WO2023163176A1 - セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬 - Google Patents

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哲也 屋鋪
拓也 曽根
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Definitions

  • the present invention relates to a reagent for detecting or measuring serine protease.
  • Biological samples are known to exist in a free state (free form) and in a conjugate state bound to a corresponding binding molecule.
  • trypsin which is a kind of serine protease
  • PSA prostate-specific antigen
  • a type of serine protease is known as a tumor marker for prostate cancer .
  • the ratio of the abundance of the free form to the abundance of the conjugate changes depending on the amount of bound molecules and the environment in vivo. I had to measure.
  • a substance is measured by an immunoassay method, there is a problem that the binding rate of the antibody differs between the free form and the complex, and accurate measurement cannot be performed.
  • Patent Document 1 (1) containing first insoluble carrier particles sensitized with a first monoclonal antibody capable of binding to a substance to be measured, which is a free substance and a conjugate, a first particle suspension, (2) a second insoluble carrier particle sensitized with a second monoclonal antibody that is capable of binding to the analyte of the educt and the conjugate and that does not compete with the first monoclonal antibody; and (3) a third particle suspension comprising third insoluble carrier particles sensitized with a third monoclonal antibody that does not recognize the free form analyte but recognizes the conjugate analyte.
  • a fluid-containing immunoagglutination assay reagent and a method using the same have been proposed.
  • Patent Document 2 at least one of three types of monoclonal antibodies having reactivity with both free and conjugated antigens and having different recognition sites is used as a carrier having a smaller particle size.
  • a measurement reagent and a measurement method using the same have been proposed in which the reactivities of free and conjugated antigens are adjusted by sensitizing the remaining monoclonal antibody to a carrier having a larger particle size.
  • a measurement method has been proposed that includes a step (2) of reacting a reactant 1 with a latex 2 immobilized with a monoclonal antibody 2 having a recognition site different from that of a substance to be measured, to obtain a reactant 2.
  • Patent Document 4 a latex 1 immobilized with a monoclonal antibody 1 reactive with both the PSA educt and the PSA conjugate, and an antibody 1 having a different recognition site for PSA, binding to the PSA educt
  • a reagent for measuring PSA containing a latex 2 having an average particle size different from that of the latex 1 on which a monoclonal antibody 2 reactive with both of the body is immobilized and a measuring method using the reagent have been proposed.
  • Patent Document 5 discloses an anti-PSA monoclonal antibody that reacts with both a free form and a conjugate of PSA.
  • a PSA measurement method and a PSA measurement reagent used in the method have been proposed in which a carrier is sensitized and brought into contact with a sample in the coexistence of an aggregation promoter.
  • the purpose of the present invention is to provide new reagents and methods for detecting or measuring both free and bound serine proteases in a sample with high sensitivity and accuracy.
  • the present inventors have found that the serine protease is released from the conjugate by detecting and measuring the serine protease in the sample in the presence of a predetermined surfactant. As a result, all or part of the immunologically measurable serine protease contained in the sample can be detected with high sensitivity and accuracy regardless of the existence form (free form, conjugate) and their abundance ratio.
  • the present invention was completed by discovering that it can be detected or measured by That is, the present invention includes the following aspects. 1.
  • Item 1 The reagent according to Item 1, Reagent A1 and Reagent B1 as follows: (A1) reagent A1 containing surfactant A, (B1) Reagent B1, comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof against said serine protease including When measuring the sample, the sample, reagent A1 and reagent B1 are mixed, reagent. 3.
  • the reagent according to item 2 wherein the content of the surfactant in the mixture of the sample and A1 and B1 is 0.02% by weight or more at the time of measurement of the sample. 4.
  • Item 4 The reagent according to Item 3, wherein the content of the surfactant in the mixture of the sample and A1 and B1 is 0.03 to 3% by weight when the sample is measured. 5.
  • Item 5. The reagent according to any one of Items 1 to 4, wherein the surfactant comprises at least one selected from the group consisting of nonionic surfactants and amphoteric surfactants. 6.
  • the surfactants include polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyethylene glycol mono-4-octylphenyl ether, octylphenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol, and 3-[(3 Item 5.
  • the immunoassay reagent is an enzyme immunoassay method, a fluorescence enzyme immunoassay method, a chemiluminescence enzyme immunoassay method, a chemiluminescence immunoassay method, an electrochemiluminescence immunoassay method, a fluorescent antibody method, a radioimmunoassay, or a Western blot.
  • Item 9 The reagent according to Item 8, which is a reagent for use in at least one immunoassay method selected from the group consisting of method, immunoblot method, latex agglutination method, and immunochromatographic method. 10. Item 9.
  • the reagent according to Item 8, wherein the immunoassay reagent is a reagent for using a latex agglutination method.
  • Item 11 The reagent according to Item 10, wherein the latex particles in the reagent for using the latex agglutination method have an average particle size of 100 to 500 nm.
  • Item 12 The reagent according to any one of Items 1 to 11, wherein the serine protease is selected from the group consisting of trypsin, elastase, and prostate specific antigen.
  • Item 12 The reagent according to any one of Items 1 to 11, wherein the serine protease is trypsin. 14.
  • Item 15 The reagent according to Item 14, wherein the serine protease is trypsin and the disease associated with the protease is pancreatic disease.
  • a method for diagnosing a disease associated with a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule comprising: (1) contacting the sample with the reagent according to any one of Items 1 to 15; (2) detecting or measuring a serine protease; (3) A method comprising judging the state of a disease associated with the serine protease based on the obtained detection result or measurement value. 19.
  • a method for aiding diagnosis of diseases associated with serine proteases that can exist in vivo in the form of conjugates with corresponding binding molecules comprising: (1) contacting the sample with the reagent according to any one of Items 1 to 15; (2) detecting or measuring a serine protease; (3) A method comprising assisting in determining the state of a disease associated with the serine protease based on the obtained detection result or measurement value.
  • a method of collecting data for diagnosing a disease associated with a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule comprising: (1) contacting the sample with the reagent according to any one of Items 1 to 15; (2) detecting or measuring a serine protease; (3) A method comprising collecting data for determining the state of a disease associated with the serine protease based on the obtained detection result or measurement value.
  • Item 21 The method according to any one of Items 18 to 20, wherein the serine protease is trypsin and the disease associated with the serine protease is pancreatic disease. 22.
  • a and B below for producing a reagent for detection or measurement of a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule (A) a surfactant; (B) Use of an antibody or antigen-binding fragment thereof against said serine protease.
  • immunologically measurable all or part of serine protease contained in a sample can be detected with high sensitivity and accuracy regardless of the existence form (free form, conjugate) and their abundance ratio. can be detected or measured at Furthermore, according to the present invention, serine protease in a sample can be detected or measured with high sensitivity and accuracy. and to determine the severity of the disease.
  • FIG. 1 shows trypsin concentration in each serum sample measured using reagents with each surfactant concentration (0%, 0.3%, 0.5%, 0.75% or 1.0% Tween20). Show the results.
  • serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule refers to a serine protease that can exist in vivo either alone or in a state bound to a corresponding binding molecule. is not particularly limited.
  • the "corresponding binding molecule” means a substance that has affinity for a serine protease and can bind to the serine protease in vivo to form a conjugate. Examples of such serine proteases include trypsin, elastase, prostate-specific antigen (PSA) and the like, preferably trypsin.
