JPH0370184B2 - - Google Patents
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- JPH0370184B2 JPH0370184B2 JP56064302A JP6430281A JPH0370184B2 JP H0370184 B2 JPH0370184 B2 JP H0370184B2 JP 56064302 A JP56064302 A JP 56064302A JP 6430281 A JP6430281 A JP 6430281A JP H0370184 B2 JPH0370184 B2 JP H0370184B2
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Description
本発明はプロテアーゼ抑制物質と共にプロテア
ーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質複合体を生成す
るプロテアーゼ酵素の免疫学的測定方法およびそ
の用具に関する。 炎症過程では、多形核および大食細胞を有する
白血球からのプロテアーゼが罹患組織に対し損傷
を生じさせる原因的役割を演じる。たとえば、エ
ラスターゼまたはコラゲナーゼのような白血球プ
ロテアーゼは白血球細胞のライソソーム中に位置
しており、病因性刺戟の後に、細胞外媒質中に放
出される。放出されるプロテアーゼは結合組織の
破壊を行ない、血液循環系に入つた後に、たとえ
ば凝固因子およびフイブリノーゲンの破壊により
ホメオスターシスを乱す。従つて、血液中の白血
球プロテアーゼの定量的測定は急性炎症の判断
に、慢性炎症の原因の追求、治療の監視および予
後に非常に価値がある。これらの因子の測定は白
血球増多が或る種の炎症性疾病、中毒、組織壊
死、内分泌疾患、悪性腫瘍等のような疾病と関連
して生じる場合には必要となる。 従来、血液中の白血球プロテアーゼの正確な定
量的測定はこれらのタンパク質が循環系に入ると
プロテアーゼ抑制物質との複合体を急速に生成
し、その豊富な量が、たとえばα1−アンチトリプ
シン、α2−マクログロブリンおよびその他ととも
に血液中に存在するという事実により妨害されて
いた。このα1−アンチトリプシンとの複合体はプ
ロテアーゼ１分子と抑制物質１分子との化学量論
的に構成された化合物であつて、共有結合が形成
されている。従つて、この酵素活性の測定は血
漿、血清および滑液、滲出液、組織エキス等のよ
うなその他の体液中のプロテアーゼ濃度を定量的
に総括するには完全に不適当である。 白血球プロテアーゼの中で、エラスターゼ
（EC3.4.21.11）は特に重要である。これは白血球
中に豊富な量で生じ、コラゲナーゼとともに顆粒
白血球の乾燥重量の５％を占める。この酵素は低
い基質特異性を有し、たとえばエラスチン、プロ
テオグリカン、コラーゲン、IgG、補体因子、フ
イブリノーゲンおよび凝集因子のようないくつか
の異なる、生物学的に重要な物質にタンパク分解
的に分解できる。血漿中に存在するエラスターゼ
の92％はα1−アンチトリプシンに結合しており、
そして８％はその他の抑制分子に結合している。
エラスターゼとα1−アンチトリプシンとの複合体
は炎症過程で、たとえば血漿、血清、腹水および
膿汁中で検出される。 体液中で生じるプロテアーゼは常に抑制物質と
結合しているので、それらの検出は免疫学的方法
を用いてのみ完全に可能である。既知方法には電
気免疫拡散法、放射免疫試験法および凝集試験法
または凝集抑制試験法がある。しかしながら、こ
れらの方法は重大な欠点を有する。電気免疫拡散
法は時間がかかり、慣用測定法としては不適であ
り、その評価は定性的で、再現性に乏しい。放射
免疫試験法はまた長時間を要し、放射性物質を使
用するので不利である。特に不利な点としては、
特別の実験装置を要すること、放射能の危険があ
るために特別な安全性測定が必要であること、放
射能標識物質の安定性が低いこと、廃棄上の問題
があること等がある。 西ドイツ国公開特許第2641840号公報には被験
血漿を酵素／抑制物質複合体に対する抗体を表面
上に担持する合成樹脂粒子または血球の懸濁液と
接触させ、凝集が生起しているか否かを直接観測
する凝集試験が開示されている。この方法は準定
量的結果しか得られず、慣用的測定法に発展させ
ることができないという欠点を有する。また使用
する抗体を高価な製造方法によつて、酵素／抑制
物質複合体にだけ存在する抗原測定対象に対し特
異な性質にしなければならない。 西ドイツ国公開特許第2206103号公報には被測
定成分を不溶性にされている結合相手と反応さ
せ、これらの２種の１方を酵素で標識をつけた指
示剤分子により検出する方法が開示されている。
この方法では酵素／抑制物質複合体の特異性定量
測定が不可能である。 本発明の目的はプロテアーゼ酵素／プロテアー
ゼ抑制物質複合体の形で存在するプロテアーゼ酵
素を定量的に測定する方法および用具を提供する
ことにあり、この方法および用具により前記既知
方法の欠点を解消することができる。 本発明によれば、この目的はプロテアーゼ酵
素／プロテアーゼ抑制物質複合体をそのプロテア
ーゼ酵素フラクシヨンに対する固相抗体と結合さ
せ、測定をこの分子結合体のプロテアーゼ抑制物
質フラクシヨンに対する標識抗体により実施する
方法により達成された。本発明の主題は、水不溶
性担体に結合されている被測定酵素プロテアーゼ
に対する抗体を用いるプロテアーゼ酵素の測定方
法であり、この方法は、プロテアーゼ抑制物質と
共にプロテアーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質複
合体を形成しているプロテアーゼ酵素を前記の結
合抗体とインキユベートし、試料溶液を除去し、
プロテアーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質複合体
で負荷されている洗浄された抗体担体をその抑制
物質に対して特異的に反応する抗体と標識物質と
から生成されたカツプリング生成物と共にインキ
ユベートし、結合しなかつたカツプリング生成物
を除去し、そして固体相上の標識物質の濃度を被
測定酵素プロテアーゼの濃度の尺度として測定す
ることを特徴とする。 本発明はまたこの方法を実施するための用具に
関し、この用具は被測定酵素プロテアーゼに対す
る抗体で被覆された試験容器およびプロテアーゼ
抑制物質に対して特異的に反応する抗体と標識物
質とから生成されたカツプリング生成物を包含す
る。本発明の他の主題は、プロテアーゼ抑制物質
と共にプロテアーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質
複合体を生成するプロテアーゼ酵素の測定にこの
ような用具を使用することを包含する。 本発明による方法および用具を使用すると、プ
ロテアーゼ抑制物質と共にプロテアーゼ酵素／プ
ロテアーゼ抑制物質複合体を形成できる全てのプ
ロテアーゼ酵素が原則的に測定でき、従つてプロ
テアーゼ酵素活性を直接測定する必要はない。本
発明の方法はプロテアーゼと特定のプロテアーゼ
に対する抑制物質とから生成される複合体、たと
えばエラスターゼ／α1−アンチトリプシン、トロ
ンビン／アンチトロンビン、プラスミン、アン
チプラスミン、トリプシン／α1−アンチトリプシ
ン等、の測定に特に適している。この方法は特異
性で、単純で、迅速であり、また敏感である。こ
の方法を実施するには、単に３種の特別に製造し
た試剤が必要なだけであり（抗体で被覆された試
