体であり、他は本発明外の抗体である。モノクロ
ーナル抗体Ｆ１Ｐ６を産生したハイブリドーマは工業技
術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１５１９１として寄託されている。

【００２３】

【表２】表２ モノクローナル抗体のヒトプラスミノー
ゲンのクリングルドメインとの反応性 ○、×はモノクローナル抗体のＬＢＳＩ、ＬＢＳＩＩま
たはｍｉｎｉ−Ｐｇへの結合性を示す。 ○：結合する、×：結合しない

【００２４】実施例３（モノクローナル抗体の反応性） ウオーレンとウイーマンの方法（文献名：前出）に準じ
て、ヒトプラスミノーゲンから、クリングルＫ１＋Ｋ２
＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４ドメインおよびｍｉｎｉ−Ｐｇを
分離精製した。すなわち、ヒト−Ｌｙｓ−Ｐｇ １８０
μＭをブタ膵臓由来のエラスターゼ１５０単位（ＣＡＬ
ＢＩＯＣＨＥＭ社製）で室温で４時間半処理し、フルオ
ロリン酸ジイソプロピル（和光純薬工業社製）を終濃度
１ｍＭになるように添加して、反応を停止させた。これ
を、リジンーセファロースカラムおよびセファクリルＳ
−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、
Ｋ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４ドメインおよびｍｉｎ
ｉ−Ｐｇに分離精製した。さらに、ｍｉｎｉ−Ｐｇは、
ｕ−ＰＡセファロースと３７℃で２時間反応させ、つい
で遠心分離により該セファロースを除去してミニプラス
ミン（ｍｉｎｉ−Ｐｌｍ）を得た。

【００２５】これらの各試料（タンパク質量０．５μ
ｇ）を、非還元処理液［終濃度で、１％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ６．８）、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン］または
還元処理液［終濃度で、１％（ｖ／ｖ）２−メルカプト
エタノール、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ６．８）、２
０％（ｖ／ｖ）グリセリン］と１：１（ｖ／ｖ）で混合
し、９５℃で５分間煮沸した。ついで各反応液を、１
２．５％（ｗ／ｖ）ゲル濃度のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動で展開し、ついでポリフッ化ビニリデン
（ＰＶＤＦ）膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に、電気的
に５０Ｖ、１時間で、ブロッティングした。このＰＶＤ
Ｆ膜を、５％（ｗ／ｖ）カゼインを含むＴＢＳを用いて
室温で１時間ブロッキングし、１０μｇの１次抗体Ｆ１
Ｐ６を、室温で２時間反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）
ＴｒｉｔｏｎＸ１００および０．５％（ｗ／ｖ）カゼイ
ンを含むＴＢＳで３回洗浄し、２次抗体として、０．０
５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００および０．５％
（ｗ／ｖ）カゼインを含むＴＢＳで２０００倍希釈した
パーオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社
製）を添加し、室温で１時間反応させ、同様に洗浄し
た。洗浄後、パーオキシダーゼ基質溶液で発色させた。
この結果、ｍｉｎｉ−Ｐｌｍを非還元処理しても還元
処理しても、モノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６はこれと反応
した。このことからモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６はクリ
ングルＫ５ドメインを認識していることが判明した。な
お、ｍｉｎｉ−Ｐｇをｍｉｎｉ−Ｐｌｍにすると、５６
０番目のＡｒｇと５６１番目のＶａｌとの結合箇所が切
断される。この状態では、Ｌ鎖とＫ５ドメインが、Ｓ−
Ｓ結合のみで存在している。これを還元処理すれば、Ｌ
鎖とＫ５ドメインに分離され、Ｋ５ドメインの分子量約
１４０００の箇所に、Ｆ１Ｐ６が反応している（Ｌ鎖は
分子量約３万）。結果を発色バンドの位置として図１に
示す。

【００２６】実施例４（ヒトプラスミノーゲンのフィブ
リン分解産物への親和性に及ぼすモノクローナル抗体の
影響） ２００μｇのヒト−Ｇｌｕ−Ｐｇを、ＩｏｄｏＢｅａｄ
ｓ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、１２５−Ｉｏｄｉｎ
ｅ（放射活性単位１７Ｃｉ／ｍｇ）で標識した。得られ
た試料とモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６とをモル比１：１
０で混合し、３７℃で２時間反応させた。一方、ＰＶＣ
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）をグルタルアルデ
ヒド処理後、ヒトフィブリノーゲンを１００μｇ／ｍｌ
の濃度で、５０μｌ／ウェルで固相化したプレートに、
トロンビンを１０ＮＩＨＵ（米国国立保健研究所トロン
ビン単位）／ｍｌの濃度で、５０μｌ／ウェル添加し、
３７℃で１時間反応させて、フィブリンに変換後、プラ
スミンを２５ｎＭの濃度で、５０μｌ／ウェル添加し、
３７℃で１時間反応させて、フィブリン分解産物プレー
トを作製した。

