JPH03123498A - 線溶系測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般に、血液の凝固及び血餅の除去に係る測定
に関し、そしてさらに詳しくは線溶活性の測定に関する
。

〔従来の技術〕

線溶（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）はスロンビンにより
形成されたフィブリン血餅が除去される機構である。

線溶系の主成分はプラスミノーゲン、プラスミノーゲン
活性化因子及び阻害物質並びにプラスミン阻害物質であ
る。プラスミノーゲンは血漿中のプロ酵素であって、そ
の活性化形であるプラスミンに転換された後フィブリン
血餅の消化を主として担当すると考えられている。

この分野の方法は、プラスミン活性についてのバイオア
ッセイと、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ
）の種々の抗原形又は線溶系の他の成分の抗原の存在に
ついてのイムノアッセイとに広く分けることができる。

ｔ−ＰＡの精製及びそれに続くクローニングは抗体の調
製のための接種物の標準化を可能にしたが、しかしモノ
クローナル抗体を生じさせるエピトープが多様であるこ
とがそれらの試薬を用いるイムノアッセイの標準化を非
常に困難なものとしている。プラスミンを測定するバイ
オアッセイも、プラスミン力価の予測に影響を与える多
くの異る基質が使用される点において多様である。

例えば、フィブリンの溶解に基礎を置く１つのバイオア
ッセイ法は、フィブリノーゲンへのスロンビンの添加を
介してペトリ皿中にフィブリンゲルを形成する。次に、
精製された線溶系成分又は血漿をマトリクスの表面に添
加し、そして１８〜２０時間後に溶解ゾーンの直径を測
定する。この方法は比較的遅く、特に正確と言う程では
なく、そしてイントリンシック（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）
活性化因子とエクストリンシック（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ
）活性化因子との間を区別しない。

文献に最もしばしば記載されるバイオアッセイ法は発色
（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ　ｉｃ）測定法である。この方法
においては、注目のプロテアーゼに対して特異的なｐ−
ニトロアニリン結合トリペプチドが加水分解されてｐ−
ニトロアニリンが放出され、そして分光光度計により追
跡可能な色の変化が生ずる。

しかしながら、この方法をｔ−ＰＡの検出に適用する場
合、ｔ−ＦＡの結合及びそれに続く活性の増強を誘導す
ることが必要である。

線溶系の成分のイムノアッセイは一般に通常のＥＬＩＳ
Ａ又は放射能測定イムノアッセイの応用である。これら
の系は生体内系の活性の正確な測定を与えることができ
ない。最近、イムノアッセイ法の固定化の特徴と発色測
定の機能的観点を組合わせたバイオイムノアッセイが開
発された。これらのバイオアッセイは、基質としての又
はｔ−ＰＡ活性増強剤としてのフィブリンを使用しない
。

〔発明が解決しようとする課題〕

組換ｔ−ＰＡは、冠動脈血栓に基く急性心筋梗塞を有す
る患者における冠動脈血栓溶解への有望なアプローチを
提供する。特異的な血栓溶解を達成するためのｔ−ＰＡ
の使用に伴い、線溶系のすべての観点について標準化さ
れ、単純化されそして容易に利用可能な測定系が要求さ
れる。従って、高感度及び迅速さを可能にしそして注目
の広範な種類の因子の検出の自動化を可能にする迅速で
且つ効率的な測定法の高い必要性が存在する。

〔課題を解決するための手段〕

酵素標識されたフィブリン複合体の消化の後に放出され
る標識されたフィブリン生成物を測定することにより線
溶系に関与する因子を検出及び測定するための方法及び
組成物が提供される。標識されたフィブリン複合体は、
液相フィブリノーゲンの存在下での固体基材に結合した
フィブリノーゲンへのスロンビンの作用により形成され
る。フィブリノーゲン相の一方又は両者が酵素標識され
ている。この方法により検出される因子には酵素、酵素
活性化因子及び阻害物質、並びに線溶に直接的又は間接
的に関与する他の因子が含まれる。

〔具体的な記載〕

本発明の方法は、線溶系酵素の基質としての、そしてそ
れ故に線溶に関与する因子についての測定系の成分とし
ての、固体支持体に結合された酵素標識フィブリンの使
用を含む。本発明の目的のため、線溶系因子には、直接
的又は間接的にフィブリンの破壊に影響を与えるあらゆ
る酵素、活性化因子、阻害物質、アンチアクチベーター
、アンチプラスミン、抗体、医薬等が含まれる。従って
、この測定法は、血餅の分解に関与するあらゆる由来の
広範囲の種類の因子を検出するために使用することがで
きる。

