JPS61228353A - アミンの免疫学的濃度決定法、モノクロナル抗体およびこの方法を実施するための試薬セツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は生物的媒質中に存在するアミンの免疫学的濃度
決定法、該アミンとキノンとの反応の結果得られる生成
物に特異的なモノクロナル抗体に関する。また、これら
抗体を分泌するノ＼イブリドーマおよび上記濃度決定法
を実施するのに必要な反応試薬を収納した試薬セットに
も関する。

従来の技術 ヒスタミンの濃度決定は急速かつ極めて敏感であること
から重要なテスト法の一つである。種々のヒスタミンの
濃度決定法が実際に利用されているが、高価な装置を所
有する研究室内でのみ実施できるにすぎない。

臨床的に最も一般的に利用されている方法は、調査すべ
き血清からブタノールによる抽出、次いでヘプタン含有
塩酸水性溶液による処理を含む螢光法による濃度決定法
であり、塩酸相に取込まれたヒスタミンはＯ−フタルア
ルデヒドにより、アルカリ媒質中で縮合されて螢光性物
質を形成する。

測定すべき螢光は、該媒質中に存在するヒスタミンの量
に比例する。この方法は長期間を要し、かつ微妙な技術
を必要とし、これは自動化しても同様である。

同様に実施されている同位体酵素測定法は特異性に係る
問題を有しており、例えばクロロプロマシンおよびセロ
トニンはヒスタミン−Ｎ−メチル−トランスフェラーゼ
の酵素活性を阻害する。

利用されている他の方法はマススペクトル法と組合せた
ガスクロマトグラフィーであり、これは複雑かつ著しく
高価な装置の使用を必要とする。

そこで、免疫学的方法よってヒスタミンの濃度決定を可
能とし、上記諸欠点を排除することは極めて大きな意義
がある。事実このような方法は特異的であり、またヒス
タミンを化学的に抽出する必要もなく、しかも高感度で
ある。これは、酵素、放射性同位体、螢光色素などの極
めて歩積の濃度決定をも可能とする物質によって、抗体
を標識したことによるものである。

不幸にも、ヒスタミンに特異的な抗体を得ることは著し
く困難であり、エッチ、ミタ等（Ｈ，Ｍｉｔａｅｔ　ａ
ｌ、）はヒスタミンに対する抗体を得ることは不可能で
あることを示しており、また兎におけるヒスタミン／牛
血清アルブミン複合体に対する抗体を得ることは困難で
あることを示した〔エージエンツ＆アクションズ（Ａｇ
ｅｎｔｓ　ａｎｄ　八ｃｔｉｏｎｓ）、　　１９８４゜
１４、　５７４−５７９　１　。

発明が解決しようとする問題点 ところで、ヒスタミンが低分子量化合物、キノンと結合
することが見出され、該付加化合物に特異的な抗体を得
ることができ、これがヒスタミンの免疫学的濃度決定法
に使用できることが見出された。

更に、ヒスタミンに関する場合、当業者には明らかであ
ろうが、抗体を得る方法並びにその実施が、生物学的媒
体中に存在し、ヒスタミンに付加できる他のアミン即ち
第１または第２アミンに対しても応用できる。

これらの中で、ドーパミンまたはノルエピネフリンなど
の神経伝達物質、グリシンまたはグルタメートなどのア
ミノ酸、アンセファリン、物質Ｐまたはニューロテンシ
ンなどの低分子量ペプチドなどを例示できる。

そこで、本発明の目的は、上記のようなアミン、これら
とキノンとの反応生成物に特異的なモノクロナル抗体の
濃度決定法、これら抗体を分泌するバイブリド−７、お
よび上記方法を実施するだめの試薬セットを提供するこ
とにある。

問題点を解決するための手段 本発明の目的とする、生成物媒質中に含まれるアミンの
免疫学的濃度決定法は、以下の工程を含むことを特徴と
する。

ａ）　検査すべきサンプル中に存在するアミンをキノン
と反応させる工程； ｂ）　次いで形成されたアミン−キノン反応生成物を特
異的に認識するモノクロナル抗体を該媒質中に導入する
工程；および Ｃ）　存在するモノクロナル抗体の種々の形態の１つを
定量する工程。

