JP3065667B2 - トロポニンｉおよびｔおよびこれらのコンプレックスの新規アッセイ法並びにイムノアッセイ用抗体の選択 - Google Patents

トロポニンｉおよびｔおよびこれらのコンプレックスの新規アッセイ法並びにイムノアッセイ用抗体の選択

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明はトロポニンＩおよびトロポニンＴ並びにこ
れらのタンパク質のコンプレックスに関するもので、特
に血液、血清および血漿中のこれらのタンパク質のコン
ホメーションの変化並びにこれらのタンパク質の種々の
形態に対する抗体の選択およびイムイアッセイにおける
これらの使用に関する。
背景技術 心筋梗塞は米国における主要な死因の１つである。米
国では毎年、胸部痛で患う約500万人が病院で診察を受
けているが、このうちの30％以下の人がその後で心筋梗
塞になることが判明している。心筋梗塞の正確で迅速な
診断は心筋梗塞で患う患者にとって重要なだけでなく、
治療を必要とする患者の迅速な同定によって経費を最小
限にする保健システムにとっても重要である。
心筋梗塞の診断は通常は病院の救急部門でおこなわれ
る。心筋梗塞の症状のある患者は症状の程度に応じて異
なった方法で治療される。一般に、心臓の状態は心電図
によって評価されるが、心筋梗塞を患う患者の約50％の
心電図には該症状はみられない。このため医者は心筋梗
塞の疑いのある患者の診断と治療に関する問題に直面す
る。即ち、心電図で心筋梗塞の症状を示さないが該症状
の疑いのある患者の診断と治療は困難である。
世界保健機構（WHO）は心筋梗塞の診断に関しては、
次の３つの基準のうちの２つを満たさなければならない
というガイドラインを設定している：（１）胸部痛を有
するか、または心臓疾患の病歴を有する；（２）心電図
に心筋梗塞の微候がみられる；（３）クレアチンキナー
ゼ（CK）またはクレアチンキナーゼMBアイソエンザイム
（CKMB）の増加がみられる。従って、心筋梗塞の疑いは
あるが、心電図でそのような微侯を示さない患者の50％
に対しては、医者は心筋梗塞の診断をするためには胸部
痛の症状とCKまたはCKMBの増加に頼らなければならな
い。
CKまたはCKMBのアッセイは病院の試験室内において複
雑な手段を用いておこなうのが一般的である。このよう
なアッセイには血液試料中のCKまたはCKMBの活性または
量を測定するイムノアッセイおよび酸素アッセイが含ま
れる。
心筋梗塞時には心筋細胞が死んでその含有成分が血液
流へ放出される。CKMBはこのような細胞成分中へ放出さ
れる。CKMBの濃度は正常値よりも高くなるので、これを
利用することによって心筋梗塞の診断が可能となる。心
筋梗塞を診断するためのCKMBの特異性は100％とはなら
ないが、これはCKMBの身体内の発生源が骨格筋にもある
からである。身体内の骨格筋の質量は心筋の質量よりも
はるかに多いので、骨格筋細胞の正常な異化回転によっ
て健全な人体内では血中のCKMB濃度は変化する。一般
に、心筋梗塞を反映し得るCKMBの濃度は５〜7ng/mlより
も高い値である［Circulation,第87巻、第1542頁〜第15
50頁（1993年）;Clin.Chem.、第39巻、第1725頁〜第172
8頁（1993年）］。骨格筋に損傷を受けた人または運動
後の人のCKMB濃度は9ng/mlよりも高くなることが報告さ
れている［Clin.Chem.、第38巻、第2396頁〜第2400頁
（1992年）］。従って、心筋梗塞用マーカーとしてCKMB
を用いるときの特異性の問題は、損傷心筋のみから放出
される他のより特異的なマーカーに関する研究を促し
た。
トロポニンＩおよびトロポニンＴは心筋梗塞の診断に
関してCKMBよりも特異的であることが最近報告されてい
る。［Ciuculitaon、第83巻、第902頁〜第912頁（1991
年）;Clin.Chem.、第40巻、第1291頁〜第1295頁（1994
年）］。トロポニンＴは腎疾患で患う患者においても多
くなるのでマーカーとしては難点があるとされているが
［Clin.Chem.、第41巻、第312項〜第317頁（1995
年）］、本発明方法によれば、トロポニンＴを診断用マ
ーカーとして有効に利用することができる。心筋梗塞の
診断用マーカーとして使用することも臨床的な多くの要
求を満たすことが報告されている［Clin.Chem.、第40
巻、第1291頁〜第1295頁（1994年）;Clin.Chem.、第41
巻、第312頁〜第317頁（1995年）］。
筋肉中のトロポニンコンプレックスはトロポニンＩ、
ＣおよびＴから成る。これらのトロポニン成分は組織に
特異的な種々のイソ型タンパク質（isoform）として存
在する。トロポニンＣは２つのイソ型タンパク質として
存在し、一方の型は心筋と遅い単収縮筋から得られてお
り、また他方の型は速い単収縮筋から得られている。ト
ロポニンＩおよびＴは遅い単収縮筋、速い単収縮筋およ
び心筋中においては異なったイソ型タンパク質として存
在する［Biochem.J.、第171巻、第251頁〜第259頁（197
8年）;J.Biol.Chem.、第265巻、第21247頁〜第21253頁
（1990年）;Hum.Genet.、第88巻、第101頁〜第104頁（1
991年）;Circul.Res.、第69巻、第1226頁〜第1233頁（1
991年）］。心筋中に含まれるトロポニンＩおよびＴは
特有のイソ型タンパク質として存在するので、骨格筋中
の他のトロポニンとは免疫学的に区別することができ
る。従って、損傷心筋から血液中へのトロポニンＩおよ
びＴの放出は不安定狂心症と心筋梗塞の症例と関連づけ
られている。しかしながら、従来技術は血中のトロポニ
ンＩおよびＴの他の形態については全く検討していな
い。
筋中のトロポニンコンプレックスは収縮性器官に強く
結合している。心臓組織中のトロポニンＴの約６％は細
胞質内では非結合タンパク質として存在しており、トロ
ポニンＴのこのプール（pool）は損傷筋から放出される
と考えられている［Am.J.Cardiol.、第67巻、第1360頁
〜第1367頁（1991年）］。
トロポニンＩ、ＴおよびＣのコンホメーションは二成
分コンプレックスと三成分コンプレックスを形成すると
きの結合時に変化する［Biochemistry、第33巻、第1280
0頁〜第12806頁（1994年）;J.Biol.Chem.、第254巻、第
350頁〜第355頁（1979年）;Ann.Rev.Biophys.Chem.、第
16巻、第535頁〜第559頁（1987年）］。トロポニンＩと
Ｔのコンホメーションの変化およびこれらのタンパク質
の血中での不均質性に関する理解は、トロポニンＩとＴ
の濃度を測定する正確な診断法の開発のためには不可欠
である。さらに、トロポニンＩは血中では不安定である
ことが報告されているが［トロポニンＩイムノアッセイ
のためのダイレクション・インサート（directioninser
t）、Sanofi/ERIAジアグノスチックス・パスツール、マ
ルネ・ラ・コケット、フランス］、この安定性に関する
機構は知られていない。この発明ほこれらの問題を解決
することによって、イムノアッセイにおいて有用な安定
なトロポニンＩ組成物およびトロポニンＴ組成物を提供
するためになされたものである。
本発明によれば、抗体の選択法並びにトロポニンＩ、
トロポニンＴおよびこれらのタンパク質のコンプレック
スのイムノアッセイにおける該方法の使用法が提供され
る。これらのタンパク質は心筋と骨格筋中においては主
として三成分コンプレックスとしてトロポニンＣと共存
する。該筋肉中においては、このトロポニンコンプレッ
クスは細いフィラメントを含むアクチンに結合したトロ
ポミオシンと結合している。遊離形態または二成分もし
くは三成分コンプレックスとして結合した形態の筋肉か
ら放出されるトロポニンＩとＴの状態については従来は
全く検討されていなかった。
発明の開示 本発明は損傷心筋からのトロポニンを含有する疑いの
ある全血、血漿または血清試料中に含まれるトロポニン
またはトロポニン群の存在または量を決定するためのイ
ムノアッセイシステムを開示する。このシステムは次の
過程（ａ）〜（ｄ）を含む：（ａ）トロポニンまたはト
ロポニン群の形態の心臓特異的領域に特異的に結合し得
る抗体であってシグナル発生要素に結合した抗体を含有
する抗体複合体の形成、（ｂ）該抗体複合体と共にイン
キュベートした全血、血漿または血清試料の形成、
（ｃ）該抗体複合体内のトロポニンまたはトロポニン群
の形態の心臓特異的領域に特異的に結合し得る捕捉抗体
であって該抗体複合体と結合し得る少なくとも１種の捕
捉抗体が結合した表面に該反応混合物を適用することに
起因する固定化複合体によるサンドイッチコンプレック
ス形成時の検出可能シグナルの発生および（ｄ）該試料
中のトロポニンまたはトロポニン群の存在または量と検
出可能シグナルとの関連づけ。
本発明は、トロポニンの形態に対して感応的な抗体お
よび該形態に対して非感応的な抗体も開示する。「抗
体」にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗
体の結合性フラグメント、組換え抗体および標的に対し
て特異的に結合するレセプタータンパク質が含まれる。
悲感応的抗体は、トロポニンまたはトロポニン群の形態
に関するアッセイにおいて上記抗体を使用したときのア
ッセイ応答値（基準値）に対してファクターが約２以下
のアッセイ応答値（即ち、基準値の50％）（好ましく
は、トロポニンの各々の形態に対して約20％の範囲内の
アッセイ応答値）をもたらす抗体である。即ち、非感応
的抗体は１種よりも多くの形態のトロポニンと結合する
抗体である。
イムノアッセイにおける感応的抗体は、トロポニンま
たはトロポニン群の形態に対して他の形態に対する応答
値に比べてファクターが少なくとも約２よりも大きい応
答値（即ち、基準値の200％）［好ましくは、ファクタ
ーが５よりも大きい応答値（即ち、基準値の500％）］
をもたらす抗体である。即ち、感応的抗体はトロポニン
の単一の形態のみに結合する抗体である。
本発明において用いるトロポニンの形態としては次の
９種が例示される：（１）心臓トロポニン三成分コンプ
レックス、（２）心臓トロポニン二成分コンプレックス
Ｉ（酸化形態）/T、（３）心臓トロポニン二成分コンプ
レックスＩ（還元形態）/T、（４）心臓トロポニン二成
分コンプレックスＩ（酸化形態）/C、、（５）心臓トロ
ポニン二成分コンプレックスＩ（還元形態）/C、（６）
心臓トロポニン二成分コンプレックスT/C、（７）非結
合型の心臓トロポニンＩ（酸化形態）、（８）非結合型
の心臓トロポニンＩ（還元形態）および（９）非結合型
の心臓トロポニンＴ。
本発明はトロポニンの安定化組成物も開示する。この
安定化組成物はトロポニンＩの安定化組成分を含有して
いてもよい。この場合、トロポニンＩは酸化されてお
り、また、トロポニンＩは非結合形態またはコンプレッ
クス形態であってもよい。この安定化組成物はトロポニ
ンＩ、ＴおよびＣの三成分コンプレックスの安定化組成
物を含有していてもよい。
本発明は、イムノアッセイに使用した表面からトロポ
ニンＩまたはＴを回収する改良法であって、pI値が約８
よりも大きな強塩基性のペプチド、タンパク質またはポ
リマーの少なくとも１種を該表面と接触させることを含
む改良法も開示する。この改良法は非結合状態のペプチ
ド、タンパク質またはポリマーを膜表面から洗い流す過
程をさらに含んでいてもよい。メリチン（melittin）は
使用した強塩基性ペプチドであってもよく、また、プロ
タミンは使用した強塩基性タンパク質であってもよい。
図面の説明 図1aはイムノアッセイによって測定したときのトロポ
ニンＩの空気酸化速度曲線を示す。
図1bはイムノアッセイによって測定したときのトロポ
ニンＩの過酸化物による酸化速度曲線を示す。
図２はイムノアッセイによって測定したときのジチオ
トレイトールによるトロポニンＩの還元速度曲線および
還元されたトロポニンＩの過酸化物による再酸化速度曲
線を示す。
図３はトロポニンＴおよび結合性インヒビターの存在
下または不存在下でのトロポニンＩのイムノアッセイに
対するトロポニンＣの効果を示す。
図４はトロポニンＩに対するイムノアッセイによって
測定したときのヒトの心臓トロポニン三成分コンプレッ
クスの分解速度曲線（結合性インヒビターの存在下また
は不存在下）を示す。
図5a〜図5fは心筋梗塞が確認された患者から採取した
試料についてのトロポニンＩのイムノアッセイに対する
結合性インヒビターの効果を示す。
発明の実施態様 定義 「抗体」または「レセプタータンパク質」はモノクロ
ーナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の結合性フラグ
メント、組換え抗体または標的に対して特異的に結合す
るレセプタータンパク質を含む。ある物質の特異的結合
性とは、特異的に結合しないある物に結合しないという
該物質の特性を意味する。逆に言えば、特異的に結合し
ないある物に対して特異的に結合する物に対してより大
きな親和性を示す該物質の特性を意味する。
イムノアッセイにおける非感応的抗体は、問題となる
トロポニンの各々の形態に対して、他の形態に対するア
ッセイ応答値に比べて約２のファクターの範囲内（好ま
しくは約20％の範囲内）のアッセイ応答値もたらす抗体
である。即ち、非感応的抗体は、イムノアッセイにおい
てトロポニンの１種よりも多くの形態の検出能を示す抗
体である。
イムノアッセイにおける感応的抗体はトロポニンまた
はトロポニン群の１種の形態に対して、他の形態に対す
るアッセイ応答値に比べてファクターが少なくとも約２
よりも大きい（好ましくは約５よりも大きい）アッセイ
応答値をもたらす抗体である。即ち、感応的抗体は、イ
ムノアッセイにおいてトロポニンまたはトロポニン群の
１種の形態の優先的な検出能を示す抗体である。
トロポニンの形態としては次の９種が挙げられる： （１）心臓トロポニン三成分コンプレックス、（２）
心臓トロポニン二成分コンプレックスＩ（酸化形態）/
T、（３）心臓トロポニン二成分コンプレックスＩ（還
元形態）/T、（４）心臓トロポニン二成分コンプレック
スＩ（酸化形態）/C、（５）心臓トロポニン二成分コン
プレックスＩ（還元形態）/C、（６）心臓トロポニン二
成分コンプレックスT/C、（７）非結合型の心臓トロポ
ニンＩ（酸化形態）、（８）非結合型の心臓トロポニン
Ｉ（還元形態）および（９）非結合型の心臓トロポニン
Ｔ。
「ゾーン」は異なる検知性シグナルの同定能に関する
概念である。従って、ゾーンは場所的な領域に対応する
か、または異なる検知性シグナルを別々に同定する機能
に対応する。検知性シグナルは、特に限定的ではない
が、次の特性を変化させることによって区別することが
できる：蛍光の波長、光学的吸光度または反射率；電子
状態の寿命または電子状態間の遷移エネルギー；酸化−
還元電位；比色特性；シグナルのタイプ（例えば、蛍光
対放射能対光学的吸光度）。
非結合トロポニンはコンプレックス形態でないトロポ
ニンである。
「標識」、「シグナル発生体」または「シグナル発生
性要素」は多数の異なる形態を具現する実体である。酸
素およびこれから得られる基質に対する結果物、コロイ
ド状金属粒子、色素を取り込んだラテックスおよびシリ
カ粒子並びに色素粒子等はシグナル発生体の例である。
酸素は基質上で反応して、例えば蛍光（例えば、紫外
光、可視光、赤外光）の波長またはpHに対する影響によ
って検知可能な生成物をもたらす。
方法 本発明は体液、特にヒトの血液、血清および血漿中に
含まれるトロポニンＩ、トロポニンＴおよびこれらのタ
ンパク質のコンプレックスのアッセイに関する。血液中
に正常濃度よりも高濃度の心臓トロポニンＩおよびＴが
存在することによって、損傷心筋が診断される。本発明
によれば、トロポニンＩおよびＴは血液中においては筋
組織中での元のコンホメーションと同一または異なって
いてもよい種々のコンホメーションで存在することが教
示される。トロポニン分子のこれらの種々のコンホメー
ションは抗体に対して異なった反応拳動を示す。
モノマー性のトロポニンＩとＴおよび二成分コンプレ
ックスと三成分コンプレックスの比率を心臓の代謝状態
と関連づけてもよい。トロポニンＩとＴおよびこれらの
トロポニンの精製コンプレックスに対する抗体の反応性
に基づくことによって、心筋梗塞で患う患者から採取し
た血液中に含まれるトロポニンＩとＴおよびこれらのコ
ンプレックスの濃度を明らかにすることができる。
本発明の態様は血液、血清および血漿中に含まれるト
ロポニンＩとＴおよびこれらのコンプレックスのコンホ
メーション並びにこれらのコンホメーションを認識する
抗体に関する。特に、次の形態を有するトロポニンＩと
Ｔを認識する抗体は好ましい：（１）分子内的に酸化ま
たは還元されたシステインを有するトロポニンＩのコン
ホメーション、（２）トロポニンＩとＴ、ＩとＣまたは
ＴとＣの二成分コンプレックス、および（３）トロポニ
ンＩ、ＴおよびＣの三成分コンプレックス。さらに、本
発明はイムノアッセイにおけるトロポニンＩとＴの改良
された回収法に関する。本発明は血液中のトロポニンＩ
とＴのアッセイに関して従来満たされていなかった要求
に応えるものである。
心筋梗塞用マーカーとして使用するためのトロポニン
ＩとＴの重要な点はこれらの分子の大きさにある程度起
因する。これらのタンパク質は比較的小さいので、より
大きなタンパク質よりも速く損傷細胞から放出される。
トロポニンコンプレックスおよびトロポニンＩとＴに対
する抗体 「抗体またはレセプタータンパク質」はモノクローナ
ル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の結合性フラグメン
トおよび標的に対して特異的に結合するレセプタータン
パク質を含む。好ましい態様においては、レセプタータ
ンパク質、例えば、抗体またはフラグメントは、トロポ
ニンＩ分子の酸化状態に対して非感応的なトロポニンＩ
のエピトープとなる。「感応性」および「非感応性」と
いう用語は一般に特定の遊離トロポニンまたはトロポニ
ンコンプレックスに対する抗体の認識能に関する。特
に、イムノアッセイにおいて有用な感応性抗体はトロポ
ニン１つまたは複数の形態と他の形態を区別し、また、
イムノアッセイにおいて有用な非感応性抗体は１つまた
複数の形態と他の形態を区別しない。抗体の感応性また
非感応性はイムノアッセイにおいて発現される。抗体が
感応性であるか非感応性であるかを決定するためには、
各々の形態のトロポニンを用いる抗体の試験を独立して
おこなうことによって各々の形態に対するアッセイ応答
を得る。一般に、特定のトロポニン形態に対して非感応
性の好ましい抗体は各々の形態のトロポニンに対してフ
ァクターが約２の範囲内（好ましくは20％の範囲内）で
同じアッセイ応答値をもたらす。特定のトロポニン形態
に対して感応性の好ましい抗体は１つまたは複数の形態
に対して、他の形態に比べて少なくとも２、好ましくは
５のファクターで大きいアッセイ応答値をもたらす。さ
らに、「トロポニンＩとＴ」は遊離の非コンプレックス
形態のこれからのトロポニンまたは二成分もしくは三成
分コンプレックス中のこれからのトロポニンを示す。ヒ
トの心臓トロポニンＩは80と97の位置に２つのシステイ
ンを有する［FEBS Letters、第270巻、第57頁〜第60頁
（1990年）］。現在の技術においては、組織からのトロ
ポニンＩは精製中に酸化状態のトロポニンＩは種々の還
元剤（例えば、メルカプトエタノール、ジチオトレイト
ール等）を用いて還元形態にすることができる［Can.J.