この測定は、固体支持体に結合した標識されたフィブリ
ンに対する未知因子の作用を必要とする。

フィブリンマトリクスは固相／液相法により形成される
。すなわち、フィブリノーゲンによる固体基材の受動被
覆（ｐａｓｓｉｖｅｃｏａｔｉｎｇ）を許容するのに十
分な時間にわたって固体基材を未標識の又は標識された
フィブリノーゲンにより被覆する。該固体基材を洗浄し
てすべての未結合フィブリノーゲンを除去した後、次に
、液相の標識されているか又は標識されていないフィブ
リノーゲンをスロンビンと共に加えて標識されたフィブ
リンマトリクスを形成せしめる。２つのフィブリノーゲ
ン相の少なくとも一方、すなわち液相又は同相は標識さ
れていなければならない。しかしながら、所望により両
相を標識することができる。標識された液相フィブリノ
ーゲンを標識されているか又は未標識の固相フィブリノ
ーゲンと共に使用する場合、シグナル対ノイズ比が一層
高くなる。未標識固相／標識化液相の組合せに比べて標
識化固相／標識化液相の組合せにおいて速度が高い。し
かしながら、前者の組合せは一層低いバックグラウンド
を有し、そして標識された試薬は天然の未標識物よりも
入手が困難であるから、標識化固相／標識化液相の組合
わせの高い速度の利点は失われる。さらに、感度の利益
が存在しない。しかしながら、標識化固相／標識化液相
の組合せは、純粋に定性的基準が用いられる色試験にお
いて一層迅速な発色をもたらす。

ともかく、得られた標識されたフィブリンマトリクスは
線溶因子のための基質として使用することができる。フ
ィブリノーゲン又はフィブリンの分解生成物中に放出さ
れた標識の量により、因子の活性を正確に且つ容易に定
量することができる。

固相フィブリノーゲン及び液相フィブリノーゲンの両者
から調製される結果として固有の物理的及び生化学的性
質を有する基質を使用するため、本明細書においてはこ
の測定法を時として「固相／液相測定法」と称するが、
これは測定法それ自体の記述によるものではなく基質の
潤製方法に関するものであると理解すべきである。

本発明の方法において使用される標識は、線溶を妨害せ
ず且つ検出を許容する任意の分子であることができる。

広範の種類の標識、例えば酵素、放射性核種、蛍光物質
、化学発光物質、酵素基質及びコファクター、酵素阻害
物質等が使用される。

標識は直接的又は間接的にフィブリノーゲンに結合せし
めることができ、この場合種々の架橋基、例えば抗体、
ハプテン−受容体、例えばビオチンアビジン、ポリヌク
レオチド等を用いることができる。これら種々の物質を
用いる多くの特許、例えば米国特許ＮｃＬＲＥ　２９．
１６９、Ｎｏ、　ＲＥ　２９．９５５、Ｎｏ、　３．６
５４．０９０＜　Ｎａ　３．６９０．８３４、Ｎｏ、　
３．８１７．８３７、Ｎｏ、　３．８６７、５１７、ｋ
　３．９３５．０７４、Ｎｏ、　３．９７５．５１１、
Ｎｏ、　３．９９６．３４５、及びＮｏ、　４．０２０
．１５１が存在する。ススロンビンによるフィブリンの
付着のために使用されるｐＨ及び緩衝液の組成は蛍光標
識及び化学発光標識と適合性であって、これらの物質が
標識として容易に使用できるものである。

本発明の方法のための好ましい酵素標識はパーオキシダ
ーゼである。パーオキシダーゼ標識が使用される場合、
測定は迅速であり、高感度であり、そして安定である。

例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼがＨ２０□−テト
ラメチルベンジジン基質と共に使用される場合、結果は
２分間以内の発色により検出される。さらに、パーオキ
シダーゼ標識されたフィブリノーゲン及びフィブリンは
一２０℃において１年間以上の商品寿命を有する。

幾つかの状況において特に有用な他の酵素標識はウレア
ーゼである。ウレアーゼが標識である場合、エンザイム
・リンクド・フィブリノリティック・アッセイ　（ＥＬ
ＦＡ）のために使用される緩衝液は、ウレアーゼが標準
的ｐＨ変化法により測定されることを許容しない。しか
しながら、表面結合したウレアーゼ−フィブリンがプラ
スミンにより除去されそしてこの除去の後に残ったフィ
ブリン関連活性を測定する場合、この酵素は有用である
。

これは、この明細書の他の場所に記載されているものと
は異る技法であるが、溶液の移行を必要とせず、そのた
め診断キット用として特に実用的であるという利点を有
する。−船釣方法はウレアーゼ−フィブリンの使用を必
要としないが、しかし所望により他の酵素と共に使用す
ることができる。

ウレアーゼ標識が尿素及びブロモクレゾールパープルを
含有する基質溶液と共に使用される場合、反応は２分間
以内の顕著な色の変化により検出することができる。こ
の標識の寿命はパーオキシダーゼ接合体のそれに匹敵す
る。

本発明の方法は、線溶系血液因子の定量のために用いら
れる現行方法に卓越する幾つかの利点を提供する。主た
る利点は非放射性標識を用いることができることである
。非放射性標識は特別な取扱技術を必要とせず、そして
放射性化学物質に伴う安定性及び適当な廃棄法の問題を
もたらさない。

本発明の目的のためには、酵素標識、例えばパーオキシ
ダーゼが好ましい。パーオキシダーゼを用いる測定法は
、常用法と比較した場合、迅速で、高感度で、安定で、
且つ高価でないと言う利点を有する。

同相／液相法により調製さ゛れる基質フィブリンは、以
前から調製されている固相フィブリンからは得られない
他の多くの性質を有する。フィブリンを調製するための
常用の固相法において放射性標識に代えて非放射性酵素
標識を用いるだけでは実行可能な測定法は得られない（
第５，６及び７図、並びにこれらに報告されているデー
ターについての後記の検討を参照のこと）。酵素標識が
使用される場合にプラスミンの測定のために適当なマト
リクスを得るためには、液相中のフィブリノーゲンをス
ロンビンと共に加えることが必要である。標識された基
質の調製法を後に詳細に記載する。

