JPH02171656A - 標識化ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター及びそれを用いた測定方法 - Google Patents
標識化ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター及びそれを用いた測定方法Info
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- JPH02171656A JPH02171656A JP32619688A JP32619688A JPH02171656A JP H02171656 A JPH02171656 A JP H02171656A JP 32619688 A JP32619688 A JP 32619688A JP 32619688 A JP32619688 A JP 32619688A JP H02171656 A JPH02171656 A JP H02171656A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、標識化されたストレプトミセス・ズブチリシ
ン◆インヒビターに関するものであり、これを用いて試
料中のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
をΔｐ＋定することができる。
ン◆インヒビターに関するものであり、これを用いて試
料中のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
をΔｐ＋定することができる。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ストレ
プトミセスーズブチリシンΦインヒビターは１９７２年
に相定と佐原（アグリカルチュラル・ビオロジカル台ケ
ミストリー（Ａｇｒｅｅ。
プトミセスーズブチリシンΦインヒビターは１９７２年
に相定と佐原（アグリカルチュラル・ビオロジカル台ケ
ミストリー（Ａｇｒｅｅ。
Ｂ ｉ ｏ １．Ｃｈｅｍ、）３６巻、１６０頁）によ
りストレプトミセス アルボグリセオラス（Ｓｔ ｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）の培養上清に見出だされ
たタンパク質であり、微生物起源のセリン・プロテアー
ゼであるズブチリシンと、分子量たり１：１で結合し、
そのプロテアーゼ活性を強く阻害する。ストレプトミセ
ス・ズブチリシン・インヒビターはアミノ酸１１３個か
らなる分子量１１．５００のタンパク質であるが、溶液
中では安定な２ｆｆ１体として分子！２３，０００で存
在する。
りストレプトミセス アルボグリセオラス（Ｓｔ ｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）の培養上清に見出だされ
たタンパク質であり、微生物起源のセリン・プロテアー
ゼであるズブチリシンと、分子量たり１：１で結合し、
そのプロテアーゼ活性を強く阻害する。ストレプトミセ
ス・ズブチリシン・インヒビターはアミノ酸１１３個か
らなる分子量１１．５００のタンパク質であるが、溶液
中では安定な２ｆｆ１体として分子！２３，０００で存
在する。
ストレプトミセス属からは、当該ズブチリシン・インヒ
ビターに構造上類似しているが、酵素に対する阻害特異
性の異なるプロテアーゼ・インヒビターが見出だされて
おり、プラスミノストレブチン、ＡＰＩ（アルカリプロ
テアーゼ・インヒビター）、ＳＡＣ，（ストレプトミセ
ス・アンチコアギュラント）アルカリプロテアーゼなど
を例示できる。ストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビター及び関連の微生物起源のプロテアーゼ・インヒ
ビターについてはケイ、ヒロミ （Ｋ 。
ビターに構造上類似しているが、酵素に対する阻害特異
性の異なるプロテアーゼ・インヒビターが見出だされて
おり、プラスミノストレブチン、ＡＰＩ（アルカリプロ
テアーゼ・インヒビター）、ＳＡＣ，（ストレプトミセ
ス・アンチコアギュラント）アルカリプロテアーゼなど
を例示できる。ストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビター及び関連の微生物起源のプロテアーゼ・インヒ
ビターについてはケイ、ヒロミ （Ｋ 。
Ｈｉｒｏｍｉ）ら編ニブロチイン・ブロテイナーゼ・イ
ンヒビター ザ ケイス オブ ストレプトミセス ズ
ブチリシン・インヒビター（ＳＳＩ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＳＳ
Ｉ））エルセピア社（アムステルダム・オランダ）（１
９８５年）に詳細に記述されている。
ンヒビター ザ ケイス オブ ストレプトミセス ズ
ブチリシン・インヒビター（ＳＳＩ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＳＳ
Ｉ））エルセピア社（アムステルダム・オランダ）（１
９８５年）に詳細に記述されている。
従来ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターの
測定方法は既知量のズブチリシンをズブチリシン・イン
ヒビターを含有する試料に加え、残存するズブチリシン
のプロテアーゼ活性を測定して失われたプロテアーゼ活
