JPH06508219A - プラスミン−α２−アンチプラスミン錯化合物の分析方法及びこの分析方法を繊維素溶解系の変化の尺度として利用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プラスミン−α２−アンチプラスミン錯化合物の分析方法及びこの分析方法を繊 維素溶解系の変化の尺度として利用する方法 本発明はプラスミン−０２−アンチプラスミン錯化合物の定量的分析方法及びこ の分析方法を繊維素溶解の変化の尺度として利用する方法に関する。

緒言 α２−アンチプラスミンは最も重要なプラスミン阻害剤である。そのプラスミン との反応は同成分の各１分子より構成される非活性の錯化合物の形成をもたらす 。この過程には２つの段階が含まれ、その第１段階ではそのプラスミンのリジン 結合部位と０２−アンチプラスミン分子のカルボキシル末端の対応部位との間で 可逆的な錯化合物が形成される。第２段階においてはその阻害剤内でのペプチド 結合の解裂により非可逆的な錯化合物が形成される。プラスミノーゲンのプラス ミンへの活性化及びそのプラスミンの作用の間に、主として液相において生ずる プラスミン−０２−アンチプラスミン錯化合物の生成と、フィブリン表面へのプ ラスミンの結合並びにその作用との間に平衡が現れる。プラスミンはフィブリン に結合されてα２−アンチプラスミンによる阻害作用に対して保護される。けれ どもフィブリンが溶解してしまったならばただちに、そのフィブリンの表面から 解放されたプラスミンはすぐに０２−アンチプラスミンにより錯化される。

循環の中でフィブリンが生ずると、この過程は、よ（知られている組織プラスミ ノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）へのフィブリンの作用に基づいて常に繊維素 溶解系の活性化を伴う。従って生じたプラスミンは部分的にα２−アンチプラス ミンによって錯化され、そして血漿内のプラスミン−０２−アンチプラスミン錯 化合物の高められた値に導く。従ってこのようなＰＡＰ−錯化合物の高められた 値は、例えば血栓症、凝固性亢進、播種住血管内凝固、エンドトキシンショック 、白血病、肝臓病、ネフローゼ症候群及び重大な外科処置の予後のような多くの 場合にフィブリン形成の増大とともに見出された。静脈を血試験の後でさえ、フ ィブリン形成の増進及び静脈閉鎖−血漿における組織プラスミノーゲンーアクチ ベータの高められた値と一致してほとんどの場合にプラスミン−０２−アンチプ ラスミン水準の高められることが見出された。

従って血清採取に際して時間に依存してＰＡＰ−錯化合物の発生に至ることも予 想することができる。この場合にその血清の中で形成されるＰＡＰ−錯化合物の 量は、それぞれの環境の中で現れる他のプラスミノーゲン及びプラスミノーゲン アクチベータ阻害剤並びに対応する受容体及び結合蛋白質に依存して予想するこ とができる。

上述した全ての場合において、ＰＡＰ−濃度のほんの僅かな上昇しか観測できな いけれども、繊維素溶解系の活性を引き伸ばすことによる結線溶解療法は液相内 での強いプラスミン生成及び最大のＰＡＰ−１化合物生成をもたらす。特に例え ばストレプトキナーゼやウロキナーゼのようなフィブリン−非特異性のプラスミ ノーゲンアクチベータはプラスミン−阻害剤の完全な消費をもたらすことができ 、そしてブスミン血症に基づく出血の傾向が高められることをもたらし得る。

この場合にはそのプラスミンの作用はもはやその特異的基質としてフィブリンに 限定されるのではなくて、フィブリノーゲンや他の種々の凝固因子のような非特 異的基質にも移行することができる。プラスミン−α２−アンチプラスミン錯化 合物の分析は、従って一方においてフィブリノーゲン及びα２−アンチプラスミ ンの消費並びに存在し得る出血傾向を伴う繊維素溶解冗進的な種々の状態におけ る一般的なプラスミン血症の表示手段として用いることができ、また他方におい て血漿のプラスミン−０２−アンチプラスミン錯化合物の僅かに高められた水準 は、例えば血栓症や血清中のＰＡＰ−錯化合物のような絶えず生じている血栓の 形成と名解についての総合的な繊維素溶解能に対するひとつの示唆である。