Biochem.、第54巻、第546頁〜第553頁（1976年）;Metho
ds Enzymol.、第85巻、第241頁〜第263頁（1982
間）］。また、現在の技術の教示するところによれば、
精製後、トロポニンＩを還元形態に維持することによっ
て分子間のジスルフィド形成を防止することができる
［J.Biol.Chem.、第258巻、第2951頁〜第2954頁（1983
年）］。
標的タンパク質に対するイムノアッセイの過程におい
ては、精製された標的タンパク質は選択された抗体を用
いるイムノアッセイの感応性と特異性を判定する標準と
して機能する。本明細書に開示するように、トロポニン
Ｉ中のシステインは分子内的に迅速に酸化されて該タン
パク質のコンホメーションを変化させる。トロポニンＩ
の酸化度とイムノアッセイ過程に対するその効果との関
連性については従来は検討されていなかった。本明細書
の教示内容によれば、トロポニンＩ分子の外見的不安定
性はトロポニンＩ分子の分子内での酸化または還元の動
力学と関連づけることができる。さらに、抗体の選択に
よって血液中に含まれるトロポニンＩの正確な定量が可
能であることも教示される。
精製された還元形態のトロポニンＩはシステインの分
子内酸化を受けるが、その速度はトロポニンＩの濃度に
は依存しない。酸化形態のトロポニンＩを調製する場
合、特に種々のチオール還元剤で調製する場合には、タ
ンパク質とチオール還元剤との混合ジスルフィドが生成
する可能性があるので特別な注意が必要である。混合ジ
スフィド形態のタンパク質は、特にイムノアッセイに用
いた抗体がシステイン80と97を包囲するタンパク質の領
域と結合している場合には、酸化形態または還元形態の
分子としては機能しない。
酸化形態または還元形態のトロポニンＩの精製物を用
いることにより、トロポニンＩに対して選択された種々
の抗体を用いるイムノアッセイにおいて特異的な効果が
観察された。ある抗体対を用いる場合には、還元形態の
トロポニンＩはイムノアッセイにおいてほとんど検出さ
れなかったが、別の抗体対を用いる場合には、酸化状態
はイムノアッセイ過程には効果をもたらさなかった。こ
れらの結果は、トロポニンＩの酸化状態に関する知見を
用いることなくトロポニンＩ分子に対する抗体を選択す
る場合には、誤った結果に導くイムノアッセイ過程と抗
体がもたらされることを示す。この結論は心筋梗塞で患
う患者からのトロポニンＩのイムノアッセイによって例
証される。患者からの試料中のトロポニンＩの酸化度は
可変的であり、現在の技術によるトロポニンＩのアッセ
イにおける外見的不安定性の可能な原因を提起する。遊
離のトロポニンＩは経時的にその酸化状態を変えて還元
形態から酸化形態に変化する（実施例４参照）。
非感応性抗体を遊離形態およびコンプレックス形態の
トロポニンに結合させることを含むイムノアッセイの場
合、好ましい抗体は酸化形態、還元形態およびコンプレ
ックス形態に対して非感応性の抗体であるが、これは血
液と共に循環するトロポニンの酸化状態および他のトロ
ポニン成分に対する結合度が経時的に変化するからであ
る。例えば、還元形態の遊離のトロポニンＩが心臓から
放出されると、該タンパク質は血液と共に循環する間お
よびその測定時までの間に酸化形態に変換される。さら
に、血液中の遊離のトロポニンＩとＴは相互の結合およ
びトロポニンＣとの結合によって二成分コンプレックス
および三成分コンプレックスを形成する。トロポニンＩ
の酸化形態またはトロポニンのコンプレックス形態への
このような変換によって次の結論が得られる。即ち、酸
化形態、還元形態およびコンプレックス形態に対して感
応性の抗体をイムノアッセイにおいて選択する場合に
は、トロポニンの形態（遊離形態、酸化形態、還元形態
またはコンプレックス形態）に応じてトロポニンの濃度
が経時的に外見上増加または減少することが該アッセイ
によって示される（該抗体はトロポニンの濃度の実際の
変化よりもこのような外見上の変化をより良く認識す
る）。別の実施例においては、損傷心筋からのトロポニ
ンコンプレックスの放出に起因して、血液と共に循環す
る間またはトロポニンをアッセイするまでの間に遊離形
態（非コンプレックス形態）およびトロポニンＩとＴの
二成分コンプレックス形態のトロポニンが形成される。
１種または複数種の感応性抗体を用いるイムノアッセイ
によるトロポニン濃度のアッセイ結果の多様性は、医者
が患者の症状の改善または悪化を判断するときに誤診を
もたらす。
１種よりも多くの感応性抗体を用いて遊離形態および
コンプレックス形態のトロポニンを測定することを含む
イムノアッセイの場合には、各々の感応性抗体をトロポ
ニンの１つまたは複数の形態と反応させて所望の形態に
対しては最大アッセイ応答値をもたらすが他の全ての形
態に対しては最小アッセイ応答値をもたらすようにな
る。好ましい抗体は、全ての感応性抗体に関して所望の
形態に対してほぼ同一（好ましくは20％以内）のアッセ
イ応答値をもたらす抗体であり、また、該最小アッセイ
応答値は該最大アッセイ応答値よりも少なくとも２（好
ましは５）のフィクターで小さい値である。例えば、イ
ムノアッセイにおいてシグナル抗体として２種の異なる
抗体を用いて、一方の抗体が酸化形態および還元形態の
遊離トロポニンＩ（または遊離トロポニンＴ）に対して
悲感応性であって該遊離形態のトロポニンに対して最大
アッセイ応答値をもたらすと共にコンプレックス形態の
トロポニンに対して最小アッセイ応答値をもたらす場合
には、他方の抗体はコンプレックス形態のトロポニンに
対して最大アッセイ応答値をもたらすと共に遊離形態の
トロポニンＩとＴに対して最小アッセイ応答値をもたら
す抗体にすべきである。この場合、トロポニンの全量は
正確に測定できる。当業者であれば次のことが認識でき
る。即ち、複数の形態のトロポニンに対して異なる親和
性（異なるアッセイ応答値をもたらす）を示す抗体は、
各々のトロポニン形態が単独で測定できるか、または分
離ゾーンにおいて測定できる場合にはイムノアッセイに
利用でき、また、イムノアッセイの相対的偏りはアッセ
イの較正において評価できる。また、感応性抗体と非感
応性抗体を固体相に結合させて分離ゾーン内の各々の形
態のトロポニンを測定できる。
別の好ましい態様においては、抗体またはトロポニン
ＩもしくはＴのエピトープに対する結合性フラグメント
は遊離のトロポニンＩまたはＴおよびトロポニンコンプ
レックスに対して非感応性である。本発明によれば、遊
離のトロポニンＩまたはＴおよびトロポニンコンプレッ
クスに対して感応性の抗体は、コンプレックス中のトロ
ポニンＩまたはＴの結合度の測定法をもたらすことが教
示される。トロポニンＩ、ＴおよびＣの精製物および精
製トロポニンコンプレックスを用いることによって、抗
体対によるトロポニンの認識に対するコンプレックス中
のトロポニンＩまたはＴの結合の効果に関する知見が得
られ、また該効果は血液中におけるトロポニンＩまたは
Ｔの動的状態と関連づけることができる。
血液中におけるトロポニンコンプレックスの成分また
は収縮性器官の他のタンパク質（トロポミオシンおよび
アクチン等）に対するトロポニンＩおよびＴの結合度は
結合の度合と親和性に依存するイムノアッセイにおいて
問題となる。これらのトロポニンの元の形態に関して
は、トロポニンコンプレックスは心筋中に存在し、ま
た、遅い単収縮性と速い単収縮性の骨格筋中ではトロポ
ニンＩ、ＣおよびＴの三成分コンプレックスとして存在
する。骨格筋からのトロポニンＩおよびＴは心筋からの
トロポニンＩおよびＴとはそれぞれ異なるアミノ酸配列
を有する。しかしながら、遅い単収縮性筋からのトロポ
ニンＣは心筋タンパク質と同じアミノ酸配列を有する
［Nature、第271巻、第31頁〜第35頁（1978年）;Arch.B
iochem.Biophys.、第186巻、第411頁〜第415頁（1978
年）;FEBS Lett.、第292巻、第５頁〜第８頁（1991
年）］。速い単収縮性骨格筋からのトロポニンＣは心筋
からのトロポニンＣとは同一ではないが、心筋からのト
ロポニンＩと結合することができる［Biochem.、第33
巻、第8464頁〜第8471頁（1994年）;Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、第90巻、第9036頁〜第9040頁（1993年）］。
骨格筋細胞の正常な回転に起因するとトロポニン成分
（トロポニンＩ、ＣおよびＴ）または収縮性器官からの
成分、例えば、骨格筋からのトロポミオシンおよびアク
チン等の放出によって、著しい量のトロポニンおよび収
縮性器官からの成分が血中へ流入する。骨格筋の質量は
心筋の質量よりも著しく多いので、正常なヒトの血液中
に存在するトロポニン成分は主として骨格筋に由来す
る。主として骨格筋に由来する循環性トロポニン成分
は、心筋梗塞の発作中または心筋の損傷時に血中へ放出
される心臓トロポニンＩおよびＴと結合する。体内での
筋損傷が進行するにつれて心臓組織に由来するトロポニ
ン成分は血液中で増量する。従って、心筋梗塞患者の血
液中の結合形態および遊離形態のトロポニン成分濃度へ
の寄与度は心筋と骨格筋では異なる。
心臓から血液中へ放出されるトロポニンの形態は遊離
形態であろうと二成分もしくは三成分コンプレックス形
態であろうと、心臓の特有の状態を示す。本発明によっ
て教示されるアッセイはトロポニンの放出パターンを解
析するものであり、医者は該放出パターンを利用するこ
とによって特異的な心不全、例えば心筋梗塞に比べて不
安定な狭心症を診断したり、心筋梗塞の発生時間を決定
することができる。
心筋梗塞患者からの遊離のトロポニンＩまたはＴのみ
を測定するイムノアッセイの臨床的意識は非常に大き
い。血中のトロポニン成分に対するトロポニンＩおよび
Ｔの結合性はトロポニン成分の濃度および該成分が筋肉
から放出されてからの時間によって変化するので、血液
中の遊離形態および結合形態のトロポニンＩおよびＴの
分析を考慮しなければならない。例えば、血中に含まれ
るカルシウムの存在下でのトロポニンＣに対するトロポ
ニンＩの結合親和力は1.27×108M-1である［Biochem.、
第33巻、第12729頁〜第12734頁（1994年）］。このこと
は次のことを意味する。即ち、トロポニンＣの濃度が10
0ng/mlで、結合形態と遊離形態のトロポニンＩの全濃度
が8ng/mlのときには、遊離のトロポニンＩの濃度の計算
値は4.6ng/mlとなる。心筋梗塞の指標となるトロポニン
Ｉの濃度が5ng/mlまたはこれよりも高くなると、遊離形
態のトロポニンＩのみ（この場合は4.6ng/ml）を測定す
るアッセイによって、医者は心筋梗塞が発生していない
と判断する。一般に、心筋梗塞を患っていると考えられ
る患者を扱う病院の救急部門においては、最初の検査結
果が陰性の場合には１時間または２時間おきに採血しな
ければならない。この例の場合、最初の試料中のトロポ
ニンIDの全濃度が8ng/ml（この値は心筋梗塞に対しては
陽性として定義されている）であるが測定濃度が4.6ng/
ml（この値は陰性の結果として定義されている）である
患者には治療がおこなわれないために、２回目の試料の
分析までの間は該患者の心筋の損傷が続行する。トロポ
ニンＴのアッセイの結果の解釈には、血中に含まれる収
縮性器官からの成分にトロポニンＴが結合するという問
題がある。従って、遊離のトロポニンＩとＴを測定する
現在の技術によるイムノアッセイの場合には、トロポニ
ンＩまたはＴの濃度がそれぞれ決定点に接近していると
きは心筋梗塞を正確に診断することができない。場合に
よっては、いくつかの異なる時点で採取した血液試料の
分析によって決定した値に比べた患者の体内の血液中の
トロポニンＩまたはＴの農度の経時的な増加または減少
による心臓の動的状態の診断によって、例えば、損傷し
た心臓が治療によって回復しているか、または悪化して
いるかを決定しなければならないことがある。このよう
の場合には、遊離のトロポニンＩまたはＴの濃度の経時
変化が結合形態と遊離形態の全トロポニン濃度の経時変
化と異なることがある。当業者であれば、血液中の全て
のトロポニン成分の濃度増加によって、結合形態のトロ
ポニンＩとＴの割合が遊離形態のトロポニンに比べて多
くなることを理解する。結合形態の全トロポニン濃度は
遊離形態のトロポニンＩとＴの濃度よりも速く増加す
る。結合形態と遊離形態のトロポニンＩとＴを含む全ト
ロポニン濃度を測定するアッセイの場合には、遊離のト
ロポニンＩまたはＴのみを測定するアッセイに比べて、
心臓損傷の進行をより正確に評価することができる。
特に好ましい態様においては、抗体または結合性フラ
グメントは心臓トロポニンコンプレックスと結合する。
特に、抗体はトロポニンコンプレックスまたは該コンプ
レックス中のトロポニンI/T、I/CおよびT/C界面のトロ
ポニンＩとＴの心臓特異性エピトープと結合する。本発
明によれば、トロポニンＩとＴに結合する抗体の三成分
コンプレックスのトロポニンＩまたはＴに対する結合性
は弱いことが教示される。さらに、本発明によれば、心
筋梗塞患者の血中にはトロポニンコンプレックスが存在
することが教示される。また、本発明によれば、遊離ト
ロポニン分子と結合する抗体を用いることによって、遊
離のトロポニンＩおよびＴまたはトロポニンＩとＴの二
成分コンプレックスに対するトロポニンコンプレックス
の血中量を評価する方法が提供される。
トロポニンの二成分および三成分コンプレックスと遊
離トロポニンＩおよびＴとの間の平衡は、トロポニン成
分とコンンプレックスに対する抗体の結合性に起因して
イムノアッセイ過程中に変化する。イムノアッセイ過程
中の種々の化学種のモル分率の変化は重要であるか、ま
たは重要でないかもしれないが、該変化は抗体の濃度、
トロポニン成分とコンプレックスに対する抗体の親和
性、トロポニン成分とコンプレックスに対する会合定数
および抗体がトロポニンと結合するまでの時間の関数で
ある。これらの可変因子は検知されるトロポニンＩとＴ
の濃度を変化させ、トロポニン濃度について誤った結論
に導くことがある。例えば、２種のイムノアッセイにお
いてサンドイッチイムノアッセイをおこなうために異な
る抗体対を使用してこれらの抗体の濃度とトロポニンＩ
またはＴに対する親和性が異なり、また、トロポニンＩ
またはＴが試料中では二成分および三成分コンプレック
スとして存在するならば、各々のイムノアッセイは異な
る結果を与えることが期待される。さらに、血液試料が
異なる濃度のトロポニンＣを含有するときには、二成分
コンプレックスとしてトロポニンＣと結合したトロポニ
ンＩとＴの割合の各々のイムノアッセイに対する影響は
異なる。
本発明によれば、トロポニンの二成分コンプレックス
は三成分コンプレックスよりも解離に対して安定である
ことが教示される。
他の好ましい態様においては、抗体または結合性フラ
グメントはトロポニンＩのＮ−末端領域のタンパク質加
水分解によって変化しないエピトープと結合する。トロ
ポニンＩのコンホメーションはリン酸化／脱リン酸化に
よって影響されることが報告されている［Biophys.J.、
第63巻、第986頁〜第995頁（1992年）;Biochem.、第33
巻、第12729頁〜第12734頁（1994年）］。別の好ましい
態様においては、抗体または結合性フラグメントは、ト
ロポニンＩのリン酸化によって変化を受けるかまたは変
化を受けないトロポニンＩまたはトロポニンＩコンプレ
ックスのエピトープと結合する。トロポニンＩは次の文
献に記載の方法によってリン酸化することができる:J.B
iol.Chem.、第252巻、第852頁〜第857頁（1997年）。ト
ロポニンＩのリン酸化物または脱リン酸化物は抗体生成
用免疫原並びにリン酸化および脱リン酸化トロポニンＩ
に対する抗体選択用抗原として利用できる。トロポニン
コンプレックスは種々の処理、例えば高濃度尿素処理、
低pH処理または２価金属カチオン（特にカルシウムイオ
ン、マグネシウムイオン）と結合する金属キレート化剤
を用いる処理等によって成分タンパク質に解離させるこ
とができる［Methods Enzymol.、第85巻、第241頁〜第
26頁（1982年）］。一般にこれらの処理法は非常に厳し
い条件下でおこなうものであって、数時間を必要とす
る。従って、トロポニンコンプレックスのこのような解
離条件は、心筋梗塞の疑いのある患者から採取した試料
に関して瞬時におこなわなければならないイムノアッセ
イにとっては実用的ではない。
二成分コンプレックス中のトロポニンＩまたはＴの結
合に対して優先的な感応性または非感応性を示す抗体の
生成と選択はまず第一に精製成分から二成分トロポニン
コンプレックスI/T、T/CおよびI/Cを調製することによ
っておこなわれる［J.Biol.Chem.、第254巻、第350頁〜
第355頁（1979年）;J.Biol.Chem.、第258巻、第2534頁
〜第2542頁（1983年）;J.Biol.Chem.、第258巻、第2951
頁〜第2954頁（1983年）;Can.J.Biochem.Cell Biol.、
第63巻、第212頁〜第218頁（1985年）;Biochem.、第33
巻、第12729頁〜第12734頁（1994年）;Ann.Rev.Biophy
s.Chem.、第16巻、第535頁〜第559頁（1987年）］。こ
の種のコンプレックスは必要に応じて当業者には既知の
方法によってコンプレックス中のタンパク質を化学的に
架橋させて安定化させてもよい。三成分コンプレックス
中のトロポニンＩまたはＴの結合に対して感応性または
非感応性の抗体の生成と選択はいくつかの方法によって
おこなうことができる。例えば、１つの方法では、三成
分コンプレックスを精製するか［Methods Enzymol.、
第85巻、第241頁〜第263頁（1983年）］、または精製ト
ロポニン成分を用いてコンプレックスを再構成する方法
である。当業者であれば次のことが理解できる。即ち、
トロポニンの二成分または三成分コンプレックスと関連
する収縮性器官の種々の他のタンパク質は精製成分から
構成でき、また得られるコンプレックスは本発明によっ
て教示されるように、抗体の生成と選択に利用できる。
コンプレックスは構成成分の化学架橋によって解離に対
して安定化させることができる。精製コンプレックス
は、例えば、マウスまたはラビットに注射してモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体を生成させる。他
の方法は遊離の非結合形態のトロポニンＩまたはＴを精
製し、この精製した遊離のトロポニンＩまたはＴを、例
えば、マウスまたはラビットに注射することによってポ
リクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成させ
る方法である。当業者であれば、抗体の生成するために
は例えば、次の文献に記載のように多くの方法が利用で
きることを理解できる：「抗体；実験マニュアル」、ハ
ーロウおよびデビット・レーン編、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（1988年）、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク。当業者であれば、
抗体のような作用をする結合性フラグメントまたはFab
フラグメントは種々の方法により遺伝情報に従って調製
できることも理解できる：「抗体工学；実用的アプロー
チ」、ボルレベック編、オックスフォード大学プレス
（1995年）、オックスフォード;J.Immunol.、第149巻、
第3914頁〜第3920頁（1992年）。特に組換え結合性フラ
グメントの調製、スクリーニングおよび選択については
実施例22と23において説明する。
生成した抗体は、まず第一に精製した二成分または三
成分コンプレックスを用いて親和性と特異性に関するス
クリーニング処理に付し、得られた抗体の親和性と特異
性についての結果を、イムノアッセイ法によって規定さ
れる望ましい特性に関して精製したトロポニンＩおよび
Ｔと比較することによって選択される。
スクリーニング処理には、マイクロタイタープレート
の別々のウェル内において、精製したトロポニンＩもし
くはＴまたは二成分もしくは三成分コンプレックスまた
はペプチドをトロポニンの心臓特異的配列に固定化する
過程を含めてもよい。潜在的な抗体または抗体群を含有
する溶液をマイクロタイターの個々のウェル内に入れ、
約30分間〜２時間インキュベートする。この溶液中に問
題となるタンパク質に対する抗体が存在する場合には、
該抗体は固定化されたトロポニンと結合する。トロポニ
ンの二成分または三成分コンプレックスの界面へ結合さ
せる抗体のスクリーニングにおいては、マイクロタイタ
ーのウェル内で固定された二成分または三成分コンプレ
ックスに結合する抗体をまず第一に選択する。この抗体
を遊離トロポニン成分への結合能に関するスクリーニン
グ処理に付す（潜在的な界面抗体はマイクロタイターウ
ェル内で固定された遊離のトロポニンＩ、ＣまたはＴに
結合すべきでない。）さらに、この界面抗体は、二成分
または三成分コンプレックスおよびトロポニンコンプレ
ックスを破壊することが知られている結合インヒビター
の存在下で該コンプレックス中の特異的なトロポニン成
分と結合することが知られている抗体とのサイドイッチ
アッセイをもたらしてはならない。この後者の条件を満
たす潜在的な界面抗体は、トロポニンコンプレックスお
よび結合インヒビターの存在下でのスクリーニングにお
