JP6578119B2

JP6578119B2 - 前立腺特異抗原の測定方法及び測定キット

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Publication number: JP6578119B2
Application number: JP2015073912A
Authority: JP
Inventors: 旭張; 周平松下; 小野　智子; 智子小野
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2019-09-18
Anticipated expiration: 2035-03-31
Also published as: JP2016194437A

Description

本発明は、前立腺特異抗原の測定方法及び測定キットに関する。

前立腺特異抗原（ＰｒｏｓｔａｔｅＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｇｅｎ；以下、ＰＳＡと略称する）は、前立腺上皮細胞から分泌される特異抗原で、前立腺癌のマーカーとして広く利用されている。前立腺癌は主に６０歳以上の男性に発病し、生活の欧米化に伴い前立腺癌の死亡率は年々増加傾向にあり、日本では６５歳以上のがんによる死亡原因の１位となっている。

血中におけるＰＳＡは、非結合の遊離型ＰＳＡ（ｆｒｅｅ−ＰＳＡ；以下、ｆＰＳＡと略称する）、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）と結合した複合型ＰＳＡ（以下、ＰＳＡ−ＡＣＴと略称する）、α２−マクログロブリン（ＭＧ）と結合した複合型ＰＳＡ（ＰＳＡ−ＭＧ）の３種類の形態で存在する（図１）。その６０〜９０％が複合体（ＰＳＡ−ＡＣＴまたはＰＳＡ−ＭＧ）を形成し、残り５〜４０％がｆＰＳＡの形で存在している。これらのうちＰＳＡ−ＭＧは、ＰＳＡ分子の表面がＭＧで覆われているために免疫学的に測定できない。そのため血中ＰＳＡと言えば、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの総和である総ＰＳＡ（ｔｏｔａｌ−ＰＳＡ；以下、ｔＰＳＡと略称する）を指すと考えられている。

ＰＳＡは、前立腺癌のスクリーニング、診断、経過観察などの最も優れた血清学的指標として汎用されている。前立腺癌の診断では、ｔＰＳＡ濃度で４ｎｇ／ｍＬ以下、４．１〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０．１ｎｇ／ｍＬ以上の３つの群に分け、その後の診断方針を決定している。ｔＰＳＡは前立腺肥大症でも軽度上昇を示すことから、癌症例と前立腺肥大症例とのいずれもが高頻度に分布し得る４．１〜１０ｎｇ／ｍＬの領域は「グレーゾーン」と呼ばれている。「グレーゾーン」では、直腸診や超音波診断などの精密検査を行い、最終的には生検が行われている。近年の研究により、前立腺癌では前立腺肥大症等の良性疾患に比べて、ｔＰＳＡに対するｆＰＳＡの存在比が低い傾向にあることが明らかになり、ｔＰＳＡ濃度に対するｆＰＳＡ濃度の比率（Ｆ／Ｔ比「％」）を求めることで前立腺癌を効率よく鑑別でき、受診者の負担を軽減できると考えられている。

また検診では、将来の前立腺癌の罹患リスクをｔＰＳＡ濃度とＦ／Ｔ比を用いて判別する「前立腺がん予測ツール」が欧州泌尿器科学会から公開されている。ｔＰＳＡ濃度が０〜１ｎｇ／ｍＬのとき、Ｆ／Ｔ比が２５％以上では５年ごと、Ｆ／Ｔ比が２５％以下のケースでは１年ごとに検診を受診することとし、ｔＰＳＡ濃度が１〜２ｎｇ／ｍＬのときは、Ｆ／Ｔ比が１８％以上では３年ごとの検診、Ｆ／Ｔ比が１８％以下なら毎年検診を受けることを提唱している。

さらに術後の経過観察においては、再発のカットオフ値を０．２ｎｇ／ｍＬとすべきであると言われており、より高感度に、より低濃度域から高濃度域までを測定できるｔＰＳＡの測定系が求められている。

広くＦ／Ｔ比が用いられていることから、ｔＰＳＡの測定は、血中のｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両分子を同等に捉えられる等モル反応性（Ｅｑｕｉｍｏｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅ）で測定することが不可欠である。等モル反応性とは、異なる存在様式の測定対象分子において、同じモル数（分子の個数）に対して同じ測定値（シグナル）を示すことを意味する。