【００２７】上記で得られた１２５−Ｉ標識化プラスミ
ノーゲンとモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６との反応混合物
を、プラスミノーゲンの濃度を基準に１０〜１００ｎＭ
の濃度の範囲で、フィブリン分解産物プレートへ添加
し、洗浄後、残存する１２５−Ｉ放射活性からプラスミ
ノーゲンの結合量を測定した。対照抗体として正常マウ
スＩｇＧ（ｎｏｒｍａｌ ＩｇＧ）を使用した。この結
果、ヒト−Ｇｌｕ−Ｐｇにおいては、そのフィブリン分
解産物に対する結合量が、Ｆ１Ｐ６により２倍以上に増
強された。その結果を表３に示す。

【００２８】

【表３】表３ ヒト−Ｇｌｕ−Ｐｇのフィブリン分解
産物に対する結合量（単位： ｐ ｍｏｌ．）

【００２９】実施例５（プラスミノーゲンからプラスミ
ンへの活性化速度に及ぼすモノクローナル抗体の影響） ヒト−Ｇｌｕ−Ｐｇとモノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６とを
モル比１：２で混合し、３７℃で２時間反応させた。反
応混合物に、ヒト−Ｇｌｕ−Ｐｇの濃度が５〜２０ｎＭ
の範囲において、１ｎＭのｕ−ＰＡ（ウロキナーゼ型プ
ラスミノーゲンアクチベータ）（持田製薬社製）、１ｍ
ＭのＳ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−リジル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩、発色性合成
基質：第一化学薬品社製）を添加し、ｐ−ニトロアニリ
ンの遊離量を波長４０５ｎｍで比色定量した。この結
果、Ｆ１Ｐ６が存在しても、ヒト−Ｇｌｕ−Ｐｇではｕ
−ＰＡによるプラスミンへの活性化速度に変化はなかっ
た。その結果を表４に示す。

【００３０】

【表４】表４ ｐ−ニトロアニリンの遊離量（単位：
Ｏ．Ｄ．（４０５ｎｍ））

【００３１】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を用いてヒ
ト血液中のプラスミノーゲン量を測定することができ
る。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトーＧｌ
ｕ−プラスミノーゲンのフィブリン分解産物への親和性
を増大させるが、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプ
ラスミンへの活性化速度を促進せず、フィブリン分解産
物に結合したヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラス
ミンへの活性化を阻害しないので、プラスミノーゲンを
フィブリン上に濃縮でき、効率的に血栓上でプラスミノ
ーゲンをプラスミンに活性化することができる。したが
って、本発明のモノクローナル抗体は血栓溶解促進剤と
して利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトプラスミノーゲンのクリングルＫ１＋Ｋ２
＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４およびｍｉｎｉ−Ｐｇを非還元お
よび還元処理したものを電気泳動し、ウエスタンブロッ
トし、モノクローナル抗体Ｆ１Ｐ６と反応させ、発色さ
せた場合の発色バンドを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 近藤 績 埼玉県幸手市権現堂1134―２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 坂田 洋一 栃木県宇都宮市富士見が岡１−25−11 (72)発明者 窓岩 清治 栃木県河内郡南河内町緑１−１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよ
   びヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのクリングルＫ５ド
   メインを認識し、かつε−アミノカプロン酸によって結
   合を阻害されない、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンお
   よびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノクロ
   ーナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのフ
   ィブリン分解産物への親和性を増大させる請求項１記載
   のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプ
   ラスミンへの活性化速度を促進せず、フィブリン分解産
   物に結合したヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラス
   ミンへの活性化を阻害しない請求項１または２記載のモ
   ノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 Ｆ１Ｐ６ハイブリドーマ（工業技術院
   生命工学工業技術研究所の寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５
   １９１）から得られる請求項１、２または３項記載のモ
   ノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよ
   びヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのクリングルＫ５ド
   メインを認識し、かつε−アミノカプロン酸によって結
   合を阻害されない、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンお
   よびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノクロ
   ーナル抗体であって、ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲン
   のフィブリン分解産物への親和性を増大させるが、ヒト
   ーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化速
   度を促進しないモノクローナル抗体を有効成分として含
   有する血栓溶解促進剤。