CN108802392A - 一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条，包括一个底板，底板上依次重叠设置有样品垫、结合垫、隔血层、层析垫和吸水垫，结合垫上设置有偶联了抗总前列腺癌特异抗原抗体的磁性纳米免疫探针；层析垫上依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线上设置有抗游离前列腺癌特异抗原的单克隆抗体，第二检测线上设置有结合抗α‑1抗糜蛋白酶ACT的前列腺特异抗原的抗体，质控线上设置能结合total PSA抗体的IgG抗体。本发明还提供了上述试纸条的制备方法。本发明能大大减低原来在检测线上预设free PSA与total PSA之间由于检测位点部分重叠，而导致的无法准确定量两种抗原比值的问题，提高检测结果的准确性。

Description

一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种试纸条，具体来说是一种用于诊断前列腺癌血清学标志物的层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

侧向免疫层析技术（Lateral Flow ImmunoAssay, LFIA）是一个近年来引起广泛关注的方法。该技术近年来得到了迅猛的发展。它基于免疫夹心反应，可以在硝酸纤维素试纸条上，实现靶标物的快速、特异性、较高灵敏度的检测。目前已经发展出了胶体金免疫层析技术、免疫酶染色层析，和磁性免疫层析等方法，未来，免疫层析技术将朝着定量、高灵敏度、多元检测、层析系统集成化等方向发展。该技术具有快速、简便，且不需要复杂、昂贵的检测设备等优点，而且可以被检测的标本种类广泛，可用于血液检、尿液检和粪便检测等各种样本的检测。因此，已经广泛应用于食源性致病菌、蛋白、病原微生物、毒素、环境污染物等物质的检测领域。

磁性免疫层析技术是以磁性纳米材料代替胶体金颗粒利用抗体、抗原在试纸条上的夹心反应，实现磁性纳米探针标记某抗原、或者菌体的检测技术，可以通过便携式的磁信号分析仪读取磁信号，该磁信号值与抗原的量有数量对应关系，因此，既可以直接通过磁信号的多少来进行抗原量的相对值比较，也可以先建立磁信号与抗原的标准曲线，从而定量样品中抗原的浓度实现抗原定量分析；而且整个层析膜的厚度上的磁信号都可以被读取，不存在信号的损失，因此磁性免疫层析既具有快速、简便、特异的优点，又克服胶体金试纸条方法难以定量且检测灵敏度低等缺点，可以满足日益多元化的POCT检测需求；还可多指标联合检测。

前列腺癌是男性生殖系常见的恶性肿瘤。近年来，在我国的发病率呈明显上升的趋势。据估计，50岁以上的男性当中，大约有40 %的人前列腺中都患有很小面积的癌症。大量临床数据表明，肿瘤的早期诊断和有效治疗可以大幅度提高患者治愈率和生存率，传统的检测方法已经无法有效面对目前人群中恶性肿瘤的高发病率、高死亡率的现状。同时对于肿瘤患者在治疗后的主要指标的监测也是指导医生用药及制定后续治疗方案的重要参考依据，因此，无论前列腺癌的早期诊断还是预后监测都需要一种简便、快速、定量、灵敏的新型血清学检测技术。利用磁性免疫层析这种兼具快速、简便，可准确定量待测指标，且无需大型仪器和专业操作人员的POCT检测技术和产品，适应国家推行的分级诊疗和在全国广大区、县、乡、镇一级的卫生医疗机构中推广应用的巨大前景。