しかし、１９９０年代に市販されている各社のｔＰＳＡ測定試薬の測定値の間に無視できないほどの差が存在した。日本泌尿器科学会と日本臨床病理学会で構成された「血清ｔＰＳＡ測定に関する調査研究委員会」は１９９７年に２２社２８種のキットが参加するサーベイを実施し、それぞれのキットのｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに対する免疫反応特性を定量的に解析した。その結果、半数の１４キットがｆＰＳＡに偏った反応を有することが分かった。このような免疫反応性の違いがキット間の測定値の差の主たる要因だと明らかにした。偏った反応を示した試薬キットは等モル反応性にないことが示唆された。

等モル反応性が成立しない原因として、主にエピトープと反応時間の２つの要因が考えられている（非特許文献１）。エピトープに関しては、ＰＳＡとＡＣＴが複合体を形成することにより、一部あるいは完全にマスクされるエピトープが存在するため、ｆＰＳＡのエピトープ数はＰＳＡ−ＡＣＴよりも多いことが挙げられている。そのため、ポリクローナル抗体を用いた測定系では、ＰＳＡ−ＡＣＴよりもｆＰＳＡが優位に検出される。
上記問題を解決するために、特許文献１では、反応混合液にｆＰＳＡ上のＡＣＴと結合する領域に対する抗体を加えることで、ＰＳＡ−ＡＣＴでは隠れているｆＰＳＡ上のエピトープをマスクし、ポリクローナル抗体を用いたＰＳＡ免疫検定法で見られるバイアスを是正できることが開示されている。

もう一つの要因として、単位時間内でのＰＳＡ−ＡＣＴと抗体との反応速度は、ｆＰＳＡと抗体との反応速度と比較して遅いことが挙げられている。エピトープが同一の場合、等モル反応性は抗原抗体反応が平衡に達することで成立するが、それには長い反応時間を必要とする（図２；非特許文献１の転載）。しかし、一刻も早く測定結果を得たいという検査現場の要望から、平衡に達する前に反応を打ち切ると、やはりＰＳＡ−ＡＣＴよりもｆＰＳＡが優位に検出されてしまう。

このような問題を解決するために、特許文献２では、やはりＰＳＡ−ＡＣＴとは反応しないｆＰＳＡに対する抗体を試料に添加するラテックス凝集法が開示されている。添加する抗体については、ＩｇＧ分画、あるいはその抗体断片であるＦ（ａｂ’）_２分画、Ｆａｂ分画のいずれにおいても、検出用抗体に対するｆＰＳＡの反応性とＰＳＡ−ＡＣＴの反応性が近づくことが示されている。

特表平９−５０８９６９号公報特開２００１−３１１７３３号公報

ＲｏｂｅｒｔＴ．ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，ｅｔａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＦＯＲＭＳＯＦＰＲＯＳＴＡＴＥ−ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＮＴＩＧＥＮＡＮＤＴＨＥＨＵＭＡＮＫＡＬＬＩＫＲＥＩＮＧＥＮＥＦＡＭＩＬＹ：ＡＮＥＷＥＲＡ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ．１９９５，Ｖｏｌｕｍｅ４５，Ｎｕｍｂｅｒ５，７２９−７４４

しかしながら、特許文献１の方法は、ｆＰＳＡ上のエピトープをマスクする必要があることから十分な反応時間を必要とする。また、特許文献２のラテックス凝集法は、測定感度が低く、測定可能範囲も狭いという問題があった。
本発明はこれらの問題に鑑みてなされたものであり、高感度かつ広い測定範囲を有し、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等しく測定することが可能な総ＰＳＡの測定方法およびその測定キットを提供するものである。