さらに、本明細書に記載するようにして調製されたフィ
ブリンマトリクスはすべてのタイプの線溶測定のために
理想的である。現在市販されているキットに卓越する主
たる利点は、天然線溶阻害物質に対して感受性でない一
層小形の発色基質ではなく、天然基質が線溶系成分のた
めに使用されることである。例えば、ｔ−ＰＡの介在に
よるプラスミノーゲンの活性化はフィブリンの存在下で
増強され、そしてフィブリンもまた活性化の最終生成物
であるプラスミンのための天然基質である。従って、本
発明の天然−様基質の存在下で起こる活性化は、他の方
法において使用される小形の発色基質において生ずるそ
れに比べてｔ−ＰＡ介在活性化の一層正確な表示を与え
る。

本発明の測定法はまた、現在用いられている方法と対比
して、それに匹敵するか又はより高い感度を伴って、線
溶因子のはるかに迅速な定量を与える。これは、血栓溶
解療法のモニターのためにこの測定を用いる場合に特に
有用であることを証明するものであろう。なぜなら、現
行の測定法の時間は臨床的に許容されないと考えられる
からである。この改良の当然の結果は、この系の成分の
阻害物質の測定もまた一層高感度であり且つより迅速で
あろうということである。

この測定法は、プラスミンのための基質としての固相／
液相の標識されたフィブリノーゲンから調製された標識
されたフィブリンを用いる。プラスミンは全線溶現象の
最終生成物として生成され又は阻害されるので、その測
定は本発明のすべての測定技法の中心である。従って、
測定がプラスミンに対する場合を除き、反応混合物中に
プラスミノーゲンを含める。しかしながら、典型的には
測定されるべき１つの成分以外のすべての成分を含む、
系の成分の種々の組合せを得ることにより線溶系の他の
成分の分析のためにこの測定法を変更することができる
。測定法に用いる成分及びサンプルの存在下でフィブリ
ンマトリクスから放出される標識の量を検出又は定量す
ることにより正確で高感度の測定が達成される。本発明
の基質からの標識のこの放出は生体内の状況を密接に模
倣するものである。

しばしば因子と称される線溶系の種々の成分の測定は、
注目の因子が線溶経路中のどこで相互作用するかに依存
して異る手法及び試薬を必要とする。すべての手法に共
通なことは、支持体に結合した本発明の標識されたフィ
ブリン基質である。

プラスミンの測定は線溶のための追加の試薬を必要とし
ないであろう。但し、他の線溶系成分の適当な量の存在
を保証するために他の試薬を添加することもできよう。

他の系成分の測定のために測定において試薬として補充
される添加される因子の混合物は、注目の因子を欠く稀
釈された血漿として又は線溶のために必要な注目の因子
を欠く精製された因子の混合物として提供することがで
きよう。あるいは、患者の血漿をプールされた正常血漿
と又は異常を検出するための既知標準のセットと比較す
ることにより診断目的のために種々の線溶因子の血漿レ
ベルを測定することができる。

本発明の測定は「直接的に」又は「間接的に」行うこと
ができ、ここで間接的方法はプラスミンの生成又はプラ
スミン活性に影響を与える競争的又は二次的相互作用を
用い、他方直接的とは、注目の因子がプラスミンの生成
又はプラスミン活性に活性化又は阻害による直接的影響
を有することを意味する。

生体内でのプラスミノーゲンの活性化の正確な生理的機
構は明らかでないが、今日まで研究されたすべてのプラ
スミノーゲンの活性化はプラスミノーゲン中のＡｒｇ　
５６０−Ｖａβ５６１ペプチド結合の開裂を介して起こ
る。２つの異る活性化経路、すなわちイントリンシック
又は液性経路及びエクストリンシック経路が存在する。

いずれの経路の活性化因子又は阻害物質を測定するため
にも直接測定法を設計することができる。測定がプラス
ミノーゲンからのプラスミンの生成に関与する活性化因
子についてである場合、プラスミノーゲン及び該活性化
因子がプラスミンの生成のために必要とする他の成分を
含める必要がある。イントリンシック経路に関与する活
性化因子にはファクターＸ■〔ハーゲマン（Ｈａｇｅｍ
ａｎ）因子〕、プレカリクレイン、及び高分子キニノゲ
ン（ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ）　（接触活性化因子）が包含
される。エクストリンシック活性化因子にはウロキナー
ゼ、ストレプトキナーゼ及びｔ−ＰＡが包含される。エ
クストリンシック経路の３種類の主たる活性化因子につ
いては、フィブリン又はある種のフィブリノーゲン断片
の存在下でプラスミンの転換についてのより有利な動力
学定数が存在する。従って、本発明の方法のための基質
としてのフィブリンマトリクスの使用は、生体内で起こ
る活性化をよりよく示すものである。