目前前列腺癌血清学检测指标临床常用前列腺特异性抗原（prostate-specificantigen, PSA），它对于前列腺癌的预防和早期诊断发挥了关键性作用；血清学中总前列腺特异性抗原（total PSA）是由游离抗原（free PSA）和结合α-1抗糜蛋白酶ACT的复合物（PSA-ACT）组成的。临床目前常用总PSA指标作为前列腺癌筛查指标，然而，PSA指标存在两个主要的问题，首先它是器官特异性，而非肿瘤特异性，有时血清中PSA含量升高并不意味着前列腺癌的高风险；其次，PSA检测存在4.0-10 ng/mL的“灰区”，在这个浓度区域内，无法单纯根据血清中总PSA浓度来预测肿瘤的风险；因此，目前临床医生推荐采用游离PSA(free PSA)与总PSA (total PSA)的比值对“灰区”样本进行更加准确、特异性的诊断。大型医疗机构使用较多的是Roche公司的全自动电化学发光仪和Beckman Coulter公司的全自动免疫分析仪，单独检测病人血样中的游离PSA和总PSA的含量，再计算两者比值，这种方法需要定期对仪器进行校正和归一化，才能保证在同样的背景值下根据样本阳性值算出比值。另外考虑到只有在硬件条件非常好的大型医院检验科中才能使用这类价格昂贵的专业设备。此外，PSA-ACT这个指标在临床应用尚未得到应有的重视，之前，周泽奇等人申请了采用ELISA方法检测前列腺特异抗原与α-1抗糜蛋白酶复合物的试剂盒专利[周泽奇等，ZL201610502331.4]，把PSA-ACT作为前列腺癌筛查的血清指标，但是考虑到ELISA方法本身存在的操作过程较复杂、用时较长，且不能准确定量等问题；而磁性免疫层析技术正好能够提供更加便捷、快速的操作，以及可以做到准确定量。

因此，综上所述，开发基于磁性免疫层析技术原理的新型前列腺癌双指标联合检测的POCT技术和方法，在单根层析试纸条上联合检测前列腺癌血清学指标，保证具有一致的背景值，从而快速、简便地得到具有更好临床诊断价值的数据，无论从检测指标选择组合以及采用的技术手段，都具有较大的创新型，具有迫切的需求。

现有技术存在的问题：

1、传统的酶联免疫吸附实验，每次仅能测试一种血清标志物，不能满足多种标志物联合检测的需要，而且操作复杂、用时较长，只能给出半定量结果；

2、文献报道在单根胶体金层析试纸条上联合检测free PSA，和total PSA，[CésarFernández-Sánchez, et al., Journal of Immunological Methods, 2005, 307, 1–12]即在硝酸纤维素膜上预设两条检测线，第一条预埋抗free PSA抗体，第二条预埋抗totalPSA的抗体，然而胶体金试纸条方法仅能给出定性或半定量结果，却无法进行准确地定量。此外，从单根试纸条的双指标联合检测的指标选择上来看，如果采用磁性免疫层析法直接测定血清中的free PSA和total PSA抗原量，想通过T1，T2线上的磁信号值计算两种指标的比值，也难以得到比较准确的比值，其原因是total PSA是由free PSA与PSA-ACT组成，要想通过T1\T2线上的磁信号计算free PSA/total PSA比值，需要达到在T1上仅固定结合了free PSA抗原的磁性探针，在T2线上仅固定结合了total PSA抗原的磁性探针，但是，实际上，T1\T2线上均可固定结合了total PSA抗原的探针，而且具有一定的随机性，因此既无法用T1/T2来计算比值，也无法用T1/(T1+T2)来计算。

3、采用化学免疫发光等专业设备虽然可以单独对前列腺癌标志物进行定量检测，然后计算比值，但是存在背景值不同可能影响比值准确性的问题；

4、基于光学信号的免疫层析试纸，只能靠目测来判断检测结果，主观性较大，所以只能实现定性、半定量或不准确的定量检测；由于只能检测硝酸纤维膜表面的探针颗粒的光学信号，所以难以反映检测线上探针的全部信号，无法准确定量，且检测灵敏度也较低。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条及其制备方法和应用，所述的这种用于诊断前列腺癌的层析试纸条及其制备方法和应用要解决现有技术中诊断前列腺癌的方法复杂，准确率不高的技术问题。

本发明提供了一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条，包括一个底板，所述的底板上依次设置有样品垫、结合垫、隔血层、层析垫和吸水垫，所述的样品垫的一侧和所述的结合垫的一侧上下叠合设置，所述的结合垫的另外一侧和所述的隔血层的一侧上下叠合设置，所述的隔血层的另外一侧和所述的层析垫的一侧上下叠合设置，所述的层析垫的另外一侧和所述的吸水垫的一侧上下叠合设置，所述的结合垫上设置有偶联了抗总前列腺癌特异抗原（total PSA）抗体的磁性纳米免疫探针；所述的层析垫上按照液体流动方向依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，所述的第一检测线上设置有抗游离前列腺癌特异抗原（free PSA）的单克隆抗体，第二检测线上设置有结合抗α-1抗糜蛋白酶ACT的前列腺特异抗原（PSA-ACT）的抗体，所述的质控线上设置有能结合total PSA抗体的IgG抗体。

