检测前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)的试剂盒,尤其是指一种新的定量检测病人血清中前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物的试剂盒及其制备方法和应用,属于诊断试剂和医疗器械领域。
背景技术
前列腺疾病是中老年男性健康的一大威胁。在发达国家中,前列腺癌(prostatecancer)的发病率很高,死亡率居第二位。据美国2012年和2013年的统计表明,大约有50万例新发病例,其中死亡率达到了10%。总体来说,发达国家前列腺癌的发病率在15%左右,远高于发展中国家。但是,中国作为发展中国家,近年来前列腺癌发病率呈上升趋势。由于前列腺癌在早期症状不明显,因此很难被发现。前列腺癌的患者主要是老年男性,随着我国人口老龄化越来越严重,患病人数会持续升高。
目前国际上普遍使用的诊断前列腺癌的方式是检测血液中总前列腺特异性抗原浓度。上世纪70年代,分别从人精浆和前列腺上皮细胞中分离出一种糖蛋白,发现其具有前列腺特异性,因此将其命名为前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)。进入血循环的大部分前列腺特异性抗原迅速与蛋白水解酶抑制物结合,主要有3种形式存在,(1)与α-1抗糜蛋白酶(ACT)结合,占70%-90%,称为结合PSA(CPSA);(2)与α-2巨球蛋白结合(MG),目前无法检测到;(3)一部分被蛋白水解酶灭活后以游离状态存在,无免疫活性,占10%-30%,称为游离PSA(FPSA)。
对于健康男性,释放入血中的PSA浓度很低,为<4ng/ml。但是,在前列腺癌病人血清中,PSA会同现另外的组合形式,比如PSA与蛋白C抑制剂的组合等。PSA作为前列腺癌的特异性标志物,对前腺癌的诊断特异性达90%-97%。被认为是有价值的前列腺癌的肿瘤标志物,被广泛应用于前列腺癌的筛选、诊断及治疗后的监测等。PSA在血清中主要有两种存在形式:一种是游离型的PSA(F-PSA),另一种是与α1-抗糜蛋白酶(ACT)结合的PSA(PSA-ACT),约占血清PSA总浓度的70%~90%。因此,特异性检测前列腺病人血清中的PSA-ACT浓度对于前列腺癌的筛选、诊断及治疗后的监测等具有十分重要的意义。
现有技术中的PSA-ACT抗原是前列腺特异抗原(PSA)和α-1抗糜蛋白酶(ACT)的复合物,其中,PSA是一种含有237个氨基酸的单链多肽,属于具有组织特异性的有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶族,而ACT是一种可以在多种肿瘤类型中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂,虽然它的生物和临床特性还不完全清楚,但是它的表达和肿瘤的生长及预后有关。由于PSA-ACT的免疫原性较为复杂,结合位点较多,不易获得能同时结合PSA和ACT的双特异性的抗体。目前尚未有检测前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物的试剂。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是提供一种检测前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)的定量检测试剂盒、其制备方法及应用。
本发明要解决的另一个技术问题是提供抗一株稳定表达抗前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶的偶联抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物定量检测试剂盒,包括抗PSA-ACT单克隆抗体包被的酶标板和抗PSA-ACT酶标抗体。
所述抗PSA-ACT单克隆抗体和抗PSA-ACT酶标抗体为PSA-ACT合成抗原的抗体。
现有技术中,PSA-ACT的免疫原性较为复杂,结合位点较多,不易获得能同时结合PSA和ACT的双特异性的抗体。本发明首先对现有技术中的PSA-ACT抗原进行了修饰与偶联,通过加入一定量的蛋白质水解酶使其断裂成若干肽段,将这些肽段分别与牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、G球蛋白和微球等载体偶联,增加半抗原的相对分子质量,提高其本身的结构特异性和免疫原性,诱导机体产生免疫应答反应。通过大量的实验进行筛选,得到具有优异免疫原性的PSA-ACT偶联抗原,在此基础上制得了表达针对PSA-ACT的两端点的具有高特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