適当なキノンとしては、ナフトキノン、ピレンキノン、
ペリレンキノン、ジフェノキノンおよびベンゾキノンを
挙げることかできる。α、β−エチレン系ケトンとして
１，４−付加生成物を形成し得るｐ−ベンゾキノンが最
も好ましいものである。

アミン−キノン反応生成物に特異的なモノクロナル抗体
なる用語は、アミンのみあるいはキノンのみを錯化する
ことなく、これらの反応生成物を遊離状態あるいは固定
化形状で錯化する抗体を意味するものとする。これは以
下に述べるような遊離または固定化した状態にあり、こ
の抗体は不動化キノンの場合には該キノンを不溶性担体
上に結合するのに使用される物質上に固定されるわけで
はなく、また以下に述べるように該担体上に固定される
わけでもない。

別々の構成の各成分を認識するものではなく、該成分と
してのキノンとアミンとの反応生成物を認識するモノク
ロナル抗体が得られるということはまったく驚くべきで
ある。

これらモノクロナル抗体はハイブリドーマから分泌され
、このハイブリドーマはケーラーおよびミルシュタイン
（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅ’ｔ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）により初
めて提案された公知の方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）。

１９７５、２５６．４９５−９７参照〕に従って調製で
きる。

ネズミのミエローマ細胞と融合する細胞を得るためには
、対象となるキノンと蛋白とを反応させ、次いでかくし
て得られた感作蛋白に第１アミンを作用させて得られる
、被検複合体（蛋白／アミン）を二十日ネズミに注入す
る。キノンを介して蛋白に別の高分子屯化合物を結合さ
せることは、ニス。

アフ′ラメアス＆ティー、チルニック（Ｓ、ＡＶＲＡＭ
［ＥＡＳｅｔ　’Ｉ’、　ＴＥＲＮＹＮＣＫ）による種
々の論文、特に″イムノケミストリー（１ｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）”、　　１９７７、　１４゜７６７
に記載されており、この方法は本発明においても応用で
きる。

複合免疫原を調製するのに使用する蛋白は、例えば牛血
清アルブミン、オボアルブミン、グルコースオキシダー
ゼ、リボヌクレーアーゼなどの酵素あるいはへ目鰻のヘ
モシアニンなどであり？尋る。

ネズミのミエローマ細胞、例えば５Ｐ−２１０またはＡ
ｇ　８　ｘ６３−６５３、と免疫された二十日ネズミの
牌か細胞とを融合することによって寿られるハイブリド
ーマはクローニングおよびサブクローニング（ｓｏｕｓ
−ｃｌｏｎａｇｅ）によって選択され、これは例えば前
に示した式Ｉまたは■の型の１．４−付加化合物に対し
て高い親和性を有し、かつ遊離アミン、遊離または固定
化キノン、並びにキノンを不溶性担体に結合するのに使
用されたポリアミンに対しては無視できる親和性を有す
るモノクロナル抗体を分泌するハイブリドーマ系列を単
離することにより行われる。

培養上澄の免疫活性は酵素−免疫法によって直接調節さ
れる。結局、各上澄の試験はヒスタミン−キノン、ポリ
アミンおよびヒスチジン−キノン−ポリアミンの複合偉
人々につき同時に行われる。

これら２種の複合体に結合する抗体の存在は酵素によっ
て標識された二十日ネズミの抗−１ｎＧ抗体によって回
収できる。第１複合体と独特の結合をする抗体を分泌す
るハイブリドーマはそれ自体保存できる。これら抗体の
明らかな特異性は、次いで阻害剤としてキノン、ヒスタ
ミン−キノン化合物、ヒスチジン−キノン化合物、グリ
シン−キノン化合物、ポリアミン、ヒスチジン、ヒスタ
ミン、ビスタミンーキノンーポリアミン複合体、ヒスチ
ジン−キノン−ポリアミン複合体およびグリシン−キノ
ン−ポリアミン複合体を用いることによる阻害法によっ
て分析される。選択されたハイブリドーマは化合物、ビ
スタミンーキノンを選択的に認識する抗体を分泌する。

ビスタミンーキノン化合物（またはヒスチジンまたはグ
リシン）とは、ヒスタミン（またはヒスチジンまたはグ
リシン）をキノンと反応させて得られる化合物と理解す
べきである。またヒスタミン−キノン−ポリアミン複合
体とは、キノンとポリアミンとを反応させ、次いでこの
反応生成物をヒスタミンと反応させて得られる反応生成
物である。

