JPS61181964A - 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト正常組織由来細胞の細胞培養液より採取
した組織型プラスミノーゲンアクチベーター（以下、ｔ
−ＰＡと略称する）に対して特異性を有する新規なモノ
クロナル抗体およびその使用に関する。

（従来の技術） リンパ球細胞と哺乳動物（たとえば、マウスやラット）
に由来する骨髄腫細胞との間の融合は、試験管内におい
て増殖し、複製可能な雑種細胞を産み出すこと（Ｋｏｈ
ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　
２５６＋４９５−４９７頁、　１９７５年）を可能にし
た。このような雑種細胞は、予め決った特異性のある均
一な抗体（モノクロナル抗体）を分泌するという特質を
有することから、種々のホルモン、蛋白質等に対するモ
ノクロナル抗体を産生ずる雑種細胞を作製し、それらに
より産生されたモノクロナル抗体を種々の研究に利用す
る試みがなされてきた。

（Ｅ、　Ｄａｌｅ　５ｅｒｖｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ、２７．
　Ｎａ１１．１７９７〜１８０６．１９８１）　、　し
かし、ヒト正常細胞由来のｔ−ＰＡに対するモノクロナ
ル抗体については、いかなる知見もなかった。

プラスミノーゲンアクチベーターとしては今日、尿また
は培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼ、および
ストレプトコッキより採取されるストレプトキナーゼが
血栓溶解側として実用に供されている。

しかし、これらはフィブリンに対する親和性の点で劣る
ので、治療に際し必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。すなわち、これらによって循環血液中で生成さ
れるプラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ−と結
合して速やかに失活するため、治療効果をあげるために
は、これらを大量に投与して、血中のプラスミンインヒ
ビタ−の量を上回るプラスミンを生成する必要がある。

しかし、大量のプラスミンが生成されるとフィブリノー
ゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフィブリンに親和性が高く、フィブ
リン上でプラスミンを生成することができれば、循環血
液中のプラスミンインヒビタ−の影響を受けることなく
、少量でフィブリンを分解することができ、循環血液中
のフィブリノーゲンを分解する作用も弱くなる。かかる
実情からフィブリン親和性が高く、少量でかつ血栓溶解
活性が高く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている
。

一方、近年フィブリン親和性の高いプラスミノーゲンア
クチベーターが大黒色腫細胞培養液より分離精製されて
いる（特開昭５７−２８００９号公報参照）。しかしな
がら、これは腫瘍細胞を原料とするものであるから、抗
原性、発癌性に問題があり、実用に供し得ないものであ
る。

これに対して、最近、ヒト正常組織由来の細胞培養液よ
り、下記の性質を有するｔ−ＰＡが見出され、分離精製
された（特開昭５９−５１２２０号）。

ａ）分子量：　６３．０００±１０．０００ｂ）等電点
ニア、０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
Ｈ：１〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体と反応しないｔ−ＰＡの大
きな利点は、フィブリンに対する親和性が極めて高く、
また、ヒト正常細胞培養液より分離したものであるから
、上述した各種プラスミノーゲンアクチベーターの種々
欠点を有しない副作用の少ない血栓溶解剤となり得るこ
とである。

また、大黒色腫細胞由来のプラスミノーゲンアクチベー
ターでは、人血清アルブミン添加による安定化効果がな
い　（Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ＋　４８巻３
号、２９４〜２９６頁、　１９８２年）のに対して、ｔ
−ＰＡでは安定化効果があり、長期保存、凍結乾燥によ
る失活がないなど、大黒色腫細胞由来のプラスミノーゲ
ンアクチベーターとは種々の異なる性質を有するもので
ある。

（発明が解決しようとする問題点） ｔ−ＰＡの取得法としては、適当な生育培体中で大の正
常組織由来細胞、たとえば、人胎児の腎、腸、肺、心臓
、輸尿管、皮膚、包皮および全胎児由来の細胞、人の胎
盤由来の細胞あるいは人の腎、腸、肺、甲状腺、心臓、
輸尿管、皮膚由来の細胞等を用いた組織培養液、特に好
ましくは、人胎児の腎、肺および包皮由来の細胞を用い
た組織培養液を、蛋白質化学において通常使用される方
法、たとえば、担体による吸着法、イオン交換法、分別
沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、各種アフイニテイク
ロマトグラフイーを組み合わせることにより精製する方
法等を挙げることができる。しかし、培養液中のｔ−Ｐ
Ａは微量であり、また、通常使用される各種クロマト法
では、ｔ−ＰＡとの特異的結合も弱く、高純度のｔ−Ｐ
Ａを取得することは困難であり、加えて回収率も満足の
いくものではなかった。故に、高純度のｔ−ＰＡを高回
収率で取得する特異的精製法の開発が望まれている。