本発明者らは、上記のような課題に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、総ＰＳＡの測定において、抗ｆＰＳＡ抗体のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを試料に添加することにより、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの抗体との反応速度差を解消し、低濃度域から高濃度域までの広い測定範囲で、等モル反応性を成立させることができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の発明に関する：
［１］遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントとを含む、
ＰＳＡ測定キット。
［２］遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、［１］のＰＳＡ測定キット。
［３］遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、［１］又は［２］のＰＳＡ測定キット。
［４］遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントとを含む、
ＰＳＡ測定キット。
［５］前記Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが、検体処理液に含まれている、［１］〜［４］のいずれかのＰＳＡ測定キット。
［６］各抗体及びＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントがモノクローナル抗体である、［１］〜［５］のいずれかのＰＳＡ測定キット。
［７］試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体を添加する工程
を含む、ＰＳＡ測定方法。
［８］さらに、Ｂ／Ｆ分離工程を含む、［７］のＰＳＡ測定方法。
［９］遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、［７］又は［８］のＰＳＡ測定方法。
［１０］遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、［７］〜［９］のいずれかのＰＳＡ測定方法。
［１１］試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体を添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体を添加する工程、
Ｂ／Ｆ分離工程
を含む、ＰＳＡ測定方法。
［１２］前記ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを添加する工程が、遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体を添加する工程より先に行われる、［７］〜［１１］のいずれかのＰＳＡ測定方法。
［１３］使用される抗体がすべてモノクローナル抗体である、［７］〜［１２］のいずれかのＰＳＡ測定方法。

本発明によれば、総ＰＳＡの測定において、短時間に低濃度から高濃度まで、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等しく測定することが可能となる。これにより、測定試料中のＰＳＡ濃度に影響を受けることなく、高感度かつワイドレンジで総ＰＳＡを測定することが可能となった。

血中ＰＳＡの３種類の異なる存在様式を模式的に示す説明図である。非特許文献１に記載のＴａｎｄｅｍ−ＲＰＳＡ測定キット（dual-monoclonal sandwich assay）におけるｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応速度差を示すグラフである（非特許文献１の転載）。ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴをそれぞれ等モル濃度含む溶液に対する応答を反応時間ごとにプロットしている。抗ｆＰＳＡ抗体のフラグメントＦａｂ’をｆＰＳＡと反応させた時の状態を模式的に示す説明図である。ｆＰＳＡの分子量がＰＳＡ−ＡＣＴの分子量とほぼ同等になる。

本発明は、免疫反応を利用するものであれば限定されない。免疫反応を利用した測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアス法と、Ｂ／Ｆ分離操作後、標識に基づくシグナルから抗体または抗原の測定が行われるヘテロジニアス法に大別されるが、測定感度も高く、特に極微量成分の測定に好適であることから、本発明ではヘテロジニアス法が特に好ましく用いられる。

Ｂ／Ｆ分離とは、標識物質で標識された標識抗原または標識化抗体と、抗体または抗原が反応した結果生じる抗原抗体複合体（Ｂｏｕｎｄ型：Ｂ）を、遊離の標識体（Ｆｒｅｅ型：Ｆ）から分離する操作のことである。Ｂ／Ｆ分離操作としては、例えば、反応の結果生じる抗原抗体複合体を、不溶性担体上に固定化された測定対象物質に対する抗体に結合させた後、不溶性担体とともに分離する固相法、あるいは抗原抗体複合体の抗体に対する抗体（二次抗体）をさらに添加して該複合体とのさらなる複合体を形成させた後、これを沈殿物として分離する二次抗体法等が挙げられる。

ホモジニアス法としては、例えば、一元放射免疫拡散法、比濁法、比ろう法、凝集法等が挙げられ、濁度の変化等により、反応相内での抗原抗体複合体を直接測定する。
へテロジニアス法としては、例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法等が挙げられる。放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法はそれぞれ放射性物質、酵素、蛍光物質を、標的物質に特異的に反応する抗体に結合した標識化抗体を用いる方法で、一般的には、抗体や抗原を不溶性担体に結合した固相化抗体または固相化抗原と組み合わせた固相法で使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識化抗体」複合物を作らせ測定する非競合法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識化抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法がある。高感度かつ広い測定範囲を有するものであれば制限はないが、増感を行いやすいため酵素反応を利用したものが好ましく、なかでも化学発光酵素免疫測定法が好ましい。また、非特異反応によるシグナルを低下させることができることから、非競合法が好ましい。

本発明における測定対象試料は、例えば、血液（全血、血清、血漿）、尿など、臨床において採取可能であり、ＰＳＡを含む検体であれば限定されない。臨床においては血液、特に利便性の観点から血清が好ましい。また、精製ＰＳＡを含む溶液、培養液、細胞あるいは臓器からの抽出液も測定対象試料として使用できる。さらに、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両方、あるいはどちらか一方を含むものも測定対象試料として使用できる。