性から試料中に存在する当該ズブチリシン・インヒビタ
ーを定ユすることにより通常行われている。ズブチリシ
ンの酵素活性はカゼイン、ｐ−二トロフェニルアセテト
、Ｎ−アセチルチロシンエチルエステルなどを用いて／
ｌ１ｌｊ定される。このとき用いられるズブチリシン濃
度は１×１０−〜３Ｘ１０ ’−ｍｇ／ｍ１（０，３
〜１．１μＭ）であり、従って計ｊ定できるストレプト
ミセス ヒビターの濃度域も同オーダーである。すなわち、この
濃度以下のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビ
ターを一ＩＩ＋定する場合には濃縮操作が必要である。
測定方法は既知量のズブチリシンをズブチリシン・イン
ヒビターを含有する試料に加え、残存するズブチリシン
のプロテアーゼ活性を測定して失われたプロテアーゼ活
性から試料中に存在する当該ズブチリシン・インヒビタ
ーを定ユすることにより通常行われている。ズブチリシ
ンの酵素活性はカゼイン、ｐ−二トロフェニルアセテト
、Ｎ−アセチルチロシンエチルエステルなどを用いて／
ｌ１ｌｊ定される。このとき用いられるズブチリシン濃
度は１×１０−〜３Ｘ１０ ’−ｍｇ／ｍ１（０，３
〜１．１μＭ）であり、従って計ｊ定できるストレプト
ミセス ヒビターの濃度域も同オーダーである。すなわち、この
濃度以下のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビ
ターを一ＩＩ＋定する場合には濃縮操作が必要である。
さらに、ズブチリシンはｐＨ７〜１。
のアルカリ性ｐＨ域で活性を示すため測定に洪せられる
試料液のｐ Ｈは、このアルカリ性域に設定される必要
がある。
試料液のｐ Ｈは、このアルカリ性域に設定される必要
がある。
本発明では、標識化されたストレプトミセス・ズブチリ
シン・インヒビターを提供し、免疫ＡＦＩＪ定に利用す
ることを［１的とするものである。
シン・インヒビターを提供し、免疫ＡＦＩＪ定に利用す
ることを［１的とするものである。
〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明者らは、
ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターに関し
、上記課題について鋭意検討した結果本発明に到達した
。すなイ〕ち、本発明は、標識剤で標識されたストレプ
トミセス・ズブチリシン・インヒビターおよびそれを用
いることを特徴とする試料ｒｌコのストレプトミセス・
ズブチリシン・インヒビターの測定方法である。
ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターに関し
、上記課題について鋭意検討した結果本発明に到達した
。すなイ〕ち、本発明は、標識剤で標識されたストレプ
トミセス・ズブチリシン・インヒビターおよびそれを用
いることを特徴とする試料ｒｌコのストレプトミセス・
ズブチリシン・インヒビターの測定方法である。
本発明の標識剤で標識されたストレプトミセス・ズブチ
リシン・インヒビターの作製方法とその検出方法はなん
ら限定されるものではなく、公知の方法により標識化及
び検出することができる。
リシン・インヒビターの作製方法とその検出方法はなん
ら限定されるものではなく、公知の方法により標識化及
び検出することができる。
標識としては、直接的に検出されるものとしては、例え
ば、放射性物質，螢光物質などがあげられ、間接的に検
出されるものとしては、例えば酵素などがあげられる。
ば、放射性物質，螢光物質などがあげられ、間接的に検
出されるものとしては、例えば酵素などがあげられる。
酵素として具体的には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ
、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどがあげられ、
放射性物質としては、 Ｈ 、 Ｉ又は
Ｉ等が、螢光物質としては、例えばフルオレスカミン、
フルオレラセンイソチオシアネート．テトラローダミン
イソチオシアネ−１・等があげられ、常法によりストレ
プトミセスφズブチリシン・インヒビターに結合される
。１票識剤が酵素である場合には、その活性を測定する
ために基質が用いられる。例えば、パーオキシダーゼの
基質としては、２．２′−アジノジ−［３〜エチルベン
ズチアゾリンスルホン酸］−２−アンモニウム塩−Ｈ
０ ５−アモノサリチル酸−ＨＯ ｏ−フェニレ
ンジ２ ２ゝ アミン−Ｈ２Ｏ２等が、βーＤーガラクトシダーゼの基
質としては、０−ニトロフェニル−βーＤガラクトピラ
ノシド等が、アルカリホスファターゼの基質としては、
ｐ−ニトロフェニル・ホスフェ−１・等が用いられる。
ラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ
、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどがあげられ、
放射性物質としては、 Ｈ 、 Ｉ又は
Ｉ等が、螢光物質としては、例えばフルオレスカミン、
フルオレラセンイソチオシアネート．テトラローダミン
イソチオシアネ−１・等があげられ、常法によりストレ
プトミセスφズブチリシン・インヒビターに結合される
。１票識剤が酵素である場合には、その活性を測定する