  • the binding molecule corresponding to the above is not particularly limited, but for example, when the serine protease is trypsin, ⁇ 1- antitrypsin or ⁇ 2- macroglobulin can be mentioned, when elastase is ⁇ 1 -protease inhibitor, PSA include ⁇ 1 -antichymotrypsin or protein C inhibitors.
  • diseases associated with serine protease include, for example, when the serine protease is trypsin, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, pancreatic cancer, pancreatitis such as papillitis, or pancreatic diseases such as pancreatic juice stasis. Diseases, cholelithiasis, biliary tract cancer, renal failure, etc., especially pancreatic diseases.
  • pancreatic diseases such as pancreatic cancer, gastric cancer, liver cirrhosis, liver cancer, bile duct cancer, lung cancer, etc., particularly pancreatic diseases.
  • prostatic cancer benign prostatic hyperplasia, prostatitis, etc. are mentioned, especially prostatic cancer.
  • the "antibody or antigen-binding fragment thereof against serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule” as used herein is particularly limited as long as it has specific binding ability to the serine protease. not.
  • the "antibody” may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody may be a commercially available product, or may be produced according to known methods such as cell fusion technology, gene recombination technology, phage display, etc. using serine protease or a portion thereof as an antigen.
  • the above-mentioned "antigen-binding fragment” means a fragment of the above-mentioned antibody, which is capable of binding to a serine protease.
  • examples include F(ab')2 fragments obtained by partial decomposition, Fab' fragments obtained by reducing F(ab')2 fragments, and the like.
  • Preferred are monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the "surfactant” used herein includes, for example, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, etc.
  • nonionic surfactants include polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (trade name Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (trade name Tween 80), and polyethylene glycol mono-4-octyl. Phenyl ether (trade name Triton X-100), octylphenoxypoly(ethyleneoxy) ethanol (trade name Nonidet (R) P40), and the like.
  • Specific examples of amphoteric surfactants include 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS).
  • Nonionic surfactants are preferred, particularly polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate.
  • diagnosis refers to determining the current or future status of a disease.
  • severity includes mild, moderate, severe, etc.
  • severe includes mild to moderate or severe, and moderate to severe. mentioned.
  • development refers to the appearance of disease symptoms.
  • samples include, for example, biological samples collected from human subjects, particularly blood samples prepared from blood.
  • blood sample as used herein means a sample containing at least a portion of blood components, and may be whole blood, serum, plasma, or a diluted product thereof.
  • the blood sample is preferably serum or plasma, more preferably serum. Preparation of blood samples can be performed by known methods.
  • One embodiment of the present invention is a reagent for detecting or measuring a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule, A and B below: (A) a surfactant; (B) an antibody or antigen-binding fragment thereof against the serine protease; Contains reagents.
  • the content of the surfactant in the above reagent is not particularly limited, it is, for example, 0.02% by weight or more, preferably 0.03 to 3% by weight, based on the total amount of the reagent.
  • the configuration, shape, state, etc. of the reagent are not particularly limited.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof (hereinafter collectively referred to as "antibody” unless otherwise specified) may be of one type or two or more types.
  • the antibody may be immobilized on a support.
  • the support can be appropriately selected according to the method of using the reagent.
  • the support include well plates (eg, 96-well microplates, etc.), membranes (eg, nitrocellulose membranes, polyvinylidene fluoride membranes, etc.), glass slides, magnetic beads, latex particles and the like. Immobilization of the antibody to the support can be performed by a known method selected according to the material of the support.
  • both the first antibody and the second antibody may be antibodies, one may be an antibody and the other may be an antigen-binding fragment, or both may be antigen-binding fragments.
  • the antibody may be labeled.
  • Labeling substances for labeling are not particularly limited, and known ones may be used. Examples of labeling substances include enzyme labels such as peroxidase and alkaline phosphatase; fluorescent labels such as fluorescein isothiocyanate (FITC); radioisotope labels such as iodine 125; electrochemiluminescence labels such as ruthenium complexes; etc. Labeling of antibodies or antigen-binding fragments thereof can be performed by known methods selected according to the type of labeling substance.
  • the reagent can contain a buffer solution. Any buffer may be used as long as it does not prevent the antibody from binding to the serine protease.
  • MES buffer HEPES buffer
  • phosphate buffer Tris buffer
  • Good's buffer glycine buffer
  • borate buffer borate buffer
  • concentration of the buffering agent in the buffer solution is usually selected appropriately from the range of 10 to 500 mM, preferably 10 to 300 mM.
  • the above reagents can contain additives known in the art in amounts that do not interfere with antibody binding to serine proteases. Examples include buffers, preservatives (sodium azide, etc.), proteins (albumin), water-soluble polymers (saccharides, polyethylene glycol, dextran, etc.), salts (sodium chloride, amino acids, etc.), and the like.
  • the reagent may be in the form of a kit containing the reagent and other elements.
  • Other components include, for example, detection reagents for labeled substances, standard samples for serine proteases, blood sample preparation reagents, diluents, supports, instructions for use, and the like.
  • each component such as the antibody, surfactant, buffer solution, and additive may be divided into two or more separate reagents.
  • reagent A1 and reagent B1 include, for example, the following reagent A1 and reagent B1: (A1) reagent A1 containing surfactant A, (B1) Reagent B1, comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof against said serine protease including When measuring the sample, the sample, reagent A1 and reagent B1 are mixed, and reagents.
  • the sample is mixed with the reagent A1 and the reagent B1 when the sample is measured, and the mixing conditions at that time are conditions that do not interfere with the binding reaction (antigen-antibody reaction) between the serine protease to be measured and the antibody. , is not particularly limited.
  • the content of the surfactant in the mixture of the sample, reagent A1, and reagent B1 at the time of sample measurement is not particularly limited, but is, for example, 0.02% by weight or more, preferably 0.03 to 3% by weight, Especially 0.05 to 1% by weight.
  • the content of the surfactant in the mixture obtained by mixing the reagent A1 with the sample is within the predetermined range when measuring the sample. It may be a composition containing a surfactant.
  • the reagent A1 may contain the buffer solution, additives, etc. in addition to the surfactant.
  • the reagent B1 may contain the buffer solution, additives, and the like. The components contained in these reagents A1 and B1 may be appropriately determined in consideration of the stability and handleability of each reagent.
  • reagents for use in immunological assays include reagents for use in immunological assays (reagents for immunological assays). Specifically, enzyme immunoassay, fluorescence enzyme immunoassay, chemiluminescent enzyme immunoassay chemiluminescence immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay, fluorescent antibody assay, radioimmunoassay, western blotting, immunoblotting, latex agglutination, immunochromatography, nephelometry, etc. mentioned. Preferred are reagents for use in latex agglutination methods. These may be commercially available or prepared according to known methods.
  • latex reagent When the above reagent is a reagent using the latex agglutination method (hereinafter referred to as "latex reagent"), latex known in the art can be used. Examples thereof include styrene latex such as polystyrene latex, acrylic latex, various modified latexes (for example, carboxylic acid modified latex obtained by introducing a carboxyl group into the above polystyrene), colored latex, and fluorescent latex.
  • the above latex can be produced by a known method, but may be commercially available. Two or more kinds of the latex may be used in combination.