ヒスタミン以外のアミンに対するモノクロナル抗体を研
究する場合、ヒスチジンまたはグリシン以外のアミンを
選択する際に、注目するアミンと類似の構造のものを使
用することができる。これらハイブリドーマは上記定義
したようなアフィニティー特性を有するモノクロナル抗
体を分泌する。

これらモノクロナル抗体も本発明の目的の１つとなる。

調製されたハイブリドーマのサンプルは１９８５年２月
４日付で寄託番号第１４２１号として、アンスチチュパ
ストウール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　　Ｐａ５ｔｅｕｒ）、
におけるコレクション　ナショナールドゥ　クルチュー
ル　ドウ　ミクロオーガニズム（Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　：［：ＮＣＭ　）に
寄託されている。

本発明によれば、上記工程の（ａ）と（ｂ）との間にお
いて、特にキノンに残されている反応性官能基の保護を
行う。この保護はキノンとアミンとの反応の結果得られ
る化合物を過剰の第１アミン、例えばグリシン、リジン
、エタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメ
タン、いわゆるトリス（ＴＲＩＳ）または同様のものと
反応させることにより実施される。

本発明による方法の第１の実施態様によれば、工程ａ）
においては、キノンを、アミノ基を有するポリマーを介
して不溶性担体上に固定化された状態にする。また第３
工程（Ｃ）においては、アミン−キノン反応生成物に錯
化された状態にあるモノクロナル抗体の濃度決定を行う
。

固定化されたキノンとは、不溶性固定化担体、例えば微
量滴定用極板；チューブ壁；ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリビニルクロリド、ポリアクリルとアミド等の
ビレットあるいはポリアクリルアミドゲル、アガロース
またはポリアクリルアミド／アガロースゲルなどの上に
予め固定した、蛋白質、ポリペプチド、ポリエチレンイ
ミンなどのポリアミンと反応させたキノンであると理解
すべきである。ｐ−ベンゾキノンの場合、反応式は以下
の通りである。

−ＮＨ ここで、Ｚは担体上に固定され、単一のアミノ基のみを
有している第１ポリアミンを示す。

定量すべきアミンがキノンと反応した場合、ｌ。

４−付加生成物を得る。遊離ｐ−ベンゾキノンおよびＲ
−Ｎ　Ｈ２で示される第１アミンの場合、反応式は以下
のようになる。

ＮＨ ＲＮＨ２が固定されたｐ−ベンゾキノンと反応する場合
には、付加生成物は以下の式で示される。

ＨＲ −ＮＨ 本発明の方法の上記第１の態様においては、工程（Ｃ）
において極めて敏感な技術として、複合体形状にあるモ
ノクロナル抗体を、これに対するかつ定量し得る要素で
標識された抗体と反応させ、該反応の後膣モノクロナル
抗体に固定された標識抗体の世を決定する工程を含む。

抗体の公知の標識物質としては、放射性元素、螢光物質
、酵素、赤血球などを例示することができる。好ましく
は酵素、例えばガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼな
どを使用する。この方法は直接免疫測定法と呼ぶことが
できる。

本発明の方法の第２の実施態様によれば、工程（ａ）に
おいては遊離キノンを使用し、工程（Ｃ）では遊離型モ
ノクロナル抗体を定量する。

この場合、特に工程（Ｃ）は以下のような異る２つの方
法で実施できる。

（１）　第１の方法として、この工程（Ｃ）では、注目
するアミンとキノンとの反応生成物としてのアミノ基を
有するポリマーを介して不溶性担体上に固定された化合
物の既知量を媒質中に導入し、またモノクロナル抗体に
対する、定量し得る要素で標識した抗体を導入し、反応
後、キノン−アミン反応生成物を有する上記担体に固定
された標識抗体の量を決定する。

（ｉｉ　）　　第２の変法として、該工程（Ｃ）では、
好ましくは、担体上に固定されたモノクロナル抗体を使
用し、酵素−アミン複合体を媒質中に添加し、例えば担
体上のあるいは液相の酵素活性を測定する。この場合、
酵素としてパーオキシダーゼを使用することが好ましい
。

本発明の方法によって定量されるサンプル、アミンは組
織および生物的液体によって調製でき、これらはそれ自
体公知の方法で、必要ならば１０ｐｇ　／ｍｌ〜２０ｎ
ｇ／ｍｌの範囲内のアミン濃度となるように稀釈される
。この濃度は反応溶媒のｐＨ，存在する免疫性試薬のア
フィニティー、担体上に固定されたキノンの量、指示の
ために使用された抗体用標識物質の性質によって変化す
る。

