JPH022936A - 組織型プラスミノーゲン活性化因子の測定方法及びその測定試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主束上皇机几分立 本発明は、エンザイム・イムノアッセイを用いて、ｔ−
ＰＡを高感度かつ高精度で測定するための方法及びその
測定試薬キットに関する。

皿米及歪 血液は生体機能を司る最も重要な液性因子であり、種々
の研究が盛んに行われ、その機能が明らかにされてきて
いる。この中でも、近年になり、特に詳細な解析が進め
られてきたのが、凝固・線溶系の機能である。つまり、
出血により凝固因子が活性化されて止血されたり、血管
内に血流が生成した際に、線溶機能が活性化されてフィ
ブリンが分解され、−時的に停止していた血流が再開さ
れたりする機能である。そして、このフィブリン分解の
過程で、重要な役割を果たす物質がｔ−ＰＡである。因
に、このｔ−ＰＡの血中濃度は、正常な状態の成人で５
　ｎｇ／ｍ　１２程度であることが知られている。した
がって、ｖＡ？Ｂ系機能の異常をチエ・７りするために
、ｔ−ＰＡの血中濃度を測定することは非常に意義があ
る。また、最近では、遺伝子組換技術によってヒト型の
ｔ−ＰＡが大量に供給されるようになり、心筋梗塞患者
や脳梗塞患者のような血栓によって起こった重度の疾患
に対し、血栓溶解の目的で使用されるようになってきた
が、ｔ−ＰＡを大量に投与することによって出血傾向と
なるため、或いは、治療に必要なｔ−ＰＡの血中濃度維
持が難しいため、ｔ−ＰＡの血中濃度測定が不可欠とさ
れている。更には、各種の疾患と血中Ｌ−ＰＡ値との因
果関係にも注目されるようになり、ｔ−ＰＡ値が正常値
より高い場合は肺梗塞症等の疾患が想定され、また、ｔ
−ＰＡ値が正常値より低い場合はエンドトキシン・シ”
！７りによるＤＩＣ（播種性血管向凝固症）等の疾患が
想定されるようになってきている。

一方、現在までに、ｔ−ＰＡの血中濃度を測定するため
の試薬キットとしては、ｔ−ＰＡのポリクローナル抗体
を用いた２種類のＥＬｔＳＡキットが既に市販されてい
る。しかし、これら市販の測定キットは、何れも、検量
線の直線性が悪く、感度も低いという問題があり、また
、一次抗体としてアフィノピューリファイされていない
ポリクローナル抗体を用いるために、特異性が劣るとい
う問題もあった。更に、血漿中のｔ−ＰＡを測定する場
合、ｔ−ＰＡがインヒビターと結合している状態を考慮
して、血漿を分離後、速やかに酸処理を行い、その後、
直ちに中和処理を行ったものをサンプルとして用いなけ
れば正確な測定値を得ることができず、したがって、大
量のサンプルを処理する際には、煩雑な前処理操作が大
きな欠点となっていた。なお、サンドイッチ・エンザイ
ム・イムノアッセイ法によるｔ−ＰＡの測定については
、特開昭５９−１７４７５９に提案されているが、測定
に用いる血漿サンプルの調製についても問題がある。因
に、血漿中には測定の対象となるｔ−ＰＡの他に、類似
の特性を持った蛋白分解酵素が多数存在し、また、エン
ザイム・イムノアッセイ法の標識として用いる酵素の阻
害物質も多種存在するため、このような物質に対する抑
制を検討しなければ、高精度で、且つ、高感度の測定は
困難である。

口が解ンしようとする晋。

本発明者らは、上述のような問題に鑑み、エンザイム・
イムノアッセイ法にょるｔ−ＰＡのｉＩｑ定について鋭
意検討を重ねたところ、サンドインチ法を採用し、該方
法における一次抗体として（−ＰＡの一本鎖及び二本鎖
の両方を等しく認識し、かつ遊離のｔ−ＰＡのみならず
、ｔ−ＰＡ−ＦＡＩコンプレックスもほぼ完全に認識す
るモノクローナル抗体を用いることにより、簡単な操作
で高感度、高精度にｔ−ｐｘを測定できることを見出し
た。しかも、特に、血漿中のｔ−ＰＡを測定する際に、
ベンズアミジン等の低分子のセリンプロテアーゼインヒ
ビター、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、及び
牛血端７／ｌ、ブミン（ＢＳＡ）を含む所定のリン酸食
塩榎衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を用いて測定に供するサンプル
を希釈することにより、簡単な操作で、測定の感度と精
度を高めることに成功した。