一方、血栓症等の治療に際して、ｔ−ＰＡの作用機構の
研究、血中レベルの確認等の手段として、ｔ−ＰＡＯ高
感度検出法の開発が望まれている。

現在、ｔ−ＰＡの測定法としては、メラノーマ由来のプ
ラスミノーゲンアクチベーターを抗原として調製したモ
ノクロナル抗体を用いる方法が報告され（特開昭５９−
５１２１号参照）、また、ｔ−ＰＡのポリクロナル抗体
を用いるサンドウィッチ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
によるキットが市販されている（　Ｂｉｏｐｏｏ１社製
＋　　Ｂｉｏｐｏｏｌ　　　ｔ　−Ｐ　ＡＥＬＩＳＡ　
　ｋｉｔ）。しかしながら、これらの方法は、ｔ−ＰＡ
に対する特異性が劣るため、感度、精度の面で満足なも
のでな（、改良が望まれている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、これらの問題点を克服するため鋭意研究
を重ねた結果、細胞融合によりｔ−ＰＡに対して特異性
を有するモノクロナル抗体を取得することに成功し、こ
のモノクロナル抗体を用いれば、１段階で高純度高収率
にｔ−ＰＡを精製できることを見出し、本発明を成すに
至った。また、該モノクロナル抗体は免疫定量等に用い
ることができ、かつ保存した雑種細胞を培養すれば、い
つでも均一な該モノクロナル抗体を大量に取得できるな
ど工業的に非常に有用である。

すなわち、本発明は、ヒト正常組織由来細胞の細胞培養
液より採取したｔ−ＰＡに対して特異性を有するモノク
ロナル抗体およびその使用に関するものである。

本発明により得られるモノクロナル抗体は、ｔ−ＰＡの
線維素溶解活性発現部位およびフィブリン親和性部位に
は結合しない性質を有するものであるが、本発明と同様
の方法により、異なる抗原決定部位に対する反応性を有
するモノクロナル抗体が得られる。

すなわち、（１）線維素溶解活性発現部位に特異的に結
合するモノクロナル抗体（抗体が結合するとプラスミノ
ーゲンアクチベーターの線維素溶解活性が消失するが、
フィブリン親和性は保持している）　、（２）フィブリ
ン親和性部位に特異的に結合するモノクロナル抗体（抗
体が結合するとプラスミノーゲンアクチベーターのフィ
ブリン親和性が消失するが、線維素溶解活性を保持して
いる）、（３）上記（１）　（２１以外の抗原決定部位
に結合するモノクロナル抗体（抗体が結合しても線維素
溶解活性およびフィブリン親和性になんら影響を示さな
い）が得られる。

上記のような異なる抗原決定基に対し、特異的に結合す
るモノクロナル抗体を組合せて使用することにより、よ
り感度の高いｔ−ＰＡの測定方法が提供される。

以下、細胞融合方法について具体的に説明を加える。

（ａ）　　抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよい。すな
わち、抗原であるｔ−ＰＡで動物を免疫し、その動物の
抗体産生細胞を取得する方法によればよい。

動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、
ヒツジ、ウマ、ウシなどが例示され、抗体産生細胞とし
ては肺細胞、リンパ節細胞、末梢血管細胞などが使用さ
れる。

（ｂ）　　骨髄腫細胞の調整 細胞融合方法において使用される骨髄腫細胞には特に限
定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの
動物の細胞株が適用できる。使用する細胞株は、好まし
くは薬剤抵抗性のものであって、未融合の骨髄腫細胞が
選択培地で生存できず、雑種細胞のみが増殖するように
すべきである。

最も普通に用いられるものは、８−アザグアニン抵抗性
の細胞株で、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホ
リボシル・トランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチ
ン−アミノプリテン−チミジン（ＨＡＴ）培地中では生
育できない性質を有する。また、使用する細胞株は、い
わゆる「非分泌型」のものであることが好ましい。たと
えば、マウス骨髄腫株５Ｐ−１またはマウス骨髄腫株Ｍ
ＯＰＣ−２１由来のＰｓ／Ｘ６３−Ａｇ　８　Ｕ　１　
　（ＰＩＵ　１）、Ｐ　３／　Ｘ６３　　Ａ　ｇ・６・
５・３、Ｐ３／ＮＳＩ　　ｌ−Ａｇ４−１、Ｓｐ２１０
−Ａｇ１４、ラット骨髄腫細胞２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ
ｌ・２・３などが好適に用いることができる。

（Ｃ）　　細胞融合 通常、イーグル最小基本培地（ＭＥＭ）　、ロズウエル
・パーク・メモリアル・インステイチュート（ＲＰＭＩ
）１６４０培地などの培地中で１〜５×１０７個の骨髄
腫細胞と抗体産生細胞１〜５Ｘ１０”個を混合（混合比
は通常１：４〜１：１０）、細胞融合が行われる。融合
促進剤としては、平均分子量が１．０００〜６，０００
のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましいが、他
にウィルスなども使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常
３０〜５０％である。