しかしながら、第２の変法に従って工程（Ｃ）を実施す
ることは、アミン−酵素複合体を使用し、アミン−酵素
結合が酵素活性を保持している場合には、特に簡単かつ
再現性のよい方法でヒスタミンを定量できる。尚、この
場合、ヒスタミンは生理的媒質（例えば全血）中で錯体
として存在する。

実施例 以下、本発明を実施例によって記載する。

■）　免疫原の調製 リン酸塩バッフｙ　　（０，１Ｍ　；ｐｔｌ＝６．０）
　２ｍｌ中に１０ｍｇの牛血清アルブミンを溶解し、こ
れに０．６ｍｌのエタノールに３０ｍｇのｐ−ベンゾキ
ノンを溶解した溶液を添加する。周囲温度下で１時間攪
拌した後、アクリル酸コポリマーを主成分とする、アイ
ビーエフ−７アームインダストリー（Ｉ　ＢＦ−Ｐｈａ
ｒｍｉｎｄｕｓｔｒｉｅ）　によって市販されているト
リスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）　　Ｇ　ＦＯ５カ
ラムによりクロマトグラフィーにかけた。このカラムは
、予め０．１５ＭのＮａＣ１の水性溶液で平衡化された
ゲル約５０ｍ１を含有するものである。同一のＮａＣｌ
溶液で溶出して、カラムの死体積に相当する体積までの
塔頂画分を回収する。この両分に１Ｍの炭酸水素す）　
ＩＪウム水性溶液の十分な量を添加して、炭酸水素す）
　ＩＪウムの最終濃度が０．ＩＭとなるようにし、次い
でこれに１０ｍｇのヒスタミンを添加する。１８０℃に
て２４時間放置した後、この溶液を、０゜ＯＩＭのリン
酸カルシウムによりｐＨ７，４に調整した０、１５Ｍの
ＮａＣ１溶液で平衡化したトリスアクリルＧｆ０５約５
０ｍ１を充填したカラムでクロマトグラフィーにかけ、
溶出は上記と同一の溶液で行った。かくして得られる免
疫原は、アルブミン１分子当たり平均２．６分子のヒス
タミンを含んでいた。

２）　二十日ネズミの免疫化 覚醒注入を含めて４回の注射を行った。１４日間隔での
初めの２回の注射では皮下投与により７０インドの完全
アジュバント２００μβ中に抗原１００μｇを分散させ
た液という割合で動物に免疫原を投与し、後の２度の注
射は同日であって第２の注射後４日目に静脈内投与によ
り生理面ｉ’ｉ！ｆ　２００μβ中に抗原５０μｇ分散
させた液という比率で投与した。

動物の殺りくおよび肺臓細胞の単離は最後の注射後３日
目に行った。

３）　融合 採用した５Ｐ２１０ハイブリドーマ細胞との融合はメル
ク社（Ｓｏｃｉｅｔ≦ＭＥＲＣＫ）　　により市販され
ているポリエチレングリコールの存在下で行った。

４）　ハイブリドーマの選択 クローンおよびサブクローンの培養を、１０％の馬血清
を補充したＲＰＭ１１６４０培地上で行った。

この培地の古典的な組成はイン　ビトロ（）ｎｖｉｔｒ
ｏ）。

１９７４、９．６に記載されている。目的とするクロー
ンはいわゆるＥＬＩＳＡ法〔酵素標識免疫吸着アッセイ
（Ｂｘｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ　ａｓｓａｙ）　　］、即ち免疫吸着剤に固定し
た酵素を用いるアッセイによって培養ウェルの上澄の内
容物を選択した。

５）　選択 上記上澄の分析法を用いて、−次培養物から、遊離ヒス
タミンに対するアフィニティーよりも著しく高い、複合
体ヒスタミン／ｐ−ベンゾキノン／アルブミンに対する
アフィニティーを有する２種のクローンを単離した。

参照番号Ｄ２２−１２　（ＣＮ　ＣＭに第１−４２１号
として寄託されている）を付与したクローンに対しては
、分泌されたモノクロナル抗体の相対的アフィニティー
は以下の第１表の通りである。