験容器、プロテアーゼ酵素で標識を付けた抗体お
よび既知濃度のプロテアーゼ酵素／プロテアーゼ
抑制物質複合体を含む溶液）、この方法は通似常
の臨床−化学実験室の装置および器具を用いて実
施できる。本方法はプロテアーゼ酵素／プロテア
ーゼ抑制物質複合体のそのプロテアーゼ酵素に対
する免疫化された抗体への結合および結合した複
合体のそのプロテアーゼ抑制物質に対する標識抗
体による後続の定量的測定に基づいている。従つ
て、検出には、絶対的に異なる結合特異性、すな
わち分子結合体の２種の相手の一方に対し特異性
を有する２種の抗血清が使用される。 たとえばプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質
複合体に存在するタンパク分解性酵素に対し特異
性を有する反応体を固体担体に結合させる。プロ
テアーゼに対し特異性の反応体は抗体またはその
抗原結合性部分である。特定の抗体製剤は特異的
に免疫化した動物の血清から単離される。使用す
る免疫源は低分子抑制物質との反応後の抑制され
た状態の、または非処理状態のプロテアーゼであ
る。抗血清の調製に適する実験動物の例には羊お
よびうさぎがあるが、その他の実験動物も好適で
ある。 固体相に存在する、プロテアーゼに対する抗体
は担体の無い形であることができ、たとえばジア
ルデヒド、ジオキシド等のような多官能性試薬と
の交叉結合により不溶性にすることができるが、
抗体は固体担体材料に結合させると好ましい。固
体担体は試験に用いる物質に対し不活性であつ
て、プロテアーゼに対する抗体を結合できる任意
の材料よりなることができる。適当な担体の例に
は、無機材料（たとえばガラス）または有機材料
（たとえばオレフイン、酢酸ビニル、塩化ビニル、
塩化ビニリデン、テトラ膜フルオロエチレン、ス
チレン、アクリル酸またはメタアクリル酸のよう
なビニル化合物の単一重合体または共重合体およ
びホルムアルデヒドと環状アセタールとの重合体
並びにポリエステル、ポリカーボネートまたはポ
リアミドのような縮重合生成物あるいはまた交叉
結合した炭水化物および交叉結合したポリペプチ
ド）の無定形粒子、ビーズ、小板、フイルムまた
は試験容器のような固体並びに細胞（たとえば赤
血球）のような生物学的粒子がある。 抗体の固体担体への結合は所望により吸着、接
着または共有状態で行なうことができる。生物学
的に活性なポリペプチドを固体担体に共有結合さ
せるためにタンパク質化学で慣用の方法により抗
体を固定することができる。この代表例には、ブ
ロモシアノーゲン法による担体表面の活性化、ま
たはグルタールジアルデヒド等のような多官能性
交叉結合による抗体表面上での表面的交叉結合が
ある。 多くの担体材料の場合に、プロテアーゼに対す
る抗体は吸着または接着により担体の表面に充分
に堅固に結合できる。被覆するには、担体を抗体
またはその抗原結合性部分と接触させる。たとえ
ば、タンパク質を水溶液、好ましくは7.2のPHを
有するホスフエート緩衝等張塩化ナトリウム溶
液、（PBS）または0.15M塩化ナトリウム溶液、
に溶解して、1μｇ〜１ｇ／、好ましくは10
mg／のタンパク質濃度を生成する。このタンパ
ク質溶液は特異的に免疫化された動物の血漿また
は血清を稀釈することにより製造されるが、抗血
清からの精製免疫グロブリンを溶解することによ
り製造すると好ましい。この溶液を担体と一緒に
１分間ないし５日間、好ましくは24時間放置す
る。次いでこの溶液を、たとえば容器外に注ぎ出
すことにより担体から分離する。担体を有利には
洗剤を含有する緩衝液（たとえばポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート0.05％を含むPH
7.2のPBS）で洗浄する。 プロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体の
測定は被測定プロテアーゼに対して特異な抗体
で、またはこの抗体からの抗原結合性部分で被覆
された担体をプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物
質複合体を含有する液、たとえば血清試料と１分
間〜48時間、好ましくは２時間、インキユベート
することにより行なう。平行試験バツチでは、既
知濃度のプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複
合体を含有する試料を使用する。これらの試料は
高度に精製されたプロテアーゼおよび高度に精製
されたプロテアーゼ抑制物質から得られた反応生
成物を緩衝液（たとえばPH7.2のPBS）または56
℃で30分間事前に不活性化したヒド血漿中に稀釈
することにより作る。インキユベーシヨンの終了
後に、溶液を担体から分離し、次に担体を緩衝液
（たとえばPH7.2のPBS）で洗浄して過剰の試料成
分を除去すると有利である。この方法で処理され
た担体を次に、複合体結合したプロテアーゼ抑制
物質に対し特異性の標識をつけた第２の試剤の溶
液とインキユベートする。この時間はPH値、温度
および濃度に関する条件によつて或る程度決ま
る。一般にこの活性時間は２〜24時間で充分であ
る。またこの試験工程用の反応成分は複合体結合
したプロテアーゼ抑制物質分子の抗原性決定子に
応答する抗体または抗体部分である。特定の抗体
製剤は特異的に免疫化した動物の血清から単離さ
れる。これらの抗血清からの抗原特異性抗体部分
を不動化した抗原に対する免疫吸着法により濃縮
し、これらを未知の特異性を有する抗体から分離
すると有利であることが判つた。 第２の反応剤に用いる標識剤は、たとえば酵
素、発光体または電子密度マーカー、あるいはま
た螢光物質または放射活性物質でである。本発明
の範囲内では、活性を光学試験により、特に可視
光下の発色反応により、またはNADHまたは
NADPHの濃度変化により容易に測定できる酵
素標識が好ましい。適当な標識用酵素の代表例に
はアルカリ性ホスフアターゼ、パーオキシダー
ゼ、グルコース・オキシダーゼ、α−およびβ−
ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、インベル
ターゼ、マレエート−デヒドロゲナーゼまたはグ
ルコース−６−ホスフアトデヒドロゲナーゼがあ
る。プロテアーゼ抑制物質に対して特異な抗体ま
たは抗原結合性抗体部分への特定の標識酵素の共
有結合は文献から既知の方法により生成される
〔たとえばJ.Histochem.Cytochem.22、1084
（1974）、Bull.Soc.Chim.Biol.50、1169（1968）〕。 複合体結合したプロテアーゼ抑制物質に対する
標識抗体の試験に使用する際の最適稀釈度は予備
実験により確立される。これは担体とどんな非特
異的特異もしてはならない、すなわち担体結合し
たプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体の
存在なしで検出できる結合をしてはならない。こ
のためには、洗剤、たとえばドデシル硫酸ナトリ
ウム1mMを標識抗体の溶液に加える。インキユ
ベーシヨンの終了後に、たとえば溶液を容器の外
に注ぎ出すことにより溶液を担体から分離する。
担体を洗剤を含有すると有利である緩衝液で数回
洗浄し、次いで担体に結合した標識剤の量を慣用
の方法で測定する。標識剤の担体への非特異性結
合を検査するには、前記したとおりであるが、被
測定結合体のプロテアーゼ／プロテアーゼ複合体
を含まない試料を用いる試験を利用する。 生物学的試料中の被測定プロテアーゼを有する
プロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体の含
量は前記の標準試料との比較により定量的に測定
することができる。 本発明による手段にはさらにまた、慣用の安定
化剤、たとえばタンパク質添加剤（牛血清アルブ
ミンまたは卵白アルブミン）、炭水化物、グリセ
ロール、静菌剤、殺カビ剤等を含ませることがで
きる。 本発明を次例でさらに詳細に説明する。 例 １ 白血球エラスターゼとα1−アンチトリプシンと
の複合体の免疫学的定量測定 ａ） 白血球エラスターゼに対する抗血清の調製 多形核を有するヒト白血球からエラスターゼ
を採取し、アフイニテイクロマトグラフイーお
よびイオン交換クロマトグラフイーにより、ポ
リアクリルアミドゲル上におけるPH4.3での電
気泳動およびヒト血清タンパク質に対する抗血
清を用いる免疫電気泳動によりその他のいずれ
の汚染タンパク質ももはや検出できなくなるよ
うな程度にまで精製した。塩を含有しない凍結
乾燥させた前記タンパク質を0.15M塩化ナトリ
ウム溶液中に２mg／mlの濃度で溶解した。この
溶液１mlをフロイントの完全助剤１mlを用いて
乳化した。このエマルジヨンを羊または山羊の
後肢の３〜４ケ所に筋肉注射した。同じ注射を
各回３週間の間隔でさらに２回行なつた。最後
の注射から21日間後に血液を採取した。最後の
血液採取後に、12週間の間隔をあけてさらに注
射を実施した。各場合に、この補助注射から14
日後に血液を採取した。この血液から血清を慣
用の方法により採取し、ナトリウムアジド0.05
％およびナトリウムエチル水銀チオサリチレー
ト0.05％の添加により安定化し、−20℃で貯蔵
した。 ｂ） α1−アンチトリプシンに対する抗血清の調
製 使用抗原はヒト血漿からの高度に精製したα1
−アンチトリプシンである。α1−アンチトリプ
シンに対する抗血清は羊または山羊の体内で、
ａ）に記載したのと同じ接種方法により作つ
た。うさぎの免疫用に、塩を含有しない凍結乾
燥したα1−アンチトリプシン１mgを0.15M塩化
ナトリウム溶液0.5mlに溶解した。この溶液を
フロイントの完全助剤0.5mlで乳化し、このエ
マルジヨンを前記動物の後肢の２〜３ケ所に筋
肉注射した。４週間後に、同じエマルジヨンを
首に皮下注射した。７日後に、血液約40mlを耳
縁部血管から採取した。各場合に４週間後にさ
らに補助注射を皮下に行ない、７日間の間隔の
後に血液を採取した。この血清はａ）に記載の
とおりに処理した。 ｃ） 抗血清からの免疫グロブリンの単離 エラスターゼに対する、またはα1−アンチト
リプシンに対する抗血清からのIgG分画を慣用
の方法〔Scand.J.Immunol.２、Suppl.1、161
（1973）またはArch.Biochim.Biophys.134、
279（1969）〕により血清から単離し、塩を含有
しない凍結乾燥した形で貯蔵した。 ｄ） 免疫吸着によるα1−アンチトリプシンに対
する抗体の精製 α1−アンチトリプシンに対する抗血清〔ｂ）
による〕から精製した免疫グロブリン〔ｃ）に
よる〕を共有的に結合したα1−アンチトリプシ
ンを含有する置換アガロース上またはセフアロ
ース4B上でクロマトグラフイー処理すること
によりプロテアーゼ抑制物質に対する抗体を免
疫特異的に単離した。プロテアーゼ抑制物質に
対する抗体を不動化した抗原上に保持し、PH
2.8の0.1Mグリシン／HCl緩衝液または3Mチオ
シアン酸カリウム溶液で溶離した。供給された
免疫グロブリンの約５〜20％がこの方法で免疫
特異的に単離された。このようにして異なる特
異性を有する免疫グロブリンが除去された。特
異性抗体を含有する溶離液をホスフエート緩衝
塩溶液次いで0.01重炭酸アンモニウム溶液に対
して透析した。次いで、このタンパク質を凍結
乾燥させた。 ｅ） 酵素／抗体共有結合体の調製 免疫特異的に精製された抗体〔ｄ）による〕
をブルタールジアルデヒドの0.2％を使用して、
子牛の小腸からのアルカリ性ホスフアターゼと
交叉結合させた〔Biochim.Biophys.Acta251、
427（1971）〕。この反応生成物をBio−GelAの
1.5m（26mm×900mm）カラム上でクロマトグラ
フイー処理した。この酵素／抗体複合体は溶離
液のAP活性の第１ピークに含有されていた。
この溶液に卵白アルブミン（0.1％を与える量）
およびナトリウムアジド（0.05％を与える量）
を加えて安定化し、４℃で貯蔵した。 ｆ） エラスターゼに対する抗体による試験容器
の被覆 ａ）に従い調製し、次にｃ）に従い精製した
エラスターゼに対する抗体をプラスチツク試験
容器上に吸着させることにより不動化した。使
用した試験容器はポリスチレンの12×55mm小形
試験管、円形セルまたは微滴定用プレートであ
る。代表的調製方法では、小形試験管またはセ
ルを10μｇIgG／ml（ナトリウムアジド0.02％
含有0.15M塩化ナトリウム溶液）を有するIgG
溶液１mlで満たす。プレートの場合は、１個所
当り50μｇ／mlのIgG溶液0.2mlを使用した。容
器を密封し、４℃で一夜放置した。試験に使用
する前に、液体をデカンテーシヨンにより除去
するか、または吸引により除去した。この容器
を次に洗浄溶液（洗剤0.05％およびナトリウム
アジド0.02％を含有する0.15％塩化ナトリウム
溶液）で数回洗浄し、次いで短時間通気乾燥さ
せた。 ｇ） 白血球エラスターゼおよびα1−アンチトリ
プシンからの複合体の調製 定量用白血球標品として、プロテアーゼおよ
びプロテアーゼ抑制物質からの複合体をこれら
２種の単離され、高度に精製された成分のイン
キユベーシヨンにより試験管内で作つた。この
目的には、１ml中に純粋白血球エラスターゼ
（ヒト）0.5mgを含有する溶液（塩化ナトリウム
0.12Mを含有するPH7.4のトリス／HCl緩衝液
10mMに溶解した溶液）0.2mlおよび１ml中に
純粋α1−アンチトリプシン（ヒト血漿から）
2.8mgを含有する溶液（塩化ナトリウム0.05M
を含有するPH8.8のトリス／HCl緩衝液50mM
に溶解した溶液）0.2mlを混合し、次いで37℃
で２時間インキユベートした。この混合物を次
いで−20℃で貯蔵した。 免疫電気泳動による白血球はこのインキユベ
ート混合物中のエラスターゼの全部がエラスタ
ーゼ／α1−アンチトリプシン複合体に変換され
たことを示した。 ｈ） 白血球エラスターゼとα1−アンチトリプシ
ンとの複合体の採取 １個所当りの抑制物質複合体中のエラスター
ゼ含有量が0.1〜10nｇである試料0.2mlを、ｆ）
に従いエラスターゼに対する抗体で被覆され、
使用できるように準備備された微滴定プレート
に充填した。既定のエラスターゼ含有量を有す
る試料はｇ）による酵素／抑制物質混合物を稀
釈して得た。使用稀釈液はホスフエート緩衝塩
溶液である。ブランクの数値を決定するため
に、数個所には酵素／抑制物質複合体を含有し
ない稀釈液0.2mlを対比させて満たした。室温
で２時間インキユベートした後に、デポーの内
容物を吸引除去した。ホスフエート緩衝塩溶液
で３回洗浄した後に、ｅ）による酵素／抗体共
有結合体含有溶液を試験個所に満たした（0.2
ml／１個所）。この溶液は事前に約800単位／
のAP活性に調整した。この稀釈には塩化マグ
ネシウム2mM、塩化亜鉛0.025mM、卵白アル
ブミン１％、ドデシル硫酸ナトリウム1mMお
よびナトリウムアジド0.02％を含有するPH7.5
のトリス／HCl緩衝液10mMを使用した。プレ