所述PSA-ACT合成抗原由前列腺特异抗原片段和α1-抗糜蛋白酶片段通过偶联载体连接组成,前列腺特异抗原片段具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列,α1-抗糜蛋白酶片段具有序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
其中前列腺特异抗原(PSA)片段氨基酸序列如下:
VPVVFLTL SVTWIGAAPL ILSRIVGGWE CEKHSQPWQV(SEQ ID No.1)
α1-抗糜蛋白酶(ACT)片段氨基酸序列如下:
PATSSSLRQM ERMLPLLTLG LLAAGFCPAV LCHPNSPLDE(SEQ ID No.2)
所述偶联载体为牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、G球蛋白或微球。发明优选采用微球作为偶联剂,微球购于Bangs Laboratories,Inc.公司,为羧基化聚苯乙烯微球,偶联反应按照微球的使用说明书操作。
所述抗PSA-ACT单克隆抗体是保藏号为CGMCC No.12298的杂交瘤细胞株3A8所表达的单克隆抗体。该细胞株表达稳定,分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性。该细胞株表达的单克隆抗体可以与前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物反应并且识别不同的表位,效价高、质量稳定、特异性强。
所述抗PSA-ACT酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的本发明所述的PSA-ACT合成抗原的多克隆抗体。多克隆抗体的制备方法和酶标抗体的方法均为本领域常规操作。
进一步地,所述定量检测试剂盒还包括PSA-ACT标准品、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。
所述的PSA-ACT标准品、浓缩洗液,样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如下:
PSA-ACT标准品:6个PSA-ACT标准品的PSA-ACT复合物的浓度分别为50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、0.5ng/ml,其中PSA-ACT复合物为市售产品;
浓缩洗液:按重量份数计氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-200.05份,超纯水1000份;
样本稀释液:人工血清;
底物溶液:TMB(四甲基联苯胺);
终止液:2mol/L硫酸溶液。
上述抗PSA-ACT单克隆抗体、以及多个PSA-ACT标准品、辣根过氧化物酶标记抗PSA-ACT多克隆抗体、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液分别放入各个试剂瓶中,上述各试剂瓶由海绵托架固定,并同PSA-ACT抗体包被的酶标板和封板膜一同置于试剂盒盒体内。
本发明还保护表达抗PSA-ACT单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A8,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.12298。
进一步地,本发明保护保藏号为CGMCC No.12298的杂交瘤细胞株用于制备检测前列腺特异抗原与α1-抗糜蛋白酶复合物的试剂的用途。
本发明试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫检测方法,定量检测人血清中的PSA-ACT复合物的浓度。其捕获抗体为抗PAS-ACT偶联抗原的抗体,酶标抗体选用HRP标记的抗PSA-ACT多克隆抗体,经反应后形成抗PAS-ACT单克隆抗体-PSA-ACT抗原-抗PSA-ACT酶标抗体的夹心形式,然后再使用TMB进行显色反应,读数后其OD值与PSA-ACT抗原的浓度呈正相关。
本发明的有益效果是:
本发明所述PSA-ACT定量检测试剂盒采用夹心法,先将抗PSA-ACT偶联抗原的单克隆抗体包被在酶标板上,再将待检样本或标准抗原与包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点,再经辣根过氧化物酶与底物发生显色反应,测定结果的颜色深浅和待检抗原的浓度呈正相关,其所用抗体为抗PSA-ACT单克隆抗体(由细胞株CGMCC No.12298表达),可根据PSA-ACT标准品绘制标准曲线,根据标准曲线方程计算待检抗原的浓度值,该检测试剂盒具有较好的敏感性和特异性,结果与参比试剂符合率高,能提供更准确可靠的检验结果,所述试剂盒操作简便易行,检测快速灵敏,所用酶标仪简单、普及,价格低廉,该检测试剂盒为PSA-ACT定量检测提供了一种有效工具。
生物保藏信息:
生物材料名称:3A8
分类命名:杂交瘤细胞株
保藏日期:2016年5月24日
保藏号:CGMCC No.12298
保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码100101。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明,并非对本发明的限制。凡依照本发明公开内容所进行的本领域等同替换,均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为用健康人混合血清对已知浓度的PSA-ACT溶液从0.05至100ng/mL进行梯度稀释得到的检测结果拟合曲线。
具体实施方式
实施例1:制备PAS-ACT偶联抗原
一、方法
抗原制备方法:前列腺特异抗原片段和α1-抗糜蛋白酶片段氨基酸序列如序列表所示。委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行蛋白制备及表达纯化服务,通过全基因合成及载体构建、转化、小试、SDS-PAGE、WB鉴定以及蛋白纯化等步骤获得目的抗原片段。
合成抗原由前列腺特异抗原片段和α1-抗糜蛋白酶片段通过偶联载体连接组成,前列腺特异抗原片段具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列,α1-抗糜蛋白酶片段具有序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
其中前列腺特异抗原(PSA)片段氨基酸序列如下:
VPVVFLTL SVTWIGAAPL ILSRIVGGWE CEKHSQPWQV(SEQ ID No.1)
α1-抗糜蛋白酶(ACT)片段氨基酸序列如下:
PATSSSLRQM ERMLPLLTLG LLAAGFCPAV LCHPNSPLDE(SEQ ID No.2)
采用微球作为偶联剂,微球购于Bangs Laboratories,Inc.公司,为羧基化聚苯乙烯微球,偶联反应按照微球的使用说明书操作。
二、结果
得到PAS-ACT合成抗原。
实施例2:制备抗PAS-ACT偶联抗原的单克隆抗体
一、方法
1、动物免疫
实施例1得到的PAS-ACT合成抗原作为免疫抗原免疫小鼠,选用6周龄、雌性BALB/c小鼠。首次免疫,50μg/只的抗原加等体积完全福氏佐剂,采用皮下注射;4周后,第二次免疫,用25μg/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂,皮下注射,二免后效价为1∶50000;2周后,第三次免疫,用25μg/的抗原加等体积不完全福氏佐剂,皮下注射,7天后,ELISA检测免疫鼠血清效价,效价达到1∶10W,准备做细胞融合。细胞融合前3天,再用25μg抗原腹腔注射以加强免疫。
2、细胞融合
细胞融合可采用公知的方法进行。取免疫小鼠脾脏细胞(1×108个细胞)与骨髓瘤细胞株Sp2/0(1×107个细胞%),在50%PEG1450作用下进行常规融合。融合细胞用HAT培养基作选择性培养,7天后改用HT培养基,14天后改用DMEM培养基培养(20%小牛血清)。融合板铺板5板,融合率为90%。
3、阳性检测
单克隆抗体的检测采用公知的方法进行,间接ELISA法。用抗原PSA-ACT(包被浓度为100ng/ml)包被酶标板,37℃孵育1h,洗板;96孔细胞培养板的每个待检孔取100ul加入包被好的酶标板,37℃孵育45min,洗板;加入HRP酶标二抗,37℃,30min,洗板;加入TMB显色液,37℃避光反应15min后,加人终止液;读取波长为450nm时的OD值。OD值读大于0.5以上定义为阳性克隆。一共得到阳性单株14株。检测到的阳性细胞再进行亚克隆,经过3~5次亚克隆直到达到100%的阳性率。
3、抗体纯化