いて用い成分とは異なるトロポニン成分に対する抗体と
のサンドイッチアッセイをもたらしてはならない。この
条件を満たす抗体は二成分コンプレックスに対して選択
される。三成分コンプレックスに対する界面抗体を選択
するためには余分のイムノアッセイをおこなわなければ
ならない。即ち、先の２つの条件を満たす潜在的な界面
抗体は、トロポニンコンプレックスおよび先の２つのス
クリーニングに用いた成分の異なるトロポニン成分に対
する抗体とのサンドイッチアッセイをもたらしてはなら
ない。マイクロタイターのウェルを次いで洗浄し、標識
化した二次抗体（例えば、生成した抗体がマウス抗体の
ときにはアリカリ性ホスファターゼと複合化させた抗−
マウス抗体）をウェル内へ添加して約30分間インキュベ
ートした後、洗浄する。基質をウェル内へ添加すると、
トロポニンに対する抗体が存在する場合には呈色反応が
みられる。問題となる抗体は心臓特異性分子に対する親
和性と特異性および抗原とのサンドイッチコンプレック
スの形成における相補性に関する分析処理に付される。
当業者であれば次のことが理解される。即ち、抗体また
は結合性フラグメントの調製、および種々のトロポニン
抗原に対する親和性と特異性に関するスクリーニングと
選択には多くのアプローチが適用できるが、これらのア
プローチによって本発明の範囲が変更されることはな
い。
トロポニンコンプレックスおよび非コンプレックス形態
のトロポニンＩとＴのアッセイ 本発明の特に好ましい態様はトロポニンＩおよびトロ
ポニンＴのアッセイ、特にイムノアッセイに関するもの
で、この場合、アッセイのために選択された抗体は三成
分コンプックス、二成分コンプレックスおよび非コンプ
レックス形態（遊離形態）のトロポニンＩまたはＴの心
臓特異性配列に結合し、これによってコンプレックス形
態（結合形態）および遊離形態のトロポニンＩとＴの量
をそれぞれ測定することができる。トロポニンＩとＴの
心臓特異性配列は次の文献に記載されている:FEBS Let
t.、第270巻、第57頁〜第61頁（1990年）;Genomics、第
21巻、第311頁〜第316頁（1994年）。トロポニンＩの心
臓特異性配列のような配列を有する14のアミノ酸から成
る合成ペプチドおよび該ペプチドに対する抗体の調製法
は次の文献に記載されている:PCT/US95/05468。
イムノアッセイはトロポニンコンプレックスおよび遊
離のトロポニンＩとＴの全てと結合する抗体カクテルの
用いてことなうことができる。あるいは、イムノアッセ
イは非結合形態のトロポニンＩとＴおよびコンプレック
ス中のトロポニンＩとＴのエピトープを認識できる特異
的抗体を用いておこなうこともできる。さらに、イムノ
アッセイはコンプレックス中の成分タンパク質の界面の
エピトープに結合する抗体および非結合形態のトロポニ
ンＩとＴに結合する抗体を用いておこなうことができ
る。
トロポニンＩまたはＴの好ましいイムノアッセイには
抗体または抗体カクテルと標識またはシグナル発生体か
らの抗体複合体の形成が含まれる。該抗体複合体はトロ
ポニンＩまたはＴのトロポニンコンプレックスの心臓特
異性領域および非結合形態のトロポニンＩまたはＴと結
合することができる。当業者であれば、シグナル発生体
としては多くの形態のものがあることを理解できる。シ
グナル発生体としては酵素、コロイド状金属粒子、色素
を配合したラテックスおよびシリカ粒子および色素粒子
が例示される。抗体とシグナル発生体との複合体は次の
文献に記載されたているようなヘテロ二官能試薬を用い
る種々の方法によって調製することができる（該文献の
記載内容も本明細書の一部を成するものである）：「ピ
アース・カタログ・アンド・ハンドブック」、ピアース
ケミカル社、ロックフォード、IL;「ユニフォーム・ラ
テックス・パーティクルズ」レイ・Ｂ・バングス著、セ
ラジェン・ディアグノスチックス社、インディアナポリ
ス、IN。他の抗体または抗体カクテルは膜のような固体
相に固定させ［Biotechniques、第４巻、第272頁〜第28
3頁（1986年）］、該膜を例えば米国特許第4,727,019号
および同第5,458,852号各明細書に記載のような装置内
へ移す。固定化された抗体は抗体複合体に対して相補的
である。固定化された抗体および抗体複合体はそれぞれ
トロポニンＩまたはＴのコンプレックスとサンドイッチ
コンプレックスを形成し、またトロポニンＩまたはＴと
サンドイッチコンプレックスを形成する。損傷心筋から
のトロポニンのコンプレックスまたは成分を含有する疑
いのある血漿または血清試料を抗体複合体と混合し、反
応混合物をインキュベートした後、上記の装置へ移す。
試料は膜を通過させ、抗体複合体に結合したトロポニン
のコンプレックスまたは成分を固定化抗体に結合させ、
過剰の非結合形態の抗体複合体は洗浄緩衝液を用いて洗
い流す。発生するシグナルは視覚または器機によって読
み取る。
トロポニンＩの特に好ましいイムノアッセイには少な
くとも２種の抗体と標識またはシグナル発生体との抗体
複合体の形成が含まれる。一方の抗体複合体はトロポニ
ンの三成分コンプレックスのトロポニンＴ成分と結合
し、他法の抗体複合体は遊離の二成分トロポニンＩ分子
と結合する。別の抗体または抗体カクテルは膜のような
固体相に固定させ、該膜を前述の装置へ移す。固定化抗
体は抗体複合体と相補的であって、トロポニンコンプレ
ックスに結合したトロポニンＩまたは非コンプレックス
形態のトロポニンＩとサンドイッチコンプレックスを形
成する。損傷心筋からのトロポニンのコンプレックスま
たは成分を含有する疑いのある血漿または血清試料を抗
体複合体と混合させ、反応混合物をインキュベートした
後、前記の装置内へ移す。試料を膜を通過させ、抗体複
合体に結合したトロポニンのコンプレックスまたは成分
を固定化抗体に結合させ、過剰の非結合状態の抗体複合
体を洗浄緩衝液を用いて洗い流す。発生するシグナルは
視覚または器機によって読み取る。このアッセイ法にお
いては、抗体複合体はトロポニンＴ特異的抗体を介して
三成分コンプレックスのトロポニンＩと結合し、またト
ロポニンＩ特異的抗体を介して全ての遊離および二成分
トロポニンＩ分子と結合する。固体相上の１種または複
数種の捕捉抗体は遊離トロポニンＩと結合し、また、ト
ロポニンＩを含む三成分トロポニンコンプレックスと結
合する。
酸化形態および還元形態のトロポニンＩの特に好まし
いイムノアッセイには少なくとも２種の抗体と標識また
はシグナル発生体との抗体複合体の形成が含まれる。抗
体複合体の一方は酸化形態のトロポニンＩと結合し、他
方の抗体複合体は還元形態のトロポニンＩ分子と結合す
る。別の抗体または抗体カクテルは膜のような固体相の
２つの分離ゾーン内に固定させ、該膜は前記の装置内へ
移す。固定化抗体は抗体複合体と相補的であって、酸化
形態または還元形態のトロポニンＩとサンドイッチコン
プレックスを形成する。損傷心筋からのトロポニン成分
を含有する疑いのある血漿または血清試料は抗体複合体
と混合させ、反応混合物はインキュベートした後、前記
の装置へ移す。試料は膜を通過させ、抗体複合体に結合
した酸化形態および還元形態のトロポニンＩを固定化抗
体と結合させ、過剰の非結合状態の抗体複合体は洗浄緩
衝液を用いて洗い流す。発生するシグナルは視覚または
器機によって読み取る。このアッセイ法においては、抗
体複合体は酸化型トロポニンＩ特異的抗体を介して酸化
形態のトロポニンＩと結合し、また還元型トロポニンＩ
特異的抗体を介して還元形態のトロポニンＩと結合す
る。固体相上の１種または複数種の捕捉抗体は酸化形態
および還元形態のトロポニンＩに結合した抗体複合体の
みと結合する。このイムノアッセイは心筋梗塞が発生し
てからの時間の評価に適用してもよい。
トロポニンＩの別の特に好ましいイムノアッセイには
抗体または抗体カクテルと標識またはシグナル発生体と
の抗体複合体の形成が含まれる。抗体複合体はトロポニ
ンコンプレックスに結合したトロポニンＩまたは非コン
プレックス形態のトロポニンＩと結合する。膜のような
固体相の３つの分離ゾーン内にトロポニンの三成分コン
プレックス、二成分コンプレックスおよび遊離トロポニ
ンＩと結合する抗体または抗体カクテルを固定させ、該
膜の前記のような装置内へ移す。例えば、三成分コンプ
レックスのトロポニンＴと結合するトロポニンＴ抗体を
１つの分離ゾーン内に固定させ、トロポニンＩの二成分
コンプレックス（トロポニンI/CおよびI/T）と結合する
トロポニンＩ抗体を別の分離ゾーン内に固定させ、ま
た、非コンプレックス形態のトロポニンＩのみと結合す
るトロポニンＩ抗体をさらに別の分離ゾーン内に固定さ
せる。これらの固定化抗体は抗体複合体と相補的であっ
て、各々の分離ゾーンによって規定されるようにコンプ
レックス形態または非コンプレックス形態のトロポニン
Ｉとサンドイッチコンプレックスを形成する。あるい
は、膜のような固体相の２つの分離ゾーン内にトロポニ
ンＩコンプレックス（二成分および三成分）および遊離
トロポニンＩと結合する抗体または抗体カクテルを固定
させる。例えば、三成分コンプレックスのトロポニンＴ
と結合するトロポニンＴ抗体および二成分コンプレック
スのトロポニンＩと結合するトロポニンＩ抗体を１つの
分離ゾーン内に固定させ、非コンプレックス形態のトロ
ポニンＩのみと結合するトロポニンＩ抗体を別の分離ゾ
ーン内に固定させる。これらの固定抗体は抗体複合体と
相補的であって、各々の分離ゾーンによって規定される
ようにコンプレックス形態または非コンプレックス形態
のトロポニンＩとサンドイッチ抗体を形成する。本発明
の別の態様は、トロポニンI/TおよびI/Cの結合ドメイン
の界面と結合するトロポニンＩコンプレックスを検出す
るために固体相上の抗体を利用する態様である。損傷心
筋からのトロポニンのコンプレックスまたは成分を含有
する疑いのある血漿または血清試料を抗体複合体と混合
させて得られる反応混合物をインキュベートさせた後、
前述の装置内へ移す。試料を膜を通過させ、抗体複合体
と結合したトロポニンのコンプレックスおよび成分を分
離ゾーン内の各々の固定化抗体と結合させ、過剰の非結
合状態の抗体複合体を洗浄緩衝液を用いて洗い流す。発
生するシグナルは視覚または器機によって読み取る。こ
のアッセイ法においては、抗体複合体は１種または複合
種のトロポニンＩ特異的抗体を介してトロポニンＩおよ
びトロポニンＩの二成分および三成分コンプレックスと
結合する。固体相上の分離ゾーン内の１種または複数種
の捕捉抗体は各々の分離ゾーンによって規定される非コ
ンプレックス形態のトロポニンＩまたはトロポニンＩ含
有トロポニンコンプレックスと結合する。このイムノア
ッセイによってトロポニンＩのフラクション、即ちコン
プレックス形態および非コンプレック形態のフラクショ
ンを定量できる。本発明によれば、心筋梗塞が確認され
た患者からの血漿および血清試料中には非コンプレック
ス形態およびコンプレックス形態のトロポニンが存在す
ることが教示される。コンプレックス形態および非コン
プレックス形態のトロポニンＩのフラクションの定量に
よって、例えば不安定狭心症または心筋梗塞による筋損
傷のタイプや程度または血栓崩壊治療効果に関して重要
な臨床的なデータが得られる。
他の特に好ましいイムノアッセイにおいては、心臓ト
ロポニン三成分コンプレックス、心臓トロポニン二成分
コンプレックス（トロポニンI/T、T/CおよびI/C）およ
び遊離の心臓トロポニンＩおよびＴを測定する。この方
法には抗体または抗体カクテルと標識またはシグナル発
生体との抗体複合体の形成が含まれる。抗体複合体はト
ロポニンコンプレックスに結合したトロポニンＴおよび
Ｉまたは非コンプレックス形態のトロポニンＴおよびＩ
と結合する。膜のような固体相の１つの分離ゾーン内に
トロポニンＩおよびＴの三成分コンプレックス、二成分
コンプレックス並びに遊離のトロポニンＩおよびＴと結
合する抗体または抗体カクテルを固定化させ、該膜を前
記の装置内へ移す。例えば、三成分コンプレックスのト
ロポニンＩと結合するトロポニンＩ抗体（各々がトロポ
ンニンI/T、T/CおよびI/Cの結合のドメインの界面を認
識する３種までの異なる抗体）、遊離のトロポニンＩと
結合するトロポニンＩおよび遊離のトロポニンＴと結合
するトロポニンＴ抗体を分離ゾーン内に固定させる。こ
れらの固定化抗体は抗体複合体に対して相補的であっ
て、コンプレックス形態および非コンプレックス形態の
トロポニンＴおよびＩとサンドイッチコノプレックスを
形成する。損傷心筋からのトロポニンのコンプレックス
または成分を含有する疑いのある血漿または血清試料を
抗体複合体と混合して得られる反応混合物をインキュベ
ートした後、前述の装置内へ移す。試料は膜を通過さ
せ、抗体複合体に結合したトロポニンのコンプレックス
および成分を分離ゾーン内の各々の固定化抗体と結合さ
せ、過剰の非結合状態の抗体複合体を洗浄緩衝液を用い
て洗い流す。発生するシグナルは視覚または器機によっ
て読み取る。このアッセイ法においては、抗体複合体は
遊離のトロポニンＩおよびＴ、二成分コンプレックスと
トロポニンＩおよびＴ並びに三成分コンプレックスのト
ロポニンＩまたはＴと結合する。固体相を分離ゾーン内
の捕捉抗体は遊離のトロポニンＩとＴおよびトロポニン
コンプレックスに対して特異的な抗体複合体と結合す
る。このイムノアッセイにより、三成分トロポニンコン
プレックス、トロポニンT/C、I/TおよびI/C並びに遊離
のトロポニンＩおよびＴを定量できる。当業者であれば
次のことが理解できる。即ち、種々のトロポニン形態に
対して特異的な抗体は１種または複数種のシグナル発生
体と複合を形成することができ、また、該複合体に関し
て先に説明した抗体は固体相の分離ゾーン内に結合でき
る。全トロポニン濃度を決定することによって心筋損傷
に関してより感度の高いイムノアッセイをおこなうこと
ができ、また、これによって不安定狭心症または心筋梗
塞のより迅速な診断とより早い血栓崩壊治療が可能とな
る。
トロポニンＴの特に好ましいイムノアッセイには、少
なくとも２種の抗体と標識またはシゲナル発生体との抗
体複合体の形成が含まれる。抗体複合体の１種はトロポ
ニンコンプレックスのトロポニンＩ成分と結合すること
ができ、また、他の抗体複合体は遊離の二成分トロポニ
ンＴ分子と結合するとことごできる。別の抗体または抗
体カクテルを膜のような固体相に固定させ、該膜を前述
のような装置内へ移す。固定化抗体は抗体複合体に対し
て相補的であって、トロポニンコンプレックスに結合し
たトロポニンＴまたは非コンプレックス形態のトロポニ
ンＴとサンドイッチコンプレックスを形成する。損傷心
筋からのトロポニンのコンプレックスまたは成分を含有
する疑いのある血漿または血清試料を抗体複合体と混合
して得られる反応混合物をインキュベートした後、前述
のような装置内へ移す。試料は膜を通過させ、抗体複合
体と結合したトロポニンのコンプレックスと成分を固定
化抗体と結合させ、過剰の非結合状態の抗体複合体は洗
浄緩衝液を用いて洗い流す。発生するシグナルは視覚ま
たは器機によって読み取る。このアッセイ法において
は、抗体複合体はトロポニンＩ特異的抗体を介してトロ
ポニンコンプレックスと結合し、また、トロポニンＴ特
異的抗体を介して全ての遊離および二成分トロポニンＴ
分子と結合する。固体相上の１種または複数種の捕捉抗
体は遊離トロポニンＴおよびトロポニンＴ含有トロポニ
ンコンプレックスと結合した抗体複合体と結合する。
トロポニンＴの別の特に好ましいイムノアッセイに
は、抗体または抗体カクテルと標識またはシグナル発生
体との抗体複合体の形成が含まれる。抗体複合体はトロ
ポニンコンプレックスに結合したトロポニンＴまたは非
コンプレックス形態のトロポニンＴと結合する。膜のよ
うな固体相の３つの分離ゾーン内にトロポニンＴの三成
分コンプレックス、二成分コンプレックスおよび遊離の
トロポニンＴと結合する抗体または抗体カクテルを固定
させ、該膜を先に説明した装置内へ移す。例えば、三成
分コンプレックスのトロポニンＩに結合するトロポニン
Ｉ抗体を１つの分離ゾーン内に固定させ、トロポニンＴ
の二成分コンプレックス（トロポニンI/TおよびC/T）に
結合するトロポニンＴ抗体を別の分離ゾーン内に固定さ
せ、また、非コンプレックス形態のトロポニンＴのみに
結合するトロポニンＴ抗体をさらに別の分離ゾーン内に
固定させる。これらの固定化抗体は抗体複合体に対して
相捕的であって、各々の分離ゾーンによって規定される
ようにコンプレックス形態または非コンプレックス形態
のトロポニンＴとサンドイッチコンプレックスを形成す
る。あるいは、膜のような固体相の２つの分離ゾーン内
にトロポニンＴコンプレックス（二成分および三成分）
および遊離トロポニンＴと結合する抗体または抗体カク
テルを固定させる。例えば、三成分コンプレックスのト
ロポニンＩと結合するトロポニンＩ抗体および二成分コ
ンプレックスのトロポニンＴと結合するトロポニンＴ抗
体を１つの分離ゾーン内に固定させ、非コンプレックス
形態のトロポニンＴのみに結合するトロポニンＴ抗体を
別の分離ゾーン内に固定させる。これらの固定化抗体は
抗体複合体に対して相捕的であって、各々の分離ゾーン
によって規定されるようにコンプレックス形態または非
コンプレックス形態のトロポニンＴとサンドイッチコン
プレックスを形成する。本発明の別の態様においては、
トロポニンC/TおよびI/Tの結合ドメインの界面と結合す
るトロポニンＴコンプレックスを検出するために固体相
上の抗体を利用する。損傷心筋からのトロポニンのコン
プレックスまたは成分を含有する疑いのある血漿または
血清試料を抗体複合体と混合させて得られる反応混合物
をインキュベートした後、前述の装置内へ移す。試料は
膜を通し、抗体複合体と結合したトロポニンのコンプレ
ックスおよび成分を分離ゾーン内の各々の固定化抗体と
結合させ、過剰の非結合状態の抗体複合体は洗浄緩衝液
を用いて洗い流す。発生するシグナルは視覚または器機
によって読み取る。このアッセイ法においては、抗体複
合体は１種または複数種のトロポニンＴ特異性抗体を介
してトロポニンＴ並びにトロポニンＴの二成分および三
成分コンプレックスと結合する。固体相上の分離ゾーン
内の１種または複数種の捕捉抗体は各々の分離ゾーンに
よって規定されるように非コンプレックス形態のトロポ
ニンＴまたはトロポニンＴ含有トロポニンコンプレック
スと結合する。このイムノアッセイによってトロポニン
Ｔのフラクション、即ち、コンプレックス形態および非
コンプレックス形態のフラクションを定量できる。本発
明によれば、心筋梗塞が確認された患者の血漿および血
清試料中には非コンプレックス形態およびコンプレック
ス形態のトロポニンが存在することが教示される。コン
プレックス形態および非コンプレックス形態のトロポニ
ンＴのフラクションの決定により、筋損傷、例えば不安
定狭心症または心筋梗塞による筋損傷のタイプや程度ま
たは血栓崩壊治療の効果に関する重要な臨床的データが
得られる。
他の特に好ましいイムノアッセイにおいては、心臓ト
ロポニン三成分コンプレックス、心臓トロポニン二成分
コンプレックス（トロポニンI/T、T/CおよびI/C）およ
び遊離の心臓トロポニンＩおよびＴを独立に測定する。
この方法には抗体または抗体カクテルと標識またはシグ
ナル発生体との抗体複合体の形成が含まれる。抗体複合
体はトロポニンコンプレックスと結合したトロポニンＴ
およびＩまたは非コンプレックス形態のトロポニンＴお
よびＩと結合する。膜のような固体相の６つの分離ゾー
ン内にトロポニンＩおよびＴの三成分コンプレックス、
二成分コンプレックス並びに遊離のトロポニンＩおよび
Ｔと結合する抗体または抗体カクテルを固定させ、該膜
を前述のような装置内へ移す。例えば、三成分コンプレ
ックスのトロポニンＩと結合するトロポニンＩ抗体を１
つの分離ゾーン内に固定し、各々がトロポニンI/T、T/C
およびI/Cの結合ドメインの界面を認識する３種の異な
る抗体を３つの分離ゾーン内に固定し、遊離トロポニン
Ｉと結合するトロポニンＩ抗体を別の分離ゾーン内に固
定し、また遊離のトロポニンＴと結合するトロポニンＴ
抗体をさらに別の分離ゾーン内に固定する。これらの固
定化抗体は抗体複合体に対して相捕的であって、各々の
分離ゾーンによって規定されるようにコンプレックス形
態および非コンプレックス形態のトロポニンＴおよびＩ
とサンドイッチコンプレックスを形成する。損傷心筋か
らのトロポニンのコンプレックスまたは成分を含有する
疑いのある血漿または血清試料を抗体複合体と混合して
得られる反応混合物をインキュベートした後、前述のよ
うな装置内へ移す。試料は膜を通過させ、抗体複合体と
結合したトロポニンのコンプレックスおよび成分を分離
ゾーン内の各々の固定化抗体と結合させ、過剰の非結合
状態の抗体複合体を洗浄緩衝液を用いて洗い流す。発生
するシグナルは視覚または器機によって読み取る。この
アッセイ法においては、抗体複合体を遊離のトロポニン
ＩおよびＴ、二成分コンプレックスのトロポニンＩおよ
びＴおよび三成分コンプレックスのトロポニンＩまたは
Ｔと結合させる。固体相上の分離ゾーン内の捕捉抗体は
遊離のトロポニンＩとＴおよびトロポニンコンプレック
スに対して特異的な抗体複合体と結合する。このイムノ
アッセイにより、三成分トロポニンコンプレックス、ト
ロポニンT/I、I/TおよびI/C並びに遊離のトロポニンＩ
およびＴを定量できる。本発明によれば、心筋梗塞が確
認された患者の血漿および血清試料中には非コンプレッ
クス形態およびコンプレックス形態のトロポニンが存在
することが教示される。各々のトロポニン三成分コンプ
レックス、トロポニンＩおよびＴの二成分コンプレック