  • the average particle size of the latex particles in the latex reagent is not particularly limited, but for example, aggregates generated by antigen-antibody reaction between the antigenic substance to be measured and the antibody exhibit a size that can be detected with the naked eye or optically. is mentioned. Specifically, it is, for example, 100 to 500 nm. Moreover, two or more kinds of average particle sizes of the latex particles may be used. "Average particle size" as used herein means a numerical value measured by a dynamic light scattering method.
  • the latex reagent includes latex particles bound with antibodies against serine proteases.
  • a method for binding an antibody to latex is not particularly limited, and includes known methods. For example, an antibody and latex are mixed in a buffer of pH 5.0 to 10.0, reacted at 20 to 30° C. for 2 to 3 hours, and then centrifuged, blocked, heated (aged), etc. Latex and antibodies can be bound by performing known post-treatments. As the buffer solution at this time, the buffer solution contained in the reagent described above may be used.
  • the action of the surfactant separates the serine protease from the binding molecule and releases the serine protease. Therefore, it is possible to detect or measure not only the serine protease present in the sample as a free form, but also the serine protease present in the form of a conjugate. Therefore, the above reagent can accurately detect serine protease, which exists in both a free form and a bound form in vivo, and whose abundance ratio may vary depending on the in vivo environment. Accurate measurement is possible.
  • the amount or concentration of serine protease can be used as a cut-off value to diagnose diseases associated with serine proteases and can be used, for example, to determine the severity of
  • One embodiment of the present invention is a method for detecting or measuring a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule, comprising: (1) contacting the sample with the reagent; (2) A method comprising detecting or measuring a serine protease.
  • the sample in the above method includes a sample to be measured using the above reagent.
  • the reagent used in the above method one or more antibodies may be used, and one or two or more surfactants may be used.
  • the above method can be performed using one or more of the above reagents.
  • the above step (1) is a step of binding the antibody contained in the reagent to the serine protease contained in the sample by contacting the reagent with the sample. Therefore, the process is not particularly limited as long as it is carried out under conditions in which the serine protease and the antibody can bind. For example, it can be performed according to known immunoassay methods.
  • the step (2) is a step of detecting or measuring the conjugate of the serine protease and the antibody obtained in the step (1).
  • Methods for detecting or measuring the conjugate are not particularly limited, and include known qualitative or quantitative methods.
  • known immunoassay methods specifically, enzyme immunoassay, fluorescence enzyme immunoassay, chemiluminescent enzyme immunoassay, chemiluminescence immunoassay, electrochemiluminescence Examples include immunoassay, fluorescent antibody method, radioimmunoassay, western blotting, immunoblotting, latex agglutination, immunochromatography, and nephelometry.
  • the degree of agglutination caused by the antigen-antibody reaction between the serine protease and the antibody bound to the latex particles is measured using, for example, absorbance, and obtained in advance.
  • concentration of serine protease in the sample can be determined from the standard curve obtained.
  • the absorbance measurement wavelength is usually 340 to 1000 nm, preferably 500 to 900 nm.
  • the degree of aggregation is not limited to absorbance, and can be measured by known methods such as nephelometry and counting immunoassay.
  • one embodiment of the present invention is a method for diagnosing a disease associated with a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule, comprising: (1) contacting the sample with the reagent; (2) detecting or measuring a serine protease; (3) A method comprising judging the state of a disease associated with the serine protease based on the obtained detection result or measurement value.
  • Steps (1) and (2) in the above diagnostic method can be performed in the same manner as in the above detection or measurement method.
  • Step (3) in the above diagnostic method includes, for example, diagnosing using the detection result or measured value (concentration, amount) of serine protease as an indicator, for example, determining a cutoff value and evaluating severity based on the cutoff value. including evaluation, prediction of onset or aggravation, or assessment of onset or aggravation risk, and the like.
  • a method for assisting diagnosis of a disease associated with a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule comprising: (1) contacting the sample with the reagent; (2) detecting or measuring a serine protease; (3) A method comprising assisting in determining the state of a disease associated with said serine protease based on the detection results or measurements obtained.
  • Steps (1) and (2) in the above method for assisting diagnosis can be performed in the same manner as in the above detection or measurement method.
  • Step (3) in the method for assisting diagnosis is, for example, diagnosing using the detection result or measured value (concentration, amount) of serine protease as an index, for example, determining a cutoff value, and based on the cutoff value
  • a doctor's judgment such as evaluating the severity, predicting the onset or aggravation, or evaluating the risk of onset or aggravation
  • assisting the judgment e.g., detection results or measured values collection, organization, and provision to physicians).
  • the present invention provides, as one embodiment, a data collection method for diagnosing a disease associated with a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule, comprising: (1) contacting the sample with the reagent; (2) detecting or measuring a serine protease; (3) A method comprising collecting data for determining the state of a disease associated with the serine protease based on the detection results or measurements obtained.
  • Steps (1) and (2) in the above data collection method can be performed in the same manner as in the above detection or measurement method.
  • Step (3) in the above data collection method is, for example, diagnosing using the detection result or measured value (concentration, amount) of serine protease as an index, for example, determining a cutoff value, and severe disease based on the cutoff value
  • Collecting data eg, detection results or measurements
  • the process also includes organizing data, providing data to doctors, and the like.
  • a and B for producing a reagent for detecting or measuring a serine protease that can exist in vivo in the form of a conjugate with a corresponding binding molecule (A) a surfactant; (B) Use of an antibody or antigen-binding fragment thereof against said serine protease.
  • a and B (A) a surfactant; (B) Use of an antibody or antigen-binding fragment thereof against said serine protease.
  • the reagents for detecting or measuring serine proteases in the above uses, reagents for use in diagnosing diseases associated with serine proteases, and (A) surfactants and (B) antibodies or antigen-binding fragments thereof are described above. It is the same as a thing.
  • Antibody A and antibody B were obtained according to the following procedure.
  • (immunogen) 1 mg of purified human trypsin (manufactured by SCRIPPS, Cat. No. T0614, purity ⁇ 95%) was dissolved in 5 mL of a physiological saline solution containing 1 mM TLCK (Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride, Nacalai, Code 34219-94). , 37° C. for 30 minutes, dialyzed against a physiological saline solution, and used.
  • TLCK Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride, Nacalai, Code 34219-94
  • the above immunogen was suspended in an adjuvant (Complete Freund's adjuvant: CFA, manufactured by GIBCO), and BALB/c mice (5 weeks old, female) were immunized with 25 ⁇ g trypsin/mouse at intervals of 2 weeks. Partial blood sampling was performed on the way, and the degree of increase in titer at the antiserum level was confirmed using the reactivity with the immunogen, trypsin, as an index. After confirming that the antibody titer had sufficiently increased by multiple immunizations, the physiological saline solution of the immunogen was administered intraperitoneally or intravenously.
  • an adjuvant Complete Freund's adjuvant: CFA, manufactured by GIBCO
  • Antibody-producing cells were collected from the spleen and fused with myeloma (P3X63Ag8.653, ECACC). Cell fusion was performed by the PEG method, and the fused cells were seeded on culture plates. After that, it was cultured in a carbon dioxide gas incubator at 37°C. (screening) The culture supernatant of each well into which the fused cells were dispensed was collected, and the antibody titer was confirmed using reactivity with trypsin as an index. Then, cells of antibody-producing clones were subcultured, and cloning was performed by the limiting dilution method.