ートを空気から遮断して密封し、室温で一夜イ
ンキユベートした。次に、吸引により液体を除
去した。プレートを３回洗浄し、短時間通気乾
燥した。次いで、アルカリ性ホズスフアターゼ
の活性を測定するために、時間の経過に従い段
階的にして、緩衝液／基質溶液を１個所当り
0.2mlの量で導入した。室温で10分間インキユ
ベートした後に、反応混合物を試験個所からミ
クロセル中に移し、吸光度を測定した。ゼロ値
として緩衝液／基質溶液を使用した。タンパク
質を加えていない個所ではこの試験個所上の酵
素／抗体共有結合体の非特異性吸着の尺度を示
す吸光度を与える。プロテアーゼ／プロテアー
ゼ抑制物質複合体を含有する個所に増大した吸
光度値が見出された。評価するには、検出され
た吸光度（非特異性吸着の場合の吸光度を引算
する）を抑制物質複合体に使用されたエラスタ
ーゼの量（ng）と比較する。次表に10分間の
反応時間後に405nmで測定した最終吸光度値を
エラスターゼの量の凾数として示す。
ーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質複合体を生成す
るプロテアーゼ酵素の免疫学的測定方法およびそ
の用具に関する。 炎症過程では、多形核および大食細胞を有する
白血球からのプロテアーゼが罹患組織に対し損傷
を生じさせる原因的役割を演じる。たとえば、エ
ラスターゼまたはコラゲナーゼのような白血球プ
ロテアーゼは白血球細胞のライソソーム中に位置
しており、病因性刺戟の後に、細胞外媒質中に放
出される。放出されるプロテアーゼは結合組織の
破壊を行ない、血液循環系に入つた後に、たとえ
ば凝固因子およびフイブリノーゲンの破壊により
ホメオスターシスを乱す。従つて、血液中の白血
球プロテアーゼの定量的測定は急性炎症の判断
に、慢性炎症の原因の追求、治療の監視および予
後に非常に価値がある。これらの因子の測定は白
血球増多が或る種の炎症性疾病、中毒、組織壊
死、内分泌疾患、悪性腫瘍等のような疾病と関連
して生じる場合には必要となる。 従来、血液中の白血球プロテアーゼの正確な定
量的測定はこれらのタンパク質が循環系に入ると
プロテアーゼ抑制物質との複合体を急速に生成
し、その豊富な量が、たとえばα1−アンチトリプ
シン、α2−マクログロブリンおよびその他ととも
に血液中に存在するという事実により妨害されて
いた。このα1−アンチトリプシンとの複合体はプ
ロテアーゼ１分子と抑制物質１分子との化学量論
的に構成された化合物であつて、共有結合が形成
されている。従つて、この酵素活性の測定は血
漿、血清および滑液、滲出液、組織エキス等のよ
うなその他の体液中のプロテアーゼ濃度を定量的
に総括するには完全に不適当である。 白血球プロテアーゼの中で、エラスターゼ
（EC3.4.21.11）は特に重要である。これは白血球
中に豊富な量で生じ、コラゲナーゼとともに顆粒
白血球の乾燥重量の５％を占める。この酵素は低
い基質特異性を有し、たとえばエラスチン、プロ
テオグリカン、コラーゲン、IgG、補体因子、フ
イブリノーゲンおよび凝集因子のようないくつか
の異なる、生物学的に重要な物質にタンパク分解
的に分解できる。血漿中に存在するエラスターゼ
の92％はα1−アンチトリプシンに結合しており、
そして８％はその他の抑制分子に結合している。
エラスターゼとα1−アンチトリプシンとの複合体
は炎症過程で、たとえば血漿、血清、腹水および
膿汁中で検出される。 体液中で生じるプロテアーゼは常に抑制物質と
結合しているので、それらの検出は免疫学的方法
を用いてのみ完全に可能である。既知方法には電
気免疫拡散法、放射免疫試験法および凝集試験法
または凝集抑制試験法がある。しかしながら、こ
れらの方法は重大な欠点を有する。電気免疫拡散
法は時間がかかり、慣用測定法としては不適であ
り、その評価は定性的で、再現性に乏しい。放射
免疫試験法はまた長時間を要し、放射性物質を使
用するので不利である。特に不利な点としては、
特別の実験装置を要すること、放射能の危険があ
るために特別な安全性測定が必要であること、放
射能標識物質の安定性が低いこと、廃棄上の問題
があること等がある。 西ドイツ国公開特許第2641840号公報には被験
血漿を酵素／抑制物質複合体に対する抗体を表面
上に担持する合成樹脂粒子または血球の懸濁液と
接触させ、凝集が生起しているか否かを直接観測
する凝集試験が開示されている。この方法は準定
量的結果しか得られず、慣用的測定法に発展させ
ることができないという欠点を有する。また使用
する抗体を高価な製造方法によつて、酵素／抑制
物質複合体にだけ存在する抗原測定対象に対し特
異な性質にしなければならない。 西ドイツ国公開特許第2206103号公報には被測
定成分を不溶性にされている結合相手と反応さ
せ、これらの２種の１方を酵素で標識をつけた指
示剤分子により検出する方法が開示されている。
この方法では酵素／抑制物質複合体の特異性定量
測定が不可能である。 本発明の目的はプロテアーゼ酵素／プロテアー
ゼ抑制物質複合体の形で存在するプロテアーゼ酵
素を定量的に測定する方法および用具を提供する
ことにあり、この方法および用具により前記既知
方法の欠点を解消することができる。 本発明によれば、この目的はプロテアーゼ酵
素／プロテアーゼ抑制物質複合体をそのプロテア
ーゼ酵素フラクシヨンに対する固相抗体と結合さ
せ、測定をこの分子結合体のプロテアーゼ抑制物
質フラクシヨンに対する標識抗体により実施する
方法により達成された。本発明の主題は、水不溶
性担体に結合されている被測定酵素プロテアーゼ
に対する抗体を用いるプロテアーゼ酵素の測定方
法であり、この方法は、プロテアーゼ抑制物質と
共にプロテアーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質複
合体を形成しているプロテアーゼ酵素を前記の結
合抗体とインキユベートし、試料溶液を除去し、
プロテアーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質複合体
で負荷されている洗浄された抗体担体をその抑制
物質に対して特異的に反応する抗体と標識物質と
から生成されたカツプリング生成物と共にインキ
ユベートし、結合しなかつたカツプリング生成物
を除去し、そして固体相上の標識物質の濃度を被
測定酵素プロテアーゼの濃度の尺度として測定す
ることを特徴とする。 本発明はまたこの方法を実施するための用具に
関し、この用具は被測定酵素プロテアーゼに対す
る抗体で被覆された試験容器およびプロテアーゼ
抑制物質に対して特異的に反応する抗体と標識物
質とから生成されたカツプリング生成物を包含す
る。本発明の他の主題は、プロテアーゼ抑制物質
と共にプロテアーゼ酵素／プロテアーゼ抑制物質
複合体を生成するプロテアーゼ酵素の測定にこの
ような用具を使用することを包含する。 本発明による方法および用具を使用すると、プ
ロテアーゼ抑制物質と共にプロテアーゼ酵素／プ
ロテアーゼ抑制物質複合体を形成できる全てのプ
ロテアーゼ酵素が原則的に測定でき、従つてプロ
テアーゼ酵素活性を直接測定する必要はない。本
発明の方法はプロテアーゼと特定のプロテアーゼ
に対する抑制物質とから生成される複合体、たと
えばエラスターゼ／α1−アンチトリプシン、トロ
ンビン／アンチトロンビン、プラスミン、アン
チプラスミン、トリプシン／α1−アンチトリプシ
ン等、の測定に特に適している。この方法は特異
性で、単純で、迅速であり、また敏感である。こ
の方法を実施するには、単に３種の特別に製造し
た試剤が必要なだけであり（抗体で被覆された試