同様に、測定されるべき因子が線溶系の特定の成分を阻
害する場合、その成分が、プラスミノーゲンの開裂によ
るプラスミンの生成のために必要な他の成分と共に含め
られるであろう。因子がアンチプラスミンである場合、
プラスミン又はその生成のために必要なすべての成分が
測定混合物中に与えられる。アンチプラスミンにはα２
−アンチプラスミン、α２−マクログロブリン、及びα
１−アンチトリプシンが含まれる。

プラスミンの活性又は生成に対する競争的又は二次的相
互作用を用いる間接測定を行うことができる。阻害物質
がプラスミンの生成を促進する活性化因子に作用する場
合、該活性化因子、プラスミノーゲン及びプラスミンの
生成のために必要な他の成分を含める必要がある。不活
性化因子Ｃ１は活性化されたファクターＸ■を阻害する
ことによりイントリンシック経路に対して特異的なよう
である。抗−活性化因子ｔ−ＰＡ阻害物質１　　（ＦＡ
Ｉ−１）はｔ−ＰＡの最初に作用する阻害物質であり、
そしてエクストリンシック経路のよく特徴付けられた阻
害物質である。両経路に影響を与えることができる他の
既知阻害物質にはアンナスロンビンｌｌｌ１体、α２−
マクログロブリン、α１−アンチトリプシン、及びα２
−アンチプラスミンが含まれる。

さらに、本発明の方法はこれらの不活性化因子／阻害物
質に影響を与える因子を測定するために使用することが
できる。これらの因子は、因子とその相補的結合質との
間の複合体の形成の結果として線溶に影響を与えること
ができる。複合体の形成とは、リガンドと受容体とが特
異的結合対を規定する場合のリガンドとその相補的受容
体との非共有結合を意味する。

次の表は、種々の線溶系成分の測定のために使用するこ
とができる精製された因子及び血漿の種々の組合せを示
す。

測定は線溶に関与する既知因子に限定されない。

むしろ、フィブリンの加水分解に影響を与える生物学的
又は合成のあらゆる因子を本発明の方法により検出及び
測定することができる。

線溶系因子の標準としてプールされた正常ヒト血漿を用
いることができ、そして遺伝的欠陥を有することが疑わ
れるか又は他の理由により不十分であることが疑われる
血漿をこの標準と比較することができる。また、幾つか
の場合には個々の因子を活性化することができる酵素を
用いて注目の因子を欠く精製された因子の混合物を調製
することができる。

はとんどの場合、線溶系の成分は種間で交叉反応するで
あろう。すなわち、１つの種からの線溶系活性化因子／
阻害物質が他の種からの線溶系成分の活性化を与えるで
あろう。従って、マウス、ラビット、ラット、モンキー
、ウシ、ヒト等のごとき色々な種からの因子を用いるこ
とができ、この場合、種々の線溶系因子についての既知
量の活性を有するサンプルにより因子を力価検定するこ
とができ、そして特定の種の有用性を決定することがで
きる。従って、ヒトの因子を測定するために本発明の方
法においてヒトの成分を使用する必要はない。但し、ヒ
トの成分を使用するのが好ましいかも知れない。

前に示唆したように、本発明の技法は特定の線溶系因子
について使用することができるのみならず、１又は複数
の因子を活性化又は阻害することができる天然又は合成
物質について用いることができる。従って、１又は複数
の線溶系因子の活性を変更する物質の存在を測定するた
めに、本発明の方法を用いることができる。この変更の
一例はモノメチルアミン塩酸塩によるα２−マクログロ
ブリンの特異的阻害であって、これはα２−マクログロ
ブリンの効果とは独立にα２−アンチプラスミンを定量
することを可能にする。今度はこれが、本発明の方法が
間接測定によりα２−マクログロブリンの阻害的関与を
測定することを可能にする。

試薬とサンプルとの混合を、生ずる反応溶液と本発明の
標識された基質との接触と同時に又はそれに先立って行
うことができる。サンプルは典型的には全血、又は血漿
のごとき全血の両分であろう。さらに、サンプルは他の
生物学的流体、例えば尿、を椎液及び唾液、並びに線溶
系に影響を与える因子を生産する細胞培養からの培地の
ごとき他の液体又は固体である。例えば、ヒトにおいて
使用するために調製される種々の血液画分、例えば線溶
を活性化又は阻害する種々の薬物又は合成物質により処
理された血小板富化画分をサンプルとして使用すること
ができる。稀釈剤、例えば緩衝剤、塩溶液、及び任意の
防腐剤、及び増量剤、並びに特定の阻害物質レベルの決
定において使用される過剰の因子を反応溶液中に存在せ
しめることができる。

測定されるべき成分が存在すれば線溶に影響を与えるの
に十分な時間にわたって反応溶液を基質と混合しそして
インキユベートし、これによって標識されたフィブリン
生成物を生じさせる。反応溶液中に放出された標識され
たフィブリンの量を定量し、そして存在する因子の量を
決定するために用いることができる。標識の量、そして
それ故に溶液中又は固相上のいずれかの標識されたフィ
ブリン断片の量、を決定するために適当な任意の技法に
より定量を行うことができる。