第１表 実施例２：“直接”型ヒスタミンの定量■）　固定化ｐ
−ベンゾキノンの調製 濃度１０μｇ　／ｍｌで牛血清アルブミンを、０．０２
％（Ｗ／Ｖ）です）　ＩＪウム窒化物を含有するリン酸
塩バッファー（ＰＢＳ）に溶解した溶液１００μｌを、
ポリスチレン件の滴定用マイクロプレートの各ウェルに
導入する。該マイクロプレートを覆い二次いで６０℃に
て２時間インキュベーションし、かつ４℃にて少なくと
も一夜インキユベートした。

液をウェルから取り出し、次いでリン酸ナトリウム溶液
（０，ＬＭ　；ｐＨ＝４．５）で洗浄した。

次いで、かくして処理したウェルの各々に、３ｍｇ／ｍ
ｌの濃度でｐ−ベンゾキノンを１０％（Ｖ／Ｖ）のエタ
ノールとリン酸カリウム溶液（０，１Ｍ；ｐＨ＝４．５
）の混合液中に溶解した溶液１００μｌを導入する。マ
イクロプレートに覆いを被せ、暗所にて４℃で１時間放
置した。液をデカンテーションし、ウェルをリン酸塩バ
ッファー（０，１Ｍ　；ｐＨ＝４．５）で洗浄して過剰
のベンゾキノンを除いた。

２）　定量すべきヒスタミンの固定 被検またはコントロールサンプルを炭酸水素ナトリウム
バッファー（０，１Ｍ）で稀釈して、ｐＨを８．５とし
、かつヒスタミンの濃度が０．１〜２０ｍｇ／ｍｌとな
るようにした。

次いで、この稀釈液１００μβを、前に得たマイクロプ
レートのウェル内に導入し、３７℃にて４時間保ち、マ
イクロプレートをカバーで覆った。次いでウェルから液
を除き、これらをＴＢＳと称する溶液で洗浄した。この
ＴＢＳは水性溶液、トリス（０，０１Ｍ　；　ｐＨ＝７
．４）およびＮａＣｌ　（０，１，５Ｍ　）からなり、
そこに古典的な界面活性剤ツイーン（ＴＷＥ　Ｅ　Ｎ　
）　２０を０．１％の割合で添加したものである。

３）　錯化 モノクロナル抗体を大量に得るために、公知の方法を採
用した。この方法は好ましくは実施例１で単離されたハ
イブリドーマにより分泌されたモノクロナル抗体を腹腔
的投与によって注入した二十日ネズミ体内に腹水を形成
し、該腹水液を単離することからなる。これらの抗体は
１％の牛血清アルブミンおよび０．１％のツイーン２０
を含むＴＢＳ中で稀釈して、約１μｇ　／ｍｌの濃度の
溶液を碍た。

前に処理した各ウェル内にモノクロナル抗体の稀薄液１
００μ！を添加し、周囲温度下で一夜該マイクロプレー
トを放置した。次いで、ウェルから液を除き、０．１％
のツイーン２０を含むＴＢＳ溶液で洗浄した。

４）　検出 ａ）　β−ガラクトシダーゼで標識した二十日ネズミの
抗−１ｇＧ抗体を、０．０２％（ｗ／ｖ）のナトリウム
窒化物含有ＴＢＳ溶液で稀釈して、抗体濃度が１〜５μ
ｇ　／ｍｌとなるようにした。この液１００μ！を各ウ
ェル内に導入し、マイクロプレートにカバーをかけ、周
囲温度で２時間放置し、次いでウェル内の液除き０．１
％のツイーン２０を含むＴＢＳ溶液で洗浄した。

ｂ）　次いで、各ウェルにβ−ガラクトシダーゼに特異
的な基質、即ちＯ−ニトロフェニル−ガラクトピラノシ
ドの緩衝水性溶液（濃度０．８ｍｇ／ｍｌ）を２００μ
β当で添加した。３７℃にて２〜４時間後、Ｎａ２ＣＯ
ｓ　（２Ｍ　＞水性溶液４０μβを添加することにより
酵素反応を停止させ、マイクロプレートのウェル内の溶
液の光学密度を測定することにより、転移基質の量を決
定した。結果を片対数座標の第１図に示した。第１図に
は出発サンプルのヒスタミンに対し、１ｍｌ当たりのヒ
スタミンの量（ｎｇ）で表わした稀釈後の濃度の関数と
して４１４ｎｍにおける光学密度を示したものである。