本発明においては、従来公知の免疫学的総ＰＳＡ測定キット又は測定方法で使用する「ｆＰＳＡに反応し、且つ、ＰＳＡ−ＡＣＴと反応する抗体」（抗ｔＰＳＡ抗体）に加えて、「ｆＰＳＡに反応するが、ＰＳＡ−ＡＣＴと反応しない抗体」（抗ｆＰＳＡ抗体）のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを使用する。前記抗ｆＰＳＡ抗体としては、ＡＣＴの結合により完全に隠れてしまうＰＳＡ上のエピトープを特異的に認識する抗体であることが好ましい。ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントは、酵素処理や化学処理等の公知の方法に従って、完全抗体から調製することができる。たとえば、Ｆａｂフラグメントは、抗体をパパインで消化することにより得られる。Ｆａｂ’ フラグメントは、抗体をペプシンで消化することにより得られるＦ（ａｂ’）_２フラグメントを、更に還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール又はメルカプトエチルアミン）で還元することにより調製することができる。すなわち、抗体分子のヒンジ領域には、２本のＨ鎖を連結するＳ−Ｓ結合１個が存在しており、このＳ−Ｓ結合のＣ末端側下流で、ペプシンによる分解を受けるので、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのＣ末端側領域には、前記Ｓ−Ｓ結合が残っている。続いて、還元剤により前記Ｓ−Ｓ結合を還元すると、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント１分子から、Ｃ末端側領域にＳＨ基１つを有するＦａｂ’ フラグメント２分子が生じる。こうして調製したＦａｂ’フラグメントは、チオール基の安定化処理を行わない場合、長期保存や溶媒の影響を受けてその全部あるいは一部分が再びＦ（ａｂ’）_２を形成する可能性があり、長期に渡り等モル反応性を維持するためには、チオール基の安定化処理を行うほうが好ましい。安定化処理は、公知の方法に従って行うことができる。

抗ｆＰＳＡ抗体のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントの使用濃度は、測定範囲の上限において等モル反応性を達成できる濃度を基準とすればよく、基準濃度の１〜１０倍量を使用濃度とすることが好ましい。抗体の性質や反応時間によって等モル反応性を達成できる濃度が異なるが、事前に予備実験を行って基準濃度を決めればよい。

前記の抗ｔＰＳＡ抗体は、例えば、標識化抗体、及び／又は固相化抗体として使用することができる。本発明で使用する標識化抗体は、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴで共通のエピトープを有する抗体を用いて調製することができる。使用可能な抗体としては完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）_２やＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ等のような抗体断片が挙げられる。

標識化抗体に使用される標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素、不溶性粒状物質などが挙げられる。該標識用の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、ユーロピウムなどが挙げられる。放射性同位元素としては、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３２Ｐなどが挙げられる。

また、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を用いて発光、蛍光又は発色反応を行うことにより、標識物質を測定できる。例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としては、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＡＭＰＰＤ（登録商標）（アダマンチルメトキシフェニルホスホリルジオキシセタン)、ＡＰＳ−５などの化学発光基質；４−メチルウンベリフェリルフォスフェート（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの蛍光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸）、ＮＢＴ（４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド）、ＩＮＴ（ヨードニトロテトラゾリウム）などの発色基質を用いることができる。

固相化抗体は、標識化抗体で使用される抗体と同様に、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴで共通のエピトープを有する抗体を用いて調製することができる。標識化抗体と同じエピトープを認識する抗体でもよいし、異なるエピトープを認識する抗体でもよい。異なるエピトープを認識する抗体であるとより好ましい。使用可能な抗体としては完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）_２やＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ等のような抗体断片が挙げられる。抗体を固定化する固相担体としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子などが挙げられる。粒子としては、磁性粒子、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。中でも、迅速簡便なＢ／Ｆ分離を実現する観点においては磁性粒子が特に好ましく、具体的には、例えば、四酸化三鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、三酸化二鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）、種々のフェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子等の磁性粒子が好ましく用いられる。また、これらの磁性粒子を、ポリスチレン等の高分子のラテックスや、ゼラチン、リポソーム等の内部に含まれる形で調製したり、表面に固定化したりしたものを好ましく用いることができる。