サンプル中の特定の成分の活性を測定することに関心を
持つ場合、例えば、血液サンプルを採取し、それを稀釈
してｌ又は複数の（通常は多数の）稀釈物を調製し、そ
してそれを、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化す
るであろう溶液に加える。この方法において、プラスミ
ンの阻害へのサンプルの寄与は最低の稀釈物においては
無視できるほど小さく、そして最高稀釈物においては測
定可能であろう。従って、活性化されたプラスミノーゲ
ンの量をプールされた血漿溶液又は標準と関連付けるこ
とができ、そして血漿により示される阻害の量と同様に
定量することができる。同様にして、生理的サンプル中
に存在するであろう内因性活性化因子又は阻害物質を調
査しようとする場合、サンプルからの寄与を実質的に圧
倒するのに十分な量ですべての因子を含有する媒体中に
血漿の稀釈物を添加する。あるいは、分析されるべき特
定の物質が実質的に濃縮されそして線溶に関与する他の
因子が存在しない場合、次にこの濃縮物を使用し、そし
て媒体中に存在する種々の因子の量を正常な血漿の実質
的な稀釈から濃縮物まで位置付けることができる。

本発明の方法は、プラスミンの活性から生ずる分解生成
物を測定することによる線溶に関与する因子の検出及び
定量のための簡単な技法を提供する。従って、固相／液
相法により形成された標識され結合されたフィブリン、
及びプラスミン又はプラスミノーゲンの使用を、プラス
ミンの活性の変更を可能にする任意の系に組み込むこと
ができる。本発明の検出系と伴に使用することができる
広範囲の種類の系を開発することができる。

活性化因子と不活性化因子又は酵素とその特異的阻害剤
の複合体の量を決定する必要があるかも知れない。これ
らの測定のために利用することができる種々の方法が存
在し、これには本発明の方法と組み合わせることができ
るＥＬＩＳＡ法が含まれる。あるいは、この様な複合体
中の因子の残留活性を測定することが必要な場合、この
系をその目的のために適用することができる。抗阻害物
質又は拭清性化因子抗体により同相を同時にプレコート
しそしてスロンビン及び標識されたフィブリノーゲンを
添加して標識されたフィブリンマトリクス形成せしめる
ことによる一例が記載される。注目の複合体が抗体上に
固定化され、その活性を妨害するであろう他の阻害物質
からそれを抽出する。

これは、残留プロテアーゼがその天然基質であるフィブ
リンの存在下で実際に作用し、そして阻害又は活性化の
一層正確な表示を与えることを可能にする。

本発明の方法に使用される固体基材又は支持体は種々の
態様で、マイクロタイターの壁、毛細管の壁、粒子（例
えば磁気粒子、ラテックス、ポリサッカライド等）、又
は他の表面に共有結合して存在することができる。特に
注目されるのはマイクロタイタープレートであり、この
場合シグナルはマイクロタイターリーダーにより測定す
ることができる。これらのリーダーは現在市販されてい
る。

固相の表面積の増加が、標識されたフィブリンの付着の
ために利用可能な面積を増加せしめ、そしてそれ故にプ
ラスミンの作用のための基質及び利用可能な表面を増加
せしめることを当業者は認識するであろう。従って、こ
の技法がより迅速に定量的結果をもたらすことが、より
大きな表面積をもたらす任意の技法により可能となる。

基質を調製する第一段階として、未標識の又は標識され
たフィブリノーゲンを固体基材の表面に被覆する。フィ
ブリノーゲンの量は、支持体の材質、その形状及び表面
、並びにその基質を用いようとする測定において用いら
れる手法に依存するであろう。表面への非特異的結合を
実質的に減らし又は除去するため、次に支持体を血清ア
ルブミンのごとき不活性蛋白質で処理することができる
。

例えば、約１〜２０ｍｇ／ｍｊ２の蛋白質を有する蛋白
質溶液を、該蛋白質が表面に結合するための時間にわた
って支持体と接触せしめ、次に洗浄しそして穏和に乾燥
せしめる。液相の標識された又は未標識のフィブリノー
ゲンを、ゼラチン（２０ｍｇ／７り又は他の濃縮された
蛋白質緩衝剤、例えば血清アルブミン巾約１ｎ／−〜約
１０ｆｆ／ｍｆ！の範囲、好ましくは約４ｐｔ／ｍｌに
おいて添加する。蛋白質は測定中のプラスミンの活性を
妨害するらしいので、一般に、マトリクスの形成の間に
蛋白質をマトリクスから除去する。例えば、マトリクス
形成のスロンビン部分でのゼラチンは典型的には４０分
後に洗浄除去される。ゼラチンがプラスミン測定中に含
まれる場合、シグナルは有意に低下し、そして測定の感
度及び特異性が害される。

次に、スロンピンを０．０１〜０．５国際単位／−のレ
ベルで添加し、そして次にこの混合物を室温にて約４０
分間インキニベートする。次に、支持体を吸引し、そし
て洗浄して過剰の液体及び試薬を除去する。所望により
、支持体をこの形態で貯蔵することができる。標識され
たフィブリンで被覆された支持体を被覆の直後に使用し
ない場合、その活性の維持を保証するために、適当に湿
潤な環境中で、例えば防腐剤を含有していてもよい緩衝
液と接触させて貯蔵することにより被覆を保持すべきで
ある。