（ｄ）　　雑種細胞の選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、ｌＯ〜２０％ウシ胎児血清含
有ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地などで適当に希釈し、マ
イクロタイタープレートに１０’〜１０６程度に植えつ
ける。各ウェルに選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地）を
加え、以後適当に選択培地の交換を行ない、培養する。

骨髄腫細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば
、未融合の骨髄腫細胞は、ＨＡＴ培地中では１０日目ぐ
らいまでに全部死滅し、また、抗体産生細胞は正常細胞
であるから、インビトロ（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ）では長
時間生育できない。したがって、培養１０〜１４日ぐら
いから生育してくるものはすべて雑種細胞である。

（ｅｌ　　抗体産生雑種細胞の検索 雑種細胞のスクリーニングは常法によればよく、特に限
定はない。たとえば、雑種細胞の増殖したウェルの上清
の一部を採取し、ｔ−ＰＡと反応させたのち、酵素、ラ
ジオアイソトープケイ光物質、発光物質で標識した第２
抗体との反応によって標識量を測定し、抗ヒト組織型プ
ラスミノーゲンアクチベーターの存在を検定することが
できる。

ｆｆ）　　クローニング 各ウェル中には２種以上の雑種細胞が生育している可能
性があるので、限界希釈法などによりクローニングを行
ない、モノクロナル抗体産生雑種細胞を取得する。

（沿　抗体取得 最も純粋なモノクロナル抗体は、所望の雑種細胞を１０
％程度のウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地など
の適当な培養液で培養し、その培養上清液から得ること
ができる。

一方、さらに大量の抗体を取得するためには、骨髄腫細
胞の由来動物と同系の動物にプリスタン（２，６，１０
，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹
腔内投与し、その後、雑種細胞を投与することにより、
インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）でＭ種細胞を大量に増殖
させればよい。この場合、１０〜１８日位で腹水腫瘍を
形成し、血清および腹水中に高濃度の抗体が生ずる。

（ｈ）　　モノクロナル抗体の精製 腹水からの抗ヒトＭｉ織型プラスミノーゲンアクチベー
ターモノクロナル抗体の精製は、通常の血清からの抗体
の回収方法に準じた方法、たとえば、Ｈｕｄｓｏｎら（
Ｐｒａｃｔｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｂｌａｃ
ｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉ。

Ｐｕｂ、、　１９７６年）を適用することができる。

抗原物質として精製したｔ−ＰＡの力価測定は、次の方
法で行なった（以下の実験についても同様）。

９５％凝固フィブリノーゲン（プラスミノーゲン含量約
５０カゼイン単位／ｇ凝固蒼白）を原料として作製した
寒天前フィブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品と
するプレート法で測定した。ｔ−ＰＡ温溶液、１％ゼラ
チン、０．１Ｍ塩塩化ナトリン台よび０．１％窒化ナト
リウムを含む０．０６７Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で希釈し、フィブリン平板上でｌ０ＩＵ／ｍｌのウ
ロキナーゼと同じ溶解窓を示す本発明に用いるプラスミ
ノーゲンアクチベーター溶液の濃度をＩＯＵ／ｍｌとし
た。

本発明によれば、人正常細胞由来のｔ−ＰＡに対して特
異性があることを特徴とするモノクロナル抗体が雑種細
胞系によって提供される。

か（して得られた抗ヒト組織型プラスミノーゲンアクチ
ベーターモノクロナル抗体は、不溶性担体と化学的に結
合することにより、ｔ−ＰＡ精製に利用することができ
る。すなわち、カラムに充填された該不溶性担体とｔ−
ＰＡを含む人正常細胞由来培養液またはこれらの粗精製
溶液を接触せしめることにより、ｔ−ＰＡは該不溶性担
体に固定されてカラムに保持される。次に、ｐＨ５〜９
の洗浄液で該不溶性担体を洗浄して未吸着不純物質を除
去し、続いて溶離液にて該不溶性担体から吸着ムたｔ−
ＰＡを溶離せしめる。ここで用いられる不溶性担体、不
溶性担体と抗ヒ）ｍ織型プラスミノーゲンアクチベータ
ーモノクロナル抗体との結合方法、溶離液等は、通常の
アフィニティークロマトグラフィーに用いられるものな
らどのようなものでも適用することができる。

（発明の効果） 本発明の抗体を用いれば、人正常細胞由来培養液または
これらの粗精製ｔ−ＰＡ溶液中に含まれる不純物を１段
階で容易に分離除去することができ、極めて高い純度の
ｔ−ＰＡを高回収率で取得することができる。