上述の抗体（断片）はそれのみで、あるいはタンパク質、多糖類、または合成高分子物質等の他の高分子物質とともに、有機化学的手法、または生物学的親和性に基づく相互作用などを介して文献から公知の方法により、標識物質または固相担体との結合体を製造することができる。
有機化学的方法では、例えば、架橋試薬を用いて共有結合させることにより結合体を製造することができる。主な架橋試薬としてはカルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、マレイミド化合物、ピリジル・ジスルフィド化合物等があげられる。
生物学的親和性を利用した結合体の製造方法の例としては、アビジンとビオチンの結合を利用した方法がある。例えば同一抗体の抗体（断片）とアルブミンなどの他の高分子物質の両方にビオチン分子を導入しアビジンにより架橋する方法や、あるいは両者の一方にアビジンを導入し、もう一方にビオチンを導入して架橋する方法がある。ビオチン分子の導入にはビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシミニドエステルなどが試薬として使われる。
抗体（断片）と標識物質及び／又は固相担体との結合体は、本発明に係る抗原抗体反応の前に製造してもよいし、事前に一方の結合体を製造していなくても、液相中で抗原抗体反応を行った後に、標識物質または固相担体と結合させてもよい。例えば、アビジンとビオチンの結合を利用した結合体の製造方法を例にすると、ビオチンまたはアビジン等を導入した抗体（断片）を用いて抗原抗体反応を液相中で行った後に、アビジンまたはビオチン等を導入した標識物質または固相担体と反応させることにより、抗原抗体反応の後に該抗体（断片）を標識化または固定化することもできる。
標識化抗体および固相化抗体の使用濃度は測定性能を考慮して決めればよい。

本発明に係る抗体は、抗体の性質に起因するｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに対する反応性の差が生じないものであれば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体を産生する動物種は任意であり、マウスのほか、ラット、ニワトリ、家兎等が挙げられる。

本発明に係る抗原抗体反応は緩衝液中で行われる。使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。また、緩衝液中に通常用いられる添加剤たとえば反応促進剤、洗浄剤または安定剤と共に使用することができる。適当な緩衝液としてグッド緩衝液等が挙げられ、例えば、２０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６〜８）または５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸／１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（ｐＨ７〜８）などが挙げられる。反応促進剤としては例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどのタンパク質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧ、プロクリンなどの防腐剤を挙げることができる。

本発明において、抗ｆＰＳＡ抗体ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントは、固相化抗体及び／又は標識化抗体との本免疫反応の前に試料に添加してもよいし、固相化抗体及び／又は標識化抗体と同時に添加してもよい。予め適当な緩衝液中で試料と抗ｆＰＳＡ抗体ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを反応させることで、反応初期にｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの分子量を同等にし、分子量の違いに起因する反応速度差を解消することが出来ることから、固相化抗体及び／又は標識化抗体との本免疫反応の前に、抗ｆＰＳＡ抗体のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを試料に添加することが好ましい。固相化抗体と標識化抗体は、同時に試料に添加してもよいし、どちらか一方を先に添加してもよい。検出感度を高めるには、別個に免疫反応を行うことが好ましく、第一免疫反応として標識化抗体を添加し、第二免疫反応として固相化抗体を添加してもよいし、第一免疫反応として固相化抗体を添加し、第二免疫反応として標識化抗体を添加してもよい。第一免疫反応として固相化抗体を添加すると、第一免疫反応と第二免疫反応の間においてもＢ／Ｆ分離を行うことができる。酵素標識化抗体を用いる場合には、固相化抗体及び標識化抗体との本免疫反応後にＢ／Ｆ分離を行った後、基質を添加することで測定値（シグナル強度）が得られる。

本発明のＰＳＡ測定キットとしては、従来の免疫学的ＰＳＡ測定キットに抗ｆＰＳＡ抗体ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを更に含ませたものであればよい。一般に、ＥＬＩＳＡ法による測定キットは標識化抗体、固相化抗体、標準物質などの試薬から構成され、さらに必要に応じて、検体と固相化抗体を反応させるため緩衝液、酵素反応のための発色液と反応停止液、固相を洗浄するための洗浄液、検体の前処理剤などを含んで構成される。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合、復元のための溶液も添付される場合がある。

本発明で使用される抗ｆＰＳＡ抗体ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントは単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬に予め添加してもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに等モル反応性を達成することを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。例えば、検体処理液や検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識化抗体溶液に添加してキットの構成試薬とすることが挙げられる。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。固相化抗体及び／又は標識化抗体との免疫反応工程の前に試料と反応させることがよいことを考慮すれば、検体処理液に添加することが特に好ましい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本実施例中では、ＰＳＡ−ＡＣＴの濃度はすべてｆＰＳＡ濃度換算で示す。