スおよび非コンプレックス形態のトロポニンＩおよびＴ
のフラクションの定量により、筋損傷、例えば不安定狭
心症または心筋梗塞による筋損傷のタイプや程度または
血栓崩壊治療の効果に関する重要な臨床的データが得ら
れる。
別の特に好ましいイムノアッセイにおいては、心臓特
異性トロポニン三成分コンプレックス、心臓特異性トロ
ポニン二成分コンプレックス（トロポニンI/T、T/C、I/
C、酸化型I/Tおよび酸化型I/C）および遊離の心臓トロ
ポニンＩ（酸化型および還元型）およびＴを独立に測定
する。この方法には抗体または抗体カクテルと標識また
はシグナル発生体との抗体複合体の形成が含まれる。抗
体複合体はトロポニンコンプレックスに結合したトロポ
ニンＴおよびＩまたは非コンプレックス形態のトロポニ
ンＴおよびＩと結合する。膜のような固体相の９つの分
離ゾーン内に三成分コンプレックス、トロポニンＩおよ
びＴの二成分コンプレックスおよび遊離のトロポニンＩ
およびＴと結合する抗体または抗体カクテルを固定さ
せ、該膜を前述の装置内へ移す。例えば、三成分コンプ
レックスのトロポニンＩと結合するトロポニンＩ抗体を
１つと分離ゾーン内に固定し、各々がトロポニンI/T、T
/C、I/C、酸化型I/Tおよび酸化型I/Cの結合ドメインの
界面を認識する５種の異なる抗体を５つの分離ゾーン内
に固定し、遊離のトロポニンＩ（酸化型および還元型）
と結合するトロポニンＩ抗体を２つの分離ゾーン内に固
定し、また、遊離のトロポニンＴと結合するトロポニン
Ｔ抗体を別の分離ゾーン内に固定する。固定化抗体は抗
体複合体に対して相捕的であって、各々の分離ゾーンに
よって規定されるようにコンプレックス形態および非コ
ンプレックス形態のトロポニンＴおよびＩとサンドイッ
チコンプレックスを形成する。損傷心筋からのトロポニ
ンのコンプレックスまたは成分が含まれている疑いのあ
る血漿または血清試料を抗体複合体と混合させて得られ
る反応混合物をインキュベートした後、前述の装置内へ
移す。試料は膜を通過させ、抗体複合体と結合したトロ
ポニンのコンプレックスおよび成分を分離ゾーン内の各
々の固定化抗体と結合させ、過剰の非結合状態の抗体複
合体を洗浄緩衝液を用いて洗い流す。発生するシグナル
は視覚または器機によって読み取る。このアッセイにお
いては、抗体複合体は遊離のトロポニンＩとＴ、二成分
コンプレックスのトロポニンＩとＴ並びに三成分コンプ
レックスのトロポニンＩまたはＴと結合する。固体相上
の分離ゾーン内の捕捉抗体は遊離のトロポニンＩとＴお
よびトロポニンコンプレックスに対して特異的な抗体複
合体と結合する。このイムノアッセイにより、三成分ト
ロポニンコンプレックス、トロポニンT/C、I/T、I/C、
酸化型I/Tおよび酸化型I/C並びに遊離のトロポニンＩ
（酸化型および還元型）およびＴを定量できる。本発明
によれば、心筋梗塞が確認された患者の血漿および血清
試料中には非コンプレックス形態およびコンプレックス
形態のトロポニンが存在することが教示される。個々の
トロポニン三成分コンプレックス、トロポニンＩおよび
Ｔの二成分コンプレックスおよび非コンプレックス形態
のトロポニンＩおよびＴのフラクションの決定により、
筋損傷、例えば、不安定狭心症または心筋梗塞による筋
損傷のタイプや程度または血栓崩壊治療の効果に関して
重要な臨床的データが得られる。
トロポニンの特に好ましいイムノアッセイにおいて
は、トロポニンの異なる形態に対して異なる認識度を示
す抗体を用いることによって２種またはそれよりも多く
の形態のトロポニン、例えば遊離形態およびコンプレッ
クス形態のトロポニンＩおよび／またはＴの濃度を測定
する。抗体または抗体カクテルと標識またはシグナル発
生体との抗体複合体を形成させる。抗体複合体は定量さ
れるべき各々の形態のトロポニンと結合できる。抗体複
合体を形成するのに好ましい抗体は前述のような「非感
応性」抗体である。装置内の膜のような固体相上の分離
ゾーン内に抗体複合体に対して相捕的な抗体または抗体
カクテルを固定させる。固定化抗体の重要な特性はアッ
セイにおける応答性によって規定されるが、これについ
てはアッセイに関する記載の後において説明する。アッ
セイの重要な特徴は２種の形態のトロポニンを定量する
場合について説明する。トロポニンの２種の形態１およ
び２を定量する場合には、２つの分離ゾーンを利用す
る。このシステムは適当なマトリックス（例えば、血
液、血漿または血清）内の２組のカリブレーターを用い
て検量される。好ましくは、１組のカリブレーターは種
々の濃度の形態１のトロポニンを含有し、他のカリブレ
ーターは形態２のトロポニンを含有する。各々のカリブ
レーターを相互に独立して抗体複合体と混合させて得ら
れる反応混合物をインキュベートした後、前述の装置内
へ移す。試料は膜を通過させ、抗体複合体に結合したト
ロポニンを分離ゾーン内の固定化抗体と結合させ、過剰
の非結合状態の抗体複合体は洗浄緩衝液を用いて洗い流
す。ゾーン１と２に発生するシグナルを各々のカリブレ
ーターを用いて測定する。最も簡単で好ましいシステム
はトロポニンの濃度に関してアッセイシグナルが直線的
またはほぼ直線的に変化するシステムである。この場
合、検量（calibration）の過程において次のように定
義される４つの独立したアッセイ勾配と２つのアッセイ
定数が得られる： m11＝カリブレーターとして形態１のトロポニンを用
いてゾーン１において決定されたアッセイ勾配（式1a） m12＝カリブレーターとして形態２のトロポニンを用
いてゾーン１において決定されたアッセイ勾配（式1b） m21＝カリブレーターとして形態１のトロポニンを用
いてゾーン２において決定されたアッセイ勾配（式1c） m22＝カリブレーターとして形態２のトロポニンを用
いてゾーン２において決定されたアッセイ勾配（式1d） C1＝トロポニンの濃度がゼロに対応するときのゾーン
１におけるアッセイシグナル （式2a） C2＝トロポニンの濃度がゼロに対応するときのゾーン
２におけるアッセイシグナル （式2b） 当業者であれば式１および式２で表される勾配および
定数は、両方の形態のトロポニンを種々の異なる濃度比
で含有するカリブレーター溶液を用いる検量によって決
定できることを理解できる。形態１および２のトロポニ
ンを含有する疑いのある血液、血漿または血清を上述の
カリブレーターの場合のようにアッセイする。このアッ
セイによって２つのシグナル値S1およびS2を得る。S1は
ゾーン１において測定したシグナル値であり、S2はゾー
ン２において測定したシグナル値である。この２つのシ
グナル値は次の２つの独立した一次方程式で表される： S1＝m11［形態１］＋m12［形態２］＋C1 （式3a） S2＝m21［形態１］＋m22［形態２］＋C2 （式3b） 式中、［形態１］および［形態２］はそれぞれ試料中
の形態１のトロポニンおよび形態２のトロポニンの濃度
を表わす。式３は、次の式４の条件下において一次代数
方程式の標準的な解法によって解くことができ、これに
よって試料中の［形態１］および［形態２］が決定され
る（例えば、「物理学者のための数学的方法」、アガデ
ミックプレス・ニューヨーク、NY参照）： m11m22−m12m21≠０ （式４） 従って、式１および４は、測定されたシグナルS1および
S2から形態１および形態２のトロポニンの濃度を決定す
るためにゾーン１とゾーン２内の抗体に対して必要なア
ッセイ応答値を規定する。一般に、形態１と形態２の濃
度の決定精度は式４に示す差の増加に伴って高くなる。
満足すべき結果を得るために必要なこの差の値は検量と
アッセイの精度およびトロポニン濃度に要求される精度
によって左右される。大部分のアッセイシステムにとっ
て、好ましいアッセイは、少なくとも１つのゾーン内の
抗体または抗体カクテルがトロポニンが形態１または形
態２であるかについて感応性であるアッセイである（こ
の場合、「感応性」については先のセンクションで定義
した）。例えば、比m11/m12もしくは比m22m21または両
方の比は約２よりも大きくするべきである。２種の形態
のトロポニンの濃度を決定するためのこの方法は２種よ
りも多くの形態の場合に拡張できる。Ｎ種の形態を測定
するためにはＮ個の分離ゾーンを使用しなければならな
い。検量はＮ種の形態のトロポニンを含有するカリブレ
ーター溶液を最低Ｎ＋１種用いておこなわなければなら
ない。Ｎ種の形態のトロポニンを含有する疑いのある試
料のアッセイについて考える。Ｎ個のゾーンの各々から
のアッセイシグナルを測定する。ｉ番目のシグナルSiは
次式で表される： 式中、mijはカリブレーターとしてトロポニンの形態
ｊのトロポニンを用いてｉ番目のゾーンにおいて決定さ
れるアッセイ勾配を示し、［形態ｊ］は試料中の形態ｊ
のトロポニンの濃度を示す。式５は１組のＮ個の一次方
程式を定義する。これらの方程式はmijのマトリックス
のデタミナントがゼロに等しくない条件下で解くことが
でき、これによってＮ種の形態のトロポニンの濃度を決
定することができる。大部分のアッセイシステムにとっ
て、好ましいアッセイは、少なくともＮ−１個のゾーン
がそこに含まれている形態のトロポニンに対して感応性
の抗体または抗体カクテルを含有するアッセイ、即ち、
比mii/mij（ｉ≠ｊ）が約２よりも大きいアッセイであ
る。従って、これらの概念はトロポニン濃度に対してア
ッセイ応答値が一次的でない場合にも拡張できる。この
場合、Ｎ個のゾーンのｉ番目で測定されるシグナル値は
次式で与えられる： 式中、Fijは［形態ｊ］の関数であって、ゾーンｉ中
の形態ｊの用量−応答値（［形態ｊ］の関数としてのシ
グナル値）を示し、上述の場合と同様の検量法によって
決定される。式６はＮ個の非線形方程式の系を示し、こ
の式は、例えば当業者には周知の近似（コンピュータ
ー）法によって解くことができ、これによってＮ種の形
態のトロポニンの濃度を決定することができる。
本発明の別の態様においては、トロポニンＩコンプレ
ックスまたはトロポニンＴコンプレックスの会合の親和
定数に影響をもたらすインヒビターを反応混合物の調製
前または調製時に試料に添加することによって遊離のト
ロポニンＩまたはトロポニンＴをそれぞれ測定する。結
合インヒビターはトロポニンコンプレックスを破壊させ
てもよく、あるいはトロポニン成分間の相互作用が完全
または部分的に妨害されてエピトープが結合のために抗
体をより容易に認識できるようにコンプレックスを開裂
または部分的に解離させてもよい。インヒビターとして
は、特に限定的ではないが、収縮性器官のタンパク質と
の結合に関してトロポニンＩまたはトロポニンＴと競合
するペプチドおよび金属キレート化剤から成る群から選
択することができる。金属キレート化剤、特にカルシウ
ムやマグネシウムに結合する金属キレート化剤は、例え
ば、トロポニンＩおよびトロポニンＣの結合の親和定数
を、カルシウムの存在下での親和性に比べて約10倍低下
させる［Biochem.、第33巻、第12729頁〜第12734頁（19
94年）］。収縮性器官のタンパク質に対するトロポニン
ＩおよびトロポニンＴの結合に影響を及ぼすペプチドに
はマストパラン、メリチンおよび収縮性器官のタンパク
質を有する結合ドメインにおいてトロポニンＩおよびＴ
の配列のような特性を示すペプチド配列が含まれる［Bi
ochem.、第31巻、第11326頁〜第11334頁（1992年）］;
J.Biol.Chem.、第267巻、第15715頁〜第15723頁（1992
年）;Biochem.、第33巻、第8233頁〜第8239頁（1994
年）］。インヒビターとして有用な他のペプチドは、ト
ロポニン成分の結合ドメインのような特性を示すペプチ
ドである。結合ドメインは、例えば、Ann.Rev.Biophys.
Biophys.Chem.、第16巻、第535頁〜第559頁（1987年）
に記載されており、このような結合ドメインに関する情
報を用いることにより、当業者は結合ドメインにおいて
タンパク質のペプチドのような特性を示すペプチドを合
成することができる。
本発明の別の態様においては、イムノアッセイ用の反
応混合物の調製前または調整時にトロポニンＣを試料に
添加することにより、試料中の全てまたはほとんど全て
のトロポニンＩまたはＴをアッセイの過程中にトロポニ
ンＣに結合させる。試料中のトロポニンＣの濃度は約0.
5μg/ml〜100μg/ml、好ましくは約１〜10μg/mlにすべ
きである。
本発明の他の態様においては、トロポニンＩのイムノ
アッセイ用の反応混合物の調製前または調製特にトロポ
ニンＣおよびＴを試料に添加することにより、三成分ト
ロポニンコンプレックス形態のトロポニンＩの全てまた
はほとんど全てを結合させることができる。試料中のト
ロポニンＣおよびＴの濃度は約0.5〜100μg/ml、好まし
くは約１〜10μg/mlにすべきである。
本発明のさらに別の態様においては、トロポニンＴの
イムノアッセイ用の反応混合物の調製前または調製時に
トロポニンＣおよびＩを試料に添加することにより、三
成分トロポニンコンプレックス形態のトロポニンＴの全
てまたはほとんど全てを結合させることができる。試料
中のトロポニンＣおよびＴの濃度は約0.5〜100μg/ml、
好ましくは約１〜10μg/mlにすべきである。
反応混合物の調製前または調製時にトロポニン成分を
試料に添加するこれらの態様にはいくてかの利点があ
る。
第一に、トロポニンＩは、トロポニンＩの低い測定濃
度をもたらすガラス表面や種々の膜に強固に吸着する。
トロポニンＴも種々の表面に吸着する。しかしながら、
トロポニンＣまたは三成分コンプレックス形態のトロポ
ニンＣに結合する場合には、トロポニンＩとＴの吸着特
性は著しく低下する。従って、トロポニンI/CもしくはT
/Cコンプレックスまたは三成分コンプレックスの回収は
トロポニンＩまたはＴの回収よりも良好である。この態
様においては、トロポニンＩまたはＴのコンプレックス
を認識する抗体をイムノアッセイにおいて使用する。
第二に、コンプレックス形態のトロポニンＩまたはＴ
のみに結合する抗体が要求されるときに、該抗体の選択
過程がより緩和される。これは、このような抗体には遊
離のトロポニンＩまたはＴに対して類似の親和性が要求
されないからである。
当業者であれば本発明による教示内容を認識すると共
に、これらの教示内容に基づいて次のことが理解でき
る。即ち、前述の種々の態様において例示したような試
薬の装置への添加等にはさらに多くの態様があり、これ
らの態様も本発明の範囲内に包含される。
カリブレーター試薬に対するトロポニンＩまたはＴの安
定化 トロポニンＩおよびＴは水性調製物や患者から採取さ
れる試料中においては不安定であることが知られてい
る。本明細書において教示されるように、タンパク質の
（外見的な）不安定性はトロポニンＩの酸化状態、トロ
ポニンＩおよびＴが他のトロポニンタンパク質とコンプ
レックスを形成する傾向性およびトロポニンＩとＴの表
面上への吸着特性に関連している。
トロポニンＩの安定化はシステインの分子内酸化によ
っておこなわれ、このタンパク質はチオール還元剤、例
えば、メルカプトエタノールおよびジチオトレイトール
等を用いることなく貯蔵される。
チオール還元剤を高濃度で含有する溶液中にトロポニ
ンＩを貯蔵すると、システインは全体的に還元形態で保
存される。しかしながら、タンパク質の分子内での酸化
および還元は動的過程であり、このため、タンパク質は
還元剤の存在下であっても酸化形態で存在するときがあ
る。メルカプトエタノールまたはＮ−アセチルシステイ
ンのような還元剤、即ち、分子中に単一のチオール基の
みを有する還元剤が存在するときには、還元剤とタンパ
ク質チオールの混合ジスルフィドが形成される。この混
合ジスルフィドの半減期は還元剤の濃度と分子内酸化速
度の関数である。即ち、混合ジスルフィドはチオール還
元剤および他のタンパク質システインによって還元され
る（但し、両方のシステインは混合ジスルフィド形態で
は存在しないと仮定する）。分子内酸化されたトロポニ
ンＩの還元においては、単一のチオール基を有する還元
剤は分子内システインを還元することによってシステイ
ンおよびタンパク質の混合ジスルフィドを生成させる。
タンパク質の混合ジスルフィドはタンパク質のシステイ
ンまたはチオール還元剤によって還元される。この還元
反応は進行し、最終的には還元剤の濃度はタンパク質を
還元状態に維持できなくなる濃度まで激減する。還元剤
の濃度がトロポニンＩのチオールの濃度に接近すると、
タンパク質システインとチオール還元剤はチオール還元
剤によって還元されない混合ジスルフィドを形成する。
あるいは、タンパク質を分子内酸化すると、チオール還
元剤の濃度はシステインを還元するには不十分な濃度と
なる。チオール還元剤の激減により、最終的には分子内
酸化形態のトロポニンＩおよび混合ジスルフィド形態の
タンパク質の混合物が得られる。トロポニンＩのこれら
の形態の各々は異なるコンホメーションを有する。
２つのチオール基を有するチオール還元剤、例えば、
ジチオトレイトールまたはジチオエリスリトールを用い
る場合、チオール還元剤の激減により、最終的には酸化
形態のトロポニンＩのみが得られる。
従って、酸化状態のトロポニンＩに感応性の抗体はイ
ムノアッセイにおいて種々の形態のトロポニンＩを識別
する。このイムノアッセイにおいてはトロポニンＩの不
正確な濃度でも測定する。
安定化されたトロポニンＩの好ましい組成物は分子内
酸化されたトロポニンＩの水性溶液を含有する。安定化
されたトロポニンＩおよびＴの特に好ましい組成物はト
ロポニンＩ、ＴおよびＣの三成分コンプレックスの緩衝
化溶液をカルシウム塩やマグネシウム塩の存在下または
不存在下で含有する。この溶液の好ましいpHの範囲は６
〜９であり、また、カルシウム塩やマグネシウム塩、例
えば、塩化カルシウムや塩化マグネシウムの濃度は0.01
mM〜10mMである。特に好ましい緩衝化溶液は約100％ま
でのヒトの血清または血漿を含有する。三成分コンプレ
ックスはトロポニンＩ、ＴおよびＣこら形成させてもよ
く、あるいは、心筋または骨格筋から単離して精製して
もよい［Methods Enzymol.、第85巻、第241頁〜第263
頁（1982年）］。
膜中のトロポニンＩの改良回収法 トロポニンＩおよびＴは種々の表面やタンパク質に吸
着することが知られており、この現象によりトロポニン
の測定濃度を低下させることができる。特に、イムノア
ッセイを大きな表面積を有する器具または装置内でおこ
なう場合、例えば膜やラテックス粒子をアッセイ法で利
用する場合、試料にさらされる表面積はトロポニンの回
収率を低下させる。材質がナイロンまたはガラス繊維で
あり、大きさが2mm×2mm×1mm〜40m×40mm×5mmの膜を
アッセイ法に利用する場合にはトロポニンＩおよびＴの
回収率は影響を受ける。
トロポニンＩおよびＴの分子は多くの塩基性アミノ酸
を有する。pHが生理学的な条件下においては、このよう
な塩基性アミノ酸の大部分は正に荷電しており、これら
の荷電基はタンパク質の吸着挙動に寄与する。
本発明の好ましい態様においては、種々の成分を膜ま
たはラテックス粒子に添加することによって、イムノア
ッセイ法において使用したトロポニンＩおよびＴの回収
率を改良することができる。特に、強塩基性のペプチド
またはタンパク質を、試料または反応混合物の添加前ま
たは添加時に、アッセイ法に用いる膜もしくはラテック
ス粒子または装置の表面上へ添加する。このような用途
に用いる好ましい化合物にはpI値が約８よりも大きいポ
リマー、タンパク質およびペプチドが含まれる。この種
の化合物としてはサルミン、リゾチーム、シトクロム、
ポリジン、ポリビニルアミン、メリチンおよびマストパ
ラン等が例示される。種々の表面または膜に添加される
ブロッキング剤の濃度は約0.01mg/ml〜100mg/mlであ
り、一般的には約0.1〜10mg/mlである。
実施例 実施例１ トロポニンELISAイムノアッセイのための試薬の製造 抗−トロポニン抗体アルカリ性ホスファターゼ複合体の
製造 50mMリン酸カリウム、10mMホウ酸カリウム、150mM塩
化ナトリウム、pH7.0、中のアルカリ性ホスファターゼ
（カルジーメ（Calzyme）、サン・ルイス・オビスポ（S
an Luis Obispo）、カルフォルニア）10mg/mlをSMCC
（スクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート、ピールス・ケミカル
株式会社（Pierce Chemical Co.）、ロックフォード、
イリノイ）で、SMCC/酵素のモル比15/1にて誘導体化し
た。誘導体化は室温で90分間行い、その後、50mMリン酸
カリウム、10mMホウ酸カリウム、150mM塩化ナトリウ
ム、pH7.0、で平衡化したGH−25カラム（アミコン株式
会社（Amicon Corp.）、ビバリー、マサチューセッツ）
でクロマトグラフした。
50mMリン酸カリウム、10mMホウ酸カリウム、150mM塩
化ナトリウム、pH7.0、中の抗−トロポニン抗体10mg/ml
をSPDP（Ｎ−スクシニミジル−３−［２−ピリジルジチ
オ］プロピオネート、ピールス・ケミカル株式会社）
で、SPDP/抗体のモル比10/1にて誘導体化した。抗体を2
mg/mlに希釈し、ジチオトレイトールおよびタウリンを
溶液に、最終濃度それぞれ1mMおよび20mMで添加した
後、溶液を室温で30分間インキュベートした。抗体−SP
DPを、50リン酸カリウム、10mMホウ酸カリウム、150mM
塩化ナトリウム、0.1mMエチレンジアミン四酢酸、pH7.