したがって、本発明は、高感度で、且つ、高精度の測定
値が得られるｔ−ＰＡ測定法を提供することを課題とす
る。また、特に、血漿中のｔ−ＰＡを測定する際に、煩
雑なサンプルの前処理操作を必要としない筒便なｔ−Ｐ
Ａ測定法を提供することを課題とする。更には、これら
の測定法に適した測定試薬キットを提供することも課題
とする。

以下本発明の詳細な説明する。

光皿見桃底 本発明の特徴は、ｔ−ＰＡを測定するサンドイッチ・エ
ンザイム・イムノアッセイ法において、一次抗体として
Ｌ−ＰＡの一本鎖及び二本鎖の両方に親和性を有し、か
つ遊離のｔ−ＰＡ及びＬＰＡ−ＰＡ　Ｉコンプレックス
の両方に親和性を有するモノクローナル抗体を使用する
ことにある。

また、本発明は、サンプルの血漿を希釈するための緩衝
液として、５〜１０ｍＭの塩酸ベンズアミジン、１〜１
）０１ＩＩのＥＤＴＡ、０．０５〜０．１５％のＢＳＡ
。

０．０１〜０．１０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを
用いることも特徴とし、更には、本発明に係る測定法を
実施するのに適した、固定化一次抗体、酵素標識二次抗
体、及びサンプル希釈用緩衝液を組み合せた測定試薬キ
７）も特徴とする。

課　を解ンするための 本発明に用いる一次抗体は、ｔ−ＰＡの一本鎖及び二本
鎖の両方及び遊離のｔ−ＰＡ、更にはｔＰＡ−ＦＡＩコ
ンプレックスの両方に親和性を有するモノクローナル抗
体であり、該モノクロナル抗体としては先に本発明者ら
が出願したモノクローナル抗体（特開昭６ｌ−２２１）
２８）の中から選ばれる。また、酵素標識する二次抗体
は、一次抗体と抗原認識部位の異なるポリクローナル抗
体、又はモノクローナル抗体を用いるが、−船釣にサン
ドイッチ・エンザイム・イムノアッセイ法では、ポリク
ローナル抗体を用いた方が良好な測定結果が得られるた
め、抗ｔ−ＰＡポリクローナル抗体を用いることが好ま
しい。この二次抗体の標識に用いる酵素は、ペルオキシ
ダーゼ、ガラクトシダゼ、或いは、ホスファターゼ等を
例示し得る。

更には、測定試薬キットに組み込む一次抗体は、９６六
マイクロウエル、ガラスピーズ、プラスチック小試験管
、イムノボール等の固相表面に固定化する。

本発明においては、ｔ−ＰＡの一本鎖及び二本鎖の両方
及び遊離のｔ−ＰＡ、およびｔ−ＰＡ−ＰＡＩコンプレ
ックスの両方に親和性を有するモノクローナル抗体を一
次抗体として、９６六マイクロウエル、ガラスピーズ、
プラスチック小試験管、イムノボール等の固相表面に固
定化する。抗体の固定化は、例えばＰＢＳで希釈した抗
体を３７η、３時間、固相表面に接触、吸着させる方法
等、通常の方法を用いることができる。一次抗体を固相
表面に吸着させた後、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３〜４回洗浄することにより
、固相表面に固定化した一次抗体は使用が可能となる。

なお、一次抗体の固定化に用いられる固相としては、９
６穴マイクロウエル（ファルコン社製）が簡単であり、
最も利用されることが多い。

二次抗体として用いる抗体と標識酵素を結合させる方法
としては、例えば、抗体をＦ（ａｂ’）ｚフラグメント
に切断した後、高純度ｔ−ＰＡを固定化したアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーにより、ｔ−ＰＡに特異的な
Ｆ（ａｂ’）ｚのみを取得し、マレイミド化ペルオキシ
ダーゼと結合させる方法（特開昭５８−１４９７００）
等を用いることができる。