《実施例１》
本実施例では、異なるＰＳＡ濃度を有する試料において、抗ｆＰＳＡ抗体のＦａｂ’フラグメントを添加することが等モル反応性に与える影響を確認した。

（１）試料の調製
測定対象試料のＰＳＡ濃度が、低濃度のものから高濃度のものまで存在することを想定し、１ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを調製した。市販のｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを、ＷＨＯ国際基準品（ＷＨＯＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎＳｔａｎｄａｒｄＰｒｏｓｔａｔｅＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｇｅｎ（９０：１０）ＮＩＢＳＣｃｏｄｅ：９６／６７０）を基準として、それぞれの濃度に調製した。

（２）抗ｆＰＳＡ抗体溶液の作製
ＰＳＡ−ＡＣＴとは反応しない抗ｆＰＳＡマウスモノクローナル抗体を使用した。公知の方法により、チオール基安定化Ｆａｂ’フラグメントを調製し、防腐剤を含む０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に、それぞれ終濃度が、０μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬになるように添加した。

（３）固相化抗体溶液の作製
磁性粒子（ＪＳＲ社）に抗ｔＰＳＡマウスモノクローナル抗体を感作し、防腐剤を含む０．０１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させた。なお、使用した抗体はｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに共通のエピトープを認識する。

（４）標識化抗体溶液の作製
抗ｔＰＳＡマウスモノクローナル抗体をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識し、０．０１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させた。なお、使用した抗体は、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに共通するエピトープであるが、固相化抗体で使用した抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する。

（５）発光基質溶液
２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２´−（５´−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）：アプライドバイオシステム社）を使用した。

（６）測定法
測定には、全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）を使用した。２５μＬの試料に１５０μＬの抗ｆＰＳＡ抗体Ｆａｂ’フラグメント溶液を加え、３７℃で４分間加温した。その後、６０μＬの固相化抗体溶液を加え、３７℃で６分間加温した後、Ｂ／Ｆ分離を行い、１００μＬの標識化抗体溶液を加え、３７℃で４分間加温し、再度Ｂ／Ｆ分離を行った後、１００μＬの発光基質溶液を加え、３７℃で約３分反応後にシグナル強度（ｃｏｕｎｔｓ）を測定した。
比較例として、抗ｆＰＳＡ抗体溶液として、抗ｆＰＳＡ抗体のＦａｂ’フラグメントに代えて、抗ｆＰＳＡ抗体の完全抗体ＩｇＧを用意した。その結果を表１に示す。

等モル反応性が成立していれば、等モルに調製したｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度は一致する。一般的に、ＰＳＡ−ＡＣＴ／ｆＰＳＡ比が１００±１０％以内であれば等モル反応性が達成されていると言え、１００±５％以内であればより好ましい。抗ｆＰＳＡ抗体ＩｇＧおよびそのＦａｂ’フラグメントを添加しなかった場合（０μｇ／ｍＬ）では、ｆＰＳＡのシグナル強度が高く、ｆＰＳＡが優位に検出されていることがわかる。抗ｆＰＳＡ抗体ＩｇＧ、またはＦａｂ’フラグメントを添加した場合、ＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度に変化はなく、抗体添加濃度に応じてｆＰＳＡのシグナル強度のみが低下した。

１００ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを測定した場合、ＩｇＧでは０．２μｇ／ｍＬ以上添加した時にｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度が一致し、Ｆａｂ’フラグメントでは、２μｇ／ｍＬを添加にした時にｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度が一致した。しかし、１ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを測定した場合、ＩｇＧでは０．０２μｇ／ｍＬ添加した時にｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度が一致したが、０．２μｇ／ｍＬ以上添加した時にはｆＰＳＡのシグナル強度がＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度よりも低くなり、等モル反応性が崩れた。一方で、Ｆａｂ’フラグメントでは０．２μｇ／ｍＬ添加した時にｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度が一致し、添加量を増やしても等モル反応性は維持されていた。