液相フィブリノーゲンを供給する特徴は実用可能な基質
そしてそれ故に実用可能な測定法を得るために必須であ
る。標識されたフィブリンマトリクスを得るために受動
的に結合した標識されたフィブリノーゲンを用いる従来
技術の方法は本発明の方法によるプラスミンの測定のた
めに適当な方法をもたらさない。プラスミンの測定のた
めに適当なマ）　ＩＪクスを得るためには、液相中の標
識された又は未標識のフィブリノーゲンをスロンビンと
共に加える必要がある。本発明の方法、すなわち固相／
液相法により調製されたプレート及び固相フィブリノー
ゲンのみを供給することによって調製されたプレートに
ついて、プラスミンの種々のレベルによる標識の放出を
示す結果が提供される（第５及び６図、並びにこれらに
ついての後記の検討を参照のこと）。固相法においては
比較的高いプラスミン濃度においてさえ差が実質的に存
在しないが、固相／液相法により調製されたプレートは
プラスミンの検出のための広い有用範囲を示す。従って
、本発明の方法は一層高感度の基質マトリクスを提供す
る。さらなる実験が示すところによれば、マトリクスの
感度はある種のパラメーターを操作することによりさら
に増強することができる。標識されたフィブリンマトリ
クスを生成するのに使用されるスロンビン濃度は「固相
のみ」測定に影響を与えず、他方、「固相／液相」測定
はスロンビン濃度の増加と共に増強されたシグナルを示
す。

固相／液相支持体を用いる測定は、一般に約り７℃〜約
３７℃の範囲の穏和な温度条件下で行うことができる。

種々の試薬の濃度は、特定の手法、測定対象、注目の因
子の濃度範囲、定性的測定又は定量的測定のいずれが要
求されるか、測定時間等に依存して広範囲に異るであろ
う。すなわち、測定時間は約１分間〜２４時間、さらに
普通には約１分間〜約１時間であろう。測定感度は４時
間内にピコグラム未満のｔ−ＦＡの測定を可能にする。

使用される媒体は通常は水性媒体であり、少量の、通常
は４０容量％未満の、さらに普通には約１０容量％未満
の極性有機溶剤を含釣ることができる。溶液は一般に約
６〜９の範囲、さらに普通には約７〜８．５の範囲のｐ
Ｈで緩衝化されている。線溶を阻害しないリン酸緩衝液
、Ｔｒｉｓ緩衝液のごとき種々の緩衝液を用いることが
できる。注目の分析対象を線溶因子にカップリングしそ
して種々の量の分析対象を含むサンプルの存在下での活
性の差異を測定することにより、ハプテン性又は抗原性
の任意のタイプのリガンド、受容体、ポリヌクレオチド
等と共に本発明を用いることができる。すでに記載した
フィブリン系因子のほかに、薬物、ホルモン、酵素、リ
ンホカイン、神経伝達物質、膜蛋白質、制御蛋白質、増
殖因子等を対象とすることができる。

本発明の使用を助けるため、方法の感度を最適化するよ
うな好ましい比率で種々の試薬を含有するキットを提供
することができる。血液因子の測定のために、標識され
たフィブリンにより被覆された容器、特にマイクロタイ
タープレート、及び１又は複数の因子欠損プラスミン基
質を用いて異る因子を測定することができる。種々の試
薬を再溶解可能な凍結乾燥された試薬として提供するこ
とができ、そして緩衝剤、安定剤、不活性蛋白質、例え
ば血清アルブミン等と組合わせて提供することができる
。幾つかの用途のためには、測定のために適当な濃度で
マイクロタイターウェル中で試薬を凍結乾燥するのが望
ましい。血液因子以外の因子が関与する場合、キットは
該因子の接合体又はプラスミンの活性を変更する分子を
含めることができる。酵素標識の使用を容易にするため
、キットは他の試薬、例えば酵素基質及びそのコファク
ターを含むことができる。必要なすべての成分が逐次的
固相に存在するような流れ系に本発明の技法を適合せし
めることもできる。サンプルを固相に導入し、そして放
出された又は保持された酵素標識フィブリンマトリクス
を測定する。この様な系は遠心分析又は他の流れ系に好
結果に適合せし杓ることができる。

次に、例により本発明をさらに説明するが、これにより
本発明の範囲を限定するものではない。

朋 例１．酵素標識されたフィブリノーゲン４０ｍｇの西洋
ワサビパーオキシダーゼ及び３００ｍｇのヒトフィブリ
ノーゲンを用いてＮａｋａｅ及びＫａｗａｏｉ（Ｊ、Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　（１９７２
）　２２：１０８４）の方法に従ってフィブリノーゲン
／パーオキシダーゼ接合体を調製した。最終生成物中の
パーオキシダーゼとフィブリノーゲンのモル比は０．３
９であった。

これを未標識のフィブリノーゲンで稀釈して、０．７２
ｍｇ／＋ｎｌのフィブリノーゲン濃度、フィブリノーゲ
ンのモル当り０．１２モルのパーオキシダーゼ゛とし、
５０％グリセロール中に一２０℃にて貯蔵した。