このようにして、作成された固定化一次抗体及び酵素標
識二次抗体を用いて、サンドイッチ・エンザイム・イム
ノアッセイにより、ｔ−ＰＡの測定を行う。

特に、Ｌ−ＰＡ測測定対象が血漿のような夾雑酵素や酵
素阻害物質を含むものであっても、セリン・プロテアー
ゼ・インヒビターである塩化ヘンズアミジン、キレート
化剤のエチレンジアミン四酢酸、−ａ的なエンザイム・
イムノアッセイに用いられるブロッキング剤の牛血清ア
ルブミン、及び界面活性剤のＴｗｅｅｎ２０を含むリン
酸食塩緩衝液（０，ｌＮ　ＮａＣｌでｐｌ＋　７．４に
調整）で希釈することにより、簡単にサンプルとして測
定することが可能である。

次に、サンプルの希釈に用いるリン酸食塩緩衝液の組成
を示す。

リン酸食塩緩衝液 塩酸ベンズアミジン　　　　　　５〜１０　　ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸　　　１〜１０　　ｍＭ生血清アル
ブミン　　　　　０．０５〜０．１５％Ｔｗｅｅｎ　２
０　　　　　　　　　０．０１〜０．１０％一次抗体を
固定化したウェル中に、血漿サンプルを一定の４度段階
で希釈液により希釈したちの各１００μｌ添加し、３７
℃、３時間、又は４℃、夜放置して抗体とｔ−ＰＡを結
合させる。その後０．１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、洗浄
に用いたものと同一のＰＢＳで至適濃度に希釈した二次
抗体を１００μｐ加える。そして、３７℃、３時間又は
４℃、−夜放置して二次抗体とｔ−ＰＡを充分反応させ
る。次いで、洗浄用ＰＢＳで３回洗浄し、ラベルした酵
素に適した基質を添加する。例えば、ペルオキシダーゼ
を用いた場合、オルトフェニレンジアミン１０ｍｇ、３
５％過酸化水素水５μｌ、及びｐＨ４，５゜０．１Ｍク
エン酸−０，２Ｍリンｉ！１２２ナトリウム緩衝液２５
ｍ１からなる基質液を用いるとよい。この基質液を使用
直前に調製し、各ウェルに１００μｐ添加する。その後
、３７℃、３０分間反応させ、反応を６Ｎ硫酸液５０μ
２を加えて反応を停止させ、発色を４９２ｎｍの波長で
吸光度を測定し、同様に測定したｔ−ＰＡ標準液の検量
線によってｔ−ＰＡ量を測定する。

なお、本発明の方法によるｔ−ＰＡ標準液の検量線、及
び市販の測定キットを用いたｔ−ＰＡ標準液の検量線を
添付の第１図に示す。

本発明に係る測定方法に用いるｔ−ＰＡ測定用試薬キッ
トは、前述したモノクローナル抗体からなる固定化一次
抗体と酵素標識二次抗体及び検体希釈用のリン酸食塩緩
衝液を組合せて成るものであって、本試薬キットをｔ−
ＰＡのエンザイム・イムノアッセイに利用すると、ｔ−
ＰＡ試料（血漿検体）を該試薬キット中の緩衝剤により
、酸処理を行うことなく、簡易な操作で希釈することが
でき、更に該試薬キット中の一本鎖及び二本鎖のｔ−Ｐ
Ａ、遊離のｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ−ＰＡＩコンプレック
スにそれぞれ等しく親和性を有するモノクローナル抗体
を一次抗体として用いることにより、高感度かつ高精度
でｔ−ＰＡを測定することが可能となる。

因に、現在Ｌ　−Ｐ　Ａ　ＩＩＩ定試薬キットとして市
販されている各製品においては、一次抗体及び二次抗体
としてポリクローナル抗体を用いており、血中のｔ−Ｐ
Ａｊｌを４１ｑ定する場合、両製品とも遊離のｔ−ＰＡ
の回収は可能であるものの、血中に存在するインヒビタ
ーＰＡＩとｔ−ＰＡとが結合したｔ−ＰＡ−ＰＡＩコン
プレックスの完全なる回収は不可能であるために、血中
の全ｔ−ＰＡ抗原量を測定するには、血漿を酸処理（ｐ
Ｈ３，９）　してｔＰＡ−ＦＡＩコンプレックスを切断
した後、中和して測定することが必要である。そして、
この酸処理により未処理の場合に比べてｔ−ＰＡ抗原量
は約１．５〜２倍高値となるという問題があり、しかも
上記酸処理と中和には臨床検査上手数と時間がかかり、
実用工大きな障害となっている。