0、で平衡化したGH−25カラム（アミコン株式会社）で
クロマトグラフした。
SMCC−アルカリ性ホスファターゼ（50mMリン酸カリウ
ム、10mMホウ酸カリウム、150mM塩化ナトリウム、5mM塩
化マグネシウム、pH7.0、中）およびチオール−抗体（5
0mMリン酸カリウム、10mMホウ酸カリウム、150mM塩化ナ
トリウム、0.1mMエチレンジアミン四酢酸、pH7.0、
中）、いずれも1mg/mlに希釈し、混合しながら等モル量
で迅速に互いに添加した。溶液を室温で３時間インキュ
ベートした後、Ｎ−エチルマレイミドを最終濃度2mMに
なるよう添加した。
ビオチニル化トロポニン抗体の製造 ジメチルホルムアミドの、ビオチン−XX、スクシニミ
ジルエステル（６−（（６−（（ビオチノイル）アミ
ノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサン酸、スクシニミジ
ルエステル、モレキュラー・プルーブズ（Molecular Pr
obes）、ユージン（Eugene）、オレゴン）を40mMで、mM
ホウ酸カリウム、150mM塩化ナトリウム、pH8.2（BBS）
の中の、2mg/ml抗体溶液に、混合しながらゆっくりと添
加し、ビオチン−XX/抗体の最終モル比20/1を得た。溶
液を室温で２時間インキュベートし、その後溶液を４℃
で少なくとも12時間透析した。
アビジン−HS磁性ラテックスの製造 水中のエスタポル・パラマグネチックラテックス粒子
（Estapor Paramagnetic latex particles）（0.94μ、
バングズ・ラボラトリーズ（Bangs Laboratories）、カ
ーメル（Carmel）、インディアナ、10％固形分、脱イオ
ン水で４回洗浄）1mlを、50mMトリスヒドロクロリド、1
50mM塩化ナトリウム、pH7.5中の0.55mg/mlアビジン−HS
（スクリップス・ラボラトリーズ（Scripps Laboratori
es）、サンディエゴ、カルフォルニア）9mlに添加し
た。ラテックス溶液を45Cで２時間インキュベートし
た。ラテックスを３回、それぞれBBS10mlで洗浄し、BBS
10ml中、再懸濁させた。
実施例２ ヒト心臓トロポニンＩおよびトロポニンＴのイムノアッ
セイ ２種類のイムノアッセイ法を記載する。これらの方法
を用いて、ヒト血清、血漿中、または精製タンパク質含
有溶液中に存在するトロポニンＩおよびトロポニンＴを
検出した。
方法Ａ トロポニンＩまたはトロポニンＴを含有するサンプル
を、10mM 3−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、
650mM塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩
化亜鉛、1mg/mlポリビニルアルコール（10,000m.w.）、
10mg/mlウシ血清アルブミン、1mg/mlアジ化ナトリウ
ム、pH7.0を含むアッセイ緩衝液（以下、アッセイ緩衝
液という）中、１〜10ng/mlトロポニンＩまたはトロポ
ニンＴとなるよう希釈した。マイクロタイター・プレー
ト・ウェル中の希釈したサンプル25μ１に、2.5μg/ml
抗−トロポニンＩまたはトロポニンＴ抗体複合体（実施
例１）および2.5μg/mlビオチニル化抗−トロポニンＩ
またはトロポニンＴポリクローナル抗体（実施例１）を
含むアッセイ緩衝液50μｌを添加し、反応混合物を形成
した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした
後、アビジン−HPで被覆された磁性ラテックス（実施例
1;アッセイ緩衝液中、0.5％ラテックス）25μｌをマイ
クロタイター・プレート・ウェルに添加し、その後室温
で５分間インキュベートした。磁性ラテックスを、マイ
クロタイター・プレート・マグネット（パーセプティブ
・ダイアグノスチックス（Perceptive Diagnostics）、
ケンブリッジ、マサチューセッツ）を用いてペレット化
し、BBS−トゥイーン（Tween）（20mMボレート、150mM
塩化ナトリウム、0.1mg/mlアジ化ナトリウム、0.02％ポ
リオキシエチレン−20−ソルビタン（Sorbitan）モノラ
ウレート（トゥイーン−20）、pH8.2）で２回、そしてT
BS（40mMトリス、150mM塩化ナトリウム、pH7.5）で１回
洗浄した。ペレットをELISA増幅試薬（ギブコ（Gibco）
BRL、ガイザーズブルグ（Gaithersburg）、メリーラン
ド）中、製造業者の手引にしたがって再懸濁した。増幅
が完結した後、磁性ラテックスをペレット化し、着色さ
れた上澄み80μｌを新しいマイクロタイター・プレート
に移した。490nmにおける吸光度（OD490）を、マイクロ
タイター・プレート・リーダー（モレキュラー・デバイ
シィズ（Molecular Devices）、パロ・アルト（Palo Al
to）、カルフォルニア）を用いて測定した。
方法Ｂ トロポニンＩまたはトロポニンＴを含有するサンプル
を、方法Ａと同様にして、アッセイ緩衝液に希釈した。
マイクロタイター・プレート・ウェルにおいて、希釈さ
れたサンプル80μｌに、30μg/ml抗−トロポニンＩまた
はトロポニンＴモノクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体に相捕的な7.5μg/mlビオチニル化抗−トロポニ
ンＩまたはトロポニンＴポリクローナル抗体（実施例
１）をさらに含むアッセイ緩衝液40μｌを添加し、反応
混合物を形成した。アリコート（25μｌ）を様々な時間
（２分間〜24時間）で取り出し、アピジン−HSで被覆さ
れた磁性ラテックス（アッセイ緩衝液中、0.5％ラテッ
クス固形分）25μｌ含有のマイクロタイター・プレート
・ウェルに添加し、その後５分間インキュベートした。
磁性ラテックスをペレット化し、BBS−トゥイーンで１
回、そしてアッセイ緩衝液でで１回洗浄した。ペレット
を、アルカリ性ホスファターゼに複合体化されたヤギ抗
マウスκ抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエ
ーツ株式会社、バーミンガム、アラバマ）５μg/mlをさ
らに含むアッセイ緩衝液25μｌ中、再懸濁し、その後、
15分間インキュベートした。磁性ラテックスをペレット
化し、アッセイの残りを、方法Ａと同様にして行った。
実施例３ 酸化型、還元型または酸化型および還元型形態のヒト心
臓トロポニンＩと結合する抗−トロポニンＩ抗体の選択 抗−トロポニンＩ抗体複合体（実施例１）および相捕
的ビオチニル化トロポニンＩポリクローナル抗体（実施
例１）を、分子内酸化型または還元型トロポニンＩの認
識のためにテストした。テストされた抗トロポニンＩモ
ノクローナル抗体は：クローン2D5およびクローン1A12
（ビオスパシフィック（BiosPacific）、エメリービレ
（Emeryville）、カルフォルニア）、クローン110およ
び111（リサーチ・ダイアグノスチックス株式会社（Res
earch Diagnostics Inc.）、フランダース（Flander
s）、ニュージャージー）ならびにクローンTRI−7F81
（DAKOコーポレーション、カーピンテリア（Carpinteri
a）、カルフォルニア）であった。テストされたビオチ
ニル化抗−トロポニンＩ抗体は、ペプチド１、ペプチド
２、ペプチド３またはペプチド４特異的と示されるアフ
ィニティー−精製ヤギポリクローナルであった（ビオス
パシフィック、エメリービレ、カルフォルニア）。ヒト
心臓トロポニンＩ（ピー・クミンス（P.Cummins）、バ
ーミンガム大学、バーミンガム、英国）を、実施例４で
記載のように1.0μg/mlで空気酸化し、分子内ジスルフ
ィドを形成した。酸化型トロポニンＩを、ジチオトレイ
トール（DTT）を含まない（酸化型サンプル）か、また
は最終濃度3mMで含む（還元型サンプル）いずれかのア
ッセイ緩衝液で１〜10ng/mlに希釈した後、室温で３時
間インキュベートし、DTTによってジスルフィドを還元
した。酸化型および還元型サンプルを、さらなる希釈な
しで、実施例２の方法Ａを採用してアッセイした。その
結果を表１に示し、酸化型トロポニンＩ（TnI）のアッ
セイ勾配を還元型トロポニンＩのアッセイ勾配で割った
比で表した。アッセイ勾配は、抗体対によるトロポニン
Ｉの認識の増大とともに、増大する。
データから、優先的に酸化型または還元型トロポニン
Ｉと結合するか、またはほぼ同時に酸化型および還元型
トロポニンＩと結合するか、いずれかの抗体を選択でき
ることがわかる。トロポニンＩの酸化−還元状態を無視
した抗体の選択は、トロポニンＩ濃度の定量において本
質的な誤差をもたらし得る。
実施例４ 精製ヒト心臓トロポニンＩの酸化−還元 精製トロポニンＩの分子内酸化および還元の速度論
（ピー・クミンス（P.Cummins）、バーミンガム大学、
英国）を、イムノアッセイ（方法Ａ、実施例２）で、ク
ローン2D5抗体複合体（実施例１）およびビオチニル化
ヤギ抗トロポニンＩペプチド１ポリクローナル抗体（実
施例１）を用いて測定した。この抗体対は、実施例３に
記載のように、酸化型トロポニンＩには強く結合し、還
元型トロポニンＩには弱く結合する。アッセイの結果
を、アッセイの直線範囲におけるアッセイ勾配［ng/ml
全（酸化型＋還元型）トロポニンＩあたりのOD490］で
表す。アッセイ勾配は酸化型トロポニンＩのフラクショ
ンとともに増大する。
還元型トロポニンＩの空気酸化 トロポニンＩの空気酸化率を２種類のトロポニンＩ濃
度で測定した。20mMトリス−HC1、0.5M塩化ナトリウ
ム、60mM 2−メルカプトエタノール、pH7.0を含む緩衝
液中0.27mg/mlの還元型トロポニンＩを、25mM 2−メル
カプトエタノールを含むか、または含まないいずれかの
アッセイ緩衝液で、1300ng/mlまたは10ng/mlいずれかに
希釈した。溶液を室温でインキュベートした。アリコー
トを、図1aに示すような様々なインキュベート時間経過
後取り出し、アッセイ緩衝液で４および8ng/mlトロポニ
ンＩに希釈し、直ちにアッセイした。その結果を図1aに
示す。誤差バー（error bars）は１標準偏差（SD）を示
す。
還元型トロポニンＩの過酸化物酸化 トロポニンＩを0.27mg/ml原液から希釈した後、すぐ
に還元型トロポニンＩの1300ng/ml溶液のアリコート
（本実施例参照、空気酸化）に、過酸化物（フィッシャ
ー（Fisher）、不安定化）を添加した（過酸化物の最終
濃度2mMまたは20mM）。溶液を室温でインキュベートし
た。図1bに示すような様々なインキュベート時間経過
後、アリコートを取り出し、カタラーゼ（カルビオケム
（Calbiochem）、ラ・ジョラ（La Jolla）、カルフォル
ニア;0.01mg/ml最終濃度５分間）で処理して過酸化物を
除去し、４および8ng/mlトロポニンＩに希釈し、直ちに
アッセイした。その結果を図1bに示す。誤差バー（erro
r bars）は１標準偏差（DS）を示す。
酸化型トロポニンＩのDTT還元 アッセイ緩衝液中、1000ng/mlにて、室温で15時間イ
ンキュベートしたトロポニンＩを、アッセイ緩衝液で４
および8ng/mlに希釈した。DTTを最終濃度０、1.5および
3.0mMになるよう添加した後、図２に示す時間の間、室
温でインキュベートした。その後、アリコートをトロポ
ニンＩについてアッセイした。定常状態に達した後（お
よそ６時間）、３種類のDTT濃度サンプル由来のアリコ
ート（100μｌ）を20mM過酸化物で15分間再度酸化し、
カタラーゼで５分間処理し、アッセイした。その結果を
図２に示す。誤差バー（error bars）は１標準偏差（D
S）を示す。
データから、トロポニンＩの酸化−還元状態を変化さ
せると、イムノアッセイの結果が時間によって変化し得
ることがわかる。酸化剤および還元剤を使用することに
よって、トロポニンＩの酸化−還元状態、およびこのよ
うなイムノアッセイ結果を、可逆的に変化させ、顕著に
安定化することができる。
実施例５ 還元型トロポニンＩのアルキル化 トロポニンＩを、様々なアルキル化試薬を用いて、迅
速にアルキル化した。還元型トロポニンＩ原液（バーミ
ンガム大学）は、20mMトリスハイドロクロリド、0.5mM
塩化ナトリウム、50mM 2−メルカプトエタノール中、0.
27mg/mlであった。３種類のアルキル化反応（＃１〜
３）を行い、対照を調製した（＃４）： 1.トロポニンＩ原液20μｌを0.5Mホウ酸カリウム、0.2m
Mエチレンジアミン四酢酸、pH8.0、20μｌに添加し、そ
の後、398mMヨードアセトアミド10μｌを添加した。
2.トロポニンＩ原液20μｌを0.5Mホウ酸カリウム、0.2m
Mエチレンジアミン四酢酸、pH8.0、20μｌに添加し、そ
の後、398mMヨード酢酸10μｌを添加した。
3.トロポニンＩ原液20μｌを0.5Mホウ酸カリウム、0.2m
Mエチレンジアミン四酢酸、pH8.0、20μｌに添加し、そ
の後、319mM N−エチルマレイミド12.5μｌを添加し
た。
4.トロポニンＩ原液20μｌを0.5Mホウ酸カリウム、0.2m
Mエチレンジアミン四酢酸、pH8.0、20μｌに添加し、そ
の後、0.5Mホウ酸カリウム、0.2mMエチレンジアミン四
酢酸、pH8.0、10μｌに添加した。
反応物を室温で１時間25分インキュベートした。この
インキュベート中、トロポニンＩ原液を氷で維持した。
それぞれの溶液（１〜４）のアリコート（24μｌ）を2.