  • the resulting single colony-derived cells were used as anti-human trypsin monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • (Monoclonal antibody preparation) Next, the resulting monoclonal antibody-producing hybridomas were mass-cultured. Pristane (manufactured by Sigma-Aldrich) was previously administered intraperitoneally, and hybridomas were administered to BALB/c mice. After breeding for 10 to 25 days and waiting for ascites to accumulate, the ascites was collected, and the resulting ascites antibody was salted out with ammonium sulfate and affinity purified to obtain mouse anti-human trypsin monoclonal antibody.
  • Pristane manufactured by Sigma-Aldrich
  • each antibody was sensitized to latex, and a combination of two types of antibody A and antibody B, which are considered to have large signals and different epitopes, was determined using the signal strength of latex agglutination as an index. Obtained.
  • Antibody A-sensitized latex ⁇ liquid and antibody B-sensitized latex ⁇ liquid were prepared according to the following materials and methods.
  • Antibody B solution 4.5 mg/mL Antibody B, 40 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.4)
  • - MES buffer 1% BSA, 20 mM MES (pH 6.0), 0.05% NaN3 - HEPES buffer: 2% BSA, 20 mM HEPES (pH 7.0), 150 mM NaCl 0.05% NaN3 (Method) 500 ⁇ L of latex solution (10% w/vol) and 500 ⁇ L of antibody A
  • Reagent A and Reagent B were prepared having the following compositions.
  • Reagent A was prepared by mixing each component to a predetermined amount or concentration.
  • Reagent B was prepared by mixing the respective antibody-sensitized latex solutions ⁇ and ⁇ in equal proportions, and further mixing other components so as to have a predetermined amount or concentration.
  • Reagent A composition - 0%, 0.3%, 0.5%, 0.75% or 1.0% Tween20, - 0.5% polyethylene glycol (PEG) (5000-50000), - 0.5% bovine serum albumin (BSA), - 150mM NaCl, - 0.09% NaN3 , ⁇ 100 mM HEPES buffer (pH 7.6)
  • Reagent B composition - 0.5% BSA, - 150mM NaCl, - 0.09% NaN3 , ⁇ 100 mM HEPES buffer (pH 7.0) ⁇ Antibody A-sensitized latex ⁇ liquid ⁇ Antibody B-sensitized latex ⁇ liquid
  • Test Example 1 (1) Take 4 ⁇ L of each of the following serum samples and add 96 ⁇ L of Reagent A (0%, 0.3%, 0.5%, 0.75% or 1.0% Tween 20) of Example 1 above. Mix and warm to 37° C. for about 5 minutes. 24 ⁇ L of reagent B was added to this mixed solution and mixed, and the absorbance at a wavelength of 700 nm was measured after reacting at 37° C. for about 5 minutes.
  • Reagent A 0%, 0.3%, 0.5%, 0.75% or 1.0% Tween 20
  • Serum 1 commercially available pooled serum (manufactured by Biopredic, trade name: Human Serum)
  • Serum 2 Serum prepared from pancreatic cancer patient (male, 65 years old)
  • Serum 3 Serum prepared from acute pancreatitis patient (male, 36 years old)
  • Serum 4 Serum prepared from chronic pancreatitis patient (female, 79 years old)

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Abstract

本発明は、試料中の遊離体および結合体の両方のセリンプロテアーゼを、高感度かつ高精度で検出または測定する新たな試薬および方法、より詳細には、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬であって、以下のＡおよびＢ：　（Ａ）界面活性剤、　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント を含む、試薬並びにその試薬を用いた該セリンプロテアーゼの検出または測定に関する。

Description

セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬
　本特許出願は、日本国特許出願第２０２２－０２９５８０号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本発明は、セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬に関する。
　医学分野や臨床検査分野において、血液などの生体試料から、疾患に関連する微量な特定物質を高精度で検出または測定し、疾患の発症や重症度を判断しようとする試みが以前から盛んに行われている。生体試料中の特定物質を検出または測定する方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法が広く知られている。
　生体試料中には、遊離の状態のもの（遊離体）と、それに対応する結合分子と結合した結合体の状態で存在する物質が知られている。例えば、トリプシンは、セリンプロテアーゼの一種であるが、遊離体としてもα１アンチトリプシンなどとの結合体としても血液中に存在し、膵疾患などの疾患を患う患者では血液中の濃度が健常者よりも高くなるため、膵疾患のマーカーとして有用である。また、その他の例として、セリンプロテアーゼの一種である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、前立腺癌の腫瘍マーカーとして知られているが、遊離体であるＰＳＡの他、ＰＳＡとα１－アンチキモトリプシンなどとの結合体で血液中に存在することが知られている。
　このような物質は、結合分子の量や生体内の環境などにより、遊離体の存在量と結合体の存在量の比率が変化するため、測定する際には、遊離体と結合体の両者を測定する必要があった。しかしながら、このような物質を、免疫学的測定方法で測定すると、抗体の結合率が遊離体と複合体の間で異なってしまい、精度よく測定することができないという問題点があった。
　このような問題を解決するための従来技術として、例えば特許文献１では、（１）遊離体および結合体の測定対象物質に結合可能な第１モノクローナル抗体を感作した第１不溶性担体粒子を含む第１粒子懸濁液、（２）遊離体および結合体の測定対象物質に結合可能であって、さらに第１モノクローナル抗体と競合しない第２モノクローナル抗体を感作した第２不溶性担体粒子を含む第２粒子懸濁液、及び、（３）遊離体の測定対象物質は認識しないが結合体の測定対象物質を認識する第３モノクローナル抗体を感作した第３不溶性担体粒子を含む第３粒子懸濁液を含む免疫凝集測定用試薬およびそれを用いる方法が提案されている。
　また、特許文献２では、遊離体および結合体の抗原の両方に反応性を有し、かつ、それぞれ認識部位が異なる３種類のモノクローナル抗体のうち、少なくとも１種類を、粒径が小さい方の担体に感作し、残りのモノクローナル抗体を粒径が大きい方の担体に感作することにより遊離体および結合体の抗原の反応性を調整する測定試薬およびそれを用いる測定方法が提案されている。
　また、特許文献３では、遊離体および結合体の測定対象物質を含む検体と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１とを反応させて反応体１を得る工程（１）、抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２と、反応体１とを反応させて反応体２を得る工程（２）を含む、測定方法が提案されている。