これに対し、本発明に係る試薬キットでは、次抗体に前
述したように、−本積及び二本鎖のｔＰＡ及び遊離のｔ
−ＰＡ、更にはｔ−ＰＡ−ＰＡｌコンプレックスをとも
に等しく認識し得るモノクローナル抗体を用いているた
め、遊離のｔＰＡのみならずｔ−ＰＡ−ＦＡＩコンプレ
ックスもほぼ完全に認識し回収されるので、血漿を酸処
理しな（でも容易に血中の全ｔ−ＰＡ抗原量を測定する
ことが可能となる。事実、本発明による試薬キットは血
漿の酸処理、未処理でも全ｔ−ＰＡ抗原量はほぼ一定で
あった（実施例５参照）。

更に、本発明に係る試薬キットのリン酸食塩緩衝１反を
用いて、凍結保存血漿を融解したものを希釈する場合１
００％の回収率を得ることができる。

なお、このことは、上記緩衝液中のセリンプロテアーゼ
インヒビター、例えばベンズアミジンハイドロクロライ
ドとエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）による、血漿
に由来する抗原抗体反応阻害因子の影響の排除及び血漿
に由来する各種プロテアーゼによるｔ−ＰＡ抗原分解作
用の抑制の各作用に因るものと推定される。

以下実施例を示して本発明及びその効果を具体的に説明
する。

実施例１ ヒト血　を試　としたｔ−ＰＡの測 マウス腹水より精製した抗ｔ−ＰＡモノクロナル抗体（
モノクローナル抗体の調製については特開昭６１−２２
１）２８号公報参照）１００．ｃｉｇ／ｍ７！（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）をＰＢＳで１０倍に希釈したものを、９６六マイ
クロウエルプレート（ファルコン社製）に各ウェル当り
１００μβ分注した。次いで、３７℃で３時間放置した
後、上記プレートを裏返して液を排除し、各ウエルヲ０
．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）と０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＢＴ−ＰＢＳ）で３回洗浄
したものを一次抗体として用いた。

次に、試料として１４名の健康成人からの血漿を、下記
組成のリン酸食塩緩衝液を用いて１０倍並びに２０倍に
希釈した。

５ｍＭ　　ＥＤＴＡ １０　ｍＭ　　塩酸ベンズアミジン ０．１％　ＢＳＡ ０１０５％　Ｔｗｅｅｎ（）ウィーン）２０上記組成の
ものをＰＢＳに溶解し、ρ１）７．４に調整したものを
上記希釈用緩衝液とした。

上記により希釈して得られた血漿の希釈液を、各ウェル
当り１００μβ分注し、３７℃で３時間放置して前記一
次抗体に反応させた後、ＢＴ−ＰＢＳで３回洗浄した。

次に、二次抗体としてペルオキシダーゼラベルＬ−ＰＡ
ポリクローナル抗体をＢＴ−ＰＢＳで１０００倍に希釈
したものを各ウェルに１００μｌ加え、３７℃で３時間
放置した後、ＢＴ−ＰＢＳで３回洗浄した後、下記組成
の基質液を１００μｌ添加し、３７℃で３０分間反応さ
せた。

基質液組成： オルトフェニレンジアミン　　　１０　　ｎａｇ３５％
過酸化水素水　　　　　　　５　μ１０、１Ｍクエン酸
−０，２Ｍリン酸２２５ｍｊ！ナトリウム緩衝液（ｐ）
ｌ　４．５） 反応終了後、６Ｎ硫酸を各ウェル当り５０μｌ加え、酵
素反応を停止させ、次いでマイクロプレートフォトメー
ター（コロナ社製）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。

同様に処理したｔ−ＰＡ標準品を用いて検量線を描き、
血漿当りのｔ−ＰＡ濃度を測定した。

これらの測定値に基いて、１０倍及び２０倍に希釈した
血漿値のｔ−ＰＡ換算値を算出した結果は表１に示すと
おりである。

表　　１ （単位、ｎｇ／ｍ　７！血漿） 実施例２ 本例は、ヒト血漿を検体として用いた場合の添加回数の
試験結果を示したものである。

実施例１に示した１４人分の血漿をプールし、このプー
ル血漿を抗ｔ−ＰＡマウスモノクローナル抗体固定化カ
ラムを通し、ｔ−ＰＡのみを選択的に除去した。これに
段階希釈したＬ−ＰＡを添加し、これを実施例１に示す
組成の血漿希釈のためのリン酸食塩緩衝液（ＢＥハソフ
ァ−）で１０倍に希釈した。一方、対照として、ｔ−Ｐ
Ａ添加血漿を実施例１に示したＢＴ−ＰＢＳで１０倍に
希釈した。本検量線を、ＢＴ−ＰＢＳ、ＢＥハソファの
２種をつくり、それぞれを、実施例１に示した手順に従
ってａｌｌ＋定した。