験容器、プロテアーゼ酵素で標識を付けた抗体お
よび既知濃度のプロテアーゼ酵素／プロテアーゼ
抑制物質複合体を含む溶液）、この方法は通似常
の臨床−化学実験室の装置および器具を用いて実
施できる。本方法はプロテアーゼ酵素／プロテア
ーゼ抑制物質複合体のそのプロテアーゼ酵素に対
する免疫化された抗体への結合および結合した複
合体のそのプロテアーゼ抑制物質に対する標識抗
体による後続の定量的測定に基づいている。従つ
て、検出には、絶対的に異なる結合特異性、すな
わち分子結合体の２種の相手の一方に対し特異性
を有する２種の抗血清が使用される。 たとえばプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質
複合体に存在するタンパク分解性酵素に対し特異
性を有する反応体を固体担体に結合させる。プロ
テアーゼに対し特異性の反応体は抗体またはその
抗原結合性部分である。特定の抗体製剤は特異的
に免疫化した動物の血清から単離される。使用す
る免疫源は低分子抑制物質との反応後の抑制され
た状態の、または非処理状態のプロテアーゼであ
る。抗血清の調製に適する実験動物の例には羊お
よびうさぎがあるが、その他の実験動物も好適で
ある。 固体相に存在する、プロテアーゼに対する抗体
は担体の無い形であることができ、たとえばジア
ルデヒド、ジオキシド等のような多官能性試薬と
の交叉結合により不溶性にすることができるが、
抗体は固体担体材料に結合させると好ましい。固
体担体は試験に用いる物質に対し不活性であつ
て、プロテアーゼに対する抗体を結合できる任意
の材料よりなることができる。適当な担体の例に
は、無機材料（たとえばガラス）または有機材料
（たとえばオレフイン、酢酸ビニル、塩化ビニル、
塩化ビニリデン、テトラ膜フルオロエチレン、ス
チレン、アクリル酸またはメタアクリル酸のよう
なビニル化合物の単一重合体または共重合体およ
びホルムアルデヒドと環状アセタールとの重合体
並びにポリエステル、ポリカーボネートまたはポ
リアミドのような縮重合生成物あるいはまた交叉
結合した炭水化物および交叉結合したポリペプチ
ド）の無定形粒子、ビーズ、小板、フイルムまた
は試験容器のような固体並びに細胞（たとえば赤
血球）のような生物学的粒子がある。 抗体の固体担体への結合は所望により吸着、接
着または共有状態で行なうことができる。生物学
的に活性なポリペプチドを固体担体に共有結合さ
せるためにタンパク質化学で慣用の方法により抗
体を固定することができる。この代表例には、ブ
ロモシアノーゲン法による担体表面の活性化、ま
たはグルタールジアルデヒド等のような多官能性
交叉結合による抗体表面上での表面的交叉結合が
ある。 多くの担体材料の場合に、プロテアーゼに対す
る抗体は吸着または接着により担体の表面に充分
に堅固に結合できる。被覆するには、担体を抗体
またはその抗原結合性部分と接触させる。たとえ
ば、タンパク質を水溶液、好ましくは7.2のPHを
有するホスフエート緩衝等張塩化ナトリウム溶
液、（PBS）または0.15M塩化ナトリウム溶液、
に溶解して、1μｇ〜１ｇ／、好ましくは10
mg／のタンパク質濃度を生成する。このタンパ
ク質溶液は特異的に免疫化された動物の血漿また
は血清を稀釈することにより製造されるが、抗血
清からの精製免疫グロブリンを溶解することによ
り製造すると好ましい。この溶液を担体と一緒に
１分間ないし５日間、好ましくは24時間放置す
る。次いでこの溶液を、たとえば容器外に注ぎ出
すことにより担体から分離する。担体を有利には
洗剤を含有する緩衝液（たとえばポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート0.05％を含むPH
7.2のPBS）で洗浄する。 プロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体の
測定は被測定プロテアーゼに対して特異な抗体
で、またはこの抗体からの抗原結合性部分で被覆
された担体をプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物
質複合体を含有する液、たとえば血清試料と１分
間〜48時間、好ましくは２時間、インキユベート
することにより行なう。平行試験バツチでは、既
知濃度のプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複
合体を含有する試料を使用する。これらの試料は
高度に精製されたプロテアーゼおよび高度に精製
されたプロテアーゼ抑制物質から得られた反応生
成物を緩衝液（たとえばPH7.2のPBS）または56
℃で30分間事前に不活性化したヒド血漿中に稀釈
することにより作る。インキユベーシヨンの終了
後に、溶液を担体から分離し、次に担体を緩衝液
（たとえばPH7.2のPBS）で洗浄して過剰の試料成
分を除去すると有利である。この方法で処理され
た担体を次に、複合体結合したプロテアーゼ抑制
物質に対し特異性の標識をつけた第２の試剤の溶
液とインキユベートする。この時間はPH値、温度
および濃度に関する条件によつて或る程度決ま
る。一般にこの活性時間は２〜24時間で充分であ
る。またこの試験工程用の反応成分は複合体結合
したプロテアーゼ抑制物質分子の抗原性決定子に
応答する抗体または抗体部分である。特定の抗体
製剤は特異的に免疫化した動物の血清から単離さ
れる。これらの抗血清からの抗原特異性抗体部分
を不動化した抗原に対する免疫吸着法により濃縮
し、これらを未知の特異性を有する抗体から分離
すると有利であることが判つた。 第２の反応剤に用いる標識剤は、たとえば酵
素、発光体または電子密度マーカー、あるいはま
た螢光物質または放射活性物質でである。本発明
の範囲内では、活性を光学試験により、特に可視
光下の発色反応により、またはNADHまたは
NADPHの濃度変化により容易に測定できる酵
素標識が好ましい。適当な標識用酵素の代表例に
はアルカリ性ホスフアターゼ、パーオキシダー
ゼ、グルコース・オキシダーゼ、α−およびβ−
ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、インベル
ターゼ、マレエート−デヒドロゲナーゼまたはグ
ルコース−６−ホスフアトデヒドロゲナーゼがあ
る。プロテアーゼ抑制物質に対して特異な抗体ま
たは抗原結合性抗体部分への特定の標識酵素の共
有結合は文献から既知の方法により生成される
〔たとえばJ.Histochem.Cytochem.22、1084
（1974）、Bull.Soc.Chim.Biol.50、1169（1968）〕。 複合体結合したプロテアーゼ抑制物質に対する
標識抗体の試験に使用する際の最適稀釈度は予備
実験により確立される。これは担体とどんな非特
異的特異もしてはならない、すなわち担体結合し
たプロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体の
存在なしで検出できる結合をしてはならない。こ
のためには、洗剤、たとえばドデシル硫酸ナトリ
ウム1mMを標識抗体の溶液に加える。インキユ
ベーシヨンの終了後に、たとえば溶液を容器の外
に注ぎ出すことにより溶液を担体から分離する。
担体を洗剤を含有すると有利である緩衝液で数回
洗浄し、次いで担体に結合した標識剤の量を慣用
の方法で測定する。標識剤の担体への非特異性結
合を検査するには、前記したとおりであるが、被
測定結合体のプロテアーゼ／プロテアーゼ複合体
を含まない試料を用いる試験を利用する。 生物学的試料中の被測定プロテアーゼを有する
プロテアーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体の含
量は前記の標準試料との比較により定量的に測定
することができる。 本発明による手段にはさらにまた、慣用の安定
化剤、たとえばタンパク質添加剤（牛血清アルブ
ミンまたは卵白アルブミン）、炭水化物、グリセ
ロール、静菌剤、殺カビ剤等を含ませることがで
きる。 本発明を次例でさらに詳細に説明する。 例 １ 白血球エラスターゼとα1−アンチトリプシンと
の複合体の免疫学的定量測定 ａ） 白血球エラスターゼに対する抗血清の調製 多形核を有するヒト白血球からエラスターゼ
を採取し、アフイニテイクロマトグラフイーお
よびイオン交換クロマトグラフイーにより、ポ
リアクリルアミドゲル上におけるPH4.3での電
気泳動およびヒト血清タンパク質に対する抗血
清を用いる免疫電気泳動によりその他のいずれ
の汚染タンパク質ももはや検出できなくなるよ
うな程度にまで精製した。塩を含有しない凍結
乾燥させた前記タンパク質を0.15M塩化ナトリ
ウム溶液中に２mg／mlの濃度で溶解した。この
溶液１mlをフロイントの完全助剤１mlを用いて
乳化した。このエマルジヨンを羊または山羊の
後肢の３〜４ケ所に筋肉注射した。同じ注射を
各回３週間の間隔でさらに２回行なつた。最後
の注射から21日間後に血液を採取した。最後の
血液採取後に、12週間の間隔をあけてさらに注
射を実施した。各場合に、この補助注射から14
日後に血液を採取した。この血液から血清を慣
用の方法により採取し、ナトリウムアジド0.05
％およびナトリウムエチル水銀チオサリチレー
ト0.05％の添加により安定化し、−20℃で貯蔵
した。 ｂ） α1−アンチトリプシンに対する抗血清の調
製 使用抗原はヒト血漿からの高度に精製したα1
−アンチトリプシンである。α1−アンチトリプ
シンに対する抗血清は羊または山羊の体内で、
ａ）に記載したのと同じ接種方法により作つ
た。うさぎの免疫用に、塩を含有しない凍結乾
燥したα1−アンチトリプシン１mgを0.15M塩化
ナトリウム溶液0.5mlに溶解した。この溶液を
フロイントの完全助剤0.5mlで乳化し、このエ
マルジヨンを前記動物の後肢の２〜３ケ所に筋
肉注射した。４週間後に、同じエマルジヨンを
首に皮下注射した。７日後に、血液約40mlを耳
縁部血管から採取した。各場合に４週間後にさ
らに補助注射を皮下に行ない、７日間の間隔の
後に血液を採取した。この血清はａ）に記載の
とおりに処理した。 ｃ） 抗血清からの免疫グロブリンの単離 エラスターゼに対する、またはα1−アンチト
リプシンに対する抗血清からのIgG分画を慣用
の方法〔Scand.J.Immunol.２、Suppl.1、161
（1973）またはArch.Biochim.Biophys.134、
279（1969）〕により血清から単離し、塩を含有
しない凍結乾燥した形で貯蔵した。 ｄ） 免疫吸着によるα1−アンチトリプシンに対
する抗体の精製 α1−アンチトリプシンに対する抗血清〔ｂ）
による〕から精製した免疫グロブリン〔ｃ）に
よる〕を共有的に結合したα1−アンチトリプシ
ンを含有する置換アガロース上またはセフアロ
ース4B上でクロマトグラフイー処理すること
によりプロテアーゼ抑制物質に対する抗体を免
疫特異的に単離した。プロテアーゼ抑制物質に
対する抗体を不動化した抗原上に保持し、PH
2.8の0.1Mグリシン／HCl緩衝液または3Mチオ
シアン酸カリウム溶液で溶離した。供給された
免疫グロブリンの約５〜20％がこの方法で免疫
特異的に単離された。このようにして異なる特
異性を有する免疫グロブリンが除去された。特
異性抗体を含有する溶離液をホスフエート緩衝
塩溶液次いで0.01重炭酸アンモニウム溶液に対
して透析した。次いで、このタンパク質を凍結
乾燥させた。 ｅ） 酵素／抗体共有結合体の調製 免疫特異的に精製された抗体〔ｄ）による〕
をブルタールジアルデヒドの0.2％を使用して、
子牛の小腸からのアルカリ性ホスフアターゼと
交叉結合させた〔Biochim.Biophys.Acta251、
427（1971）〕。この反応生成物をBio−GelAの
1.5m（26mm×900mm）カラム上でクロマトグラ
フイー処理した。この酵素／抗体複合体は溶離
液のAP活性の第１ピークに含有されていた。
この溶液に卵白アルブミン（0.1％を与える量）
およびナトリウムアジド（0.05％を与える量）
を加えて安定化し、４℃で貯蔵した。 ｆ） エラスターゼに対する抗体による試験容器
の被覆 ａ）に従い調製し、次にｃ）に従い精製した
エラスターゼに対する抗体をプラスチツク試験
容器上に吸着させることにより不動化した。使
用した試験容器はポリスチレンの12×55mm小形
試験管、円形セルまたは微滴定用プレートであ
る。代表的調製方法では、小形試験管またはセ
ルを10μｇIgG／ml（ナトリウムアジド0.02％
含有0.15M塩化ナトリウム溶液）を有するIgG
溶液１mlで満たす。プレートの場合は、１個所
当り50μｇ／mlのIgG溶液0.2mlを使用した。容
器を密封し、４℃で一夜放置した。試験に使用
する前に、液体をデカンテーシヨンにより除去
するか、または吸引により除去した。この容器
を次に洗浄溶液（洗剤0.05％およびナトリウム
アジド0.02％を含有する0.15％塩化ナトリウム
溶液）で数回洗浄し、次いで短時間通気乾燥さ
せた。 ｇ） 白血球エラスターゼおよびα1−アンチトリ
プシンからの複合体の調製 定量用白血球標品として、プロテアーゼおよ
びプロテアーゼ抑制物質からの複合体をこれら
２種の単離され、高度に精製された成分のイン
キユベーシヨンにより試験管内で作つた。この
目的には、１ml中に純粋白血球エラスターゼ
（ヒト）0.5mgを含有する溶液（塩化ナトリウム
0.12Mを含有するPH7.4のトリス／HCl緩衝液
10mMに溶解した溶液）0.2mlおよび１ml中に
純粋α1−アンチトリプシン（ヒト血漿から）
2.8mgを含有する溶液（塩化ナトリウム0.05M
を含有するPH8.8のトリス／HCl緩衝液50mM
に溶解した溶液）0.2mlを混合し、次いで37℃
で２時間インキユベートした。この混合物を次
いで−20℃で貯蔵した。 免疫電気泳動による白血球はこのインキユベ
ート混合物中のエラスターゼの全部がエラスタ
ーゼ／α1−アンチトリプシン複合体に変換され
たことを示した。 ｈ） 白血球エラスターゼとα1−アンチトリプシ
ンとの複合体の採取 １個所当りの抑制物質複合体中のエラスター
ゼ含有量が0.1〜10nｇである試料0.2mlを、ｆ）
に従いエラスターゼに対する抗体で被覆され、
使用できるように準備備された微滴定プレート
に充填した。既定のエラスターゼ含有量を有す
る試料はｇ）による酵素／抑制物質混合物を稀
釈して得た。使用稀釈液はホスフエート緩衝塩
溶液である。ブランクの数値を決定するため
に、数個所には酵素／抑制物質複合体を含有し
ない稀釈液0.2mlを対比させて満たした。室温
で２時間インキユベートした後に、デポーの内
容物を吸引除去した。ホスフエート緩衝塩溶液
で３回洗浄した後に、ｅ）による酵素／抗体共
有結合体含有溶液を試験個所に満たした（0.2
ml／１個所）。この溶液は事前に約800単位／
のAP活性に調整した。この稀釈には塩化マグ
ネシウム2mM、塩化亜鉛0.025mM、卵白アル
ブミン１％、ドデシル硫酸ナトリウム1mMお
よびナトリウムアジド0.02％を含有するPH7.5
のトリス／HCl緩衝液10mMを使用した。プレ