具体的，所述的total PSA是指血清中的总前列腺癌特异性抗原，所述的free PSA是指血清中的游离前列腺癌特异性抗原，PSA-ACT是指血清中的与α-1抗糜蛋白酶ACT结合的抗原复合物。

进一步的，还包括一个隔血层，所述的隔血层设置在结合垫和层析垫之间，主要起过滤作用，可减缓血样涌动速度，适当增加抗原-抗体作用时间。

进一步地，沿底板的长度方向，所述的样品垫、结合垫、隔血层、硝酸纤维素膜和吸水垫的各重叠部分的长度为0.5-2.0 mm。

进一步地，所述的样品垫和结合垫均采用玻璃纤维素膜；所述的层析垫采用硝酸纤维素膜。

进一步地，所述的底板采用聚氯乙烯材料。

进一步地，所述的硝酸纤维素膜采用硝酸纤维素膜milipore 95或者satorisi135膜；所述的第一检测线、第二检测线和质控线两两相邻的线之间的间隔距离大于2 mm；所述的磁珠的粒径为100-150 nm。

本发明还提供了上述用于诊断前列腺癌的层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1)一个制备偶联了total PSA抗原抗体的磁性纳米免疫探针的步骤：在2吗琳代乙磺酸缓冲液（MES）中，用N-C二甲/胺-3-丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)、N-一羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基纳米磁珠表面的羧基，分离磁珠，弃上清，洗涤未反应的N-C二甲/胺-3-丙基-N-乙基碳二亚胺、N-一羟基琥珀酰亚胺，然后加入抗total PSA的单克隆抗体，制得偶联了抗total PSA抗体的磁性纳米免疫探针；

2)一个制备结合垫和样品垫的步骤：将玻璃纤维素膜浸泡在含有海藻糖、蔗糖、聚乙二醇辛基苯基醚-100的硼酸盐缓冲液（BS）中，干燥获得结合垫，将步骤1）得到的偶联了totalPSA抗原抗体的磁性纳米免疫探针固定到空白结合垫上，然后将玻璃纤维素膜浸泡在含盐、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮的硼酸盐吐温缓冲液（BST）中，待润湿后进行干燥获得样品垫；

1)一个制备第一检测线、第二检测线和质控线的步骤：将抗free PSA的单克隆抗体、结合α-1抗糜蛋白酶ACT的前列腺特异抗原的抗体和能结合total PSA抗体的IgG抗体依次包被到硝酸纤维素膜上，带有第一检测线、第二检测线和质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫；

2)一个组装试纸条的步骤：在底板上依次设置样品垫、结合垫、隔血层、层析垫和吸水垫，各相邻垫之间要相互重叠0.5-2.0 mm，得到联合检测free PSA和PSA-ACT的免疫层析检测试纸条，所述的质控线相比于第二检测线更靠近吸水垫。

优选地，步骤1）具体为在pH 6.0的MES缓冲液中，用EDC、NHS活化羧基磁珠表面的羧基，将抗体蛋白偶联在磁珠表面；利用磁分离架分离磁珠，弃去上清后用pH9.0的BS0.005M的BS缓冲液洗涤去除未反应的活化剂，加入相应的抗体，在37度摇床下反应3小时，再用含有5%的BSA的BS缓冲液封闭1小时，用磁力架磁分离，加入BST洗涤三次，加入含0.05%吐温的BS保存液，得到磁性免疫探针。

优选地，步骤2）具体为将玻璃纤维素膜浸泡在含有质量百分比浓度为5 %蔗糖、质量百分比浓度为2 %海藻糖、质量百分比浓度为0.025 %的TritonX-100、0.02 M BS缓冲液中，待润湿后干燥获得空白结合垫，将步骤一得到的磁性免疫探针按照1 mL/15 cm的用量均匀喷涂在空白结合垫上，静置、干燥得到结合垫。将玻璃纤维素膜浸泡在含质量百分比浓度为2 % NaCl、质量百分比浓度为0.5 %BSA、质量百分比浓度为0.4 % PVP、0.02 M BST缓冲液中，润湿后干燥获得样品垫，结合垫、隔血层和样品垫均封袋置于4℃保存备用。