結果は第２図に示す通りであって、ＢＴ−ＰＢＳ希釈血
漿サンプルは、検量線、ＢＥバッファ希釈のものに比較
して誤差の大きいことが明らかである。

次に、上記血漿希釈液のための緩衝液に、塩酸ヘンズア
ミジンに代えて低分子セリンプロテアゼの１種であるパ
ラアミノベンザミジンを含むリン酸緩衝液を用い同様の
試験を行った。すなわち、上記ＢＥパンファーの組成中
の塩酸ヘンザミジンの代わりにパラアミノベンザミジン
を用いるほかは、上述したと同様の手順に従って試験を
行った。

その結果、血漿希釈のための緩衝液組成にパラアミノベ
ンザミジンのような低分子セリンプロテアーゼインヒビ
ターを用いた場合にも、塩酸ベンザミジンを上記組成に
用いた場合と同様の効果が得られた。

上述により、各種血漿へのｔ−ＰＡ添加回収試験を行っ
た結果を表示すると表２のとおりである。

表２ 実施例３ 本例は一末鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡの回収比較試験
を行った結果を示したものである。

ｔ−ＰＡ（９０％以上が一本鎖のｆｉｂｒｏｂｌａｓＬ
　ｔＰＡ）溶液にプラスミン溶液を加えたちの並びに等
量の緩衝液（実施例１で用いたもの）を加えたものをそ
れぞれ３７℃で１時間反応させて一本ｔＸ　ｔ−ＰＡと
二本鎖ｔ−ＰＡを得た。−本積と二本鎖の確認は電気泳
動法により行った。

次いで、ｔ−ＰＡ？ｍ度が等しい一末鎖Ｌ−ＰＡ溶液並
びに二本鎖ｔ−ＰＡ溶液を、本発明によるｔ−ＰＡ　　
ＥＬＩＳＡプロトコールに従って測定した。

結果は第３図に示すとおりであって、−末鎖ｔＰＡ溶液
、二本鎖ｔ−ＰＡ溶液ともに抗原量に差は認められず、
これにより本発明によるＩＦ、ＬＩＳＡは、−本積及び
二本鎖ｔ−ＰＡを等しく認識することがわかる。

実施例４ 本例Ｃ！ｔ−ＰＡ−ＰＡ　Ｉコンプレックスの回収試験
を行った結果を示したものである。

０、１Ｍグリシン、０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１？
Ｉ）リス１）Ｃ１（ｐＨ８，２）で２倍段階希釈した精
製Ｐ　Ａ　Ｉ　（７２，８μｇ／ｍ　ｌ〜１．２μｇ／
ｍ　１’　）を用意し、これに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐｌ＋　７．４）で調整した１
）００ｎ／ｍ　１のｔＰＡ溶液を等量混合し、３７℃で
３０分間インキュヘートを行った。

これらの反応液のｔ−ＰＡ抗原量及び活性を測定した。

ｔ−ＰＡ抗原量は本発明によるＥＬＩＳＡプロトコール
に従って測定した。

また、ｔ−ＰＡ活性は合成基質Ｓ−２２８８を用いて行
った。すなわち、１００ｎ＋Ｍ　　）リスＩＩＣＩ（ｐ
Ｈ８，２）に１５ｍＨのＳ　−２２８８と０．２６ｍｇ
／ｍ　１のｔ　−Ｐ　Ａｓｔｉｍｕｌａｔｏｒを加えた
ものを基質液として用意し、この基質液３０μｌにサン
プルを等増加えた後、３７℃で２時間反応させた。同時
に標準ｔ−ＰＡとしてＷｌ（０・ｔ　−Ｐ　Ａｓｔａｎ
ｄａｒｄを用いて反応させた。

結果は第４図に示すとおりで、ＦＡ　Ｉ　−Ｈ農産が増
加するに伴ない、ｔ−ＰＡ活性は減少したが、ｔ−ＰＡ
抗原量には変化がみられなかった。ｔＰＡ活性が減少す
るのはｔ−ＰＡがＦＡＩとコンプレックスを形成してい
るためと考えられる。この結果より、本発明によるＥＬ
ＩＳＡは遊離のｔＰＡのみならず、ｔ−ＰＡ−ＰＡ　Ｉ
コンブ１／・ｊリスも認識していることがわかる。