　さらに、特許文献４では、ＰＳＡの遊離体と結合体の両者と反応性を有するモノクローナル抗体１が固定化されたラテックス１と、抗体１とはＰＳＡに対する認識部位が異なる、ＰＳＡの遊離体と結合体の両者と反応性を有するモノクローナル抗体２が固定化された、ラテックス１とは平均粒径の異なるラテックス２とを含む、ＰＳＡ測定用試薬およびそれを用いる測定方法が提案されている。
　さらにまた、特許文献５には、遊離体および結合体のＰＳＡの双方に反応する抗ＰＳＡモノクローナル抗体であって、互いにエピトープを異にする２種の抗ＰＳＡモノクローナル抗体で、所定の粒子径の不溶性担体を感作し、凝集促進剤の共存下で、試料と接触させるＰＳＡの測定方法およびそれに用いるＰＳＡ測定用試薬が提案されている。
特開２００１－１０８６８１号公報 ＷＯ２００６／０６８２０６パンフレット 特開２００７－１６３３１９号公報 特開２００５－１０６６０９号公報 ＷＯ２０１２／１３３４８２パンフレット
　本発明は、試料中の遊離体および結合体の両方のセリンプロテアーゼを、高感度かつ高精度で検出または測定する新たな試薬および方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、試料中のセリンプロテアーゼの検出および測定を、所定の界面活性剤の存在下で行うことで、結合体からセリンプロテアーゼを遊離させることができ、その結果、試料中に含まれる免疫学的に測定可能な全て又は一部のセリンプロテアーゼを、存在形態（遊離体、結合体）およびそれらの存在比にかかわらず、高感度かつ高精度で検出または測定できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
１．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬であって、
以下のＡおよびＢ：
　（Ａ）界面活性剤、
　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
を含む、
試薬。
２．項１に記載の試薬であって、
以下の試薬Ａ１および試薬Ｂ１：
　（Ａ１）界面活性剤Ａを含む試薬Ａ１、
　（Ｂ１）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、試薬Ｂ１
を含み、
試料の測定時に、試料と試薬Ａ１と試薬Ｂ１が混合される、
試薬。
３．前記試料の測定時において、試料とＡ１とＢ１の混合物中の前記界面活性剤の含有量が、０．０２重量％以上である、項２に記載の試薬。
４．前記試料の測定時において、試料とＡ１とＢ１の混合物中の前記界面活性剤の含有量が、０．０３～３重量％である、項３に記載の試薬。
５．前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１～４のいずれかに記載の試薬。
６．前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、および３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネートからなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１～４のいずれかに記載の試薬。
７．前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含む、項１～４のいずれかに記載の試薬。
８．前記試薬が、免疫学的測定用試薬である、項１～７のいずれかに記載の試薬。
９．前記免疫学的測定用試薬が、酵素免疫測定法、蛍光酵素免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光測免疫測定法、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、イムノブロット法、ラテックス凝集法、およびイムノクロマトグラフィー法からなる群から選択される少なくとも１種の免疫学的測定法に用いるための試薬である、項８に記載の試薬。
１０．前記免疫学的測定用試薬が、ラテックス凝集法を用いるための試薬である、項８に記載の試薬。
１１．前記ラテックス凝集法を用いるための試薬中のラテックス粒子の平均粒子径が、１００～５００ｎｍである、項１０に記載の試薬。
１２．前記セリンプロテアーゼが、トリプシン、エラスターゼ、および前立腺特異抗原からなる群から選択される、項１～１１のいずれかに記載の試薬。
１３．前記セリンプロテアーゼが、トリプシンである、項１～１１のいずれかに記載の試薬。
１４．セリンプロテアーゼに関連する疾患の診断に用いるための、項１～１３のいずれかに記載の試薬。
１５．前記セリンプロテアーゼがトリプシンであり、前記プロテアーゼに関連する疾患が膵疾患である、項１４に記載の試薬。
１６．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定方法であって、
（１）項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること
を含む、方法。
１７．前記試料が、血清または血漿である、項１６に記載の方法。
１８．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断方法であって、
（１）項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
（３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断すること
を含む、方法。
１９．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断を補助する方法であって、
（１）項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
（３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断することを補助すること
を含む、方法。
２０．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患を診断するためのデータの収集方法であって、
（１）項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
（３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断するためのデータを収集すること
を含む、方法。
２１．前記セリンプロテアーゼがトリプシンであり、前記セリンプロテアーゼに関連する疾患が膵疾患である、項１８～２０のいずれかに記載の方法。
２２．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬を製造するための、以下のＡおよびＢ：
　（Ａ）界面活性剤、
　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
の使用。
２３．対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断用試薬を製造するための、以下のＡおよびＢ：
　（Ａ）界面活性剤、
　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
の使用。
　本発明によれば、試料中に含まれる免疫学的に測定可能な全て又は一部のセリンプロテアーゼを、存在形態（遊離体、結合体）およびそれらの存在比にかかわらず、高感度かつ高精度で検出または測定することができる。
　さらに、本発明によれば、試料中のセリンプロテアーゼを高感度かつ高精度で検出または測定することできるので、セリンプロテアーゼの量または濃度をカットオフ値などとして用いることにより、セリンプロテアーゼに関連する疾患の診断や、その疾患の重症度の決定などに用いることができる。
図１は、各界面活性剤濃度（０％、０．３％、０．５％、０．７５％または１．０％Ｔｗｅｅｎ２０）の試薬を用いて、各血清試料中のトリプシン濃度を測定した結果を示す。
　本明細書における「対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼ」は、生体内に単独で、または対応する結合分子と結合した状態で存在し得るセリンプロテアーゼであれば、特に限定されない。ここで、「対応する結合分子」は、セリンプロテアーゼに対して親和性を有し、該セリンプロテアーゼと生体内で結合し、結合体を形成し得る物質を意味する。このようなセリンプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、エラスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などが挙げられ、好ましくは、トリプシンが挙げられる。
　上記対応する結合分子としては、特に限定されないが、例えば、セリンプロテアーゼがトリプシンである場合、α１アンチトリプシンまたはα２マクログロブリンが挙げられ、エラスターゼの場合、α１－プロテアーゼインヒビターが挙げられ、ＰＳＡの場合、α１－アンチキモトリプシンまたはプロテインＣインヒビターが挙げられる。
　本明細書における「セリンプロテアーゼに関連する疾患」としては、例えば、セリンプロテアーゼがトリプシンの場合、急性膵炎、慢性膵炎、膵癌、乳頭炎などの膵炎、あるいは膵液うっ滞を合併しやすい疾患などの膵疾患、胆石症、胆道癌、腎不全などが挙げられ、特に膵疾患が挙げられる。
　エラスターゼの場合、急性膵炎、慢性膵炎、膵癌などの膵疾患、胃癌、肝硬変、肝癌、胆管癌、肺癌などが挙げられ、特に膵疾患が挙げられる。
　ＰＳＡの場合、前立腺癌、前立腺肥大症、前立腺炎などが挙げられ、特に前立腺癌が挙げられる。
　本明細書における「対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント」は、上記セリンプロテアーゼに特異的結合能を有するものであれば特に限定されない。
　上記「抗体」は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよい。また、当該抗体は、市販品でもよく、セリンプロテアーゼまたはその一部分を抗原として用いて細胞融合技術、遺伝子組換え技術、ファージディスプレイ等の既知の方法にしたがって生産したものでもよい。
　また、上記「抗原結合フラグメント」は、上記抗体のフラグメントであって、セリンプロテアーゼに結合能を有するフラグメントを意味し、例えば、上記抗体をパパイン等で部分分解して得られるＦａｂフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを還元処理して得られるＦａｂ’フラグメント等が挙げられる。
　好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが挙げられる。