この条件下で、ヒスタミンの検出限界は約２０ｐｇ　／
１００μβである。

実施例３：酵素螢光法によるヒスタミンの定量］）　ア
ミンとｐ−ベンゾキノンとの反応被検サンプルまたはコ
ントロール用サンプル（これはヒスタミンと２０％（Ｖ
／Ｖ）のエタノールを含有するリン酸バヅファー（０，
１Ｍ　；　ｐＨ＝４．５）中に６ｍｇ／ｍｌの濃度でｐ
−ベンゾキノンを溶解した溶液を含む）を小さなチュー
ブ内で混合して、最終体積的０．５ｍｌを含有する溶液
を１辱だ。この混合物を暗所にて１時間室温に維持した
。

２）　反応性官能基の保護 次いで、各チューブ内にグリシン（２Ｍ）および炭酸ナ
トリウム（２Ｍ）含有水性溶液５０μｌを添加して、最
終ｐＨが７．５〜８．５の液を得、混合物を暗所にて１
時間、周囲温度下で維持した。

３）　錯化 次いで、前に碍たモノクロナル抗体を、リン酸−カリウ
ム（０，５Ｍ　）の水性溶液（１０％（ｗ／ｖ）の牛血
清アルブミンと０．１％のツイーン２０を含む）に溶解
した溶液９０Ａｔ、ｉ２を添加して、抗体濃度を約１８
０ｍｇ／ｍｌとなるようにした。これらチューブを周囲
温度にて２０時間放置した。

４）　検出 これらチューブに含まれる溶液を、次いで実施例２−１
および２−２に記載したように、牛血清アルブミンを介
してヒスタミンがウェル当たり１Ｍｇのヒスタミンの割
合で壁土に固定化されているマイクロプレートのウェル
内に導入した。

こようにして満たした各ウェル内に、次いで実施例２（
４−ａ）に記載した条件下で二十日ネズミの抗−１ｇＧ
で標識された抗体の溶液を加え、実施例２　（４−ｂ）
におけるように検定した。

測定された酵素活性は、添付第２図から理解されるよう
に、ヒスタミンの出発サンプルの濃度に反比例している
。この第２図は溶液中のヒスタミン濃度の関数として光
学密度をプロットしたものである。

この条件下で、参照番号Ｄ２２−１２のハイブリドーマ
によって分泌されるモノクロナル抗体の検出限界は５ｍ
ｇ／ｍｌであった。

種々の濃度でヒスタミンを含有する溶液の２２個の試料
を上記２つの方法で順次定量した。これら溶液は、オボ
アルブミンで感作したモルモットの肺の洗液から得たも
のである。第３図の横軸に本発明の直接型方法（Ｅ）で
碍だ結果を、一方縦軸に螢光法（Ｆ）で得た結果をとっ
て夫々プロットしたものである。この図から、これら２
種の方法により得られる結果が良好な相関性を示すこと
がわかる。この図において“十″は一連の実験結果を表
し、一方“■”は異ったサンプルを用いて１週間後に行
った別の一連の実験結果を表す。

１例５：反応性パーオキシダーゼ−ヒスタミンの調製 ａ）　西洋わさびのパーオキシダーゼ１０ｍｇを１．７
ｍｌのリン酸塩バッファー（０，１Ｍ　；　ｐＨ＝７．
０）に溶解させた。次いで３０ｍｇの１．４−ベンゾキ
ノンをＬｍｌのエタノール中に溶かした溶液０．３ｍｌ
を添加する。

暗所で、１時間周囲温度下で反応させた。

１．４−ベンゾキノンに共有結合したパーオキシダーゼ
を、ゲル（トリスアクリルＧＦＯ５の２．５Ｘ８ｃｍの
カラム）で濾過することにより未反応ベンゾキノンから
分離し、次いで０．１５　ＭＮａＣＩ溶液で洗浄した。

褐色の第１画分を１００ｍｇのヒスタミン２塩酸塩を含
有するコルトフ（Ｋｏｌｔｈｏｆｆ　；１９３２）によ
るρ１１９の硼酸ナトリウム−リン酸カリウムバッファ
ー０．５ｍｌと混合した。飽和硼酸す）　ＩＪウムバッ
ファーの１容を添加して、ｐｔ＋を８．５に調製した。