以上のことから、等モル反応性を達成するためには、添加する抗体量は測定対象試料中のＰＳＡ濃度によって調整する必要があることがわかった。すなわち、試料中に１００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡが含まれる場合では、試料中に１ｎｇ／ｍＬのＰＳＡが含まれる場合の１０〜１００倍量の抗ｆＰＳＡ抗体を添加する必要がある。しかし、ＩｇＧでは、試料中のＰＳＡ濃度に対して添加量が多くなりすぎると、ｆＰＳＡのシグナル強度がＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度よりも低くなり、等モル反応性が崩れてしまう。一方、Ｆａｂ’フラグメントを添加した場合は、添加量が一定量を超えれば等モル反応性を維持できることが示された。

《実施例２》
さらに試料に添加する抗ｆＰＳＡ抗体の形状が等モル反応性に与える影響を確認した。抗ｆＰＳＡ抗体溶液として、Ｆａｂ’フラグメントに変えて、完全抗体ＩｇＧまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントを添加したものを用意した。抗ｆＰＳＡ抗体は実施例１と同じものを用い、１ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを測定した。それ以外は実施例１と同様に測定した。その結果を表２に示す。

実施例１と同様に、抗ｆＰＳＡ抗体ＩｇＧおよびそのＦａｂ’フラグメントを添加しなかった場合では、ｆＰＳＡのシグナル強度が高く、ｆＰＳＡが優位に検出されていることがわかる。ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’を添加した場合では、ＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度に変化はなく、抗体添加濃度に応じてｆＰＳＡのシグナル強度のみが低下した。ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’ともに０．０２μｇ／ｍＬを添加した時、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度が一致し、等モル反応性が成立した。しかし、０．２μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬを添加した時、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２を添加した場合はｆＰＳＡのシグナル強度がＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度よりも低くなり、ＰＳＡ−ＡＣＴが優位に検出された。一方、Ｆａｂ’を添加した場合は等モル反応性が維持されていた。

実施例１より、測定試料が１００ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡを含む場合に等モル反応性が達成できる抗ｆＰＳＡ抗体濃度は、ＩｇＧでは０．２μｇ／ｍＬ、Ｆａｂ’フラグメントでは２μｇ／ｍＬであることが明らかとなっている。しかし、その抗ｆＰＳＡ抗体濃度で１ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡを含む試料を測定すると、Ｆａｂ’を用いなければ等モル反応性を達成できないことがわかった。このことから、低濃度域から高濃度域までの広い測定範囲を有する測定系においては、試料にＦａｂ’フラグメントを添加することが、等モル反応性を達成するために有効であるとわかった。

実施例１や２において、ＩｇＧやＦ（ａｂ’）_２フラグメントを添加した場合、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのシグナル強度が逆転するポイントが観測された。この逆転現象は、ｆＰＳＡと抗体の複合体の分子量が、ＰＳＡ−ＡＣＴの分子量より大きくなることに起因すると考えられる。溶液中で行われる抗原抗体反応の反応速度は、多くの要因の影響を受ける。その要因の一つとして測定対象物質の形状、特に分子量が挙げられる。分子量の小さなものは分子量大きなものに比べ、溶液中での抗体との反応は速い。ＰＳＡの場合、ｆＰＳＡの分子量は約３４，０００ダルトン、ＰＳＡ−ＡＣＴの分子量は約９４，０００ダルトンである。抗体の分子量は１５０，０００ダルトン、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの分子量は１００，０００ダルトンのため、ｆＰＳＡと結合してできる抗原抗体複合体の分子量は、ＰＳＡ−ＡＣＴの分子量よりも大きくなってしまう。しかし、Ｆａｂ’やＦａｂフラグメントの分子量は５０，０００ダルトンのため、ｆＰＳＡと結合してできる抗原抗体複合体の分子量はＰＳＡ−ＡＣＴとほぼ同等になり（図３）、分子量の違いに起因する反応速度差を解消することができると考えられる。

《実施例３》
次に、Ｆａｂ’フラグメントの濃度を２μｇ／ｍＬから段階希釈した抗ｆＰＳＡ抗体溶液を用意した。１ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを測定し、その添加量毎の効果を確認した。測定条件は実施例１と同様である。その結果を表３に示す。