実施例５ 本例は本発明に係る測定方法と、従来の酸処理を行う方
法との比較を行った結果を示したものである。

１５例の血漿試料を用い、各血漿試料を２分割し、一方
は実施例１に示す方法で測定した。他方は、市販の測定
試薬を用い、前述した酸処理と中和を行う前処理、すな
わち、血漿に等量の１．０Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，９）
を加え、３７℃、１５分間保温した後、直ちに０．　Ｉ
Ｍ　ＮａｇｌｌＰ０４と０．４Ｍ　Ｎａ０１）を含む中
和液を２容を加える処理を行った後、ＢＴ−ＰＢＳで液
量を１０倍に希釈した。

次いで、この希釈した液を試料として用い、実施例１に
示した手順に従って測定を行った。

結果は表３に示すとおりである。

表３ （単位、ｎｇ／ｍ　１血漿） 表３にみられるとおり、本発明による測定方法は、酸処
理を行う従来法に比べて測定結果に実質的な差がなく、
一方、本発明は、酸処理と中和の前処理を省略し得る利
点がある。

主所鬼四米 以上述べたとおり、本発明によると、従来の測定法にお
いて必須とされていた検体（例えば血漿）の煩雑な前処
理（Ｍ処理と中和）を行う必要がなく、塩酸ベンズアミ
ジン、ＥＤＴＡ、ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０を含むリン
酸食塩緩衝液（ＰＢＳ）で希釈するという節易な操作で
測定精度が著しく向上し、かつ多数の検体を同時に高感
度で測定することが可能となる。

更に、従来方法では比較的低い感度と検量線の非直線性
が問題とされていたが、本発明によると、一本鎖及び二
本鎖のｔ−ＰＡ、Ｍｕのｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ−ＰＡ　
Ｉコンプレックスとそれぞれ等しく親和性を有するモノ
クローナル抗体を一次抗体として使用することにより、
高感度でかつ検量線の直線性の良好なｔ−ＰＡ測定方法
を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は、本発明の方法によるＬ−ＰＡ標準液の
検量線と市販のａｌｌ定試薬キットを用いたｔ−ＰＡ標
準液の検量線をそれぞれ示す。第２図は、ヒト血漿を検
体として用いた場合の添加回収試験の結果を示す。また
、第３図は、−末鎖ｔＰＡと二本鎖Ｌ−ＰＡの添加回収
試験の結果を示し、°第４図はｔ−ＰＡ−ＰＡ　Ｉコン
プレックスの回収試験結果を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡと
   記す）を固定化した一次抗体と酵素標識二次抗体とを用
   いるサンドイッチ・エンザイム・イムノアッセイにより
   測定する方法において、固定化一次抗体として、一本鎖
   及び二本鎖の両方のｔ−ＰＡを等しく認識し、かつ遊離
   のｔ−ＰＡのみならず、ｔ−ＰＡ−ＰＡＩコンプレック
   スも等しく認識するモノクローナル抗体を用いることを
   特徴とするｔ−ＰＡの測定方法。
2. （２）一本鎖及び二本鎖の両方のｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ
   −ＰＡＩコンプレックスを認識するモノクローナル抗体
   は、固相表面に固定化したものである請求項（１）に記
   載の測定方法。
3. （３）５〜１０ｍＭの塩酸ベンズアミジン、又はパラア
   ミノベンザミジン、ＦＯＹ、ＤＦＰ、ＰＭＳＦなどの低
   分子セリンプロテアーゼインヒビター、１〜１０ｍＭの
   エチレンジアミン四酢酸、０．０５〜０．１５％の牛血
   清アルブミン、及び０．０１〜０．１０％のトウィーン
   ２０を含むリン酸食塩緩衝液から成ることを特徴とする
   、ｔ−ＰＡを免疫学的手法で測定する際に検体を希釈す
   るのに用いるための緩衝液。
4. （４）一本鎖及び二本鎖の両方のｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ
   −ＰＡＩコンプレックスをともに等しく認識するモノク
   ローナル抗体からなる固定化一次抗体、ｔ−ＰＡ抗体に
   標識酵素を結合させた酵素標識二次抗体及び請求項（３
   ）に記載の緩衝液を組合せたことを特徴とするｔ−ＰＡ
   のサンドイッチ・エンザイム・イムノアッセイに用いる
   ｔ−ＰＡ測定試薬キット。