9Mメルカプトエタノール0.9μｌに添加し、室温で15分
間インキュベートした後、サンプルを液体窒素で凍結し
た。また、それぞれの溶液（１〜４）の残りのアリコー
トを、さらなる処理をせず、液体窒素で凍結した。
実施例６ アルキル化トロポニンＩのイムノアッセイ Ｎ−エチルマレイミド（NEM）、ヨード酢酸（IHA
C）、ヨードアセトアミド（IAM）でアルキル化された
（実施例５）、またはアルキル化されていない（対照サ
ンプル、実施例５）トロポニンＩを新たに解凍し、アッ
セイ緩衝液で１〜10ng/mlに希釈した。還元型トロポニ
ンＩ原液（実施例５）の新たに解凍したアリコートを、
０または3mM DTTいずれかをアッセイ緩衝液に希釈した
（標準サンプル）。室温で0.5時間または5.5時間いずれ
かの間、インキュベートした後、すべての希釈液のアリ
コート（25μｌ）を取り出し、クローン2D5抗トロポニ
ンＩモノクローナル抗体複合体およびビオチニル化ヤギ
抗トロポニンＩペプチド１特異的ポリクローナル抗体
（実施例１）を用いてアッセイした（方法Ａ、実施例
２）。この抗体対は酸化型トロポニンＩには強く結合
し、還元型トロポニンＩには弱く結合する（実施例３お
よび４）。トロポニンＩは、0.5時間のインキュベート
では本質的に還元されたままであるが、5.5時間のイン
キュベート後は還元型形態を安定化するDTTが存在しな
い限り、ほとんど完全に（空気により）酸化されるだろ
う（実施例４参照）。結果を表２に示し、直線範囲にお
けるアッセイ勾配（ng/ml全トロポニンＩあたりのO
D490）で表す。より大きなアッセイ勾配は、抗体とトロ
ポニンＩとの間での結合性相互作用が強いことを示す。
データから、抗体対は還元型トロポニンＩと同様に、
つまり、酸化型トロポニンＩと比較すると弱く、アルキ
ル化トロポニンＩと結合することがわかる。さらに、ア
ルキル化は、トロポニンＩの酸化−還元状態を安定化す
るための酸化剤または還元剤の使用により観察される効
果（実施例４）と同様に、時間に関してイムノアッセイ
結果を安定化する。標準サンプルと比較した対照サンプ
ルの、より低くおよびより安定なアッセイ勾配は、対照
サンプルをpH8にて室温でインキュベートする間に、対
照サンプルトロポニンＩの２つのサステイン残基と２−
メルカプトエタノールとの間で形成される混合ジスルフ
ィドの存在によって説明される（実施例５参照）。
実施例７ 心筋梗塞が確認された患者由来の心臓トロポニンＩのイ
ムノアッセイでの過酸化物の影響 心筋梗塞が確認された患者由来の、ヘパリン含有チュ
ーブに入った凍結ヒト血清または血漿を地方病院から入
手した。血清または血漿を室温で解凍し、直ちに２つの
アリコートに分割した。１つのアリコートを、過酸化物
を最終濃度20mMで添加することによって室温で酸化し
た。第２のアリコートは処理しなかった。20分後、カタ
ラーゼを最終濃度0.01mg/mlで添加することにより、酸
化反応を止めた。カタラーゼ添加10分後、酸化したアリ
コートおよび未処理のアリコートをアッセイ緩衝液で連
続的に４倍に希釈し、直ちに、2D5抗トロポニンＩ複合
体およびピオチニル化抗トロポニンＩペプチド３特異的
抗体を用いて心臓トロポニンＩについてアッセイした
（実施例２、方法Ａ）。この相捕的抗体対は酸化型トロ
ポニンＩと強く結合し、還元型トロポニンＩと弱く結合
する（実施例３）。空気酸化された（実施例４）精製ト
ロポニンＩ（ピー・クミンス、バーミンガム大学）をア
ッセイ緩衝液で２、４および8ng/mlに希釈し、同じ抗体
試薬を用いてアッセイし、標準曲線を作成した。純酸化
型または未処理血清または血漿サンプル（表３）中のト
ロポニンＩの濃度を、アッセイの直線領域の範囲内に入
ったOD490測定値を用いて上記標準曲線から算出した。
データから、心筋梗塞が確認された患者由来の血清ま
たは血漿サンプルの酸化は、イムノアッセイにより決定
される心臓トロポニンＩの濃度にかなりの影響を及ぼし
得ることがわかる。トロポニンＩの酸化状態を無視し
た、血清または血漿中のトロポニンＩのイムノアッセイ
は、トロポニンＩ濃度の重大な過小評価をもたらし、心
筋梗塞症の診断ができない結果になり得る。
実施例８ ２回の凍結／解凍サイクル後におけるヒト血漿中の心臓
トロポニンＩのイムノアッセイでの過酸化物の影響 血漿サンプル番号５（表３、実施例７）を始めに解凍
し、その後再凍結し、−70Cで数日間貯蔵した後、氷で
３時間、未処理のまま貯蔵した。血漿を室温で解凍し、
２つのアリコートに分割した；一方は過酸化物で酸化
し、他方は実施例７に記載したように未処理のままにし
た。酸化されたアリコートおよび未処理のアリコートに
おけるトロポニンＩの濃度を、実施例７に記載のイムノ
アッセイにより直ちに測定したところ、未処理アリコー
トにおいては53.9ng/ml、酸化されたアリコートにおい
ては56.4ng/mlであることがわかった。
データから、２回目の解凍後の血漿の酸化は、イムノ
アッセイによって測定される心臓トロポニンＩの濃度に
あまり影響を及ぼさなかったことがわかる。
実施例９ 心筋梗塞患者由来の酸化型および還元型血漿における心
臓トロポニンＩのイムノアッセイ 心筋梗塞が確認された患者由来の、ヘパリン含有チュ
ーブに入った凍結ヒト血漿を地方病院から入手した。血
漿を室温で解凍し、直ちに２つのアリコートに分割し
た。一方のアリコートを実施例７で記載したようにして
過酸化物で酸化した。他方のアリコートは、DTTを最終
濃度が10mMになるように添加して還元した後、室温で３
時間インキュベートした。酸化したアリコートはその
後、アッセイ緩衝液に連続的に２倍に希釈し、還元した
アリコートは3mM DTTを含むアッセイ緩衝液に連続的に
２倍に希釈した。希釈したアリコートを、相捕的抗体対
クローン2D5抗トロポニンＩ複合体およびビオチニル化
抗トロポニンＩペプチド３ポリクローナル抗体、または
相捕的抗体対クローンTRI−7 F81抗トロポニンＩ複合体
およびビオチニル化抗トロポニンＩペプチド３ポリクロ
ーナル抗体、いずれかを用いて、トロポニンＩについて
直ちにアッセイした（方法Ａ、実施例２）。精製トロポ
ニンＩ（バーミンガム大学）を空気酸化し（実施例
４）、アッセイ緩衝液で２、４および8ng/mlに希釈し、
これを用いて標準曲線を作成し、当該曲線から純酸化型
または還元型血漿サンプル中におけるトロポニンＩの濃
度を測定した。結果を表４に示す。
データから、血漿サンプル中における心臓トロポニン
Ｉの化学的酸化および還元は、精製トロポニンＩについ
て観察されたのと同様に（実施例３）、テストされる抗
体対のトロポニンＩについての認識に影響を与えること
がわかる。
実施例10 トロポニンＣのトロポニンＩへの結合に感受性のある、
または感受性のない、いずれかの抗トロポニンＩ抗体の
選択 モノクローナル抗トロポニンＩ複合体および相捕的ビ
オチニル化抗トロポニンＩポリクローナル抗体（実施例
１）を、遊離トロポニンＩ、および二成分コンプレック
ス中トロポニンＣに結合されたトロポニンＩのそれらの
認識についてテストした。４つのタイプのトロポニンＩ
サンプルを室温で調製し、トロポニンＩについてアッセ
イした；それらは：添加トロポニンＣを含むおよび含ま
ない酸化型トロポニンＩ、ならびに添加トロポニンＣを
含むおよび含まない還元型トロポニンＩである。酸化型
（空気による、実施例４参照）ヒト心臓トロポニンＩ
（ピー・クミンス、パーミンガム大学）を、2mM塩化カ
ルシウムを含むアッセイ緩衝液で２、４および8ng/mlに
希釈した。それぞれのトロポニンＩ濃度の１つのアリコ
ートを、未処理にするか、またはアッセイ緩衝液中30mM
DTT原液から最終濃度3mMになるようDTTを添加すること
により還元して還元反応を起こした。３時間還元反応を
起こした後、それぞれの酸化型および還元型トロポニン
Ｉアリコートを２つのアリコートに分割した；一方のア
リコートには、ヒト心臓トロポニンＣ（バイオ−テック
・インターナショナル株式会社、シアトル、ワシント
ン）を、20mMリン酸カリウム、4mMホウ酸カリウム、150
mM塩化ナトリウム、pH7.0中、1mg/mlの原液から、最終
濃度が0.1mg/mlになるように添加し、他方のアリコート
には、トロポニンＣを含まない同体積の上記緩衝液を添
加した。トロポニンＣを添加して１時間後、すべてのア
リコートを、表５に挙げた抗体対を用いて、トロポニン
Ｉについてアッセイした（方法Ａ、実施例２）。表５中
における結果は、トロポニンＣ存在下でのアッセイ勾配
をトロポニンＣ不存在下でのアッセイ勾配で割ることに
よって得られたアッセイ応答率として表されている。
表５の結果から、幾つかの抗体対は、遊離トロポニン
ＩならびにトロポニンＣに結合されたトロポニンＩを等
しく十分に認識し、一方で他の抗体対は遊離トロポニン
Ｉのみを認識することがわかる。トロポニンＣに結合さ
れたトロポニンＩを認識しない抗体でのイムノアッセイ
は、トロポニンＩの幾つかがトロポニンI/C二成分コン
プレックスとして存在する場合、全トロポニンＩ濃度を
過小評価するだろう。
実施例11 トロポニンＩに対して大過剰量で存在するトロポニンＣ
を用いたトロポニンＩイムノアッセイでのトロポニン
Ｔ、EDTA、メリチンおよびマストパラン（Mastoparan）
の影響 エチレジアミン四酢酸（EDTA）は、カルシウムおよび
マグネシウムイオンをキレート化することによって、ト
ロポニンＩのトロポニンＴおよびトロポニンＣへの結合
親和力（binding affinity）を低下する。メリチンは、
トロポニンＣへ結合することによって、トロポニンＩの
トロポニンＣへの親和力を低下する。トロポニンＴの存
在下および不存在下でトロポニンＩおよびトロポニンＣ
の二成分コンプレックスを解体するときのEDTAおよびメ
リチン（以下、結合インヒビターという）の有効性をア
ッセイする。酸化型ヒト心臓トロポニンＩ（ピー・クミ
ンス、バーミンガム大学）を、2mM塩化カルシウムを含
むアッセイ緩衝液中1.0ug/mlで、最終濃度3mMのジチオ
トレイトールにより室温で３時間還元した。還元したト
ロポニンＩを、2mM塩化カルシウムおよび3mMジチオトレ
イトールを含むアッセイ緩衝液で、２および4ng/mlに希
釈した。それぞれの濃度のものを４つのアリコートに分
割し、それらにヒト心臓トロポニンＣ（バイオ−テック
・インターナショナル株式会社）を、20mMリン酸カリウ
ム、4mMホウ酸カリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.0
中100倍過剰の原液から最終濃度が０、0.1、1.0および1
0.0μg/mlになるよう添加した。その結果得られたそれ
ぞれのアリコートをさらに２つのアリコートに分割し、
それにヒトトロポニンＴ（スクリップス．ラブズ）を、
脱イオン水中100倍過剰の原液から最終濃度が0.0または
0.1μg/mlいずれかになるよう添加した。トロポニンＴ
の添加後、アリコートを室温で１時間インキュベート
し、その後、トロポニンＩについてアッセイした（方法
Ｂ、実施例２）。抗体溶液を、結合インヒビター（30mM
EDTAおよび0.15mMメリチン（シグマ・ケミカル株式会
社、セントルイス、ミズーリ））を含むか、または含ま
ないいずれかの、30μg/mlクローン1A12抗トロポニンＩ
および7.5μg/mlビオチニル化抗トロポニンＩペプチド
４特異的抗体（実施例１）を含んだマイクロタイター・
プレート・ウェルに添加した。抗体のトロポニンＩサン
プルへの添加によって形成された反応混合物のアリコー
トを0.5時間後取り出し、さらに実施例２の方法Ｂと同
様にして処理した。トロポニンＣまたはＴを含まず、結
合インヒビターを含まないサンプルのアッセイ結果を用
いて、標準用量−応答曲線を作成した。アッセイに対す
る結合インヒビター添加の標準曲線での影響をテストし
たところ、無視できることがわかった。インヒビターお
よびトロポニン成分を含むサンプルについてのアッセイ
応答率（図３に示す）を、それぞれのサンプルのアッセ
イ勾配を標準曲線の勾配で割ることによって求めた。
データから、トロポニンＣの存在下ではトロポニンＩ
濃度は著しく過小評価されることがわかる。結合インヒ
ビターはトロポニンＣの効果をほとんど完全に逆にす
る。トロポニンＣの不存在下でのトロポニンＴの存在は
トロポニンＩイムノアッセイに影響を及ぼさない。（デ
ータは図３に示さない。）トロポニンＣおよびＴの存在
下では、トロポニンＩの測定濃度は顕著に減少する。コ
ンプレックスが二成分の場合より、コンプレックスが三
成分の場合の方が、トロポニンコンプレックスを開裂す
るか、または部分的に解離するときにおいて、結合イン
ヒビターの有効性は小さくなるようである。マストパラ
ンまたはメリチンも、トロポニンＣ濃度10ug/mlのI/Cコ
ンプレックスを解離する結合インヒビターとして、0.1m
Mでテストした（データは示さない）。メリチンは、ア
ッセイ応答率を増大させることに関して、メリチン/EDT
A（図３）と同程度に有効であり、一方、マスパランは
テスト濃度においてメリチンの約1/3の有効性を有して
いた。
実施例12 トロポニンＣまたはトロポニンＣおよびＴの存在下で
のトロポニンＩのイムノアッセイにおける結合インヒビ
ターの影響 1.0μg/ml精製ヒト心臓トロポニンＩ（DTTにより還
元、実施例４）、および1.2μg/mlヒト心臓トロポニン
Ｃ（バイオ−テック・インターナショナル株式会社）ま
たは1.2μg/mlトロポニンＣおよび3.1μg/mlヒト心臓ト
ロポニンＴ（スクリップス・ラブズ）いずれかを含む溶
液を、3mM DTTを含むアッセイ緩衝液中において室温で
２時間インキュベートした。トロポニンＴの添加に先立
って、トロポニンＣをトロポニンＩに添加した。トロポ
ニン溶液を、トロポニンＩ濃度に換算して２、４および
8ng/mlになるよう、2mM塩化カルシウムおよび0.5mMDTT
を含むアッセイ緩衝液で希釈し、実施例11と同様にし
て、結合インヒビターを用いて、および用いずに直ちに
アッセイした。抗体およびトロポニン成分の反応混合物
のアリコートを、抗体を添加してから0.5時間および2.2
時間後、取り出した。これらのアリコートをさらに、実
施例２の方法Ｂと同様にして処理した。トロポニンＣお
よびＴを含まず、結合インヒビターを含まない還元型ト
ロポニンＩをアッセイし、標準曲線を作成した。結合イ
ンヒビター添加の標準曲線上でのアッセイへの影響をテ
ストしたところ、無視できることがわかった。その結果
を、それぞれのサンプルのアッセイ勾配を標準曲線の勾
配で割ることによって求められるアッセイ応答率とし
て、表６に示す。
データから、トロポニンＩ濃度に対して約２倍モル過
剰で存在するトロポニンＴおよびＣは、イムノアッセイ
で測定されるトロポニンＩの量を顕著に低下させること
がわかる。トロポニンＣ単独では、このアッセイで採用
される抗体濃度でのトロポニンＩの測定濃度への影響は
より小さい。結合インヒビターは、0.5時間のインキュ
ベートではトロポニンＣおよびＴの影響を部分的に逆に
し、2.2時間後では完全に逆にする。
実施例13 トロポニンＩについての精製ヒト心臓三成分トロポニ
ンコンプレックスのアッセイ 精製ヒト心臓三成分トロポニンコンプレックス（バイ
オ−テック・インターナショナル株式会社、20mMクエン
酸ナトリウムを含む緩衝液、pH6中3mg/ml原液）を、2mM
塩化カルシウムを含むが、0.1mM塩化亜鉛または1mM塩化
マグネシウムを含まないアッセイ緩衝液（以下、無金属
アッセイ緩衝液という）中、全トロポニンＩ濃度が１〜
15ng/mlになるよう希釈した。希釈した溶液を、実施例1
1と同様にして、結合インヒビターを用いて、および用
いずにトロポニンＩについてアッセイした。抗体のトロ
ポニンコンプレックスとの反応混合物のアリコートを、
図４に示す時間で取り出し、さらに、実施例２の方法Ｂ
と同様にして処理した。精製トロポニンＩ（バイオ−テ
ック・インターナショナル株式会社）をアッセイし標準
曲線を作成するのに用いた。結合インヒビター添加の標
準曲線上でのアッセイへの影響をテストしたところ、無
視できることがわかった。図４に示すアッセイ応答率
は、コンプレックスのアッセイ勾配（全トロポニンＩ濃
度の関数としてのOD490）を標準曲線の勾配で割ること
によって求めた。
この結果から、三成分コンプレックス中においてトロ
ポニンＣおよびＴと結合されるトロポニンＩは、非常に
長時間のインキュベート後でさえ、このアッセイで採用
される抗体およびトロポニンＩ濃度においてあまり十分
に認識されないことがわかる。特に、30分経過時点にお
いて、インヒビターの使用または不使用に拘わらず、ト
ロポニンＩは検出できなかった。結合インヒビターはコ
ンプレックスをゆっくり開裂するか、または部分的に解
き、このため抗体により認識されるトロポニンＩのフラ
クションはゆっくり増大する。
実施例14 心筋梗塞が確認された患者由来の血漿および血清のト
ロポニンＩイムノアッセイでの結合インヒビターの影響 心筋梗塞が確認された患者由来の、EDTAおよびヘパリ
ン含有チューブに入った凍結血清および血漿を地方病院
から入手し、室温で解凍した。塩化カルシウムを最終濃
度6mMになるよう添加し（全てのEDTAと結合するた
め）、得られた溶液を室温で２時間インキュベートした
後、4Cで一晩中インキュベートした。インキュベートし
たサンプルを無金属アッセイ緩衝液で、希釈倍数２から
最大希釈倍数256で希釈した。希釈したサンプルを、ポ
リクローナル抗体がヤギ抗−トロポニンＩペプチド３特
異的であること以外は実施例11と同様にして、結合イン
ヒビターを用いて、および用いずにトロポニンＩについ
て直ちにアッセイした。希釈したサンプルへの抗体の添
加により形成された反応混合物のアリコート図5a〜ｆに
示す時間で取り出し、さらに、実施例２の方法Ｂと同様
にして処理した。酸化型トロポニンＩ（バーミンガム大
学）を無金属アッセイ緩衝液中２、４および8n/mlでア
ッセイし、標準曲線を作成した。結合インヒビターの添
加の標準曲線上でのアッセイへの影響をテストしたとこ
ろ、無視できることがわかった。希釈した血清または血
漿サンプルについて測定したOD490値を希釈倍数の逆関
数としてプロットした。得られた曲線の直線範囲（典型
的にはOD490＜２、トロポニンＩ濃度8ng/ml未満に相当
する）での勾配を標準曲線の勾配で割り、図5a〜ｆで示
す純血清または血漿サンプル中におけるトロポニンＩの
濃度を得た。図5aから図5fそれぞれは、異なる患者由来
の血清または血漿でのイムノアッセイを表している。
データから、テストされた全ての血清および血漿サン
プル中のトロポニンＩの測定濃度は結合インヒビターの
添加によって増大したことがわかる。重要にも、トロポ
ニンＩの測定濃度の時間プロファイル（time profile）
は、幾つかの場合において２段階（biphasic）であった
（図5a〜ｃおよび図5e）。速い段階は最初のアッセイ時
間0.5時間以内で完結していた。遅い段階は、サンプル
に依存して、６〜24時間で上がり続けた。精製三成分ト
ロポニンコンプレックスについても遅い段階を観察した
（実施例３）。その結果、希釈した血清および血漿サン
プルについて観察した遅い段階は、インヒビターおよび
抗体によって三成分っコンプレックスを開裂することま
たは部分的に解離することと関連しているかもしれな
い。速い段階は、三成分コンプレックスより容易に開裂
されたり、または部分的に解かれるトロポニンＩの結合
コンプレックスを示し、このため、精製三成分コンプレ
ックスについては速い段階がない（実施例13）。したが
って、速い段階はトロポニンＩの二成分コンプレックス
を開裂すること、または部分的に解離することと関連し
得る。
実施例15 遊離トロポニンＩ、三成分コンプレックスにおいて結合
されるトロポニンＩ、ならびに遊離および結合トロポニ
ンＩ両方に感受性のあるイムノアッセイ ３セットの抗体を、遊離トロポニンＩおよび三成分コ
ンプレックスにおいて結合されるトロポニンＩを認識す
るためのそれらの能力について評価した。以下の＃１〜
３で記載された３種類の抗体原液を、結合インヒビター
（30mM EDTAおよび0.15mMメリチン）および以下の抗体
を使用するか、または使用しないかのいずれかで、無金
属アッセイ緩衝液で調製した： 1.30μg/ml 1A12抗トロポニンＩおよび7.5μg/mlビオ
チニル化抗トロポニンＩペプチド４特異的； 2.30μg/ml 1A12抗トロポニンＩ、30μg/ml 9B1抗ト
ロポニンＴモノクローナル（バイオスペシフィック）、
それぞれ５μg/mlのビオチニル化抗トロポニンＩペプチ
ド１、２、３および４特異的； 3.30μg/ml 9B1抗トロポニンＴおよびそれぞれ５μg/
mlのビオチニル化抗トロポニンＩペプチド１、２、３お
よび特異的。
ヒト心臓トロポニン三成分コンプレックス（バイオ−
テック・インターナショナル株式会社）を、１〜15ng/m
lトロポニンＩ当量となるよう無金属アッセイ緩衝液で
希釈し、精製トロポニンＩ（バイオ−テック・インター
ナショナル株式会社）を同じ緩衝液で２、４および8ng/
mlになゆよう希釈した。トロポニンコンプレックスおよ
びトロポニンＩの希釈液を、抗体溶液＃１〜３を用いて
実施例２の方法Ｂを採用して直ちにアッセイした。抗体
のトロポニンコンプレックスおよびトロポニンＩサンプ
ルへの添加により形成された反応混合物のアリコート
を、抗体を添加してから0.5時間および2.5時間後に取り
出し、さらに実施例２の方法Ｂと同様にして処理した。
結果は表７に示し、アッセイの直線範囲におけるng/ml
全トロポニンＩあたりのOD490の単位のアッセイ勾配で
表す。より高い勾配は、抗体のトロポニン成分へのより
よい結合を示している。抗体溶液＃２をテストしたとこ
ろ、ここで記載したアッセイ法を採用して、精製ヒト心
臓トロポニンＴ（スクリップス・ラブズ）を１〜6ng/ml
で用いた逆反応性（cross reactivity）についてネガテ
ィブであることがわかった（データは示さない）。
データから、溶液＃１において抗体を用いたイムノア
ッセイは遊離トロポニンＩを認識するが、三成分コンプ
レックスにおけるトロポニンＩを認識しないことがわか
る。溶液＃２において抗体を用いたイムノアッセイは、
遊離トロポニンＩおよび三成分コンプレックス中のトロ
ポニンＩをほとんど同程度に十分に認識する。したがっ
て、抗体溶液＃２は、少量のトロポニンＩが三成分コン
プレックスとして存在するとき、全トロポニンＩのアッ
セイについて、溶液＃１より優れている。溶液＃３にお
いて抗体を用いたイムノアッセイは、三成分コンプレッ
クスを十分に認識するが、遊離トロポニンＩを十分に認
識しない。遊離トロポニンＩのこの不十分な認識のた
め、抗体溶液＃３のアッセイ勾配は結合インヒビターの
存在下で時間に関して減少する。イムノアッセイに３種
類全ての抗体溶液を使用することにより、遊離トロポニ
ンＩ（溶液＃１）、全トロポニン（溶液＃２）および結
合トロポニンＩ（溶液＃３）の濃度を独立して算出する
ことができる。
実施例16 心筋梗塞患者由来の血漿中における遊離トロポニン
Ｉ、結合トロポニンＩおよび全トロポニンＩの算出 実施例15記載の３種類の抗体溶液をイムノアッセイに
使用し、心筋梗塞が確認された患者由来の血漿中におけ
るトロポニンＩ濃度を測定した。実施例14と同様にし
て、凍結血漿を処理し、無金属アッセイ緩衝液に希釈し
た。希釈した血漿を、抗体溶液＃１〜３（実施例15）を
用いた実施例２の方法Ｂを採用して、直ちにトロポニン
Ｉについてアッセイした。反応混合物を形成するために
抗体をサンプルに添加してから0.5時間および2.5時間
後、アリコートを取り出し、さらに実施例２の方法Ｂと
同様にして処理した。無金属アッセイ緩衝液中、遊離ト
ロポニンI 1〜4ng/ml、またはトロポニンコンプレック
ス（バイオ−テック・インターナショナル株式会社）１
〜8ng/mlトロポニンＩ、いずれかをアッセイし、それぞ
れの抗体溶液の全トロポニンＩ濃度の関数としてのOD
490の標準曲線を作成するのに用いた。それぞれの抗体
溶液によって測定された表８に示される、純血漿サンプ
ル中におけるトロポニンＩの濃度を、結合インヒビター
の不存在下での遊離トロポニンＩまたは三成分コンプレ
ックス中のトロポニンＩのいずれかの標準曲線を用い
て、実施例14と同様にして、表８に示したように算出し
た。結合インヒビターを用いてアッセイされたトロポニ
ンＩ濃度をインヒビター不使用の濃度で割ることによっ
て算出される比も表８に示す。
データから、抗体溶液＃１を用いたアッセイによって
測定されたトロポニンＩの濃度は溶液＃２または＃３を
用いて測定された濃度より、結合インヒビターの存在に
敏感であり、このためトロポニンコンプレックスを開裂
すること、または部分的に解離することに敏感であるこ
とがわかる。実施例15のデータは、抗体溶液＃１は主と
して遊離トロポニンＩを測定し、溶液＃２は遊離トロポ
ニンＩおよび三成分コンプレックス中で結合されるトロ
ポニンＩの両者を測定し、溶液＃３は面として三成分コ
ンプレックス中で結合されるトロポニンＩを測定するこ
とを示唆する。したがって、表８のデータとともに導か
れる実施例15からの結論としては、希釈された血漿サン
プル中では、遊離および結合トロポニンＩはいずれも十
分量存在することを示している。イムノアッセイで使用
された３種類の抗体溶液の中で、溶液＃２は、予期した
通り、最も大きなアッセイトロポニンＩ濃度を与える。
これは、抗体溶液＃２を用いたイムノアッセイは遊離お
よび結合トロポニンＩ、いずれも測定するためである。
したがって、抗体溶液＃２は、血漿サンプル中における
トロポニンＩの最も包括的な測定値を提供する。精製ト
ロポニンコンプレックスで標準化された抗体溶液＃２
は、インヒビター添加およびアッセイインキュベート時
間に関して、最も安定なアッセイを提供する。遊離トロ
ポニンＩで標準化された抗体溶液＃２を用いて測定され
たトロポニンＩ濃度の2.5時間での減少は、標準曲線の
勾配の2.5時間での増加に起因するものである。
実施例17 遊離ヒト心臓トロポニンＴおよびヒト心臓三成分コン
プレックスにおけるトロポニンＴのイムノアッセイ 以下の抗体を含み、結合インヒビター（30mM EDTAお
よび0.15mMメリチン）を含むかまたは含まないいずれか
の無金属アッセイ緩衝液において、２種類の抗体原液
（＃１および２）を後述するようにして調製した： 1.30μg/ml 1A12抗トロポニンＩ、30μg/ml 9B1抗ト
ロポニンＴおよび7.5μg/mlビオチニル化抗トロポニン
Ｔペプチド３特異的（バイオスパシフィック）。
2.30μg/ml 9B1抗トロポニンＴおよび7.5μg/mlビオ
チニル化抗トロポニンＴペプチド３特異的。
ヒト心臓トロポニン三成分コンプレックス（バイオ−
テック・インターナショナル株式会社）を無金属アッセ
イ緩衝液で１〜20ng/mlトロポニンＴに希釈し、精製ヒ
ト心臓トロポニンＴ（スクリップス・ラブズ）を同じ緩
衝液で1.5、3.0および6.0ng/mlに希釈した。トロポニン
コンプレックスおよびトロポニンＴの希釈液を、実施例
２の方法Ｂを採用して抗体溶液＃１および＃２を用い
て、直ちにアッセイした。抗体のトロポニンコンプレッ
クスおよびトロポニンＴサンプルへの添加により形成さ
れた反応混合物のアリコートを、抗体を添加してから0.