ために基質が用いられる。例えば、パーオキシダーゼの
基質としては、２．２′−アジノジ−［３〜エチルベン
ズチアゾリンスルホン酸］−２−アンモニウム塩−Ｈ
０ ５−アモノサリチル酸−ＨＯ ｏ−フェニレ
ンジ２ ２ゝ アミン−Ｈ２Ｏ２等が、βーＤーガラクトシダーゼの基
質としては、０−ニトロフェニル−βーＤガラクトピラ
ノシド等が、アルカリホスファターゼの基質としては、
ｐ−ニトロフェニル・ホスフェ−１・等が用いられる。
例えば、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビタ
ーのヨード１２５漂識化について述べれば、その方法、
その検出方法は何ら限定されるものではなく、公知の方
法により標識化及び測定することができる。標識方法と
しては直接法として、クロラミンＴ／Ｊ：． イオジ
ンモノクロライド法．電解法，酵素法（ラクトペルオキ
シダーゼ法）、ヨードジエン法があり、間接法として、
ポルトン−ハンター法があるが、その他の方法であって
も良い。また、検出方法については、通常のガンマシン
チレーションカウンターを用いれば良い。
ーのヨード１２５漂識化について述べれば、その方法、
その検出方法は何ら限定されるものではなく、公知の方
法により標識化及び測定することができる。標識方法と
しては直接法として、クロラミンＴ／Ｊ：． イオジ
ンモノクロライド法．電解法，酵素法（ラクトペルオキ
シダーゼ法）、ヨードジエン法があり、間接法として、
ポルトン−ハンター法があるが、その他の方法であって
も良い。また、検出方法については、通常のガンマシン
チレーションカウンターを用いれば良い。
測定に使用される試薬は、上記物質以外にも溶解剤、緩
衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の試薬が用いられる
。
衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の試薬が用いられる
。
以上述べたような標識化ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビターを用いて、例えば競合法により試料中
のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを測
定することができる。
ン・インヒビターを用いて、例えば競合法により試料中
のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを測
定することができる。
本発明における、標識化ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビターは免疫測定法に利用でき、試料中のス
トレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターは特に０
．１〜３２０ｎｇ／ｍｌという低濃度の範囲でも高感度
に測定可能であった。また本発明の標識化ストレプトミ
セス・ズブチリシン・インヒビターを用いた免疫測定法
は、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターに
特異的な測定方法であり、ズブチリシンの活性阻害を用
いる従来法に比べて、極めて簡便であり、短時間に多数
の検体の測定が可能となった。
ン・インヒビターは免疫測定法に利用でき、試料中のス
トレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターは特に０
．１〜３２０ｎｇ／ｍｌという低濃度の範囲でも高感度
に測定可能であった。また本発明の標識化ストレプトミ
セス・ズブチリシン・インヒビターを用いた免疫測定法
は、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターに
特異的な測定方法であり、ズブチリシンの活性阻害を用
いる従来法に比べて、極めて簡便であり、短時間に多数
の検体の測定が可能となった。
以下、実施例により本発明を詳述する。しかし本発明は
これら実施例のみに限定されるものではない。
これら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
（１）不溶化抗体の調製
未処理９６ウエルマイクロタイターブレー１・（ダイナ
チック社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸すトリウム緩衝
液（ｐＨ９，Ｇ）に溶解した １μｇ／１１１１のマウ
スの抗ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
・モノクローナル抗体（昭和６３年１２月２６Ｌ］付特
許出願「モノクローナル抗体、その製法及びそれを用い
た測定法」 （東ソー株式会社）の実施例１に記載の方
法で作製したもの）の溶液２５０μｍを加えて、４°Ｃ
で一夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液を除
去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含
有０．０１ Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０以下Ｐｕｓと
記す）に０．０４％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）を含有