さらに、該不溶性担体はｔ−ＰＡを脱着せしめたのち、
洗浄液で洗浄するだけで何回でも使用することができる
ので、ｔ−ＰＡ精製工程に簡便さを与えることができる
など多くの利点を有し、工業的に極めて有用である。ま
た、本発明における抗ヒト組織型プラスミノーゲンアク
チベーターモノクロナル抗体の異なる利用方法としては
、臨床等におけるｔ−ＰＡの免疫定量が挙げられる。ｔ
−ＰＡの血中での作用機構の研究など、凝固線溶系の解
析に該モノクロナル抗体を導入することにより、感度の
高い微量定量が可能になる。

（実施例） 実施例１ 抗原の精製 大胎児腎組織培養液４１に硫安を３００　ｇ　／　ｌの
割合で加え、４℃下−晩装置する。生じた沈澱を濾過で
集め、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍロダンアンモニウ
ム溶液で溶解する。得られた溶解液は液量４００ｍ１．
　ｔ　−Ｐ　Ａの活性は２１Ｕ／ｍｌ、比活性は１０　
Ｕ／Ａ　ｚ　ｓ。であった。これをフェニールセファロ
ースカラム（Ｉ　Ｘ　１０ｃｍ）に吸着させた後、エチ
レングリコールを５０％程度まで濃度勾配法で増加させ
、ｔ−ＰＡを溶出する。溶出液は液量１５０ｍ１．　ｔ
　−Ｐ　Ａの活性は５２Ｕ／ｍｌ比活性は２５０　Ｕ　
／　Ａ　ｚ　＊。であった。

この溶出液は０．１％ツイン８０を含む生理食塩水で透
析し、抗つロキナーゼＩｇ−Ｇセファロースカラムを通
過させた後、アルギニンセファロースカラム（１，５×
１０ｃｍ　）に連続的に吸着させる。０．１％ツイン８
０を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、０
．１％ツイン８０を含む０．５Ｍアルギニン溶液でｔ−
ＰＡを溶出する。この溶液は、液量５２ｍ１、ｔ−ＰＡ
の活性は９８Ｕ／ｍｌ、比活性は３２００Ｕ　／　Ａ　
ｚｏｏであった。

これを凍結乾燥で濃縮後、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０
．１Ｍアルギニン、０．１Ｍ　　ＥＤＴＡおよび０．１
％ツイン８０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したセファデックスＧ−１５００カラム（
１，５×１００ｃｍ　）でゲル濾過して活性のある部分
を集める。得られた溶液は液量１５ｍＬ　ｔ　−Ｐ　Ａ
の活性は２７０Ｕ／ｍｌ、比活性は１２５００Ｕ／　Ａ
ｔｌ１゜であった。

マウスの免疫 上述の如く精製したｔ−ＰＡ１００μｇをフロイント・
コンプリート・アジュバントに乳濁化させ、マウスＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ♂群の皮下に２週間の間隔をあけて
３回投与し、免疫を行なった。これらのマウスの中で、
ｔ−ＰＡに対する血清抗体価が最も高いマウスにｔ−Ｐ
Ａ１００μｇを腹腔内注射し、免疫を完了した。

細胞融合 最終免疫の３日後にマウスを殺し、肺臓を取り出し、細
断した後５．ステンレスメツシユで圧迫、濾過し、イー
グルズ・ミニマム・エッセンシャル・メディウム（Ｍ　
Ｅ　Ｍ）に浮遊させ、肺臓細胞浮遊液を得た。この牌細
胞とマウス骨髄腫細胞５ｐ−１をそれぞれ血清を含有し
ないＭＥＭで３回洗浄し１．牌細胞と５Ｐ−１とを１０
＝１で混合して遠心後（８００回転、５分）沈澱を軽く
ほぐし、４４％ポリエチレングリコール２０００／Ｍ　
Ｅ　Ｍ溶液１ｍｌを徐々に加え、３７℃温水中で１分間
遠心管をゆっくり回転させて細胞融合を行なった。１分
後ＭＥＭ１ｍｌを加えてゆっくり回転させ、さらに毎分
２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、計１０ｍ１とした後、
１０００回転、５分間遠心して上清を除去した。この細
胞沈澱物を１０％ウシ胎児血清含有ロズウエル・パーク
・メモルアル・インステイチュート（ＲＰＭｒ）１６４
０培地に５Ｐ−１が１×１０６個／ｍｌになるように懸
濁し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）に０
．１ｍｌずつ植えつけた。