ＰＡＰの　折のために　い′る　々の　法：ＰＡＰ−錯化合物の分析のために既 に多くの試験方法が発表されており、中でも２次元的免疫電気泳動法、ラテック ス試験法、ＲＩＡ、そしてより最近には種々のＥＬＩＳＡ系が発表されている。

まず最初、Ｐｌｏｗ　等により、かなり感度の低いＰＡＰ−錯化合物分析のため のラテックス凝集試験法が提出された。次いで２次元的電気泳動法が記述された が、これにおいてはｔＩＷ′！のａ２−アンチプラスミンと錯化されたそれとの 異なった易動度が利用されている。これらの方法はまだ感度が充分ではなく、そ してかなり時間がかかり、かつ多数の試料には適していなかった。プラスミンの Ｂ−鎖と０２−アンチプラスミンとの錯化合物に対してポリクローナル抗血清を 用いてＷｉｍａｎ　等によりＲＩＡが開発されたが、これはそのようにして生の ままのプラスミノーゲンやプラスミンによっては左右されなかった。しかしなが ら、まだなお生のままののα２−アンチプラスミンはＰＡＰ−錯化合物と一緒に いずれにしても著しく僅かな程度でしか検出されなかった。

種々のＥＬＩＳＡ系において用いられているような二重サンドイツチ法の開発は 大きな利益であった。既に、結合抗体としててα２−アンチプラスミンに対する 抗体を用い、かつ定量化のためにその酵素に対する成る抗体を用いるか、又はそ の逆に用いて、種々の方法がこれまでに開発されている。Ｈａｒｐｅｌ等は、結 合抗体としてａ２−アンチプラスミンに対するポリクローナル抗体、及び検出系 としてプラスミノーゲンに対するＰｏｘ　で標識したＦａｂ　フラグメントを用 いて感度の高い分析方法を最初に発表したが、その際、生のままの各抗体に比し てＦａｂフラグメントはプラスミノーゲン及び他の種々の血漿蛋白質の減少した 非特異的結合の利点をもたらす。Ｈｏ１ｖｏｅｔ　等及びＭｉｍｕｒｏ等によっ て他のＥＬＩＳＡ系が記述されているが、これらはその錯化合物のそれぞれ１部 に対する２つのモノクローナル抗体を用いるか、又はポリクローナル抗体とモノ クローナル抗体とを用いている。つい最近になって初めてＨａｓａｄａ等により リボソーム−免疫−溶解法（Ｌ　Ｉ　ＬＡ）が提出された。これまでに記述され ているＥＬＩＳＡ試験系又はＬＩＬＡ試験系は、上に記述した全ての方法がその 錯化合物のみならず、それら本来の錯化されていない分子をも認識するような抗 体を用いているためにそのＰＡＰ−錯化合物の著しく低い濃度に比しての錯化さ れていないα２−アンチプラスミン又はプラスミノーゲンの大過剰によってはい ずれにしても成る限度までしか損なわれなかった。

ドイツ特許ＤＥ−Ａｌ　４１１５９３３　に１つの方法が公開されているが、こ れはモノクローンナル抗体ＢＭＡ　ＰＡＰ６及びそれに従属するハイブリドーマ 細胞系（ＢＷＰＡＰ６）を得ることに関するものであり、この抗体はＰＡＰ−ｆ ｉ化合物に対して或る特異的親和性を有し、そしてこの錯化合物の個々の成分に 対してはまったく親和性を有しないか、又は極めて僅かの親和性しか有しない。

この抗体はアンモニア処理により分解されたＰＡＰ−錯化合物による免疫発現に よって得られたものである。しかしながらこの抗体もまたＥＬＩＳＡにおいてし か機能性を持たず、そしてウェスターン法によっては特性付けられていない。