得られた混合物を周囲温度にて２０時間、暗所で放置し
、冷却ＴＢＳバッファーに対して２４時間透析した。

ｂ）　上記操作ａ）の変法 この変法は、０．１ｍｇのヒスタミン２塩酸塩を含有す
る溶液（０、Ｌｍｌのリン酸力ルウムバッファ−（０，
１Ｍ　；　ｐＨ＝４．５）に溶解したもの）に、１０ｍ
ｇ／ｍｌで１．４−ベンゾキノンを溶解したアルコール
溶液０．０１ｍ１を添加することからなる。

この混合物を、暗所にて、１時間周囲温度下に維持し、
次いで０．５ｍｌの西洋わさびのパーオキシダーゼの溶
液（１０ｍｇを、ｐＨ９の硼酸す）　ＩＪウムーリン酸
カリウム０．５ｍｌに溶解した溶液）を添加する。この
混合物を周囲温度にて一夜放置した後、トリスアクリル
ＧＦＯ５のクロマトグラフィーカラムに通し、くり色の
第１画分を集めた。

実施例６：競合法による、本発明のヒスタミンの定量 ａ）　ベンゾキノンとヒスタミンとの反応ヒスタミン−
１，４−ベンゾキノンの結合は上記実施例３で既に記載
した。

反応性官能基の保護および実施例３による中和の後、錯
化反応を行った。

ｂ）　錯化並びに競合 ヒスタミンは以下の方法に従って固定化モノクロナル抗
体上に固定した。即し、ベンゾキノンで処理したヒスタ
ミン溶液０．Ｌｍｌをマイクロプレートの各ウェル内に
入れた。該プレートの壁には本発明によるモノクロナル
抗体が固定されている。

このプレートを一夜周囲温度下でインキュベートし、次
いでヒスタミンーパーオ゛キシダーゼ複合体の”　Ｔ　
Ｂ　Ｓ−ツイン２０（０，１％ｖ／ｖ）−ＢＳ△（１％
〉”バッファー溶液０．　Ｌｍｌを添加した。

周囲温度で２時間インキュベートした後、上記プレート
をＴＢＳ−ツイーン２０（ツイーン２０を０．１容量％
含む）バッファーで３回洗浄した。

最後に、マイクロプレートの固体相と結合したパーオキ
シダーゼの活性を、１ｍｇ／ｍｌの０−フェニレンジア
ミンおよび０．０６％の過酸化水素を含有する０、０５
Ｍのクエン酸バッファー０．２ｍｌを添加することによ
り測定した。

１０分後、酵素反応を０．５％のＮａ２５Ｏａを含有す
る２Ｎ硫酸０．０５ｍ１を添加することにより停止させ
た。測定は４９２ｎｍで行った。

第４図に、片対数グラフとして、４９２ｎｍにおける光
学密度を、稀釈後の出発サンプルのヒスタミン濃度変化
に対してプロットした。ヒスタミン濃度はｎｇ／ｍｌで
表示した。

第５図の縦軸（ｙ）に競合法（ＥＬｒＳ△）に従って行
った測定を、また横軸（ｘ）に螢光法で得た測定結果を
とり夫々プロットした。第５図から明らかな如く、上記
２神の方法の間には良好な相関性があることがわかる。