１日後、ＨＡＴ　（ヒポキサンチンＩ　Ｘｌ０−’Ｍ。

アミノプリテン４　Ｘｌ０−’Ｍ、チミジン１．６Ｘ１
０−’Ｍ）を含んだＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０−１０％Ｆ
Ｃ３培地（ＨＡＴ培地）を各ウェルに０．１ｍｌずつ添
加し、その後、３〜４日毎に１／２ｆをＨＡＴ培地で交
換して、ＨＡＴ選択を進めた。雑種細胞は７日月ぐらら
いくつかのウェルで生育が認められ、１０〜１４日後に
はほぼ全ウェルで雑種細胞が増殖した。

抗体産生細胞の検索 雑種細胞が増殖した穴の培養液を分取し、Ｅｎｚｙｍｅ
Ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ
　　（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）によりｔ−ＰＡに対する抗
体産生雑種細胞を調べた。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡは　Ｊｅａｎ−Ｌｕｃ　Ｇｕｅｓｄｏｎ
（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　２７．１１３１．１９７９）のビ
チオン−アビジン系を用いた。９６六マイクロプレート
にｔ−ＰＡを０．０５μｇ／１００μｌ／穴分注し、２
５℃で１８時間静置して、ｔ−ＰＡを固相に吸着させた
。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄し
た後、０．５％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ２００μ
ｌを加え、０℃で一晩静置し、各穴の未吸着部分をブロ
ックした。

次いで、検体である培養液を１００１１６／穴を入れ、
３７℃で２時間反応させた。０．０５％トリトンＸ−１
００を含むＰＢＳで３回洗浄後、ビチオン化−ヤギ抗マ
ウスＩｇＣ，（ＥＹラボラトリ−社製）１００μｍ／穴
を加え、３７℃で１時間反応させた。

洗浄後、ワサビパルオキシダーゼ−アビジン（ＥＹラボ
ラトリ−社製）１００μｌ／穴を加え、１時間後ＰＢＳ
−１−リドンで洗浄した後、０．００１％過酸化水素、
　０．１５＋ｎｇ／ｍｌ　　Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−
ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ　−６，６
−５ｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（牛丼化学薬品社製）
の０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４
，０）を加え、波長４１４ｎｍでの吸光度を測定した。

検体中、ｔ−ＰＡに対する抗体が存在した穴にのみ発色
が見られる。

ｔ−ＰＡに対する単一抗体産生細胞のクローニング ＥＬＩＳＡで陽性を示したマイクロプレートの穴の雑種
細胞を取り出し、細胞の数を測定した。

１０％ウシ胎児血清添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地で
希釈し、マイクロトレイに０．５個／穴の割に接種した
。マイクロトレイは前日、マウスの腹腔細胞をｆｅｅｄ
ｅｒｃｅｌｌとして２Ｘ１０５個／ｍｌ接種、培養した
ものを用いた。培地を交換しながら、約２週間注意深く
培養を続け、雑種細胞のコロニー形成を待った。

雑種細胞が増殖し、コロニーの出現した穴の抗体産生量
をＥＬ　Ｉ　ＳＡで測定し、陽性を示した雑種細胞を再
度クローニングした。

抗体産生能の高いクローン細胞Ｘ−２１およびＸ−２３
が得られた。

ｉｎ　　ｖｉｖｏによるｔ−ＰＡに対する単一抗体の作
製 ７週令以上のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスにＰｒ１ｓｔａｎ（
アルドリッチ社製）　０．５ｍｌを腹腔内投与し、１週
間以上経過した後、ｉｎ　ｖｉｖｏで培養、増殖させた
雑種細胞（Ｘ−２１）　　Ｌ〜９Ｘ１０’個／マウスを
腹腔内接種した。雑種細胞（Ｘ−２１）を接種した１週
間後から、マウスの体重は急激に増加し、１０〜１５日
にピークに達した。体重がピークの前後にマウスをエー
テル麻酔下に層殺し、腹水を採取した。これを３．００
Ｏｒｐｍ　　１０分間遠心分離し、５〜１５ｍ１／匹の
モノクロナル抗体含を腹水を得た。

実施例２ モノクロナル抗体の精製 実施例１で得られた腹水１０ｍ１から、Ｈｕｄｓｏｎら
（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉ、　Ｐｕｂ、。

１９７６年）の方法に準じてモノクロナル抗体を精製し
た。

まず、腹水１０ｍ１に飽和硫酸アンモニウム溶液１０ｍ
１　（５０％飽和）を加え、４℃下−晩装置する。生じ
た沈澱を遠心分離し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８
）５ｍｌで溶解し、１００量倍の同緩衝液に一晩透析し
た。透析後１０，０００回転、５分間遠心分離して上澄
み液を分取した。このサンプルを充分量の０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化しておいたＤＥＡＥ　ト
ヨバール６５０Ｍカラム（東洋曹達社製）２０ｍ　ｌに
かけ、Ａｔ、。が０．０２以下になるまで０．０１Ｍト
リス緩衝液（ｐ　Ｈ８）で洗浄した後、当該溶液から０
．２Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｌを含む０．０１Ｍ　）リス緩衝
液（ｐＨ８）まで直線的に濃度を変え、該モノクロナル
抗体を分画溶出した。モノクロナル抗体分画はＥＩＡに
よる抗体活性および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により決定し、続いて、リン酸緩衝食塩水で平
衡化したセファデックスＧ−２００カラム（ファルマシ
ア社製）を用いて分画溶出し、Ｘ−２１モノクロナル抗
体１０６ｍｇを得た。