优选地，步骤3）具体为用pH7.4的PBS缓冲液分别将free PSA和PSA-ACT检测抗体稀释到2 mg/mL，二抗稀释到1 mg/mL，然后用喷膜机在硝酸纤维素膜上分别预埋稀释后的free PSA检测抗体、稀释后的PSA-ACT检测抗体和稀释后的二抗，分别制得第一检测线、第二检测线和质控线，各线之间间隔距离3-5.0 mm，而带有两条检测线和质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫。

优选地，步骤4）具体为在底板上依次设置样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫，各相邻垫之间相互重叠0.5-2.0 mm，其中层析垫的设置方向为使得控制线相比于检测线2更靠近吸水垫，然后用自动切膜机将底板及其上设置的样品垫、结合垫、隔血层、层析垫和吸水垫进行切割成宽度一定的长条，将长条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存，长条即为联合检测free PSA和PSA-ACT的免疫层析检测试纸条。

本发明还提供了上述的用于诊断前列腺癌的层析试纸条的应用方法，包括以下步骤：

步骤一，将待测样本加到联合检测双指标的免疫层析检测试纸条的样品垫上，通过层析作用待测样本会从样品垫出发，依次经过结合垫、隔血层、层析垫和吸水垫；

步骤二，待待测样本进入吸水垫后，用专用的磁敏定量分析仪分别检测层析垫上的检测线1和检测线2的磁信号，和层析垫上的质控线的磁信号强度，实现对free PSA和PSA-ACT的定量检测。

本发明提供了一种联合检测血清中free PSA与PSA-ACT的磁性免疫层析试纸条，采用双抗夹心法基本原理，试纸条包括底板和依次相互重叠地铺设在底板上的样品垫、结合垫、隔血层、硝酸纤维素膜、吸水垫； 本发明改变了两条T线上预埋抗体的种类，以单根磁性免疫层析试纸条进行前列腺癌相关性血清标志物的联合检测为目标，通过预设两条T线，第一检测线上预设抗free PSA的单克隆抗体，第二检测线上设置有抗PSA-ACT的抗体。质控线上预设了可以结合磁珠上total PSA抗体的IgG抗体。本发明能大大减低原来在检测线上预设free PSA与total PSA之间由于检测位点部分重叠，而导致的无法准确定量两种抗原比值的问题，提高检测结果的准确性。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。

1、本发明不仅保留了层析试纸条操作简便、结构简单、成本低的优点,还首次采用免疫层析方法联合检测前列腺癌病人血清中的free PSA和PSA-ACT，利用双检测线同时检测这两个指标，有效提高前列腺癌的筛查及诊断。

2、本发明所涉及的层析试纸条，利用磁性纳米免疫探针作为标记物，通过抗原抗体特异性反应在检测线上形成条带，再利用磁敏定量检测仪探测检测线上的磁信号强度，通过计算得到更加准确的free PSA/total PSA ratio，得到定量检测结果。由于单根试纸条具有相同的背景值，因此根据T线信号值可以计算两种标志物的比值，从而提高检测的准确性。

3、在试纸条的样品垫和结合垫上添加适量的聚合物和封闭试剂，保证在试纸条层析过程中，固定在结合垫上的磁性免疫探针能完全释放，几乎没有残留，在硝酸纤维素膜上有适宜的层析速度，而且不与硝酸纤维素膜发生非特异性吸附。

附图说明

图1是本发明所涉及的联合检测free PSA和PSA-ACT的免疫层析检测试纸条的结构示意图；

图2是本发明所涉及的联合检测free PSA和PSA-ACT的免疫层析检测试纸条的跑条条带。

具体实施方式

实施例1 将磁性纳米材料与total-PSA抗体偶联

1.活化：以pH 5.0、0.01 M的无水吗啉乙磺酸-吐温溶液(MEST，0.05 % Tween-20)作为活化缓冲溶液，取2 mg磁性纳米微球于2 mL离心管中，加入500 μL 活化缓冲液洗涤：在超声波清洗仪超声和涡旋重悬磁珠，再以磁分离架进行磁分离5分钟，移去上清液；加入500 μL活化缓冲液重新同样操作洗涤微球两遍后，向微球中加入485 μl活化缓冲液再加入碳化二亚胺与浓度为0.25 g/mL的N-羟基琥珀酰亚胺各2.5 mg，在超声波清洗仪超声和涡旋重悬磁珠混匀后置垂直混合仪上室温反应30分钟后用磁分离架进行磁分离5分钟，移去上清液；用MEST活化缓冲液同样操作洗涤除去未反应的活化剂，再更换离心管，并用MEST活化缓冲液同样操作洗涤微球两遍。