例２．酵素標識された固相フィブリン ポリスチレンマイクロタイクープレートを、例１に記載
したパーオキシダーゼで標識されたフィブリノーゲンに
より、低イオン強度Ｔｒｉｓ緩衝液中で室温にて約１時
間受動被覆した。このプレートは４℃にて一週間貯蔵す
ることができる。プレートを吸引しそして洗浄し、そし
て次に液相のパーオキシダーゼ標識されたフィブリノー
ゲンを、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ｐ
８７．８−８．２）を含有する２０ｍｇ／ｒｄ！ゼラチ
ン（牛皮−６０ｂｌｏｏｍ）Ｔｒｉｓ緩衝液中４８／ｒ
ｄ！の濃度において添加した。

次に、同じ緩衝液中のスロンビンをｏ、０１〜０．５国
際車位／ｍｊ！のレベルで添加し、そしてこの混合物を
室温にて約４０分間インキュベートした。次に、このプ
レートを吸引しそして洗浄した。

このフィブリンマトリクスはプラスミン−生成基質混合
物のための基質としてそのまま使用することができた。

プラスミン−生成基質混合物中に放出される酵素標識さ
れたフィブリンの量を測定することができ、そして生成
したプラスミンの量を決定するために用いることができ
る。この様な定量の代表的データーを、プラスミンの標
準化された調製物の多数の稀釈物について第１図に示す
。

標準化はＣＴＡ　（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔｈｒ
ｏｍｂｒｏｌｙｔ＋ｃＡｇｅｎｔｓ）単位を用いて行っ
た。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衡液中に稀釈を行い、そして
標識されたフィブリンマトリクスを含有するマイクロタ
イタープレートのすべてのウェル中にあらかじめ分配し
ておいた５０バの緩衝液に５０７’のアリコートとして
加えた。第１図中の濃度はこの更なる２倍稀釈の濃度を
示す。

この更なる稀釈は定量のために正確に５０−’を取り出
すために必要である。放出されたバーオキシダーセーフ
イブリン分解生成物の測定は、このマイクロタイタープ
レートから５Ｑ、Ｊの溶液を新たなプレートの対応する
ウェルに移すことにより行った。

この移送の後、１５０Ｉの西洋ワサビパーオキシダーゼ
基質（１ｍＭテトラメチルベンジジン及び０．１６Ｍ　
　Ｔｒｉｓ−クエン酸緩（１液（ｐｆ１５．１５）と共
に０．０６％過酸化水素及び２０％エタノール）を、移
送された溶液に添加し、そして生ずる色の変化を分光光
度法により６５０ｎｍの波長でモニターした。第１図中
の読みのユニットは、単位時間（分）当りミリ光学濃度
ユニットとしての変化の回帰分析の結果を示す。機器は
現在入手可能なものであり、このデーターを日常的に且
つ自動に計算するものである。設点光学濃度の読みを用
いることもできる。

ム　活性化因子測定 例　に記載したようにして調製した前標識されたプレー
トから出発して、０．１〜１０．０ｍｇ／　ｍｌの範囲
の組織プラスミノーゲン活性化因子の稀釈物を加えた。

次に、プレートのすべてのウェルにプラスミノーゲンを
約０．０５〜０．１ユニツ）／ｍ１の範囲の濃度で添加
した。プラスミノーゲンの由来は、精製したプラスミノ
ーゲン又は血漿調製物中のプラスミノーゲンであった。

次に、反応混合物を室温にて種々の時間にわたりインキ
ュベートし、その後５０ｐＩを取り出し、そして放出さ
れたパーオキシダーゼ標識の量を測定した。この実験の
結果は、プラスミノーゲン調製物中に存在するプラスミ
ンの量に依存して、ストレプトキナーゼ及びウロキナー
ゼを包含するプラスミノーゲン活性化因子の直接測定を
可能にし、この測定は２０時間以上にわたって行うこと
ができる。４時間のインキュベーションの後の感度はｌ
ｐｇ／＋ｒ＋１未満である。サンプルの結果を第２図に
示す。測定中に存在する活性化因子の量についての標準
としてこの測定結果を用いることにより、ＦＡＩ−１及
びＦＡＩ−，２のごとき特定の阻害物質の存在下及び非
存在下で既知量の活性化因子を添加した後に結果を比較
することにより、存在する特定の活性化因子阻害物質の
量を決定することができる。

例４．阻害物質測定 例２において調製した前標識したプレートを用い、１７
５０〜１／１．０００の稀釈での血漿を添加し、そして
次に０．０１〜０．１ユニツト／顎のレベルでプラスミ
ンを添加した。次に、この反応混合物を室温にて３０〜
６０分間インキニベートし、そして反応混合物の５０ｐ
’のアリコート中の酵素標識の量を測定した。この実験
は線溶系の阻害物質のレベルの測定を可能にする。サン
プルの結果を第３図に示す。

例５．　イムノアッセイ フィブリノーゲンを被覆したプレートをさらに抗ｔ−Ｐ
Ａ抗体により室温にて約１時間受動被覆する。

次に、例２に記載したようにしてプレート上に標識され
たフィブリンマトリクスを生じさせる。未知量のｔ−Ｐ
八及び血漿を添加し、そして混合物をさらに１時間イン
キュベートする。次に、プレートを吸引しそして洗浄し
、その後プラスミノーゲンを添加する。インキュベーシ
ョンの後、反応混合物の５０１１１のアリコート中の放
出されたパーオキシダーゼ標識を測定した。さらに、結
合段階で精製ｔ−ＰＡを使用し、次に短い第二段階にお
いて血漿を使用することにより、この方法をｔ−ＦＡＩ
−１のごとき特定のｔ−ＰＡ阻害物質を検出するために
使用することができる。この機能的イムノアッセイ法の
代表的な結果を第４図に示す。