ートを空気から遮断して密封し、室温で一夜イ
ンキユベートした。次に、吸引により液体を除
去した。プレートを３回洗浄し、短時間通気乾
燥した。次いで、アルカリ性ホズスフアターゼ
の活性を測定するために、時間の経過に従い段
階的にして、緩衝液／基質溶液を１個所当り
0.2mlの量で導入した。室温で10分間インキユ
ベートした後に、反応混合物を試験個所からミ
クロセル中に移し、吸光度を測定した。ゼロ値
として緩衝液／基質溶液を使用した。タンパク
質を加えていない個所ではこの試験個所上の酵
素／抗体共有結合体の非特異性吸着の尺度を示
す吸光度を与える。プロテアーゼ／プロテアー
ゼ抑制物質複合体を含有する個所に増大した吸
光度値が見出された。評価するには、検出され
た吸光度（非特異性吸着の場合の吸光度を引算
する）を抑制物質複合体に使用されたエラスタ
ーゼの量（ng）と比較する。次表に10分間の
反応時間後に405nmで測定した最終吸光度値を
エラスターゼの量の凾数として示す。
【表】
このデータはエラスターゼ／α1−アンチトリ
プシン複合体の濃度がこの方法で定量的に測定
できることを示している。試料中の約0.4ngか
ら約6ngまでの複合体結合したエラスターゼの
量と測定された吸光度との間には厳密な相関関
係がある。本試験で使用した緩衝液／基質溶液
は次の濃度を有する溶液である。10mMのp.ニ
トロフエニルホスフエート、0.5mMの塩化マ
グネシウムおよび1.0mMのジエタノールアミ
ン／HCl緩衝液（PH9.8）。 例 ２ トロンビンとアンチトロンビンとの複合体の
定量的な免疫学的測定 ａ） 抗血清からの免疫グロブリンの単離 ヒト血漿からのアンチトロンビンに対する
またはヒトプロトロンビンに対する市販のうさ
ぎ抗血清をプロテアーゼおよびプロテアーゼ抑
制物質に対する特異抗体源として使用した。こ
れらの抗血清からIgG分画を既知方法により単
離し、塩を含有しない凍結乾燥した形で貯蔵し
た。 ｂ） ヒトアンチトロンビンに対する酵素標識
抗体の調製 ヒトアンチトロンビンに対する抗血清から
ａ）に従い単離した免疫グロブリン分画を標識
用酵素として子牛の小腸から得たアルカリ性ホ
スフアターゼに化学的に共有結合させ、こうし
て得られたIgGと酵素との共有結合体を例1e）
と同様にさらに処理した。 ｃ） プロトロンビンに対する抗体による試験容
器の被覆 ａ）に従い精製したヒトプロトロンビンに対
する抗血清からの免疫グロブリン分画をプラス
チツク容器上に吸着により不動化した。このた
めには、ポリスチレンの微滴定プレートを使用
し、その試験個所の各々に１ml（0.02のナトリ
ウムアジドを含有する0.15M塩化ナトリウム溶
液）当り50μｇの免疫グロブリンを含有する溶
液0.2mlを入れた。プレートを空気遮断するよ
うに密封し、４℃で一夜放置した。試験に使用
する前に、IgG含有溶液を除去した。容器を
0.05％の洗剤および0.02％のナトリウムアジド
をさらにまた含有する0.15M塩化ナトリウム溶
液で数回洗浄し、次に短時間通気乾燥させた。 ｄ） ヒトトロンビンとヒトアンチトロンビン
との分子結合体の調製 本試験の白血球用標品として使用するため
に、ヒトから得たトロンビンとアンチトロンビ
ンとの複合体を、これらの２種の成分の混合
物を高度に精製した形でインキユベートするこ
とにより生成させた。このためには、アンチト
ロンビン（ヘパリン補助因子）50単位および
ヘパリン50単位を10mMのPH7.5のトリス／
HCl緩衝液1.26ml中で37℃において30分間イン
キユベートした。次に同じ緩衝液50μ中のト
ロンビン50単位（酵素タンパク質16.7μgに相当
する）を混合物に加えた。37℃で２時間インキ
ユベートした後に、この反応溶液および適当な
稀釈工程をこの試験に使用した。 ｅ） トロンビン−アンチトロンビン複合体の
定量的測定 既知量のトロンビンを複合体結合した形で有
する標品0.2mlを、ｃ）に従いプロトロンビン
に対する抗体で被覆された、試験用に準備した
微滴定プレートの試験個所に導入した。既知量
の標品として、各種稀釈度でｄ）によるインキ
ユベート混合物をホスフエート緩衝塩類溶液に
入れた溶液を使用した。ブランク値を決定する
ために、酵素／抑制物質複合体を含有しない稀
釈液0.2mlを数個所に入れた。室温で２時間イ
ンキユベートした後に、全部の試験個所を吸引
により空にし、洗剤0.05％をさらに含有するホ
スフエート緩衝塩溶液で３回洗浄した。次い
で、ｂ）に従い調製したアンチトロンビンに
対する酵素標識抗体含有溶液0.2mlを各試験個
所に入れた。この溶液は事前に約300単位／
のAP活性に調整した。2mMの塩化マグネシウ
ム、0.025mMの塩化亜鉛、１％の卵白アルブ
ミン、1mMのドデシル硫酸ナトリウムおよび
0.02％の緩衝アジドをさらにまた含有する
10mMのトリス／HCl緩衝液（PH7.5）を稀釈
液として使用した。プレートを室温で空気遮断
して一夜インキユベートした。プレートを３回
洗浄し、次に短時間通気乾燥させた。次いで
AP試験のために、１個所当り0.2mlの稀釈液／
基質溶液を入れた。20分のインキユベーシヨン
時間の後に、反応混合物を試験個所からミクロ
セルに移し、吸光度を光度計で測定した。ゼロ
値用には稀釈液／基質溶液を使用した。プロテ
アーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体を含有す
る試験個所に増大した吸光度値が見られた。評
価するには、特定の個所で20分間インキユベー
トした後の稀釈液／基質溶液中で405nmにおい
て検出された吸光度を使用した複合体結合スロ
ンビンの計算量と比較した。 次表に20分の反応時間後に405nmにおける最
終吸光度値を抗原の量の凾数として示す。
プシン複合体の濃度がこの方法で定量的に測定
できることを示している。試料中の約0.4ngか
ら約6ngまでの複合体結合したエラスターゼの
量と測定された吸光度との間には厳密な相関関
係がある。本試験で使用した緩衝液／基質溶液
は次の濃度を有する溶液である。10mMのp.ニ
トロフエニルホスフエート、0.5mMの塩化マ
グネシウムおよび1.0mMのジエタノールアミ
ン／HCl緩衝液（PH9.8）。 例 ２ トロンビンとアンチトロンビンとの複合体の
定量的な免疫学的測定 ａ） 抗血清からの免疫グロブリンの単離 ヒト血漿からのアンチトロンビンに対する
またはヒトプロトロンビンに対する市販のうさ
ぎ抗血清をプロテアーゼおよびプロテアーゼ抑
制物質に対する特異抗体源として使用した。こ
れらの抗血清からIgG分画を既知方法により単
離し、塩を含有しない凍結乾燥した形で貯蔵し
た。 ｂ） ヒトアンチトロンビンに対する酵素標識
抗体の調製 ヒトアンチトロンビンに対する抗血清から
ａ）に従い単離した免疫グロブリン分画を標識
用酵素として子牛の小腸から得たアルカリ性ホ
スフアターゼに化学的に共有結合させ、こうし
て得られたIgGと酵素との共有結合体を例1e）
と同様にさらに処理した。 ｃ） プロトロンビンに対する抗体による試験容
器の被覆 ａ）に従い精製したヒトプロトロンビンに対
する抗血清からの免疫グロブリン分画をプラス
チツク容器上に吸着により不動化した。このた
めには、ポリスチレンの微滴定プレートを使用
し、その試験個所の各々に１ml（0.02のナトリ
ウムアジドを含有する0.15M塩化ナトリウム溶
液）当り50μｇの免疫グロブリンを含有する溶
液0.2mlを入れた。プレートを空気遮断するよ
うに密封し、４℃で一夜放置した。試験に使用
する前に、IgG含有溶液を除去した。容器を