5時間および3.0時間後、取り出し、実施例２の方法Ｂと
同様にしてさらに処理した。その結果を表９に示し、ア
ッセイの直線範囲におけるng/ml全トロポニンＴあたり
のOD490の単位のアッセイ勾配で表した。より高い勾配
は、抗体のトロポニン成分へのよりよい結合を示す。
データから、溶液＃１の抗体は遊離トロポニンＴおよ
び三成分コンプレックス中で結合されるトロポニンＴ両
方を同程度に十分に認識することがわかる。溶液＃２の
抗体は遊離トロポニンＴを十分に認識するが、三成分コ
ンプレックス中のトロポニンＴを十分に認識しない。し
たがって、抗体溶液＃１は、かなりの量の三成分コンプ
レックスが存在するヒト血液サンプルにおいて全トロポ
ニンＴ濃度の最も包括的で正確な測定値を提供すること
が予想される。
実施例18 トロポニンＩの濾過膜への非特異的結合を防止するため
のトロポニンＣの使用 酸化型心臓トロポニンＩ（空気酸化、実施例４、バー
ミンガム大学からの入手試料）を、ヒト血清（ハイブリ
テック株式会社、サンディエゴ）中最終濃度100ng/ml
で、100ug/mlヒト心臓トロポニンＣ（バイオ−テック・
インターナショナル株式会社）を用いて、または用いず
に、室温にて30分間インキュベートした。２種類の濾過
膜、サイトセップフィルター（CytoSep filter）（オー
ルストローム・フィルトレーション（Ahlstrom Filtrat
ion、マウント・ホーリー・スプリングズ（Mount Holly
Springs）、ペンシルバニア）およびガラスファイバー
フィルター（GB−100R、マイクロ・フィルトレーション
・システムズ（Micro Filtration Systems）、ダブリ
ン、カルフォルニア）を1.5cm×3.0cmの長方形にカット
し、テープ片でフィルターを横切って透明フィルム（カ
タログ＃pp2500、3M、オースティン、テキサス）に固定
した。トロポニンＣを含むトロポニンＩ溶液（300μ
ｌ）およびトロポニンＣを含まないトロポニンＩ溶液
（300μｌ）を濾過膜の上面に一端にゆっくり塗布した
ところ、該溶液は毛管作用により濾過膜の他端まで移動
した。該他端から約15μｌの溶液をプラスチックピペッ
トチップで採取した。採取した溶液をアッセイ緩衝液で
20、40および80倍に希釈し、実施例２の方法Ａを採用し
てTRI−7 F81抗トロポニンＩ複合体およびビオチニル化
抗トロポニンＩペプチド３特異的抗体を用いてアッセイ
した。濾過膜を通過していないトロポニンＣを含む、お
よび含まないトロポニンＩ溶液のアリコートもアッセイ
し、標準曲線を作成するのに用い、この標準曲線から濾
過膜を通過した溶液中のトロポニンＩの濃度を決定し
た。計算した濃度を100ng/mlで割って、表10に示すトロ
ポニンＩの回収率を得た。表10で示された実験誤差は、
１つの標準偏差を表す。
データから、トロポニンＣの存在は、トロポニンＩの
濾過膜への非特異的結合を低下させるのを促進すること
がわかる。
実施例19 トロポニンＩの濾過膜への非特異的結合を防止するた
めの高等電点のタンパク質の使用 血液濾過膜（サイトセップ1.5cm×3.0cm）を、表11に
挙げたタンパク質1mg/mlを含む脱イオン水溶液に室温で
16時間浸漬した。濾過膜を脱イオン水で１回濯ぎ、35C
で２時間乾燥した。酸化型ヒト心臓トロポニンＩ（バイ
オ−テック・インターナショナル株式会社）を、添加塩
化カルシウム2mMをさらに含むヒト血清（ハイブリテッ
ク株式会社、サンディエゴ、カルフォルニア）中100ng/
mlで、実施例18と同様にして、濾過膜を通過させた。濾
過膜から回収されたトロポニンＩの量を、TRI−7 F81抗
トロポニンＩおよびビオチニル化抗トロポニンＩペプチ
ド４特異的抗体を使用して添加結合インヒビター（実施
例11）を用いて、アッセイ（方法Ｂ、実施例２）により
測定した。表11のデータはトロポニンＩの回収率として
表されており、実施例18の場合と同様にして決定され
た。
データから、メリチンおよびプロタミンスルフェート
はトロポニンＩの血液濾過膜への非特異的結合を本質的
に低減させるが、カゼインおよび脱脂粉乳にはテスト濃
度においてほとんど効果がないことがわかる。
実施例20 TRI−7 F81抗トロポニンＩおよびビオチニル化抗トロポ
ニンＩペプチド４に特異的な抗体を用いた三成分トロポ
ニンコンプレックスのイムノアッセイ イムノアッセイに標記の抗体対を使用したことおよび
抗体とトロポニンサンプルとの反応混合物のアリコート
を抗体をトロポニンに添加してから３時間後にとりだし
たこと以外は実施例13と同様にして、精製三成分トロポ
ニンコンプレックス（バイオ−テック・インターナショ
ナル株式会社）中のトロポニンＩについてアッセイし
た。アッセイ応答率は、結合インヒビター不存在下では
0.16、結合インヒビター存在下では0.49であった。
データから、標記の抗体対は三成分コンプレックス中
においてトロポニンＩを十分に認識しないことがわか
る。実施例10では、トロポニンＴ不使用時のトロポニン
Ｃの存在は、トロポニンＩについての標記の抗体対の認
識にほとんど影響がないことが示された。したがって、
標記の抗体対は、三成分コンプレックス中に存在するト
ロポニンＩに結合するよりも、トロポニンＣとの二成分
コンプレックス中に存在するトロポニンＩに対して強く
結合できる。
実施例21 TRI−7 F81抗トロポニンＩ複合体およびビオチニル化抗
トロポニンＩペプチドに特異的な抗体を用いた、心筋梗
塞が確認された患者由来の血漿中におけるトロポニンＩ
のイムノアッセイ 心筋梗塞が確認された患者由来の凍結血漿を解凍し、
添加塩化ナトリウム0.5Mをさらに含むヒト血清（ハイブ
リテック株式会社、サンディエゴ、カルフォルニア）で
希釈し、実施例２の方法Ａを採用して標記の抗体対でト
ロポニンＩについてアッセイした。酸化型精製ヒト心臓
トロポニンＩ（バーミンガム大学）をアッセイし、標準
曲線を作成するのに使用し、この曲線から血漿中のトロ
ポニンＩの濃度を決定した。純血漿サンプルを氷上に数
時間置いた後、−70℃フリーザーで凍結した。凍結した
血漿を室温で解凍し、標準血漿および標準トロポニンＩ
をアッセイ緩衝液で希釈したこと以外は上述と同様の方
法でアッセイした。標準試料は血清（第１アッセイ）ま
たはアッセイ緩衝液（第２アッセイ）で希釈すると、ほ
とんど同一のアッセイ勾配を示した。純血漿サンプル
を、表12に示す時間の間、４℃でさらにインキュベート
し、アッセイ緩衝液中において再度アッセイした。
データから、凍結／解凍サイクル後、および４℃での
インキュベート後、アッセイしたトロポニンＩの濃度は
かなり増大することがわかる。このアッセイ不安定性
は、凍結／解凍サイクルによって三成分トロポニンコン
プレックスが開裂すること、または部分的に解離するこ
とと関連しているかもしれない。
実施例22 組換え抗体（結合フラグメントまたはFabフラグメン
ト）の発現、スクリーニングおよび選択 マウスの免疫処置 マウスを以下の方法によって免疫処置した。０日目お
よび28日目に、10匹のマウスそれぞれを、フロインドの
完全アジュバンド中に乳化したタンパク質抗原（トロポ
ニンＩおよびトロポニン三成分コンプレックス）50μｇ
を用いて腹腔内に投与することによって免疫処置した。
マウスの眼窩後の洞への穿刺によって採血した。ビオチ
ニル化抗原に対する力価が高い場合は70、71および72日
目にタンパク質50μｇを投与して追加の免疫処置を行
い、その後77日目に屠殺して脾臓摘出を行った。抗体の
力価が不十分な場合は56日目に抗原50μｇを投与して追
加の免疫処置を行い、63日目に採血した。十分な力価が
得られた場合、マウスを98、99および100日目に抗原50
μｇを用いる追加免疫処置に付し、105日目に脾臓を摘
出した。
抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリー 所望のタンパク質抗原（トロポニンＩまたはトロポニ
ン三成分コンプレックス）に対する抗体の力価が高いマ
ウスを屠殺し、脾臓細胞からの全RNAを精製した（アナ
ル・バイオケム（Anal.Biochem.）、第162巻：第156頁
〜第159頁（1987年））。脾臓細胞由来の全RNA（50μ
ｇ）を、プライマーとしてオリゴ（dT）12を有するスー
パースクリプトTM（SuperscriptTM）II逆転写酵素（ギ
ブコBRL、ガイザーズブルク（Gaithersburg）、メリー
ランド）の鋳型として直接使用することによって、PCR
のためのcDNAを調製した。Taq DNAポリメラーゼ（ボー
リンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、イン
ディアナポリス、インディア）、１反応あたり３μＬの
cDNA、32の異なる５′オリゴヌクレオチドおよび単一の
３′オリゴヌクレオチドを用いる全部で32のPCR反応を
用いＨ鎖可変領域を増幅した。同様に、κ鎖可変領域
を、29の異なる５′オリゴヌクレオチドおよび単一の
３′オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。脾臓細胞中
に存在するほとんどすべての抗体可変領域が、マウス抗
体は配列の編集（compilation）に基づくcDNAとオリゴ
ヌクレオチドの不適正化（mismatches）により生じる実
際のアミノ酸配列の２箇所よりも多くない変化で確実に
増幅されるようにオリゴヌクレオチドを予めデザインし
た（セキュエンシズ・オブ・プロテイン・オブ・イムノ
ロジカル・インタレスト（Sequences of proteins of i
mmunological interest）、第２巻、第５版、1991年、
ケンブリッジ、マサチューセッツ）。それぞれの二重鎖
PCR生成物のアリコートを、単一の３′オリゴヌクレオ
チドのみを用いてもう一度増幅し、一重鎖DNA（ss−DN
A）を調製した。すべてのκ鎖増幅反応によるss−DNA産
生物をプールし、すべてのＨ鎖反応由来のss−DNA産生
物を別にプールした。それぞれのプールしたサンプル中
のss−DNAを、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）お
よびゲンパク・ファックスHPLCカラム（Genpak Fax HPL
C column）を用いて精製した。精製したss−DNAを用
い、標準的なオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法
（oligonucleotide directed mutagenesis techtique
s）（ジェイ・イムノール（J.Immunol.）、第149巻：第
3903頁〜第3913頁、1992年）に従って、M13ウラシル鋳
型の突然変異誘発を行った。M13鋳型は、Ｈ鎖およびκ
鎖可変領域いずれについてもss−DNAの５′および３′
端末に相補的なDNA配列を含む。その結果として、Ｈ鎖
およびκ鎖可変領域をM13ベクターにアニールすると、
異なる抗体配列を有する混合物が得られた。その結果得
られた抗体は、Ｈ鎖の第１不変領域に結合されたＨ鎖の
可変領域および完全なκ鎖を含むFab抗体フラグメント
として発現された。電気応答能のある細胞（electrocom
petent cells）（DH12SギブコBRL.、ガイザーズブル
ク、メリーランド）を、得られたM13DNAを用いたエレク
トロポレーションによって形質転換した。500ngM13ベク
ターの40μL DH12S細胞への典型的なエレクトロポレー
ションによって、107〜108の異なる抗体クローンが得ら
れた。クローンをさらに増幅し、抗体ファージ・ディス
プレイ・ライブラリー（antibody phage display libra
ry）を調製した。M13ベクターは、Ｈ鎖がM13の主要なコ
ートタンパク質を含む融合タンパク質である遺伝子VIII
タンパク質として発現されるようにデザインされた。ど
のファージ粒子にも、約2700の遺伝子VIIIタンパク質の
複製があった。Ｈ鎖／遺伝子VIII融合タンパク質が大腸
菌の外質に分泌した後、分泌されたκ鎖はＨ鎖に結合し
て機能性抗体Fabフラグメント（functional antibody F
ab fragment）を形成する。これは、ファージ内部に包
含された抗体をコード化するDNAを有するファージの表
面上に機能性抗体を有するファージの生成をもたらす。
抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリーのスクリー
ニング M13突然変異誘発DNAを大腸菌にエレクトロポレートす
ることによって得られた抗体ファージ・ディスプレイ・
ライブラリーは、ファージ粒子（抗体ファージ）上にデ
ィスプレイされた多くの様々な抗体からなる。タンパク
質抗原に対して親和性の高い抗体の数は少ない。以下の
スクリーニング方法を開発して、トロポニンＩおよびト
ロポニン三成分コンプレックスに特異的な抗体を単離し
た。抗体ファージを、ビオチニル化された酸化型トロポ
ニンＩ（10-9M、10ビオチン／タンパク質）またはビオ
チニル化トロポニン三成分コンプレックス（10-9M、11
ビオチン／タンパク質）とともに溶液中で平衡になるま
でインキュベートした。ビオチニル化タンパク質抗原に
結合している抗体ファージを、アビジンで被覆された磁
性ラテックスとのインキュベーションにより単離した。
非特異的抗体ファージを洗い落とし、ラテックスに結合
している抗体ファージを溶離し、XL1ブルー大腸菌細胞
（ストラタジーン、ラ・ジョラ（La Jolla）、カルフォ
ルニア）中の増殖によって増幅した。その後、増幅され
た抗体ファージを２回目の選択処理に付した。ビオチニ
ル化タンパク質抗原および抗体ファージとインキュベー
ションを溶液中で行ったため、ビオチニル化タンパク質
抗原の濃度を調節して高親和性の抗体のみを選択した。
上述の方法を、抗体ファージ中のトロポニン抗体をコー
ド化するファージの含有率が高くなるまで繰り返した。
その後、抗体配列はサブクローニングに供した。
抗体サブクローニング 全抗体DNA配列を、Ｈ鎖の５′側に存在するκ鎖のシ
グナル配列に結合している５′オリゴヌクレオチド、な
らびにＨ鎖不変領域配列の末端に結合している３′オリ
ゴヌクレオチドを用いて増幅した。増幅後、DNAを、ア
ガロースゲル電気泳動を採用して精製した後、アニール
し、pBR322発現ベクターに結合した。エレクトロポレー
ションによるDH10B細胞の形質転換をこのDNAを用いて行
い、細胞をテトラサイクリンプレート上で増殖して、挿
入DNAを含むクローンを選択した。コロニーを、テトラ
サイクリンを10μg/mL含有する2YT培地3mL中に移し、37
℃で一晩中培養物を培養した。一晩中培養した細胞培養
物を250mLのじゃま板を具有する振盪フラスコ（baffle
shake flasks）内において、１％グリセロールおよび10
mg/mLテトラサイクリンを含む50mL 2YT培地に1:100で希
釈し、テストするのに十分な抗体を得た。培養物を、培
養物の吸光度が２〜４になるまで37℃で培養した。この
時点で、培養物を誘導し、23℃で一晩中培養した。細胞
を高圧ホモジナイザーで破壊し、抗体を精製した。
エピトーマッピングによる抗体の特性決定 得られた抗体の二重抗体／固相／非競合的酵素イムノ
アッセイ（サンドウィッチアッセイ）における特性を評
価した。第１のFabの結合が第２のFabの結合を立体的に
阻害しないようにタンパク質抗原上の明らかに異なるエ
ピトープと結合するように抗体Fabフラグメント（Fab）
を選択した。タンパク質抗原を、ビオチン−XX−NHSエ
ステル（モレキュラー・プルーブズ（Molecular Probe
s）、ポートランド、オレゴン）を用いることによりビ
オチンで標識化した。タンパク質抗原のビオチニル化
は、ビオチンのタンパク質に対するモル比を十分に小さ
くすることによって（平均で４ビオチン／タンパク
質）、エピトープが抗体結合部位の本来の構造に関して
実質的な影響を受ける確率が最小になるようにして行っ
た。第１のFabフラグメントを、アフィニティー精製ヤ
ギ−抗−マウスFabを吸着させたマイクロタイタープレ
ートのウェル内でインキュベートした。ウェルを洗浄
し、非特異的マウスFabを高濃度で含むブロッキング溶
液をそれぞれのウェル内へ入れることによって残りの抗
−Fab部位を飽和させ。別のマイクロタイタープレート
のウェル内においては、第2Fabフラグメントをビオチニ
ル化タンパク質抗原とともに平衡になるまでインキュベ
ートした。第２のFabはビオチニル化タンパク質抗原よ
りも実質的なモル過剰で存在していた。第２のFabおよ
びビオチニル化タンパク質抗原を含む混合物を、第１の
Fabで被覆したマイクロタイタープレートのウェルに添
加してインキュベートした。ストレプトアビジンおよび
アルカリ性ホスファターゼの複合体を混合物に添加して
ビオチニル化タンパク質に結合させることによってタン
パク質抗原の存在を検出した。マイクロタイターのウェ
ルを洗浄し、結合したアルカリ性ホスファターゼの存在
をフェノールフタレインモノフォスフェートを添加する
ことによって検出し、560nmでの生成物の形成速度を、
マイクロタイタープレート用分光光度計を用いて測定し
た。混合物中の過剰な非特異的マウスFabは、第２のFab
が、マイクロタイタープレートのウェルに吸着された抗
−Fabに結合するのを妨げた。対照試験を第１および第
２のFabとして同一のFabを用いて行ったところ、第２の
Fabが結合したエピトープが第１のFabの場合と同一であ
る場合、アルカリ性ホスファターゼのマイクロタイター
プレートのウェルへの結合はほとんど観察されないこと
がわかった。テストされる２種類の異なるFabフラグメ
ントが同じタンパク質上の異なるエピトープに結合する
場合、ウェルに結合される活性なアルカリ性ホスファタ
ーゼの量は対照試験の場合よりも実質的に多かった。こ
のアッセイ法の利点は、抗体が標識化されないため、多
くの抗体が明らかに異なるエピトープと結合する場合に
は多くの抗体を迅速にアッセイして測定することができ
ることである。多数の異なるエピトープを測定し、抗体
をそれらのエピトープ特異性によって分類した。
実施例23 酸化型および還元型の遊離トロポニンＩならびに三成分
コンプレックス中において結合されたトロポニンＩの認
識のための相補的抗体対の特性決定および選択 トロポニンＩに結合された抗体を、抗体複合体および
相補的ビオチニル化抗体からなる対としてサンドウィッ
チイムノアッセイでテストした（実施例１）。テストさ
れた抗体は抗トロポニンＩ組換え抗体であり、これは本
来的には遊離トロポニンＩと結合する抗体であるが、遊
離トロポニンＩおよび三成分コンプレックス中のトロポ
ニンＩと結合するよう選択された抗体である（実施例2
2）。ヤギ抗トロポニンＩペプチド３特異的ポリクロー
ナル抗体もテストした。
精製ヒト心臓三成分トロポニンコンプレックス（バイ
オ−テック・インターナショナル）をアッセイ緩衝液で
希釈し、表13に示す相補的抗体対を用いてアッセイした
（実施例２の方法Ａ）。結果を、アッセイの直線範囲の
ng/ml全トロポニンＩあたりのOD490の単位でアッセイ勾
配として表す。より高い勾配は、抗体のトロポニンＩへ
のよりよい結合を示す。
酸化条件下（以下、解離／酸化サンプルという）およ
び還元条件下（以下、解離／還元サンプルという）で三
成分トロポニンコンプレックスの成分を解離することに