従ってここでＰＡＰ−！化合物中のネオ抗原に対して指向された他の成る特異的 なモノクローナル抗体を包含する試験系が提案されるが、ここでこの抗体はアン モニア処理されていない天然のＰＡＰ−錯化合物で免疫化することにより得られ たものであり、またこの抗体はウェスターン法においてもそのＰＡＰ−錯化合物 とのみ反応するものであり、そしてこの抗体は結合抗体として用いられるもので ある。これにより、対応するＰＡＰ−錯化合物−ＥＬＩＳＡ法は血漿中環境にお いても、血清中環境においても高特異性でかつ高感度になる。

ＰＡＰ−′Ａ　のネオ　７に・　る　の　び　゛　：本発明に用いられる抗体Ｍ ＰＷ７ＡＰは英国サリスバリーのＰｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ　の動物細胞培養物ヨーロッパ収集所に寄託された該当す るハイブリドーマ細胞系から分泌されるものである。この細胞系は公知の方法に よりマウスの骨髄腫細胞系（ＮＳＯ）と天然のＰＡＰ−錯化合物で免疫化された マウスの牌臓細胞との融合により得られたものである。この分泌されたモノクロ ーナル抗体はウェスターン法においてはそのＰＡＰ−錯化合物とのみ特異的であ るけれどもそれぞれの成分とは反応しないと言うことによって特徴づけられる（ 第１図）。

越腋の原理： ここで記述する試験の方法は固相酵素免疫分析法であり、その際ＰＡＰ−錯化合 物のネオ抗原に特異的なモノクローナル抗体であるＭＰＷ７ＡＰをプラスチック マイクロタイタープレートの上に吸着させる。試験試料とともにインキュベーシ ョンしたときにそれらＰＡＰ−錯化合物が選択的に結合し、そして結合しなかっ た物質を除去した後でその錯化合物をその錯化合物のプラスミノーゲン部分のク リングル１−３領域に対するペルオキシダーゼ−標識したモノクローナル抗体で あるＭＰＷ２ＰＧ　ＰＯＸによって検出する。この標識された抗原−抗体の複合 体の定量化はペルオキシダーゼに対する色原性基質であるＡＢＴＳによって行わ れる。