実施例３ モノクロナル抗体の物理化学的性質 以下の物性は、実施例２で精製したモノクロナル抗体（
Ｘ−２１）を用いて測定した。

ａ）分子量：　　１５０．０００±５．０００５〜１０
％の濃度勾配ゲルによる５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルスラブ電気泳動をＬａｅｍｍｌｉの緩衝液系を用いて
行ない、再クローン性抗体の分子量を推定した。分子量
マーカーはＢｉｏ　Ｒａｄ社の５ＤＳ−ＰＡＧＥ標準分
子量マーカー（Ｈｉｇｈ）　（ミオシン２００に、　　
β−ガラクトシダーゼ１１６．２５　Ｋ。

ホスフオリラーゼ８９２．５　Ｋ、ウシ血清アルブミン
６６．２　Ｋ、オボアルブミン４５Ｋ）を用いた。

ｂ）ＩｇＧサブクラス：　ＩｇＧ１ １　／１５Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２）にアガロ
ースを１％加え、煮沸溶解後スライドグラスに５ｍｌの
せて固化した。直径３Ｉｌｌｆｆｌの穴を３ｍｍ間隔で
開け、各穴に腹水化に成功した融合細胞の培養液または
ヤギで作製したマウス抗体に対する抗血清（抗マウスＩ
ｇ）の各種類を１５μ！入れた。スライドグラスを湿潤
箱に入れ、室温で１８時間静置し、培養液と抗マウスＩ
ｇを入れた２大間に抗原抗体反応による沈降線の形成を
観察した。

Ｃ）等電点：　　ｐｌ＝６．７〜７．０ＬＫＢ−カラム
等電点電気泳動装置を用い、１■程度の部分精製した再
クローン性抗体を添加し、ｐＨ３，５〜９．５のアンホ
ラインキャリア：アンホライト（ＬＫＢ社製）存在下で
４℃、定電圧７００Ｖ、４０〜６０時間通電し、定常状
態となったところで、１ｍｌずつ分画した。水冷下でｐ
Ｈ測定後、２８０ｎｎ＋−の吸光度とｔ−ＰＡに対する
特異的抗体の検出を再クローン抗体のスクリーニング法
を利用して測定した。結果を第１図に示す。

ｄ）抗原との結合部位： フィブリン親和性部位および線維素溶解活性発現部位以
外の抗原決定基 実施例１および２と同様にして製造したＸ−２１モノク
ロナル抗体およびＸ−２３モノクロナル抗体を用い、ｔ
−ＰＡと抗原抗体反応させた後、フィブリンプレート法
で残有する線維素溶解活性を測定した。結果を表１に示
す。

表１ Ｘ−２１Ｘ−２３ 残存活性（％）　　　　１００　　　　　２５上記の抗
原抗体反応液をり、Ｌ、Ｈｅｅｎｅらの方法に準じて作
製したフィブリンセファロースカラム（Ｔｈｒｏｍｂ、
　Ｒｅｓ、　２１３７〜１５４（１９７３）　）に付し
、０．３Ｍアルギニン・塩酸を加えた生理食塩液に溶出
させ、溶出液の線維素溶解活性をフィブリンプレート法
にて測定した。結果を表２に示す。

表２ 線維素溶解活性（％） 溶出液　ｔ−ＰＡ単独　ｔ−ＰＡ−Ｘ−２１ｔ−ＰＡ−
Ｘ−２通過画分　　２０　　　　　　２３　　　　　　
　８６溶出画分　　８０　　　　　　７７　　　　　　
　１４ｅ）　アミノ酸配列（Ｎ末端） 配列解析はＥｄｍａｎ分解（Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、
、ＥｕｒｏｐｅａｎＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１．８０
．１９６７年）に基いて行なった。

サンプルを気相プロティンシーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓ　ｔｅｍｓ社製、　Ｍｏｄｅｌ　４７０
　Ａ）のカートリッジに導入し、予め作成したプログラ
ムを用いて自動的にｃｏｕｐｌｉｎｇ、　ｃｌｅａｖａ
ｇｅおよびｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ反応を行なった。得ら
れたＰＴＨ（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸を
アセトニトリル／　ＨＺ　Ｏ／ＴＦＡ　（）リフルオロ
酢酸）　＝３３／６７１０．０２　（ｖ／Ｖ／Ｖ）に溶
解し、逆相高圧液体クロマトグラフ（カラム：４．６φ
Ｘ　３０ｃｍ、センシュー科学製５ＥＱ−４）に注入し
、その保持時間を標準ＰＴＨ−アミノ酸の保持時間と比
較することによって各ＰＴＨ−アミノ酸を同定した。