よって、トロポニンＩを調製した。精製ヒト心臓三成分
トロポニンコンプレックスを、50mM 3−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸、150mM塩化ナトリウム、6Mウ
レア、10mM EDTAおよび0.05mMメリチンを含む解離緩衝
液、pH7.0、中、4ug/mlで室温にて４時間インキュベー
トし、解離／酸化サンプルを形成した。解離／酸化サン
プルをアッセイ緩衝液で１〜30ng/ml（全タンパク質濃
度）に希釈し、表13に示す相補的抗体対を用いてアッセ
イした（実施例２の方法Ａ）。解離およびアッセイ緩衝
液は1.5mM DTTも含み、トロポニンＩの分子内ジスルフ
ィドを減少させたこと以外、同様の方法を採用して、解
離／還元サンプルを形成し、アッセイした。
当該解離方法が、遊離トロポニンＩのアッセイに関し
て遊離トロポニンＩを妨害しなかったことを示すため
に、精製酸化型トロポニンＩ（バイオ−テック・インタ
ーナショナル）を、当該方法を採用して処理し、解離／
酸化サンプルを形成し、その後10の異なる相補的抗体対
（表13の対19〜28）を用いてアッセイした。アッセイ結
果（示さず）を、上記解離方法で処理されなかった精製
酸化型トロポニンＩで得られた結果と比較した。テスト
された10の抗体対いずれについても、処理済および未処
理の精製トロポニンＩのアッセイ結果の間で有意差は認
められなかった。
ビオチニル化9B1抗トロポニンＴモノクローナルおよ
びヤギ抗トロポニンＩペプチド３特異的ポリクローナル
複合体抗体からなる抗体対（＃29、表13）は、三成分コ
ンプレックス（実施例15）から解離されるトロポニンＩ
を認識せず、この抗体対で解離／酸化サンプルおよび解
離／還元サンプルを用いて得られるアッセイ勾配は０で
ある。
データ（表13）から、解離／酸化サンプルと解離／還
元サンプルとの間で、三成分コンプレックス中のトロポ
ニンＩについて本質的に同一のアッセイ応答（勾配）を
提供するイムノアッセイを行うための、トロポニンＩに
直接化される抗体を生成し、選択することができること
がわかる（例えば、抗体対＃17）。従って、例えば、＃
17のような抗体対は、テストされるあらゆる形態のトロ
ポニンＩを含むサンプル中におけるトロポニンＩの全濃
度を測定するのに使用することができる。抗体を生成
し、選択するのに採用される上記方法によって、心筋梗
塞を患っている患者の血液中における酸化型および還元
型遊離トロポニンＩならびに三成分コンプレックス中の
トロポニンＩを測定するアッセイにおいて良好な利用候
補でるある抗体が製造される。
実施例24 ラテックス粒子に対するトロポニンの非特異的吸着にお
けるプロタミンおよびメリチンの影響 アビジン−HSで被覆された磁性ラテックス（実施例
１）を洗浄し、３種類の異なる希釈液で１％固形分に再
懸濁した：血清（ハイブリテック株式会社、サンディエ
ゴ、カルフォルニア）、0.2mg/mlプロタミンクロリドを
含む血清および0.1mMメリチンを含む血清。再懸濁した
ラテックス溶液それぞれ125μＬを、6ng/mlの酸化型精
製トロポニンＩ（バイオ−テック・インターナショナル
株式会社）または18ng/mlの精製三成分トロポニンコン
プレックスいずれかを含む血清125uL体積と混合し、ト
ロポニンとラテックスとの溶液を形成した。また、血
清、0.2mg/mlプロタミンクロリドを含む血清または0.1m
Mメリチンを含む血清125μＬ体積を、6ng/mlの酸化型精
製トロポニンＩまたは18ng/ml精製三成分コンプレック
スいずれかを含む血清125ul体積と混合し、ラテックス
を含まないトロポニン溶液を形成した。溶液を室温で30
分間インキュベートした。ラテックスをペレット化し、
上澄みを収集した。トロポニンおよびラテックスの溶
液、ならびにラテックスを含まないトロポニン溶液由来
の上澄みを、抗体対＃17（表13）を用いてトロポニンに
ついてアッセイし（アッセイ緩衝液の代わりに血清を用
いたこと以外、実施例２の方法Ａと同様）、トロポニン
濃度を測定した。トロポニンおよびラテックス溶液の上
澄み中のトロポニン回収率（表14）を、トロポニンおよ
びラテックスの溶液由来の上澄み中のトロポニンの測定
濃度をラテックスを含まないトロポニン溶液中のトロポ
ニンの測定濃度で割ることによって求めた。
データから、メリチンおよびプロタミンクロリドはト
ロポニンの回収率を増大させ、つまりメリチンおよびプ
ロタミンクロリドはトロポニンのラテックスへの非特異
的吸着を低減させることがわかる。
実施例25 ラテックス粒子を利用するトロポニンのためのサンドウ
ィッチイムノアッセイのアッセイ応答におけるプロタミ
ンおよびメリチンの影響 アビジン−HS磁性ラテックス（実施例１）を洗浄し、
２種類の異なる希釈液で１％固形分に再懸濁した：アッ
セイ緩衝液および0.1mMメリチンを含むアッセイ緩衝
液。マイクロタイタープレートのウェルで、再懸濁され
たそれぞれのラテックス溶液25μｌを、精製酸化型トロ
ポニンＩ（バイオ−テック・インターナショナル株式会
社）を０〜16ng/mlの様々な濃度で含むアッセイ緩衝液2
5μｌと混合し、トロポニンＩとラテックスとの溶液を
形成した。溶液を室温で30分間インキュベートした。そ
れぞれのウェルに、２つの抗体の対＃17（表13）をそれ
ぞれ2.5ug/mlで含む溶液50μｌを添加し、反応混合物を
形成した。反応混合物を15分間インキュベートした後、
ラテックスをペレット化し、洗浄し、さらに方法Ａ（実
施例２）と同様にして処理した。その結果を、ng/mlト
ロポニンＩあたりのOD490の単位のアッセイ勾配として
表15に示す。
データから、メリチンのアッセイ緩衝液への添加によ
ってアッセイ応答が約２倍増大し、したがってトロポニ
ンＩに対するアッセイ感度が向上することがわかる。示
されていないデータでは、ラテックス粒子を利用したト
ロポニンＩについてのイムノアッセイへのプロタミン
（0.03〜0.1mg/ml）およびメリチン（0.017〜0.05mM）
の添加によって、アッセイ応答は30％〜400％向上し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）心臓特異的なトロポニンＩとトロポ
    ニンＴから成る群から選択される心臓特異的な遊離のト
    ロポニンのイソ型タンパク質および（ii）１種の該トロ
    ポニンのイソ型タンパク質と共にこれとは異なる少なく
    とも１種のトロポニン成分のイソ型タンパク質を含む１
    種もしくは２種以上のコンプレックスとして存在する心
    臓特異的な複合したトロポニンのイソ型タンパク質を含
    有する血液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イ
    ソ型タンパク質の存在もしくは量を決定するためのアッ
    セイ法において、 該血液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イソ型
    タンパク質と結合する抗体であって、心臓特異的な該ト
    ロポニンのイソ型タンパク質に対して特異的な抗体を用
    いるイムノアッセイによって検出可能なシグナルを該血
    液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イソ型タン
    パク質の存在もしくは量と関連づけることを含む該アッ
    セイ法。
  2. 【請求項２】サンドイッチイムノアッセイを含む請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】シグナル発生要素と複合した抗体を含む複
    合抗体であって心臓特異的なトロポニンのイソ型タンパ
    ク質と結合する複合抗体を供給する過程または心臓特異
    的なトロポニンのイソ型タンパク質と結合する固体相抗
    体を供給する過程を含む請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】シグナル発生要素と複合した抗体を含む複
    合抗体であって心臓特異的なトロポニンのイソ型タンパ
    ク質と結合する複合抗体を供給する過程および心臓特異
    的なトロポニンのイソ型タンパク質と結合する固体相抗
    体を供給する過程を含む請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】次のコンプレックスと結合する抗体を供給
    する過程を含む請求項１記載の方法：心臓特異的な酸化
    されたトロポニンＩのイソ型タンパク質を含有するコン
    プレックス、心臓特異的な還元されたトロポニンＩのイ
    ソ型タンパク質を含有するコンプレックス、または心臓
    特異的な酸化されたトロポニンＩのイソ型タンパク質を
    含有するコンプレッスおよび心臓特異的な還元されたト
    ロポニンＩのイソ型タンパク質を含有するコンプレック
    ス。
  6. 【請求項６】イムノアッセイの結果を血液試料中に複合
    化トロポニンの存在と関連づけることを含む心筋梗塞の
    診断法として利用する請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】少なくとも１種の抗体が複数のモノクロー
    ナル抗体を含む請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】血液試料中の心臓特異的なトロポニンＩと
    トロポニンＴから成る群から選択されるトロポニンのイ
    ソ型タンパク質のコンプレックスの存在もしくは量を決
    定するためのイムノアッセイ法であって次の過程（ａ）
    〜（ｄ）を含む該イムノアッセイ法： （ａ）心臓特異的なトロポニンの該イソ型タンパク質お
    よびこれとは異なる少なくとも１種のトロポニン成分を
    含有するコンプレックス中の該イソ型タンパク質と特異
    的に結合する抗体を含有する抗体複合体およびシグナル
    発生手段を供給するか、または心臓特異的なトロポニン
    の該イソ型タンパク質およびこれとは異なるトロポニン
    成分を含有する二成分をコンプレックス中の該イソ型タ
    ンパク質と特異的に結合する抗体を含有する抗体複合体
    およびシグナル発生手段を供給し、および３種のトロポ
    ニン成分の三成分コンプレックス中の心臓特異的なトロ
    ポニンのイソ型タンパク質と特異的に結合する抗体を含
    む抗体複合体およびシグナル発生手段を供給する。 （ｂ）過程（ａ）における抗体複合体を該試料と接触さ
    せることによってこれらの抗体複合体を試料中に存在す
    るトロポニンコンプレックスと結合させる。 （ｃ）捕捉抗体と結合した後で抗体複合体と結合したト
    ロポニンコンプレックスに特異的に結合するか、または
    抗体複合体に結合したトロポニンコンプレックスと特異
    的に結合する少なくとも１種の捕捉抗体が結合した固体
    相を試料と接触させることによって、抗体複合体と結合
    したかもしくは結合するトロポニンコンプレックスの固
    体相に結合するときに抗体複合体からの検出可能なシグ
    ナルを存在させる。 （ｄ）試料中の心臓特異的なトロポニンイソ型タンパク
    質のコンプレックスの存在もしくは量と該検出可能なシ
    グナルを関連づける。
  9. 【請求項９】血液試料中のいずれかの心臓特異的なトロ
    ポニンＩとトロポニンＴから成る群から選択されるトロ
    ポニンのイソ型タンパク質を含有するコンプレックスの
    存在もしくは量を決定するためのイムノアッセイ法であ
    って、次の過程（ａ）〜（ｄ）を含む該イムノアッセイ
    法： （ａ）２種以上のトロポニン成分を含有するトロポニン
    コンプレックスと特異的に結合する抗体を含有する抗体
    複合体およびシグナル発生手段を供給するか、または２
    種のトロポニン成分を含有する二成分コンプレックス中
    のトロポニンと特異的に結合する抗体を含有する抗体複
    合体およびシグナル発生手段を供給し、および３種のト
    ロポニン成分を含有する三成分コンプレックスと特異的
    に結合する抗体を含有する抗体複合体およびシグナル発
    生手段を供給する。 （ｂ）過程（ａ）の抗体複合体を該試料と接触させるこ
    とによってこれらの抗体複合体を試料中のトロポニンコ
    ンプレックスと結合させる。 （ｃ）抗体複合体と結合した心臓特異的なトロポニンの
    イソ型タンパク質を含有するトロポニンの二成分コンプ
    レックスおよび三成分コンプレックスと特異的に結合す
    る少なくとも１種の捕捉抗体が結合した固体相を該試料
    と接触させるか、また、捕捉抗体と結合した後で抗体複
    合体と結合した心臓特異的なトロポニンのイソ型タンパ
    ク質を含有するトロポニンの二成分コンプレックスおよ
    び三成分コンプレックスと特異的に結合する少なくとも
    １種の捕捉抗体が結合した固体相を該試料と接触させる
    ことによって、抗体複合体と結合したかもしくは結合す
    る心臓特異的なトロポニンのイソ型タンパク質の固体相
    に結合するときに抗体複合体からの検出可能なシグナル
    を存在させる。 （ｄ）試料中の心臓特異的なトロポニンのイソ型タンパ
    ク質のコンプレックスの存在もしくは量と該検出可能な
    シグナルを関連づける。
  10. 【請求項１０】（ｉ）心臓特異的なトロポニンＩとトロ
    ポニンＴから成る群から選択される心臓特異的な遊離の
    トロポニンのイソ型タンパク質および（ii）１種の該ト
    ロポニンのイソ型タンパク質と共にこれとは異なる少な
    くとも１種のトロポニン成分のイソ型タンパク質を含む
    １種もしくは２種以上のコンプレックスとして存在する
    心臓特異的な複合したトロポニンのイソ型タンパク質を
    含有する血液試料中の全ての該遊離イソ型タンパク質と
    該複合イソ型タンパク質の存在もしくは量を決定するた
    めのアッセイ法において、 該血液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イソ型
    タンパク質と結合する抗体であって、心臓特異的な該ト
    ロポニンのイソ型タンパク質に対して特異的な抗体を用
    いるイムノアッセイによって検出可能なシグナルを該血
    液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イソ型タン
    パク質の存在もしくは量と関連づけることを含む該アッ
    セイ法。
  11. 【請求項１１】該アッセイによって各々のイソ型タンパ
    ク質の定量的アッセイ測定をおこなう請求項10記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】少なくとも１種の抗体が複数のモノクロ
    ーナル抗体を含む請求項10記載の方法。
  13. 【請求項１３】心臓特異的なトロポニンＩとトロポニン
    Ｔから成る群から選択される心臓特異的な１種のトロポ
    ニンのイソ型タンパク質と共にこれとは異なる少なくと
    も１種のトロポニン成分のイソ型タンパク質を含む１種
    もしくは２種以上のコンプレックスとして存在する心臓
    特異的な複合したトロポニンのイソ型タンパク質を含有
    する血液試料中の該複合イソ型タンパク質の存在もしく
    は量を決定するためのアッセイ法において、 該血液試料中の該複合イソ型タンパク質と結合する抗体
    であって、心臓特異的な該トロポニンのイソ型タンパク
    質に対して特異的な抗体を用いるイムノアッセイによっ
    て検出可能なシグナルを該血液試料中の該複合イソ型タ
    ンパク質の存在もしくは量と関連づけることを含む該ア
    ッセイ法。
  14. 【請求項１４】該アッセイによって各々のイソ型タンパ
    ク質の定量的アッセイ測定をおこなう請求項13記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】少なくとも１種の抗体が複数のモノクロ
    ーナル抗体を含む請求項13記載の方法。
  16. 【請求項１６】（ｉ）心臓特異的なトロポニンＩとトロ
    ポニンＴから成る群から選択される心臓特異的な遊離の
    トロポニンのイソ型タンパク質および（ii）１種の該ト
    ロポニンのイソ型タンパク質と共にこれとは異なる少な
    くとも１種のトロポニン成分のイソ型タンパク質を含む
    １種もしくは２種以上のコンプレックスとして存在する
    心臓特異的な複合したトロポニンのイソ型タンパク質を
    含有する血液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合
    イソ型タンパク質の存在もしくは量を決定するためのア
    ッセイ法において、 該血液試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イソ型
    タンパク質と結合する抗体であって、心臓特異的なトロ
    ポニンＩもしくはトロポニンＴまたは心臓特異的なトロ
    ポニンンＩとトロポニンＴに対して特異的な抗体を用い
    るイムノアッセイによって検出可能なシグナルを該血液
    試料中の該遊離イソ型タンパク質と該複合イソ型タンパ
    ク質の存在もしくは量と関連づけることを含む該アッセ
    イ法。
  17. 【請求項１７】（ｉ）心臓特異的な遊離のトロポニンＩ
    および（ii）該トロポニンＩと共にこれとは異なる少な
    くとも１種のトロポニン成分を含む１種もしくは２種以
    上のコンプレックスとして存在する心臓特異的な複合し
    たトロポニンＩを含有する血液試料中の該遊離トロポニ
    ンＩと該複合トロポニンＩの存在もしくは量を決定する
    ためのアッセイ法において、 該血液試料中の該遊離トロポニンＩと該複合トロポニン
    Ｉと結合する抗体であって、心臓特異的なトロポニンＩ
    に対して特異的な抗体を用いるイムノアッセイによって
    検出可能なシグナルを該血液試料中の該遊離トロポニン
    Ｉと該複合トロポニンＩの存在もしくは量と関連づける
    ことを含む該アッセイ法。
  18. 【請求項１８】（ｉ）心臓特異的な遊離のトロポニンＴ
    および（ii）該トロポニンＴと共にこれとは異なる少な
    くとも１種のトロポニン成分を含む１種もしくは２種以
    上のコンプレックスとして存在する心臓特異的な複合し
    たトロポニンＴを含有する血液試料中の該遊離トロポニ
    ンＴと該複合トロポニンＴの存在もしくは量を決定する
    ためのアッセイ法において、 該血液試料中の該遊離トロポニンＴと該複合トロポニン
    Ｔと結合する抗体であって、心臓特異的なトロポニンＴ
    に対して特異的な抗体を用いるイムノアッセイによって
    検出可能なシグナルを該血液試料中の該遊離トロポニン
    Ｔと該複合トロポニンＴの存在もしくは量と関連づける
    ことを含む該アッセイ法。
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