【図面の簡単な説明】

添付第１図〜第５図は夫々本発明の実施例において得ら
れた測定結果をプロットしたグラフである。

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）キノンと、被検サンプル中に存在するアミン
   とを反応させ； ｂ）次いで生物的媒質中に、形成されるアミン−キノン
   反応生成物を特異的に認識するモノクロナル抗体を添加
   し； ｃ）存在するモノクロナル抗体の１形態を定量する、 各工程を含む生物的媒質中のアミンの免疫学的定量方法
   。
2. （２）上記工程ａ）とｂ）の間に、キノンに残されてい
   る反応性官能基を保護する工程を含むことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の定量方法。
3. （３）上記工程ａ）においては、キノンを、アミノ基含
   有ポリマーを介して不溶性担体に固定化された状態とし
   、上記工程ｃ）で上記反応生成物アミン−キノンと錯化
   されたモノクロナル抗体を定量することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項または第２項に記載の定量方法。
4. （４）上記工程ｃ）において、錯体として存在するモノ
   クロナル抗体に、定量し得る要素で標識した該抗体に対
   する抗体と反応させ、該反応の終了後上記モノクロナル
   抗体に固定された上記標識抗体の量を測定することを特
   徴とする特許請求の範囲第３項に記載の定量方法。
5. （５）上記工程ａ）において、キノンを遊離状態にし、
   上記工程ｃ）において遊離型のモノクロナル抗体を定量
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２
   項に記載の定量方法。
6. （６）上記工程ｃ）にいて、上記媒質中に、アミノ基含
   有ポリマーを介して不溶性担体上に固定した所定のアミ
   ンおよびキノンの反応によって得られる生成物の既知量
   と、定量し得る要素で標識した上記モノクロナル抗体に
   対する抗体とを添加し、反応後、上記のアミン−キノン
   反応生成物を有する担体上に固定された上記標識抗体の
   量を測定することを特徴とする特許請求の範囲第５項に
   記載の定量方法。
7. （７）上記工程ｃ）において、上記モノクロナル抗体が
   好ましくは担体上に固定されており、上記媒質に、酵素
   −アミン複合体を加え、該酵素の活性を定量することを
   特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の定量方法。
8. （８）上記酵素として、パーオキシダーゼを使用するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の定量方法
   。
9. （９）第１アミンの定量に使用することを特徴とする特
   許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の定量方
   法。
10. （１０）ヒスタミンの定量に使用することを特徴とする
    特許請求の範囲第９項に記載の定量方法。
11. （１１）上記工程ａ）において、キノンとしてｐ−ベン
    ゾキノンを使用することを特徴とする特許請求の範囲第
    １〜１０項のいずれか１項に記載の定量方法。
12. （１２）キノンと第１または第２アミンとの反応生成物
    に特異的なモノクロナル抗体。
13. （１３）第１アミンとｐ−ベンゾキノンとの反応生成物
    に特異的であることを特徴とする特許請求の範囲第１２
    項に記載のモノクロナル抗体。
14. （１４）ｐ−ベンゾキノンとヒスタミンとの反応生成物
    に対して特異的であることを特徴とする特許請求の範囲
    第１２項または第１３項に記載のモノクロナル抗体。
15. （１５）コレクション　ナショナル　ドゥ　クルチュー
    ル　ドゥ　ミクロオーガニズムに第 I −４２１号とし
    て寄託されているハイブリドーマ系列により分泌された
    ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１４項に
    記載のモノクロナル抗体。
16. （１６）特許請求の範囲第１２〜１４項のいずれか１項
    に記載のモノクロナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
17. （１７）コレクション　ナショナル　ドゥ　クルチュー
    ル　ドゥ　ミクロオーガニズムに第 I −４２１号とし
    て寄託されているセルラインにみられる特性を有するハ
    イブリドーマ。
18. （１８）特許請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項に
    規定した方法を実施するための試薬セットであって、 （ｉ）キノンと、 （ｉｉ）キノンと、定量すべきアミンとの反応生成物に
    特異的なモノクロナル抗体と、 （ｉｉｉ）該モノクロナル抗体の定量用系 とを含むことを特徴とする上記試薬セット。
19. （１９）特許請求の範囲第４項記載の方法を実施するた
    めの上記試薬セットであって、キノンがアミノ基含有ポ
    リマーを介して不溶性担体上に固定され、かつ上記モノ
    クロナル抗体の定量用系が定量可能な要素で標識された
    上記モノクロナル抗体用抗体を含むことを特徴とする特
    許請求の範囲第１８項に記載の試薬セット。
20. （２０）特許請求の範囲第６項に記載の方法を実施する
    ための上記試薬セットであって、キノンが遊離キノンで
    あり、上記モノクロナル抗体の定量用系が定量すべきア
    ミンと、アミノ基を有するポリマーを介して不溶性担体
    上に固定化された所定のキノンとの反応生成物および定
    量し得る要素で標識された上記モノクロナル抗体に対す
    る抗体を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１８項
    に記載の試薬セット。
21. （２１）特許請求の範囲第７項記載の方法を実施するた
    めのものであり、上記キノンが遊離キノンであり、上記
    モノクロナル抗体定量用系が酵素−アミン複合体を含む
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１８項に記載の試薬
    セット。
22. （２２）上記キノンの反応性官能基を保護し得る化合物
    を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１８〜２１項
    のいずれか１項に記載の試薬セット。