得られたアミノ酸配列は下記のとおりである。

Ｌ鎖：Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｉ
ｎ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｌａ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｘ　　−’　　　１ｉｅ−Ｓｅ
ｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ
−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−（Ｇｌｙ）Ｈ鎖：Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅ　ｒ−Ｇｌ　ｎ−３ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−３ｅ　ｒ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　−Ｃｙ″５−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｙ　ｒ　−（Ｓｅ　ｔ）　−１１ｅ
−Ｔｈｒ−Ｘ　　−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（式中、括弧は推定
残基、Ｘは未同定残基を表わす。）ｆ）各種プラスミノ
ーゲンアクチベーターとの交叉反応性 ヒト尿由来ウロキナーゼおよびブタ心臓抽出プラスミノ
ーゲンアクチベーターとの反応性をＥＬＩＳＡ（ビチオ
ン−アビジン系）により調べた。

ｘ−２１モノクロナル抗体はｔ−ＰＡのみと結合し、そ
の他のウロキナーゼ、ブタ心臓抽出プラスミノーゲンア
クチベーターとは反応しなかった。

実施例４ 免疫吸着クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡの精製 人胎児腎細胞培養液５１に硫酸アンモニウム３００　ｇ
　／　ｌを加え、４℃で一晩放置する。生じた沈澱を遠
心分離し、０．１％ツイン８０を含む生理食塩水で溶解
する。得られた溶解液は、液量４８０ｍ１、活性３５Ｕ
／ｍｌであった。この粗精製液を限外濾過で約５０倍に
濃縮した後、０．０１％ツイン８０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液で洗浄したＸ−
２１モノクロナル抗体結合セファロース４Ｂ（抗体３ｎ
＋ｇ／ｍｌ担体）カラムに、濃縮液５ｍｌを通した。未
吸着分を洗浄除去後、カラムに吸着保持されたｔ−ＰＡ
を、５０％エチレングリコール、０．０１％ツイン８０
を含む０．１Ｍグリシン・塩酸（ｐＨ２，５）で溶出し
た。溶出した分画の吸光度Ａ２１１゜とｔ−’ＰＡ活性
の関係を第２図に示した。

粗精製液と溶出分画の性質は表３のとおりであつた。

表３ サンプル　　　活性（Ｕ／ｍｌ）　　回収率（％）粗精
製液　　　　７８００　　　　　　１００溶出分画　　
　　６５００　　　　　　８３実施例５ モノクロナル抗体を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡによるｔ−Ｐ
Ａの定量 実施例１および２にしたがって製造したモノクロナル抗
体Ｘ−２１およびＸ−２３を用いて、ＥＬＩＳＡ用試薬
を調製した。

（１）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）［識モノ
クロナル抗体−Ｆａｂ’　の作製Ｓ、Ｙｏｓｈｉｔａｋ
ｅらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９２．１４１３〜
１４２４．１９８２）に準じて、モノクロナル抗体Ｘ−
２３Ｉ　ｇＧ　３０ｍｇをペプシン消化し、セファデッ
クスＧ−１００を用いゲル濾過して、Ｆ　（ａｂ’）ｚ
分画を分取した。得られたＦ　（ａｂ’）ｚの緩衝液溶
液にβ−メルカプトエチルアミンを加え、３７℃で２時
間還元処理した後、セファデックスＧ−２５を用いて分
画し、Ｆａｂ”を採取した。マレイミド化ＨＲＰとＦａ
ｂ’　を混合し、４℃で２００時間反応せた後、０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化した
セファクリルＳ−２００を用いて精製し、２８０ｎｍお
よび４０３ｎｍの吸光度を測定し、吸収極大部分の分画
を分取した。

＋２）ＥＬＩＳＡ測定系 ９測定子底マイクロプレートの各ウェルに０．０５Ｍ炭
酸ナトリウム（ｐＨ９，６）に溶解したモノクロナル抗
体Ｘ−２１を２００μβずつ添加した。２５℃で３時間
湿潤箱でインキュベートし、溶液を捨てた後、０．０５
％ツイン２０を含むＰＢＳ溶液を各ウェルに注ぎ、数分
間振盪洗浄し、溶液を捨てた。ｔ−ＰＡを０．１％ＢＳ
Ａを含むＰＢＳ／ツイン溶液で希釈し、２００μＥずつ
各ウェルに注加し、２５℃で１６時間反応させた。先と
同様にＰＢＳ／ツイン溶液で洗浄した後、ＨＲＰ標識モ
ノクロナル抗体Ｘ−２３−Ｆａｂ’　のＰＢＳ／ツイン
希釈溶液を２００μ！添加し、２５℃で３時間反応させ
た後、溶液を捨てた。洗浄後、酵素基質として、０．０
１％過酸化水素、０−フェニレンジアミン（０，４ｍｇ
／ｍｌ）を含むクエン酸リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ　
Ｈ５，０）　２００μｌを添加し、２５℃で３０分間反
応させた。４．５Ｍ硫酸５０μ！を加え、反応を停止さ
せた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。