抗ｆＰＳＡ抗体Ｆａｂ’フラグメントを０．０３１μｇ／ｍＬ添加すると、１ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ試料において等モル反応性を達成でき、０．０６３μｇ／ｍＬ以上添加することで、試料中のＰＳＡ濃度が１ｎｇ／ｍＬであっても、１００ｎｇ／ｍＬであっても、等モル反応性を達成できることが確認された。測定範囲の上限を１００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡとすると、本実施例に用いた抗体および測定条件では、抗ｆＰＳＡ抗体Ｆａｂ’フラグメントの使用濃度が０．０６３μｇ／ｍＬのときに、測定範囲の上限において等モル反応性を達成できることがわかった。これを基に、以後の実施例では０．２５μｇ／ｍＬの抗ｆＰＳＡ抗体Ｆａｂ’フラグメントを使用することにした。

《実施例４》
ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの混合比率を変えた測定対象試料を用いて、抗ｆＰＳＡ抗体Ｆａｂ’フラグメントの添加効果を確認した。
総ＰＳＡが一定量（ｆＰＳＡ濃度換算で１ｎｇ／ｍＬ）となるようにｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの混合比率を変えた試料を調製した。抗ｆＰＳＡ抗体溶液として０．２５μｇ／ｍＬのＦａｂ’フラグメントを用いた以外は、実施例１と同様に測定した。０、１、１０、５０、及び１００ｎｇ／ｍＬのＷＨＯ国際基準品を基に作製した検量線を用いて、試料中の総ＰＳＡ濃度を求めた。その結果を表４に示す。一般的に、測定値の誤差が±１０％以内であれば、等モル反応が達成されていると言えることから、ＰＳＡ−ＡＣＴとｆＰＳＡの混合比率に依らず等モル反応性が達成できることが示された。

《実施例５》
ＰＳＡ−ＡＣＴと、ＷＨＯのｔＰＳＡ基準品（患者実検体に近い割合でＰＳＡ−ＡＣＴとｆＰＳＡが含まれる）の混合比率を変えた測定対象試料を用いて、抗ｆＰＳＡ抗体Ｆａｂ’フラグメントの添加効果を確認した。
総ＰＳＡ濃度が１ｎｇ／ｍＬになるようにＷＨＯのｔＰＳＡ基準品とＰＳＡ−ＡＣＴの混合比率を変えた試料を調製し、実施例４と同様に測定した。結果を表５に示す。その結果、ＰＳＡ−ＡＣＴの混合比率に依らず等モル反応性が達成できることが示された。

《実施例６》
１ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ、及びＰＳＡ濃度レベルが異なる４種類の血清サンプルを用意し、実施例４と同様に測定した。結果を表６に示す。その結果、Ｆａｂ’フラグメントを添加することで、より正確な総ＰＳＡ濃度の測定が可能となることが示された。

本発明によれば、測定試料中のＰＳＡ濃度に影響を受けることなく、広い測定範囲でｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの等モル反応性を成立させることができる。よって、総ＰＳＡ濃度を短時間かつ高精度に測定することが可能となり、前立腺癌の検診や診断現場等において有用である。

Claims

ヘテロジニアス法によるＰＳＡ測定方法であって、
試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体を添加する工程、
Ｂ／Ｆ分離工程
を含み、抗原抗体反応が平衡に達する前に前記反応を打ち切ることを特徴とする、ＰＳＡ測定方法。
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、請求項１に記載のＰＳＡ測定方法。
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、請求項１又は２に記載のＰＳＡ測定方法。
ヘテロジニアス法によるＰＳＡ測定方法であって、
試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体を添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体を添加する工程、
Ｂ／Ｆ分離工程
を含み、抗原抗体反応が平衡に達する前に前記反応を打ち切ることを特徴とする、ＰＳＡ測定方法。
前記ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを添加する工程が、遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体を添加する工程より先に行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＳＡ測定方法。
使用される抗体がすべてモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＰＳＡ測定方法。
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントとを含む、
抗原抗体反応が平衡に達する前に前記反応を打ち切る、請求項１に記載のＰＳＡ測定方法に用いるヘテロジニアス法用のＰＳＡ測定キット。
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、請求項７に記載のＰＳＡ測定キット。
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、請求項７又は８に記載のＰＳＡ測定キット。
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原／α１−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントとを含む、
抗原抗体反応が平衡に達する前に前記反応を打ち切る、請求項４に記載のＰＳＡ測定方法に用いるヘテロジニアス法用のＰＳＡ測定キット。
前記Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが、検体処理液に含まれている、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のＰＳＡ測定キット。
各抗体及びＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントがモノクローナル抗体である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のＰＳＡ測定キット。