2.偶联：以500μL、pH 9.0、0.005M的硼酸盐吐温缓冲液(BST，0.05％Tween-20)溶液作偶联缓冲液将上述活化好的微球同样操作洗涤两遍；加475μL偶联缓冲液重悬洗涤后的微球，再加入60-150 μg的total-PSA抗体室温反应3小时，将total-PSA抗体偶联于微球表面。

3.封闭：加入500 μL的1％牛血清白蛋白(BSA)(BSA事先溶解在硼酸盐吐温缓冲液中)对免疫微球表面没有完全反应的活化基团进行封闭，并且通过BSA的物理吸附，封闭其它的空间位点，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附，室温下封闭反应2小时。

4.保存：将上述封闭后的免疫微球磁分离架进行磁分离5分钟，移去上清液；用BST同样操作洗涤四次，最后将微球重悬在保存液中，制成浓度为2 mg/mL的微球溶液，保存液的配方为：pH 9.0、含0.05 % Tween-20、0.1 % NaN₃和0.1 % BSA的0.005 M硼酸盐缓冲体系。

实施例2 联合检测试纸条的构建

本发明提供了一种用于诊断前列腺癌血清标志物的层析试纸条，包括一个底板7，所述的底板7上依次重叠设置有样品垫1、结合垫2、隔血层、层析垫8和吸水垫6，所述的结合垫2上设置有偶联了total-PSA抗体的磁性纳米免疫探针；所述的层析垫2上按照液体流动方向依次设置有第一检测线3、第二检测线4和质控线5，所述的第一检测线3上设置有抗freePSA的单克隆抗体，第二检测线4上设置有抗结合α-1抗糜蛋白酶ACT的前列腺特异抗原的抗体，所述的质控线5上设置有能与total PSA抗体结合的IgG抗体。

进一步的，还包括一个隔血层，所述的隔血层设置在结合垫2和层析垫8之间。

进一步的，沿底板的长度方向，所述的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜8和吸水垫6的各重叠部分的长度为0.5-2.0 mm。

进一步的，所述的样品垫1和结合垫2均采用玻璃纤维素膜；所述的层析垫采用硝酸纤维素膜。

进一步的，所述的底板7采用聚氯乙烯材料。

进一步的，所述的硝酸纤维素膜8采用硝酸纤维素膜milipore 95或者satorisi135膜；所述的第一检测线3、第二检测线4和质控线5两两相邻的线之间的间隔距离大于2 mm；所述的磁珠的粒径为100-150 nm。

上述试纸条的制备方法如下：

1.划膜：用划膜仪器将浓度为2 mg/ml的IgG以1 μL/cm的量喷涂在NC膜上，作为质控线（C线，如图1中所示），将PSA-ACT的抗体溶于PBS配置成1-3 mg/ml的溶液，然后将配好的抗体溶液以1 μL /cm的量喷涂在距离C线5mm的地方记为T2线，将Free-PSA的抗体溶于PBS配置成1-3 mg/ml的溶液，然后将配好的抗体溶液以1 μL /cm的量喷涂在距离C线10 mm的地方记为T1线，然后置于37 ℃干燥烘箱烘干过夜，取出后保存于干燥环境中。

2.组装试纸条：将试纸条的各个部分按照图1的结构组装，两部分之间的重叠通过粘性实现。

实施例3 样品的检测及结果分析

1.取偶联了total PSA抗体的磁微球分散液10 μL，混合后与20 μL的层析液（1 %小牛血清的PBS）以及100 μL的待测溶液混合，取100 μL用移液枪加入到样品垫上，进行测试。