材料反りに１： Ｏ高い結合能を有する９６個の窪を有するマイクロタイタープレート〔例えばＮ ＵＮＣＩｎｍｎｏｐｌａｔｅ　庸■１ｓｏｒｐ　４−９３４５４又はＧＲＥＩＮ ＥＲａＩＳＡ　プレート（Ｎｏ、　６５５０６１１、プレート表面上（例えばＣ ０３ＴＡＲ３０９５）　］Ｏ波長４０５　ｎｍ及び４９２　ｒｕｎのための肚ｌ ５Ａ−リーダー（例えばオーストリア国のＺｉｎｓｓｅｒ　の　Ａｎｔｈｏｓ　 Ｒｅａｄｅｒ　２００１１０　ＰＡＰ−ネオ抗原に対する抗体ＭＰＷ７ＡＰ及び Ｐｏｘ　で標識された、プラスミノーゲンのクリングル１−３領域に対する抗体 ＭＰＷ２ＰＧＰＯＸ　（オーストリア国ウィーンのＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ　社 ）Ｑ　ＰＡＰ−錯化合物標準血漿及びＰＡＰ−錯化合物を除いた血漿（オースト リア国ウィーンのＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ　社）ドイツ国マンハイムのＢｏａｈ ｒｉｎｇｅｒ社のＡＢＴＳ　［２−２’−アジノビス−（３−エチルベンゾ−チ アゾリンスルホン酸］Ｏアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ　（登録商標）：ドイ ツ国し−フエルクーゼンのＢｅｙｅｒ社１ ０　２−（エチル水銀チオト安息香酸のナトリウム塩［ドイツ国Ｍｅｒｃｋ　社 の［Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ　（登録商標）　］　８１８９５７］Ｏポリオキシエ チレンソルビタンモノオレアート［米国Ｓｉｇｍａ　社のＴｗｅｅｎ２０、Ｐ　 １３７９　］ ○　牛血清アルブミン：最純（ＢＳＡ）ＯＲＨＯ２０／２１　（ドイツ国Ｂｅｈ ｒｉｎｇ）○　ベンズアミジンクロリド（ドイツ国Ｍｅｒｃｋ　社）清液： 被覆用緩衝液：　１．５９ｇ　のＮａ１ＣＯｓ・ｌＯＨ，０，２，９３ｇ　のＮ ａＨＣＯｓ及び１００ｍｇ　のＴｈｉｍｅｒｏｓａｌを蒸留水で１１にする。ｐ Ｈ＝９．６被覆用溶液　：　被覆用緩衝液中の２０μ／ｍｌのＭＰＷ？ＡＰ　、 窪当り１００μｍｔＡＦｉｌ（！Ｊ８：　Ｗ、Ａ＋？１．、習Ｌ％−Ｚ、ｌＧｌ ：ｊ：Ｏ，，１°４４　ｇ　（７）Ｎａｇ）ＩＰＯｎ洗浄用緩衝液：　ＰＢＳ＋ ０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０ブロック用溶液：ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ 稀釈用緩衝液２：　ＤＢ１＋１％　ＰＡＰ除去血漿（ＤＢ２） ｆｆ＃Ｃπ簀！Ｍ液３：　ＤＢ１＋１０％ＰＡＰ除去血漿検出用緩衝液＋　ＤＢ Ｉ中の１０　ｕｇ／ｍｌ　ＭＰＷ２ＰＧ　Ｂｏｘ　；　１００　ｕ１ｆＦＭ停止 用溶液　：　ＮａＦ　３００　ｍｇ／１００　ｍｌ蒸留水；１ｏｏｕｌ／ｉ’！ 反応工Ω安定牲： 被覆用緩衝液及び被覆されたプレートに抗微生物物質を加えておき、そして従っ て４℃において安定である。他の各蛋白質含有溶液及び洗浄用緩衝液は微生物の 繁殖を防ぐために新しく作られたものであるか、又は滅菌条件のもとに保たれな ければならなかった。抗生物質はペルオキシダーゼとの不都合な反応を防ぐため にこれらの場合においては使用すべきではなかった。

方法ニ プレートの被ｒ！Ｉ： ＥＬＩＳＡプレートの各層を１００μｍ１の被覆用溶液で満たす（最良には多管 マイクロピペットを用いて）。次にそのプレートを粘着性のプラスチックフィル ムで覆い、そして少なくとも１６時間、又は成る場合には任意の長時間にわたり ４℃において貯蔵する。使用の前にその被覆されたプレートを空にし、そして窪 １個当り１００ＬＬＬのブロック用溶液を加えて３７℃において１時間インキュ ベーションしてそのプレート表面上の過剰の反応性基をブロッキングする。全て のインキュベーション段階の間中それらのプレートはプラスチックフィルムで覆 ったままにしておく。

試且の皿処腫： 標準クエン酸液又はＥＤＴＡ−血漿を使用することができるが、阻害されなかっ たプラスミノーゲンアクチベータをＰＡＰ−ｆｉ化合物の試験管内形成かもたら されるように注意すべきである。従って特に血栓溶解治療用の市販の標準物の場 合にはけ常に各血液試料にその採取に際して種々のインヒビターを添加すべきで ある（例えば２０００　ＫＵＩ／ｍｌ　のアプロチニン＋２０ｍＭ　のベンズア ミジンの最終濃度） 各血漿試料はＰＡＰ−錯化合物の低濃度のものについてはＤＢＩで１：ｌＯに、 そして高濃度のものについては１　：　１００　に稀釈する。窪１つ当り１００ μｍが必要であり、そして２度の測定が推奨される。

標ヱ剪処瑠： ＰＡＰ−錯化合物標準血漿は蒸留水に溶解し、そしてＰＡＰ濃度の低い試料に対 して使用するためにはＤＢ３で、またＰＡＰ濃度の高い試料に対して使用するた めにはＤＢ２で１　：　１００　ないし１　：　１８００の１運の稀釈割合のも の、または零値のものを作る。この場合も１００μν窪及び２度測定が推奨され る。