　本明細書における「界面活性剤」としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられ、
　非イオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ　２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（商品名Ｔｗｅｅｎ　８０）、ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（商品名Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）、オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（商品名Ｎｏｎｉｄｅｔ（Ｒ）　Ｐ４０）などが挙げられる。
　両性界面活性剤の具体例としては、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）などが挙げられる。
　好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられ、特にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートが挙げられる。
　本明細書において「診断」とは、疾患の現在または未来の病状を判定することをいう。
　本明細書において、「重症度」としては、軽症、中等症、重症等が挙げられ、「重症化」としては、軽症から中等症または重症への重症化、中等症から重症への重症化が挙げられる。
　本明細書において「発症」とは、疾患の症状が現れることをいう。
　本明細書における「試料」としては、例えば、ヒト被験者から採取された生体試料、特に血液から調製した血液試料が挙げられる。本明細書における「血液試料」とは、血液成分の少なくとも一部を含む試料を意味し、全血、血清、および血漿のいずれであってもよく、これらを希釈したものであってもよい。血液試料は、好ましくは血清または血漿であり、より好ましくは血清である。血液試料の調製は、既知の方法で行うことができる。
　本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬であって、
以下のＡおよびＢ：
　（Ａ）界面活性剤、
　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
を含む、
試薬を含む。
　上記試薬において、界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、試薬全体の０．０２重量％以上であり、好ましくは０．０３～３重量％である。
　上記試薬の構成、形状、状態などは、特に限定されない。
　また、上記試薬において、上記抗体またはその抗原結合フラグメント（以下、特に言及しない限り「抗体」と総称する）は、１種でもよく、２種以上でもよい。
　上記試薬において、上記抗体は、支持体に固定化されていてもよい。支持体は、当該試薬を用いる方法に応じて、適宜選択することができる。支持体としては、例えば、ウェルプレート（例、９６ウェルマイクロプレートなど）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜、ポリフッ化ビニリデン膜など）、スライドガラス、磁気ビーズ、ラテックス粒子等が挙げられる。抗体の支持体への固定化は、支持体の材質に応じて選択した既知の方法により行うことができる。
　上記抗体が支持体に固定されている場合、上記セリンプロテアーゼの異なるエピトープに結合する第二の抗体を含んでいてもよい。
　この場合、第一の抗体と第二の抗体の両方が抗体でもよく、一方が抗体であり、他方が抗原結合フラグメントでもよく、両方が抗原結合フラグメントでもよい。
　また、上記抗体は、標識化されたものであってもよい。標識化のための標識物質は、特に限定されず、既知のものを用いればよい。標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素標識；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識；ヨウ素１２５などの放射性同位体標識；ルテニウム錯体などの電気化学発光標識；ビオチン；金属ナノ粒子等が挙げられる。抗体またはその抗原結合フラグメントの標識化は、標識物質の種類に応じて選択した既知の方法により行うことができる。
　上記試薬は、緩衝液を含むことができる。緩衝液としては、抗体がセリンプロテアーゼに結合するのを妨げる性質を有しないものであればよく、例えばｐＨ５．０～１０．０、好ましくはｐＨ５．５～８．５の中性付近に緩衝作用を有する、例えばＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。また、緩衝液中の緩衝剤の濃度としては、通常１０～５００ｍＭ、好ましくは１０～３００ｍＭの範囲から適宜選択される。
　上記試薬は、抗体がセリンプロテアーゼに結合するのを妨害しない量で、当該分野で既知の添加剤を含むことができる。例えば、緩衝剤、防腐剤（アジ化ナトリウムなど）タンパク質（アルブミン）、水溶性高分子（糖類、ポリエチレングリコール、デキストランなど）、塩類（塩化ナトリウム、アミノ酸など）などを含む。
　上記試薬は、上記試薬と他の要素を含むキットの形態であってもよい。他の要素としては、例えば、標識物質の検出試薬、セリンプロテアーゼの標準試料、血液試料調製用試薬、希釈液、支持体、使用説明書などが挙げられる。
　上記試薬において、上記抗体、界面活性剤、緩衝液、添加剤などの各成分は、２個以上の別個の試薬に分かれて含まれていてもよい。その一例として、例えば、以下の試薬Ａ１および試薬Ｂ１：
　（Ａ１）界面活性剤Ａを含む試薬Ａ１、
　（Ｂ１）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、試薬Ｂ１
を含み、
試料の測定時に、試料と試薬Ａ１と試薬Ｂ１が混合される、
試薬などが挙げられる。
　上記試薬において、試料の測定時に試料と試薬Ａ１と試薬Ｂ１が混合されるが、その際の混合条件は、測定対象のセリンプロテアーゼと抗体の結合反応（抗原抗体反応）が妨害されない条件であれば、特に限定されない。
　試料の測定時における試料と試薬Ａ１と試薬Ｂ１の混合物中の界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０２重量％以上であり、好ましくは０．０３～３重量％、特に０．０５～１重量％である。
　上記試薬Ａ１は、試料の測定時に、試料と試薬Ｂ１と混合して得られる混合物中の界面活性剤の含有量が、上記所定の範囲内になればよく、界面活性剤そのものであっても、界面活性剤を含む組成物であってもよい。
　上記試薬Ａ１は、界面活性剤に加えて、上記緩衝液、添加剤などを含んでいてもよい。また、上記試薬Ｂ１は、抗体に加えて、上記緩衝液、添加剤などを含んでいてもよい。これらの試薬Ａ１およびＢ１に含まれる成分は、各々の試薬の安定性、取扱性などを考慮して適宜決定すればよい。
　上記試薬の例としては、免疫学的測定法に用いるための試薬（免疫学的測定用試薬）が挙げられ、具体的には、酵素免疫測定法、蛍光酵素免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光測免疫測定法、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、イムノブロット法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフィー法、ネフェロメトリー法などに用いるための試薬が挙げられる。好ましくは、ラテックス凝集法に用いるための試薬が挙げられる。これらは、市販されているものでよく、既知の方法にしたがって調製したものでもよい。
　上記試薬がラテックス凝集法を用いる試薬（以下、「ラテックス試薬」と称する）である場合、当該分野で既知のラテックスを使用することができる。例えば、ポリスチレンラテックスなどのスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテックス、種々の変性ラテックス（例えば、上記ポリスチレン中にカルボキシル基を導入したカルボン酸変性ラテックス）、着色ラテックス、蛍光ラテックス、などが挙げられる。
　上記ラテックスは、既知の方法で製造することができるが、市販されているものでもよい。また、上記ラテックスは、２種以上を併用してもよい。
　上記ラテックス試薬におけるラテックス粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、例えば、測定対象となる抗原物質と抗体との抗原抗体反応により生じた凝集体が肉眼または光学的に検出できる大きさを示すものが挙げられる。具体的には、例えば、１００～５００ｎｍである。
　また、ラテックス粒子の平均粒子径は、２種以上であってもよい。
　本明細書における「平均粒子径」は、動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により測定した数値を意味する。
　上記ラテックス試薬は、セリンプロテアーゼに対する抗体が結合したラテックス粒子を含む。ラテックスに抗体を結合する方法は、特に限定されず、既知の方法が挙げられる。例えば、抗体とラテックスを、ｐＨ５．０～１０．０の緩衝液中で混合し、２０～３０℃の条件で２～３時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理、加熱（エイジング）処理などの既知の後処理を行うことにより、ラテックスと抗体を結合させることができる。
　この際の緩衝液としては、上述した試薬に含まれる緩衝液でよい。
　上記試薬においては、試料中にセリンプロテアーゼと結合分子との結合体の状態で存在していても、界面活性剤の作用により、セリンプロテアーゼと結合分子を分離し、セリンプロテアーゼを遊離させることができるので、試料中に遊離体として存在していたセリンプロテアーゼばかりでなく、結合体の状態で存在していたセリンプロテアーゼも検出または測定することができる。したがって、上記試薬は、生体内で遊離体と結合体の両方の状態で存在し、生体内の環境によって存在比が異なり得るセリンプロテアーゼを、精度よく検出することができ、その量（濃度）も精度よく測定することができる。
　さらに、上記試薬は、試料中のセリンプロテアーゼを精度よく検出または測定することできるので、セリンプロテアーゼの量または濃度をカットオフ値などとして用いることにより、セリンプロテアーゼに関連する疾患の診断や、その疾患の重症度の決定などに用いることができる。
　本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定方法であって、