させた溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔと記す）で３回洗浄した
後、１％Ｉ）ＳＡ （ウシ血清アルブミン）を含有する
ＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｍを加えて、４℃でブロッキン
グ処理し、そのまま４℃にて保存した。
チック社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸すトリウム緩衝
液（ｐＨ９，Ｇ）に溶解した １μｇ／１１１１のマウ
スの抗ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
・モノクローナル抗体（昭和６３年１２月２６Ｌ］付特
許出願「モノクローナル抗体、その製法及びそれを用い
た測定法」 （東ソー株式会社）の実施例１に記載の方
法で作製したもの）の溶液２５０μｍを加えて、４°Ｃ
で一夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液を除
去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含
有０．０１ Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０以下Ｐｕｓと
記す）に０．０４％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）を含有
させた溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔと記す）で３回洗浄した
後、１％Ｉ）ＳＡ （ウシ血清アルブミン）を含有する
ＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｍを加えて、４℃でブロッキン
グ処理し、そのまま４℃にて保存した。
（２）ヨード１２５漂識ストレプトミセスチリシン・イ
ンヒビターの調製 （ヨウ素化） Ｎａ１２５Ｉ溶液１００ ｕ Ｃｌ（１μＩアマジャム
製１ＭＳ３０）をポリスチレン製チューブに入れた。
ンヒビターの調製 （ヨウ素化） Ｎａ１２５Ｉ溶液１００ ｕ Ｃｌ（１μＩアマジャム
製１ＭＳ３０）をポリスチレン製チューブに入れた。
０ 、 ２ ５ Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．５）を１
０μｍ加え次に、攪拌しながら０．０５Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７、５に溶解したＩＯｍｇ／＋ｎｌのストレプトミ
セス・ズブチリシン・インヒビター１０μ＋ 、０．０
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５に溶解した５ｍｇ／ｍｌ
のクロラミンＴ（和光純薬製）１０／Ｚｌを加え、４０
秒間放置した。０．０５Ｍリン酸緩衝緩衝ｋｐＨ ７．
５に溶解した１．２ｍｇ／ｍｌメタエ亜硫酸ナトリウム
１００μｍを加え、４０秒間放置後、２％牛血清を含有
した０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５に溶解した２
、０Ｂ／ｍｌのヨウ化ナトリウムを３６９μｍ加えた。
０μｍ加え次に、攪拌しながら０．０５Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７、５に溶解したＩＯｍｇ／＋ｎｌのストレプトミ
セス・ズブチリシン・インヒビター１０μ＋ 、０．０
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５に溶解した５ｍｇ／ｍｌ
のクロラミンＴ（和光純薬製）１０／Ｚｌを加え、４０
秒間放置した。０．０５Ｍリン酸緩衝緩衝ｋｐＨ ７．
５に溶解した１．２ｍｇ／ｍｌメタエ亜硫酸ナトリウム
１００μｍを加え、４０秒間放置後、２％牛血清を含有
した０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．５に溶解した２
、０Ｂ／ｍｌのヨウ化ナトリウムを３６９μｍ加えた。
（分離精製）
予め０．０５Ｍリン酸緩衝緩衝＆ｐＨ ７．５で平衡化
したセファデックスＧ２５を用いたカラム（ＮＡＰ−５
。
したセファデックスＧ２５を用いたカラム（ＮＡＰ−５
。
ファルマシア製）にヨウ素化反応混合液を移し、０、０
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７、５で溶出し、遊離のヨウ素を
除いてヨード１２５標識ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビターを得た。放射活性は１９、９μＣ ｉ
／ ｍ ｌであった。
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７、５で溶出し、遊離のヨウ素を
除いてヨード１２５標識ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビターを得た。放射活性は１９、９μＣ ｉ
／ ｍ ｌであった。
（３）放射免疫測定法による試料中のストレプトミセス