１２二上り洗浄： 全てのインキュベーション段階の間で各プレートは１窪当り約３００μの洗浄用 緩衝液で人手により、又は自動洗浄装置を用いて３回洗浄する。各洗浄過程の後 でそのプレートを吸取紙の上でたたいて脱液する。

試秋過程＝ １、）　ＥＬＩＳＡプレートを４℃において１夜被覆させる。

２）　ブロック用溶液を用いて３７℃で１時間インキュベーションする。

３）　洗浄する。

４）　試料を１夜４℃においてインキュベーションする。

５）　洗浄する。

６）　Ｐｏｘで標識した抗体とともに３７℃で２時間インキュベーションする。

７）　洗浄する。

８）　基質溶液を用い、光を防ぎながら室温において３０分間インキュベーショ ンする。

９）　停止用溶液を加える。

１０）　リニヤ尺の検量線を作製し、そして高又は低ＰＡＰ濃度についての対応 的標準曲線からその試料についての値を読み取る。稀釈率を掛算する。

稙里の評価： 結果を評価するためにその試料の読み取り値を対応するＰＡＰ−錯化合物の参照 試料のそれと比較する。

慝準化； プラスミン−α２−アンチプラスミン錯化合物は困難にしか安定な精製された形 で作ることができないので〔この錯化合物は容易に蛋白質分解的に解裂され、そ してこの錯化合物がプラスミンから又はその阻害剤から過剰に形成されたかに従 って各種のエピトープが生じ得る（１）］　、ＰＡＰ−錯化合物を直接血漿中で 作り出し、そしてこれを各精製した成分からのＰＡＰ−錯化合物により検定する ことにした。この目的のために、充分以上の濃度のウロキナーゼとともにクエン 酸−血漿をインキュベーションして可能な最大の量のプラスミン−α２−アンチ プラスミン錯化合物を得た。次にその反応をベンズアミジンとトラジロールとの 添加によって停止させた。そのようにして形成された錯化合物は一７０℃におい て凍結されるか、又は４℃において凍結乾燥されて安定である。標準血漿の中の 錯化合物の実際の量を測定するために、この標準物のＥＬＩＳＡ測定値を各精製 さスミンを作り、そしてこのウロキナーゼ−セファ０−ゼを除去した後で、その 生じた活性を、Ｓ−２２５１により直ちに、また精製した０２−プラスミンとと もに３７℃において３０分間インキュベーションした後に測定した。このプラス ミン活性の差は形成されたＰＡＰ−錯化合物の量に相当する（第２図）。

葺屋性： 上に記述した試験方法はプラスミン−α２−アンチプラスミン錯化合物に対して 特異的であり、そしてその標準物がＰＡＰの除去された血漿の中でその試験され るべき血漿試料と同じ濃度で溶解されていたことを仮定して、良好な血漿回収率 を与える。

感１及び正宣値： この分析においては検出下限は、精製された系においても血漿においても１０ｎ ｇ／ｍｌである。

ｆ；ＸＩＬ： 正常の対照物集団密度ではＰＡＰ−平均値はクエン酸のものについて１５２±７ ２ｎｇ／ｍｌであり、そしてＥＤＴＡ−血漿については１３２±７２　ｎｇ／ｍ ｌ　であって、血清試料においては殆どの場合にＰＡＰ−値は高くなっている。

鷹皿値： 血栓溶解療法はＰＡＰ−血漿値＞８００　ｎｇ／ｍｌを与える。経皮的トランス ルミナル冠動脈造影法（ＰＴＣＳ）で成功裏に処置された冠動脈性毛嫉患を有す る患者においては１２ケ月の後にもなお高いＰＡＰ−値であった（第３図）。