（１）上記試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること
を含む、方法を含む。
　上記方法における試料は、上記試薬を用いた測定の対象となる試料が挙げられる。
　上記方法で使用する試薬において、使用される抗体は、１種でもよく、２種以上でもよく、界面活性剤も１種でもよく、２種以上でもよい。
　また、上記方法は、１種または２種以上の上記試薬を用いて行うことができる。
　上記工程（１）は、上記試薬と試料を接触させることにより、該試薬に含まれる抗体と、該試料中に含まれるセリンプロテアーゼを結合させる工程である。したがって、該セリンプロテアーゼと、該抗体が結合可能な条件下での工程であれば、特に限定されない。例えば、既知の免疫学的測定法に準じて行うことができる。
　上記工程（２）は、上記工程（１）によって得られた該セリンプロテアーゼと該抗体との結合体を検出または測定する工程である。
　該結合体の検出または測定方法は、特に限定されず、既知の定性的または定量的方法が挙げられる。具体的には、例えば、既知の免疫学的測定法が挙げられ、具体的には、酵素免疫測定法、蛍光酵素免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光測免疫測定法、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、イムノブロット法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフィー法、ネフェロメトリー法などが挙げられる。
　これにより、試料中のセリンプロテアーゼを検出することができ、試料中のセリンプロテアーゼの量（濃度）を定量することができる。
　例えば、試料中のセリンプロテアーゼの濃度の測定としてラテックス凝集法を用いる場合、セリンプロテアーゼとラテックス粒子に結合した抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを例えば吸光度を用いて測定し、予め求めてあった標準品の検量線から、試料中のセリンプロテアーゼの濃度を求めることができる。なお、吸光度の測定波長は、通常３４０～１０００ｎｍ、好ましくは５００～９００ｎｍが上げられる。また、凝集の度合いは、吸光度に限定されるものではなく、既知の方法を用いることができ、例えばネフェロメトリー、カウンティングイムノアッセイなどの方法により測定することもできる。
　上記工程（２）で得られたセリンプロテアーゼの検出結果または測定値（濃度、量）に基づいて、該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断することもできる。
　したがって、本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断方法であって、
（１）上記試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
（３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断すること
を含む、方法を含む。
　上記診断方法における工程（１）および（２）は、上記検出または測定方法と同様に行うことができる。
　上記診断方法における工程（３）は、例えば、セリンプロテアーゼの検出結果または測定値（濃度、量）を指標として診断すること、例えば、カットオフ値を決定し、カットオフ値に基づいて重症度を評価、発症もしくは重症化を予測、または発症リスクもしくは重症化リスクを評価すること、などを含む。
　また、本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断を補助する方法であって、
（１）上記試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
（３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断することを補助すること
を含む、方法を含む。
　上記診断を補助する方法における工程（１）および（２）は、上記検出または測定方法と同様に行うことができる。
　上記診断を補助する方法における工程（３）は、例えば、セリンプロテアーゼの検出結果または測定値（濃度、量）を指標として診断すること、例えば、カットオフ値を決定し、カットオフ値に基づいて重症度を評価、発症もしくは重症化を予測、または発症リスクもしくは重症化リスクを評価すること、などの医師の判断を必要とする工程において、その判断を補助すること（例えば、検出結果または測定値の収集、整理、医師への提供など）を含む。
　さらに、本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患を診断するためのデータの収集方法であって、
（１）上記試薬と、試料を接触させること、
（２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
（３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断するためのデータを収集すること
を含む、方法を含む。
　上記データの収集方法における工程（１）および（２）は、上記検出または測定方法と同様に行うことができる。
　上記データの収集方法における工程（３）は、例えば、セリンプロテアーゼの検出結果または測定値（濃度、量）を指標として診断すること、例えば、カットオフ値を決定し、カットオフ値に基づいて重症度を評価、発症もしくは重症化を予測、または発症リスクもしくは重症化リスクを評価すること、などの医師の判断に必要なデータ（例えば、検出結果または測定値）を収集することを含む。さらに、当該工程は、データの収集に加えて、データの整理、データの医師への提供なども含む。
　また、本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬を製造するための、以下のＡおよびＢ：
　（Ａ）界面活性剤、
　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
の使用。
　さらに、本発明は、一実施態様として、対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断に用いるための試薬を製造するための、以下のＡおよびＢ：
　（Ａ）界面活性剤、
　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
の使用。
　上記使用におけるセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬、セリンプロテアーゼに関連する疾患の診断に用いるための試薬、並びに（Ａ）界面活性剤および（Ｂ）抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記試薬について説明したものと同様である。
　以下、実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
＜モノクローナル抗体の作製＞
　以下の手順にしたがって、抗体Ａ、抗体Ｂを得た。
（免疫原）
　ヒト精製トリプシン（ＳＣＲＩＰＰＳ社製、Ｃａｔ．　Ｎｏ．Ｔ０６１４、精製度≧９５％）１ｍｇを１ｍＭ　ＴＬＣＫ　（Ｔｏｓｙｌ－Ｌ－ｌｙｓｙｌ－ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ナカライ、Ｃｏｄｅ　３４２１９－９４）を含む生理食塩水溶液５ｍＬに溶解し、３７℃にて３０分間加温後、生理食塩水溶液にて透析し使用した。
（免疫方法）
　上記免疫原をアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ：ＣＦＡ、ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、２５μｇトリプシン／匹となるようＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）に２週間間隔で免疫した。途中で部分採血を行い、抗血清レベルでの力価上昇度を免疫原であるトリプシンとの反応性を指標に確認した。複数回の免疫にて抗体力価が十分上昇していることを確認した上で、上記免疫原の生理食塩水溶液を腹腔内もしくは静脈内投与した。脾臓より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＥＣＡＣＣ）と細胞融合した。細胞融合はＰＥＧ法で行い、融合細胞を培養プレートに播種した。その後、３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
（スクリーニング）
　融合細胞を分注した各ウェルの培養上清を採取し、抗体力価をトリプシンとの反応性を指標に確認した。そして抗体産生クローンの細胞を継代培養し、限界希釈法によりクローニングを行った。得られた単一コロニー由来の細胞を抗ヒトトリプシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした。
（モノクローナル抗体調製）
　次に得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを大量培養した。予め腹腔内にプリスタン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を投与し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、ハイブリドーマを投与した。１０～２５日間飼育し、腹水の貯留を待った後、腹水を採取し、得られた腹水抗体を硫安塩析、アフィニティー精製を行うことによりマウス抗ヒトトリプシンモノクローナル抗体を取得した。
（モノクローナル抗体の組合せ予備検討）
　上記で得られた複数のモノクローナル抗体について、各抗体をラテックスに感作し、ラテックスの凝集のシグナル強度を指標に、シグナルが大きくエピトープが異なると考えられる２種類の抗体Ａ、抗体Ｂの組合せを得た。
＜抗体感作＞
　以下の材料および方法にしたがって、抗体Ａ感作ラテックスα液、抗体Ｂ感作ラテックスβ液を調製した。
（材料）
・ラテックス液：ラテックス（ＪＳＲ製、商品名：ＩＭＭＵＮＴＥＸ）、平均粒子径３５１　ｎｍ、固形分：１０％
・抗体Ａ溶液：５．０ｍｇ／ｍＬ　抗体Ａ、４０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
・抗体Ｂ溶液：４．５ｍｇ／ｍＬ　抗体Ｂ、４０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
・ＭＥＳ緩衝液：１％ＢＳＡ、２０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．０５％ＮａＮ３