（３）測定系の感度 各種濃度のｔ　−Ｐ　Ａ　（０，０４〜０．００１２５
　Ｕ／ｍｌ）を用い、１０回測定した平均値で検量線を
作成した。

結果を第３図に示す。

この結果から、本測定系を用いれば、ｔ−ＰＡ（ＬＯＯ
２Ｕ／ｍｌまでは定量可能である。

実施例６ ヒト血液中のｔ−ＰＡの定量 実施例５で調製したＥＬＩＳＡにより、人血液中のｔ−
ＰＡの定量を行なった。検体はＢｅｒｇｓｄａｒｆらの
方法（Ｔｒｏｎ＋ｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、　５０．７４
０〜７４４．１９８３）に準じて調製した。クエン酸加
採血した血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、　１５分）
して得た血漿２５ｔｔｌに、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐ　Ｈ３，９）２５μｌを加え、室温で１時間放置す
る。０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム−０，４Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液を５０μ！加え中和した後、０．１％
ＢＳＡを含むＰＢＳ／ツイン溶液４００μｌを加え２０
倍希釈液とし、検体とした。健常人２２名より採血し、
ｔ−ＰＡの定量を行なった。結果を第４図に示す。

この結果から、健常人血液中のｔ−ＰＡは、平均０．２
２２±０．０１１（Ｓ　Ｄ）　Ｕ／ｍｌ　（８，８８ｍ
ｇ／ｍｌ）であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はｘ−２１モノクロナル抗体の等電点電気泳動結
果と抗体活性の相関を示した図表、第２図はｘ−２１モ
ノクロナル抗体を用いた免疫吸着クロマトパターンであ
り、各溶出骨画く横軸）の吸光度（Ａ２８゜）とｔ−Ｐ
Ａ活性の相関を示した図表、第３図はＸ−２１モノクロ
ナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる検量線の図表、第４
図は健常人血液中のｔ−ＰＡＯ量を測定した結果を示す
図表である。 〉容出分画 第３図 し−ＰＡ　　　Ａス　　度　　（ｑろｎｌ）手続補正書 昭和６ａ年３月１３日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）人の正常組織由来細胞の細胞培養液より採取した
   組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対する下記の
   性質を有するモノクロナル抗体。 ａ）分子量：１５０，０００±５，０００ ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ ｃ）等電点：６．７〜７．０ ｄ）抗原との結合部位：フイブリン親和性部位および線
   維素溶解活性発現部位以外の抗原決定基 ｅ）Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列 Ｌ鎖：【アミノ酸配列があります】 Ｈ鎖：【アミノ酸配列があります】 （式中、括弧は推定残基、Ｘは未同定残基を表わす。）
2. （２）免疫吸着クロマトグラフイーによる人正常細胞由
   来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターの精製に当
   り、人の正常組織由来細胞の細胞培養液より採取した組
   織型プラスミノーゲンアクチベーターに対する下記の性
   質を有するモノクロナル抗体を使用することを特徴とす
   る精製法。 ａ）分子量：１５０，０００±５，０００ ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ ｃ）等電点：６．７〜７．０ ｄ）抗原との結合部位：フイブリン親和性部位および線
   維素溶解活性発現部位以外の抗原決定基 ｅ）Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列 Ｌ鎖：【アミノ酸配列があります】 Ｈ鎖：【アミノ酸配列があります】 （式中、括弧は推定残基、Ｘは未同定残基を表わす。）
3. （３）人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチ
   ベーターの検出に当り、人の正常組織由来細胞の細胞培
   養液より採取した組織型プラスミノーゲンアクチベータ
   ーに対する下記の性質を有するモノクロナル抗体を使用
   することを特徴とする検出法。 ａ）分子量：１５０，０００±５，０００ ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ ｃ）等電点：６．７〜７．０ ｄ）抗原との結合部位：フイブリン親和性部位および線
   維素溶解活性発現部位以外の抗原決定基 ｅ）Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列 Ｌ鎖：【アミノ酸配列があります】 Ｈ鎖：【アミノ酸配列があります】 （式中、括弧は推定残基、Ｘは未同定残基を表わす。）