将14株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水,纯化抗体。在预先1周注射石蜡油(0.5ml/只)致敏的BALB/C小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞,细胞数为106,7~10天后采集腹水,离心得上清。腹水上清按1∶10稀释于PBS中,并以0.5ml/min上样于经PBS平衡的HiTrap Protein G亲和层析柱中。用PBS洗杂,再用甘氨酸缓冲液(pH值为2.7)洗脱,用SDS-PAGE电泳鉴定纯度。包被PSA抗原,间接ELISA法测定抗体效价,14株抗体的效价在1∶8W~1∶20W之间。
4、抗体的标酶及效价测定
得到纯化抗体后,利用改良过碘酸钠氧化法进行抗体标酶。首先称取适量HRP酶,溶于三蒸水中,加人新近配制的过碘酸钠溶液,混匀后置4℃,30min;加入乙二醇溶液,室温,30min;加入适量纯化抗体,混匀,调pH值至9.0,放4℃,过夜;加入硼氢化钠,混匀,置40C,2h;将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液,置4℃,30min;离心后,用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析过夜。包被PSA抗原,直接ELISA法测定酶标抗体效价,酶标抗体的效价在1∶500~1∶5K之间,酶标抗体的工作浓度为1∶200~1∶2K之间。
二、结果
选择稳定性高、效价高、单克隆抗体特异性强、表达量大的细胞株进行保藏。
得到杂交瘤细胞株3A8,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.12298,保藏时间为2016年5月24日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码为100101。
杂交瘤细胞株3A8表达抗PSA-ACT的单克隆抗体,该抗体的效价在1∶8W~1∶20W之间。
实施例3:制备抗PAS-ACT偶联抗原的多克隆抗体
一、方法
1、免疫家兔
1)制备油包水抗原乳剂:5ml弗氏佐剂吸入到一支10ml注射器中,将等量抗原(实施例1得到的PAS-ACT合成抗原)与卡介苗(终浓度为15~30mg/ml)放入到另一支10ral注射器中,两个注射器用连通器进行连接,抽吸混匀,直至混匀成乳白色,抽吸困难,滴入水面不散为止。
2)免疫动物:选用2~2.5kg的健康家兔,第一次用皮内多点注射法,共注射抗原乳剂2ml(含抗原50mg/只)。三周后再次皮内多点免疫,再隔两周后于静脉注射可溶性抗原100mg,此为强化免疫。
2、试血
强化注射后7天耳静脉取血,分离血清,用间接ELISA法测其效价,方法同实施例2的“4、抗体的标酶及效价测定”。
3、采血
选用一次全采血法,自颈动脉无菌放血,分离血清,加入适量防腐剂,分装小瓶,低温冰箱保存。
4、IgG的提取
用50%硫酸铵沉淀一次,33%硫酸铵沉淀两次,然后用DEAE层析法把兔血清进行纯化。
5、效价的测定
用间接ELISA法测定纯化的IgG效价,方法与血清抗体效价的检测相同。
二、结果
得到抗PAS-ACT多克隆抗体,抗体效价为1∶60000。
实施例4:制备PSA-ACT定量免疫检测试剂盒的制备
一、试剂盒组成
1、酶标板:包被实施例2制备的抗PSA-ACT单克隆抗体的酶标版;
2、抗PSA-ACT酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的抗PSA-ACT多克隆抗体;
3、PSA-ACT标准品:为6个标准品,标准品中PSA-ACT复合物的浓度分别为50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、0.5ng/ml,其中PSA-ACT复合物为市售产品,购于北京安必奇生物科技有限公司;
4、浓缩洗液:按重量份数计氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份;
5、样本稀释液:市售人工血清;
6、底物溶液:TMB(四甲基联苯胺);
7、终止液:2mol/L硫酸溶液。
8、封板膜
二、制备方法
(一)制备酶标板
1、包被液的配制:
包被液采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将实施例2得到的抗PSA-ACT的单克隆抗体稀释至100ng/100μL,pH值为7.0~pH 7.4。
2、封闭液的配制:
1)封闭液采用0.01M磷酸盐缓冲溶液,其pH值为7.0~pH7.4;
2)将3%的脱脂奶粉加入上述溶液中,配制成封闭液。
3、包被酶标板:
1)将配制的包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入90μL包被液;
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被8h;
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入90μL封闭液,置于37℃温箱,30分钟;
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温30分钟。
(二)配制酶标抗体溶液
1、用辣根过氧化物酶(辣根过氧化物酶快速标记试剂盒,购于北京中合正安生物技术有限公司)标记实施例2得到的单克隆抗体,得到酶标抗体。
2、用HRP偶联物稳定剂(购于天津百萤生物科技有限公司)以1∶5000的比例稀释上述酶标抗体。
(三)配制PSA-ACT标准品
将市售PSA-ACT抗原(购于北京安必奇生物科技有限公司)用人工血(购于湖州英创生物科技有限公司)清稀释配制,稀释浓度分别是50ng/ml,25ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2ng/ml,0.5ng/ml。
(四)配制浓缩洗液(20×0.01M PBS)
将氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-200.05份,超纯水1000份,混匀即得。
(五)样本稀释液
人工血清:市售(购于湖州英创生物科技有限公司)
(六)底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine),购于南京生兴生物技术有限公司。
(七)配制终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1∶8稀释,配制成终止液。
三、使用方法
1、试验前将试剂盒取出,置于室温(20-25℃)30分钟。
2、打开装有96孔酶标板的密封袋R1,将暂不用的板条放回密封袋内封好,保存在2-8℃。
3、配制工作洗涤液
浓缩洗液稀释20倍(1份浓缩洗液加19份无菌去离子水或超纯水),稀释后的工作洗涤液可在2-8℃保存2周。若浓缩洗液出现结晶,请30℃水浴溶解后使用。
4、留第一孔做空白对照,此步骤中空白孔不加入任何液体。
5、其余各孔依次加入100μL标准品和血清样本。
6、贴上封板膜,在37℃条件下孵育60±1分钟。
7、洗涤:揭开封板膜,洗涤酶标板。每孔每次加入不少于300μL的洗涤液,静置40秒后将酶标板孔内液体除去,在吸水纸上反复拍打以去除残留液体,重复上述洗涤操作,共洗涤3次。
8、除空白孔外,每孔加入100μL酶标抗体。
9、贴上封板膜,在37℃条件下孵育30分钟。
10、同步骤7。
11、每孔加入底物溶液100μL,在37℃下孵育10分钟,避光。
12、每孔加入50μL终止液,加样顺序和加入底物溶液的顺序一致,混匀。
13、加入终止液后,在5分钟内于酶标仪450nm波长处读吸光度值(OD值)。二、数据处理
各孔OD值减去空白对照孔OD值后再进行分析。
以PSA-ACT抗原浓度为横坐标,OD值为纵坐标,作直线拟合得到标准曲线方程。根据标准曲线方程计算待检样本中PSA-ACT抗原浓度。
实施例5:PSA-ACT定量免疫检测试剂盒性能验证
一、分析灵敏度
取实施例4的试剂盒中的酶标板,向20个孔分别加入样本稀释液进行检测,得出吸光度值A,计算20个样本稀释液孔检测值的平均值M和标准差SD,得出(M+2SD)所对应的A值,将(M+2SD)所对应的A值带入标准曲线方程中,求出对应的浓度值,即为灵敏度。
二、精密度分析
取同一批次3个试剂盒(按实施例4测定同一实验内控品(20ng/mL),读取450nm处的OD值,每个试剂盒测10孔,按照公式计算所有结果CV(%)值,每种规格取3个批次做平行试验,结果见表1。
表1
三、回收率
选择正常人血液添加人PSA-ACT抗原20ng/mL、10ng/mL后检测,计算真实值与期望值的比值,得到回收率。回收率介于80-120%之间认为合格,结果见表2。
表2
四、检测范围
用健康人混合血清对已知浓度的PSA-ACT溶液从0.05至100ng/mL进行梯度稀释,用实施例4试剂盒检测。以浓度为横坐标,OD450值为纵坐标绘制曲线,并进行直线拟合,确定检测范围。见图1所示。
五、稳定性实验
将组装好的试剂盒在37℃环境中放置,每天做标准曲线检测OD值,连续检测5天,检测值变化率(即变异系数CV)小于15%,见表3,证明试剂盒稳定。其结果显示5天的变异系数CV≤15%,说明本发明稳定性良好。
表3