2.在加样10分钟后，根据图2，首先看质控线上是否有条带，判定试纸条的有效性，然后借助仪器测试第一检测线和第二检测线的磁信号值，实现定量检测；将试纸条放入MAR仪器进行磁性检测，得到T1，T2，C线的磁信号值，根据自制标曲判断待测样品的free-PSA和PSA-ACT的含量。结果分析是以free PSA和PSA-ACT的浓度之和作为total PSA的含量，对照目前临床诊断依据，当这个含量在4-10 ng/mL的灰区范围内，则通过free-PSA/(free-PSA+PSA-ACT)的值来辅助判定，一般临床这个比值低于0.2时，提示具有较高的前列腺癌的风险。

Claims (8)

1.一种用于诊断前列腺癌血清学标志物的层析试纸条，包括一个底板，其特征在于：所述的底板上依次设置有样品垫、结合垫、隔血层、层析垫和吸水垫，所述的样品垫的一侧和所述的结合垫的一侧上下叠合设置，所述的结合垫的另外一侧和所述的层析垫的一侧上下叠合设置，所述的层析垫的另外一侧和所述的吸水垫的一侧上下叠合设置，所述的结合垫上设置有偶联了total PSA抗原抗体的磁性纳米免疫探针；所述的层析垫上按照液体流动方向依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，所述的第一检测线上设置有抗freePSA的单克隆抗体，第二检测线上设置有抗结合α-1抗糜蛋白酶ACT的前列腺特异抗原的抗体，所述的质控线上设置有能结合total PSA抗体的IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条，其特征在于：还包括一个隔血层，所述的隔血层设置在结合垫和层析垫之间。

3.根据权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌血清学标志物的层析试纸条，其特征在于：沿底板的长度方向，所述的样品垫、结合垫、隔血层、硝酸纤维素膜和吸水垫的各重叠部分的长度为0.5-2.0 mm。

4.根据权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条，其特征在于：所述的样品垫和结合垫均采用玻璃纤维素膜；所述的层析垫采用硝酸纤维素膜。

5.根据权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条，其特征在于：所述的底板采用聚氯乙烯材料。

6.根据权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜采用硝酸纤维素膜milipore 95或者satorisi135膜；所述的第一检测线、第二检测线和质控线两两相邻的线之间的间隔距离大于2 mm；所述的磁珠的粒径为100-150nm。

7.权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌的层析试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1) 一个制备偶联了total PSA抗原抗体的磁性纳米免疫探针的步骤：在2吗琳代乙磺酸缓冲液中，用N-C二甲/胺-3-丙基-N-乙基碳二亚胺、N-一羟基琥珀酰亚胺活化羧基纳米磁珠表面的羧基，分离磁珠，弃上清，洗涤未反应的N-C二甲/胺-3-丙基-N-乙基碳二亚胺、N-一羟基琥珀酰亚胺，然后加入抗total PSA的单克隆抗体，制得偶联了total PSA抗原抗体的磁性纳米免疫探针；

2) 一个制备结合垫和样品垫的步骤：将玻璃纤维素膜浸泡在含有海藻糖、蔗糖、聚乙二醇辛基苯基醚-100的硼酸盐缓冲液中，干燥获得结合垫，将步骤1）得到的偶联了totalPSA抗原抗体的磁性纳米免疫探针固定到空白结合垫上，然后将玻璃纤维素膜浸泡在含盐、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮的硼酸盐吐温缓冲液中，待润湿后进行干燥获得样品垫；

3) 一个制备第一检测线、第二检测线和质控线的步骤：将抗free PSA的单克隆抗体、抗结合α-1抗糜蛋白酶ACT的前列腺特异抗原的抗体和能结合total PSA抗体的IgG抗体依次包被到硝酸纤维素膜上，带有第一检测线、第二检测线和质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫；

4) 一个组装试纸条的步骤：在底板上依次设置样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫，各相邻垫之间要相互重叠0.5-2.0 mm，得到联合检测free PSA和PSA-ACT的免疫层析检测试纸条，所述的质控线相比于第二检测线更靠近吸水垫。

8.权利要求1所述的一种用于诊断前列腺癌血清学标志物的层析试纸条的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

1) 步骤一，将待测样本加到联合检测双指标的免疫层析检测试纸条的样品垫上，通过层析作用待测样本会从样品垫出发，依次经过结合垫、层析垫和吸水垫；

2) 步骤二，待待测样本进入吸水垫后，用专用的磁敏定量分析仪分别检测层析垫上的第一检测线和第二检测线的磁信号，和层析垫上的质控线的磁信号强度，实现对free PSA和PSA-ACT的定量检测。