々の　の患　におしるＰＡＰ−イＡ　の　：方法　患者　血漿水準 外科的患者３，４　２．１　ｕｇ／ｒｎ１ＥＬＩＳＡ　癌腫　０．１２−０．１ ５　ｕＭ急性前骨髄性白血病　＞０．２８μＭ 出血性ショック　＞０．２８μＭ 敗血症１１　２．２　μｇ／１１＋１ 血栓性血小板減少性紫斑病１２２．１　ＬＬＩＫ／ｍ１敗血性紅斑性狼癒４′１ ８　高められている゛　のＰＡＰ−イＡ物： 採血の後で異なった時間を経過した後に血清を分離してその得られた血清の中の ＰＡＰ−錯化合物含有量を分析した場合には、特定の患者群において時間に依存 するＰＡＰ−錯化合物の上昇をきたすことが示されている（第４図）。血清中の そのようなＰＡＰ上昇を示した１群は繊維素溶解能が例えばアスピリン（アセチ ル酸）の摂取により変化することを示す患者を対象としている。この場合、例え ば１日当り１００　ｍｇのアスピリンの摂取の場合に１週間後に著しいＰＡＰ− 錯化合物の上昇に達し、これは２週間摂取した後には更に強められている。アス ピリン投与の終了の１週間後にはＰＡＰの上昇は少ないけれどもなお検出可能で ある（第５図）。

復明１妊１嘗１里： 現在はＰＡＰ標準は入手できない。従って標準化は、安定な錯化合物を形成した 、新たに各精製した成分から直接作られたＰＡＰＭ化合物を含むＰＡＰ鑵化金化 合物標準血漿用して比較することにより達成される。

のちのとのデータの　：傘 ＊　：多数の試薬の入手の支障のために試験系の直接の比較ができなかった。

＊＊：この系はＴｅ１ｊｉｎ社より市販で得られるＰＡＰ−キットに相当する。

＊傘＊二本発明の対象のもの。

第１図：　ＰＡＰ−錯化合物の１成分であるα２−アンチプラスミンに対して指 向されている３つのモノクローナル抗体のウェスターン法。

第２図：精製された成分からなるＰＡＰ−錯化合物を含む血漿の中で行われたＰ ＡＰ−錯化合物の比較。図には緩衝液で、又は過剰の０２−アンチプラスミンで インキュベーションされた、新しく作られたプラスミンのアミド分解の活性が示 されている。両方の活性の差から、阻害されたプラスミンに応じて対応する錯化 合物の濃度が計算される。

第３因二冠動脈性心疾患を有する患者と対照被検者におけるＰＡＰ−錯化合物。

第４図：反応性被検者の血清の中のＰＡＰ−錯化合物の時間的経過。

第５図：アスピリン投与の前（０）、１週間後（・）及び２週間後（ム）、並び にその投与の終了の１週間後（△）の、血清中でのＰＡＰ−錯化合物の発生の経 時的変化。

＃１　＃２　＃３ モノクローナルα２−ＡＰ　抗体 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．プラスミン−α２−アンチプラスミン錯化合物を定量的に分析する方法にお いて、ウェスターン法において専らそのＰＡＰ−錯化合物とのみ反応する、その 錯化合物中の或るネオアンチゲンに対して特異的なモノクローナル抗体を使用す ることを特徴とする方法。
2. ２．抗体ＭＰＷ７ＡＰの特性を有するモノクローナル抗体を使用することを特徴 とする、請求の範囲１の方法。
3. ３．サンドイッチＥＬＩＳＡ系を使用することを特徴とする、請求の範囲１又は ２の方法。
4. ４．結合抗体として抗ＰＡＰ−ネオアンチゲンを使用することを特徴とする、請 求の範囲３の方法。
5. ５．結合抗体として抗ＰＡＰ−ネオアンチゲンを、そして検出用抗体としてプラ スミノーゲンに対する抗体を使用することを特徴とする、請求の範囲３の方法。
6. ６．繊維素溶解の変化を検出するために請求の範囲１ないし５の方法を使用する 方法。
7. ７．繊維素溶解能の変化を検出するために血清中のＰＡＰ−錯化合物を分析する 請求の範囲６の方法を使用する方法。
8. ８．アスピリン投薬の制御のために請求の範囲６又は７の方法を使用する方法。
9. ９．血清中のＰＡＰ−錯化合物の分析によるアスピリン投薬の制御のために請求 の範囲８の方法を使用する方法。