0.05％の洗剤および0.02％のナトリウムアジド
をさらにまた含有する0.15M塩化ナトリウム溶
液で数回洗浄し、次に短時間通気乾燥させた。 ｄ） ヒトトロンビンとヒトアンチトロンビン
との分子結合体の調製 本試験の白血球用標品として使用するため
に、ヒトから得たトロンビンとアンチトロンビ
ンとの複合体を、これらの２種の成分の混合
物を高度に精製した形でインキユベートするこ
とにより生成させた。このためには、アンチト
ロンビン（ヘパリン補助因子）50単位および
ヘパリン50単位を10mMのPH7.5のトリス／
HCl緩衝液1.26ml中で37℃において30分間イン
キユベートした。次に同じ緩衝液50μ中のト
ロンビン50単位（酵素タンパク質16.7μgに相当
する）を混合物に加えた。37℃で２時間インキ
ユベートした後に、この反応溶液および適当な
稀釈工程をこの試験に使用した。 ｅ） トロンビン−アンチトロンビン複合体の
定量的測定 既知量のトロンビンを複合体結合した形で有
する標品0.2mlを、ｃ）に従いプロトロンビン
に対する抗体で被覆された、試験用に準備した
微滴定プレートの試験個所に導入した。既知量
の標品として、各種稀釈度でｄ）によるインキ
ユベート混合物をホスフエート緩衝塩類溶液に
入れた溶液を使用した。ブランク値を決定する
ために、酵素／抑制物質複合体を含有しない稀
釈液0.2mlを数個所に入れた。室温で２時間イ
ンキユベートした後に、全部の試験個所を吸引
により空にし、洗剤0.05％をさらに含有するホ
スフエート緩衝塩溶液で３回洗浄した。次い
で、ｂ）に従い調製したアンチトロンビンに
対する酵素標識抗体含有溶液0.2mlを各試験個
所に入れた。この溶液は事前に約300単位／
のAP活性に調整した。2mMの塩化マグネシウ
ム、0.025mMの塩化亜鉛、１％の卵白アルブ
ミン、1mMのドデシル硫酸ナトリウムおよび
0.02％の緩衝アジドをさらにまた含有する
10mMのトリス／HCl緩衝液（PH7.5）を稀釈
液として使用した。プレートを室温で空気遮断
して一夜インキユベートした。プレートを３回
洗浄し、次に短時間通気乾燥させた。次いで
AP試験のために、１個所当り0.2mlの稀釈液／
基質溶液を入れた。20分のインキユベーシヨン
時間の後に、反応混合物を試験個所からミクロ
セルに移し、吸光度を光度計で測定した。ゼロ
値用には稀釈液／基質溶液を使用した。プロテ
アーゼ／プロテアーゼ抑制物質複合体を含有す
る試験個所に増大した吸光度値が見られた。評
価するには、特定の個所で20分間インキユベー
トした後の稀釈液／基質溶液中で405nmにおい
て検出された吸光度を使用した複合体結合スロ
ンビンの計算量と比較した。 次表に20分の反応時間後に405nmにおける最
終吸光度値を抗原の量の凾数として示す。
【表】
【表】
このデータは使用された抗原の量と光度計測
定した酵素による指示反応との間に厳密な相関
関係があることを示している。この関係は実施
しようとするとトロンビン／アンチトロンビン
の定量的測定を可能にする。
定した酵素による指示反応との間に厳密な相関
関係があることを示している。この関係は実施
しようとするとトロンビン／アンチトロンビン
の定量的測定を可能にする。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被測定プロテアーゼ酵素に対する抗体を用い
てプロテアーゼ酵素を測定する方法であつて、プ
ロテアーゼ抑制物質によりプロテアーゼ酵素／プ
ロテアーゼ抑制物質複合体を形成しているプロテ
アーゼ酵素を水不溶性担体と結合したプロテアー
ゼ酵素抗体とインキユベートし、その試料溶液を
除去し、上記の酵素／抑制物質複合体で負荷され
ている洗浄された抗体担体を、上記の抑制物質に
対して特異的に反応する抗体と標識物質とから生
成されたカツプリング生成物と共にインキユベー
トし、結合しなかつたカツプリング生成物を除去
し、ついで固体相上の標識物質の濃度を被測定酵
素の濃度の尺度として測定することを特徴とする
プロテアーゼ酵素の免疫学的測定方法。 ２ 上記の被測定プロテアーゼ酵素が白血球から
のエラスターゼであり、そして上記の抑制物質が
α1−アンチトリプシンである、特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 ３ プロテアーゼ抑制物質と共にプロテアーゼ酵
素／プロテアーゼ抑制物質複合体を形成している
プロテアーゼ酵素を、水不溶性担体と結合した被
測定プロテアーゼ酵素に対する抗体とインキユベ
ートし、試料溶液を除去し、上記酵素／抑制物質
複合体で負荷されている洗浄された抗体担体を上
記抑制物質に対して特異的に反応する抗体と標識
物質とから生成されたカツプリング生成物と共に
インキユベートし、結合しなかつたカツプリング
生成物を除去し、ついで固体相上の標識物質の濃
度を上記被測定酵素の濃度の尺度として測定する
プロテアーゼ酵素の免疫学的測定方法を実施する
ための測定用具であつて、被測定プロテアーゼ酵
素に対する抗体で被覆された試験容器および上記
プロテアーゼ抑制物質に対して特異的に反応する
抗体と標識物質とから生成されたカツプリング生
成物からなる測定用具。 ４ 白血球からのエラスターゼに対する抗体で被
覆された試験容器およびα1−アンチトリプシンに
対して特異的に反応する抗体と標識酵素とから生
成されたカツプリング生成物からなる、特許請求
の範囲第３項に記載の測定用具。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19803016575 DE3016575A1 (de) | 1980-04-30 | 1980-04-30 | Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57551A JPS57551A (en) | 1982-01-05 |
| JPH0370184B2 true JPH0370184B2 (ja) | 1991-11-06 |
Family
ID=6101282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6430281A Granted JPS57551A (en) | 1980-04-30 | 1981-04-30 | Immunologic measuring method and means of enzyme |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0038935B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57551A (ja) |
| CS (1) | CS219900B2 (ja) |
| DD (1) | DD158676A5 (ja) |
| DE (2) | DE3016575A1 (ja) |
| IL (1) | IL62728A (ja) |
| ZA (1) | ZA812773B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023163176A1 (ja) * | 2022-02-28 | 2023-08-31 | 住友ベークライト株式会社 | セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬 |
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