・ズブチリシン−インヒビターの定量 本実施例中の（１）で作製したモノクローナル抗体を固
定化したマイクロタイタープレー１・を室’ＩＭに戻し
、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、（２）で調製した
ヨード１２５標識ストレプトミセス・ズブチリシン・イ
ンヒビターを１５０００ｃｐｍ／１０μｌになるように
ＰＢＳで希釈して、各ウェルにｌＯｌｚｌずつ加えた。
・ズブチリシン−インヒビターの定量 本実施例中の（１）で作製したモノクローナル抗体を固
定化したマイクロタイタープレー１・を室’ＩＭに戻し
、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、（２）で調製した
ヨード１２５標識ストレプトミセス・ズブチリシン・イ
ンヒビターを１５０００ｃｐｍ／１０μｌになるように
ＰＢＳで希釈して、各ウェルにｌＯｌｚｌずつ加えた。
その後、直ちに精製したストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビター０、１〜３２０Ｂ／ｍｌを溶解したＰ
ＢＳを標準物質として各ウェルに５０μｌずつ加え、室
温で１８時間放置した。その後、溶液を除去してから、
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、各ウェルを取り外
してチューブに移し、これをガンマシンチレーションカ
ウンター（アロカ社製）で計測し、１分間当たりのカウ
ント数（ｃｐＩＷ）を出した。標準物質の濃度及びｅｐ
Ｈをプロットして表１のような結果を得て検量線を作成
した。
ン・インヒビター０、１〜３２０Ｂ／ｍｌを溶解したＰ
ＢＳを標準物質として各ウェルに５０μｌずつ加え、室
温で１８時間放置した。その後、溶液を除去してから、
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、各ウェルを取り外
してチューブに移し、これをガンマシンチレーションカ
ウンター（アロカ社製）で計測し、１分間当たりのカウ
ント数（ｃｐＩＷ）を出した。標準物質の濃度及びｅｐ
Ｈをプロットして表１のような結果を得て検量線を作成
した。
表１
Claims (2)
- （１）標識剤で標識されたストレプトミセス・ズブチリ
シン・インヒビター。 - （２）請求項（１）記載の標識化ストレプトミセス・ズ
ブチリシン・インヒビターを用いることを特徴とする試
料中のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32619688A JPH02171656A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 標識化ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター及びそれを用いた測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32619688A JPH02171656A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 標識化ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター及びそれを用いた測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02171656A true JPH02171656A (ja) | 1990-07-03 |
Family
ID=18185090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32619688A Pending JPH02171656A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 標識化ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター及びそれを用いた測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02171656A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5464741A (en) * | 1993-10-08 | 1995-11-07 | Henwell, Inc. | Palladium (II) octaethylporphine alpha-isothiocyanate as a phosphorescent label for immunoassays |
-
1988
- 1988-12-26 JP JP32619688A patent/JPH02171656A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5464741A (en) * | 1993-10-08 | 1995-11-07 | Henwell, Inc. | Palladium (II) octaethylporphine alpha-isothiocyanate as a phosphorescent label for immunoassays |
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