・ＨＥＰＥＳ緩衝液：２％ＢＳＡ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　０．０５％ＮａＮ３
（方法）
　ラテックス液（１０％ｗ／ｖｏｌ）５００μＬと抗体Ａ溶液（４．９ｍｇ／ｍＬ）５００μＬを混和し、２０℃で９０分間振とう撹拌した。また、別途、同様に調製した混合液に、抗体Ｂ溶液（４．３８ｍｇ／ｍＬ）５５０μＬを追加し、２０℃で９０分間振とう撹拌した。
　得られた混合液を、遠心分離機（ローター：Ｒ１５Ａ（ＨＩ抗体ＡＣＨ））を用いて、１００００ｒｐｍの条件で、１０℃で３０分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、得られた沈査にＭＥＳ緩衝液２５ｍＬを添加し、ソニケーションにて分散した。その後、３７℃で６０分間振とう撹拌した。
　得られた分散液を、同遠心分離機を用いて、１００００ｒｐｍの条件で、１０℃で３０分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、得られた沈査にＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＬを添加し、ソニケーションにて分散させ、各抗体感作ラテックスα、β液を得た。
＜測定用試薬＞
　下記の組成を有する試薬Ａおよび試薬Ｂを調製した。試薬Ａは、各構成成分を所定の量または濃度になるように混合することにより調製した。試薬Ｂは、各抗体感作ラテックスα、β液を等量の割合で混合し、さらに他の構成成分を所定の量または濃度になるように混合して調製した。
（１）試薬Ａ
（組成）
・０％、０．３％、０．５％、０．７５％または１．０％Ｔｗｅｅｎ２０、
・０．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（５０００～５００００）、
・０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
・１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、
・０．０９％ＮａＮ３、
・１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）
（２）試薬Ｂ
（組成）
・０．５％ＢＳＡ、
・１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、
・０．０９％ＮａＮ３、
・１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
・抗体Ａ感作ラテックスα液
・抗体Ｂ感作ラテックスβ液
［試験例１］
（１）以下の各血清試料を４μＬとり、これに上記実施例１の試薬Ａ（０％、０．３％、０．５％、０．７５％または１．０％Ｔｗｅｅｎ２０）９６μＬを加えて混和し、３７℃で約５分間加温した。この混合液に試薬Ｂ　２４μＬを加えて混和し、３７℃で約５分間　反応後の波長７００ｎｍの吸光度を測定した。
　・血清１：市販のプール血清（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ社製、商品名：Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ）
　・血清２：膵癌患者（男性、６５歳）より調製した血清
　・血清３：急性膵炎患者（男性、３６歳）より調製した血清
　・血清４：慢性膵炎患者（女性、７９歳）より調製した血清
（２）試料の代わりにトリプシン標準液を用いて、上記（１）と同様に操作し、吸光度を求めて検量線を作成した。
（３）上記（２）で得られた検量線に試料の吸光度をあてはめ、各血清試料の各界面活性剤濃度（０％、０．３％、０．５％、０．７５％または１．０％Ｔｗｅｅｎ２０）の試薬における試料中のトリプシン濃度を求めた。その結果を図１に示す。
　図１に示されるとおり、いずれの血清試料においても、界面活性剤を含む試薬において、トリプシン濃度が一定の値となった。

Claims (23)

  1. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬であって、
    以下のＡおよびＢ：
    　（Ａ）界面活性剤、
    　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
    を含む、
    試薬。
  2. 　請求項１に記載の試薬であって、
    以下の試薬Ａ１および試薬Ｂ１：
    　（Ａ１）界面活性剤Ａを含む試薬Ａ１、
    　（Ｂ１）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、試薬Ｂ１
    を含み、
    試料の測定時に、試料と試薬Ａ１と試薬Ｂ１が混合される、
    試薬。
  3. 　前記試料の測定時において、試料とＡ１とＢ１の混合物中の前記界面活性剤の含有量が、０．０２重量％以上である、請求項２に記載の試薬。
  4. 　前記試料の測定時において、試料とＡ１とＢ１の混合物中の前記界面活性剤の含有量が、０．０３～３重量％である、請求項３に記載の試薬。
  5. 　前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１～４のいずれかに記載の試薬。
  6. 　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、および３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネートからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１～４のいずれかに記載の試薬。
  7. 　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含む、請求項１～４のいずれかに記載の試薬。
  8. 　前記試薬が、免疫学的測定用試薬である、請求項１～７のいずれかに記載の試薬。
  9. 　前記免疫学的測定用試薬が、酵素免疫測定法、蛍光酵素免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光測免疫測定法、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、イムノブロット法、ラテックス凝集法、およびイムノクロマトグラフィー法からなる群から選択される少なくとも１種の免疫学的測定法に用いるための試薬である、請求項８に記載の試薬。
  10. 　前記免疫学的測定用試薬が、ラテックス凝集法を用いるための試薬である、請求項８に記載の試薬。
  11. 　前記ラテックス凝集法を用いるための試薬中のラテックス粒子の平均粒子径が、１００～５００ｎｍである、請求項１０に記載の試薬。
  12. 　前記セリンプロテアーゼが、トリプシン、エラスターゼ、および前立腺特異抗原からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれかに記載の試薬。
  13. 　前記セリンプロテアーゼが、トリプシンである、請求項１～１１のいずれかに記載の試薬。
  14. 　セリンプロテアーゼに関連する疾患の診断に用いるための、請求項１～１３のいずれかに記載の試薬。
  15. 　前記セリンプロテアーゼがトリプシンであり、前記プロテアーゼに関連する疾患が膵疾患である、請求項１４に記載の試薬。
  16. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定方法であって、
    （１）請求項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
    （２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること
    を含む、方法。
  17. 　前記試料が、血清または血漿である、請求項１６に記載の方法。
  18. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断方法であって、
    （１）請求項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
    （２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
    （３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断すること
    を含む、方法。
  19. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断を補助する方法であって、
    （１）請求項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
    （２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
    （３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断することを補助すること
    を含む、方法。
  20. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患を診断するためのデータの収集方法であって、
    （１）請求項１～１５のいずれかに記載の試薬と、試料を接触させること、
    （２）セリンプロテアーゼを検出または測定すること、
    （３）得られた検出結果または測定値に基づいて該セリンプロテアーゼに関連する疾患の状態を判断するためのデータを収集すること
    を含む、方法。
  21. 　前記セリンプロテアーゼがトリプシンであり、前記セリンプロテアーゼに関連する疾患が膵疾患である、請求項１８～２０のいずれかに記載の方法。
  22. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼの検出または測定用試薬を製造するための、以下のＡおよびＢ：
    　（Ａ）界面活性剤、
    　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
    の使用。
  23. 　対応する結合分子との結合体の形態で生体内に存在し得るセリンプロテアーゼに関連する疾患の診断に用いるための試薬を製造するための、以下のＡおよびＢ：
    　（Ａ）界面活性剤、
    　（Ｂ）該セリンプロテアーゼに対する抗体またはその抗原結合フラグメント
    の使用。
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