以上、本発明を幾分具体的に記載したが、本発明の範囲
はこれらの具体例に限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、固相／液相酵素標識フィブリノーゲンから生
成した酵素標識フィブリンの分解生成物の定量により測
定した、混合物中のプラスミンの量の測定からの代表的
データーを示すグラフである。 第２図は、プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡの直接
測定からの結果を示すグラフである。 第３図は、線溶系の阻害物質のレベルの測定からの結果
を示すグラフである。 第４図は、ｔ−ＰＡの検出についてのイムノアッセイの
結果を示すグラフである。 第５図は、固相調製されたパーオキシダーゼ標識フィブ
リンについて、種々のレベルのプラスミンによる標識の
放出を示すグラフである。 第６図は、固相／液相調製されたパーオキシダーゼ標識
フィブリンについて、種々のレベルのプラスミンによる
標識の放出を示すグラフである。 第７図は、標識されたフィブリンマトリクスを生成する
ために使用されるスロンビン濃度が固相のみ測定に影響
を与えず、他方、固相／液相測定がスロンビン濃度の増
加と共に増強されたシグナルを示すことを表わすデーク
ーのグラフである。 速度（ミリ００／’分） 速度（ミリＯＤ／分） 速ｇｒ＜ミリＯＤ／分） 速度（ミリＯＤ／分） 速度（ミリＯＤ／分） 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成１年特許願第３２２８２２号 発明の名称 線溶系測定法 補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　エルカチク。 インコーホレイティ ド ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光
虎ノ門ビル　電話５０４−０７２１６、補正の対象 （１）　　願書の「出願人の代表者」の欄（２）委任状 （３）図　面 ７、補正の内容 （１）（２１別紙の通り （３）　　　図面の浄書（内容に変更なし）８、添附書
類の目録 （１）訂正願書 （２）　　委任状及び訳文 （３）浄書図面 １通 各１通 １通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、線溶系の因子又は線溶系と相互作用する因子を含ん
   で成るサンプル中の分析対象の検出方法であって、 １）該サンプルを検出可能に標識されたフィブリン基質
   と接触せしめることにより反応混合物を形成し、ここで
   該基質は、固体支持体をフィブリノーゲンにより被覆し
   そして該被覆されたフィブリノーゲンに可溶性フィブリ
   ノーゲン及びスロンビンを加えることにより調製された
   ものであり、そして前記固体表面上に被覆された前記フ
   ィブリノーゲン又は前記可溶性フィブリノーゲンのいず
   れかが検出可能に標識されているかあるいは両者が検出
   可能に標識されており；そして ２）前記接触の後に前記反応混合物中に放出される標識
   されたフィブリン生成物を検出する；ことを特徴とする
   方法。 ２、前記の検出が、前記サンプル中の前記因子の定量的
   測定である、請求項１に記載の方法。 ３、前記検出可能に標識されたフィブリノーゲンが酵素
   により標識されたものである、請求項１に記載の方法。 ４、前記酵素標識がパーオキシダーゼである、請求項１
   に記載の方法。 ５、前記因子が線溶系の活性化因子でありそして前記反
   応混合物がプラスミノーゲンをさらに含有している、請
   求項１に記載の方法。 ６、前記因子が組織プラスミノーゲン活性化因子である
   、請求項５に記載の方法。 ７、前記サンプルが全血、血漿又は血清サンプルである
   、請求項１に記載の方法。 ８、前記因子が線溶系の阻害物質でありそして前記反応
   混合物がプラスミノーゲンをさらに含有している、請求
   項１に記載の方法。 ９、前記因子がアンチプラスミンでありそして前記反応
   混合物がプラスミノーゲンをさらに含有している、請求
   項１に記載の方法。 １０、前記因子がプラスミノーゲンである、請求項１に
   記載の方法。 １１、線溶測定において使用するための標識されたフィ
   ブリン基質の製造方法であって、検出可能に標識された
   フィブリノーゲンを固体支持体上に被覆することにより
   被覆された基質を得； 該被覆された基質を液相フィブリノーゲンと接触せしめ
   ることにより固相／液相前基質を得；そして 該前基質を血栓溶解酵素と接触せしめることにより前記
   基質を得る； ことを特徴とする方法。 １２、前記溶相フィブリノーゲンが検出可能に標識され
   ている、請求項１１に記載の方法。 １３、前記標識されたフィブリンが酵素により標識され
   たものである、請求項１１に記載の方法。 １４、検出可能に標識されたフィブリノーゲンを固体支
   持体上に被覆することにより被覆された基質を得； 該被覆された基質を液相フィブリノーゲンと接触せしめ
   ることにより固相／液相前基質を得；そして 該前基質を血栓溶解酵素と接触せしめることにより前記
   基質を得る； ことにより製造された標識されたフィブリン基質。 １５、前記液相フィブリノーゲンが検出可能に標識され
   ている、請求項１４に記載の基質。 １６、前記標識されたフィブリンが酵素により標識され
   たものである、請求項１４に記載の基質。