一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及人降钙素原的检测方法,尤其涉及vde免疫检测试剂盒,属于生物领域。
背景技术
降钙素原(procalcitonin,PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质,分子质量为13kD的糖蛋白,由116个氨基酸组成,包括N-残端、降钙素、下钙素三个部分,其中1~57为N-残端,60~92为降钙素,96~116为下钙素。1996年以来,PCT作为一种新型的诊断细菌感染以及其继发的合并症的鉴别诊断工具,在诊断败血症、败血症休克以及严重系统炎症反应等此类疾病诊断以及过程的追踪观察方面,PCT诊断具有明显优势,且特异性高。2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT作为诊断指标之一。近年来PCT被认为是系统性炎性反应综合征、脓毒症、急性呼吸窘迫综合征等疾病的预警指标,反映了全身性细菌感染的存在和严重程度。
在人体血液循环中,不仅存在全长的PCT多肽(约13kD),而且源自于PCT多肽的片段也广泛存在其中,具体来说,相关文献也讨论过降钙素部分上下游分别发生的蛋白水解切割(Muller等,Crit Care Med 2000;977-83;Whang等,J Clin Endocrinol Metab 1998;83:3296-301)。然而,关于此的实验证据很少,使用针对PCT的降钙素部分的抗体通过亲和层析从脓毒症患者分离到循环中的PCT,并且已经得出结论,即PCT3-116是主要的循环PCT物质(Weglohner等,Peptides 2001;22:2099-103.)。目前可以确定的是,甲状腺的C细胞首先合成前PCT,前降钙素原主要由N端84个氨基酸(含由25个氨基酸的前导肽)、活性降钙素(32肽)和Katacalcin(21肽)三部分组成,后两部分被4肽(-Gys-Lys-Lys-Arg-)隔开。前降钙素原进入内质网,经糖基化和酶切除导肽,转变为PCT,PCT又经不同蛋白酶分别作用,先切除N端肽形成57肽,57肽进一步降解即生成成熟降钙素和Katacalcin,成熟降钙素的C末端尚需酰胺化才能最后形成活性降钙素,降钙素为活性32肽。
实验证明,PCT浓度升高的主要原因是细菌内毒素引发的全身效应。PCT在检测时表现出的高度特异性的原因是:1、在正常个体中,PCT经过一系列的体内酶催化作用最后水解形成CT,故其血清中的PCT浓度很低,仅为10~50pg/ml。2、在系统炎症反应综合症(SIRS)、败血症、急性/慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎和创伤等患者的血清中的PCT浓度会显著升高,其浓度可达到正常水平的几倍甚至上万倍。研究表明,在LPS血类败血症相关因子作用下,靶细胞(PBMC)等应急分泌PCT,这时PCT的分泌速率超过转化速率(由PCT分解成CT),或者该转换过程缺少相关的水解酶,从而导致血清中PCT浓度成倍升高。3、在病毒感染、慢性非特异性炎症等患者的血清中PCT浓度持平或稍有增加。因此,PCT可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标,它不仅与疾病的严重程度成正相关,而且随着病情的变化而变化。
目前国际上开展的PCT浓度检测方法很多,主要有以下几类:
(1)凝胶法,此方法费事且不易形成自动化检测;
(2)酶联免疫吸附法,传统的ELISA法检测操作复杂、反应时间较长、灵敏度低;
(3)放射免疫测定,此方法反应时间长、检测结果不稳定,重复性差,且存在放射性污染问题;
(4)免疫发光法,该方法特异性强、灵敏度高,但需要昂贵的实验仪器;
(5)胶体金层析法,此方法灵敏度低,只能定性无法实验定量检测;
在PCT的临床检测中,目前国际市场上免疫检测产品包括法国梅里埃VIDAS,美国RB公司,美国RD公司等均有推出,VIDAS采用荧光法检测,需要特定的仪器,才能够实现准确定量;ELISA产品采用双抗夹心法,先将PCT的特异抗体包被在酶标板上,再加入待检样本37℃孵育,再加入辣根过氧化物酶(即HRP)标记的单克隆抗体37℃孵育,待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构,再加入四甲基联苯胺显色,颜色的深浅和待检抗原的浓度呈正相关,从而实现PCT的检测。此类产品在检测时采用两步法,检测速度慢导致检测耗时过长,检测的准确度也存在不足之处;并且此类方法通常采用PCT单抗或多抗,检测敏感性不足,在较低浓度下往往无法建立线性良好的标准曲线,导致其无法检测较低浓度的PCT待测样品。
发明内容
在本发明的全文中,下述简写分别代表的术语是:
PCT-人降钙素原;
PBS-磷酸盐缓冲溶液;
CBS-碳酸盐缓冲溶液;
Tirs-三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液;
BSA-牛血清白蛋白;
TMB-四甲基联苯胺;
HRP-辣根过氧化物酶;
AP-碱性磷酸酶;
PNPP-对硝基苯磷酸二钠;
OD-在给定波长下的吸光度。
对于PBS、CBS、Tris、TMB等的组成、浓度、pH等,均可采用免疫生物学上的常见类型。
针对现有技术的缺陷,本发明提供了一种人降钙素原免疫检测试剂盒,能够快速、准确检测待测样品中PCT的浓度,检测效率高,在20min内即可完成检测操作;检测灵敏度高,在0.01ng/ml~20ng/ml范围内均呈现良好的线性;检测成本低,只需使用酶标仪等即可完成检测。
为实现上述目的,本发明是通过下述技术方案实现的:
一种人降钙素原免疫检测试剂盒,试剂盒内包括PCT单克隆多抗包被的酶标板;至少两个PCT标准品试剂瓶,每个PCT标准品试剂瓶中装有不同浓度的PCT标准品;酶标试剂瓶,其中装有酶标记的抗PCT的单克隆多抗。
对于本发明而言,上述的单克隆多抗体,可以是针对某一个肽段表位的多个单克隆抗体混合得到,也可以是相应的单克隆抗体与多克隆抗体混合,同样的,也可以是一个或多个多克隆抗体的混合物。
上述单克隆抗体制备方法为本领域技术人员所熟知,GENBANK中获得人降钙素原蛋白的基因序列,相应的可以得到其N端(N-proCT)、降钙素(Calcitonin,CT)以及下钙素(Katacalcin,KAT)抗原的多肽序列:
N端(N-proCT):
Ala-Pro-Phe-Arg-Ser-Ala-Leu-Glu-Ser-Ser-Pro-Ala-Asp-Pro-Ala-Thr-Leu-Ser-Glu-Asp-Glu-Ala-Arg-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Leu-Val-Gln-Asp-Tyr-Val-Gln-Met-Lys-Ala-Ser-Glu-Leu-Glu-Gln-Glu-Gln-G lu-Arg-Glu-Gly-Ser-Ser-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg-Ser
降钙素(Calcitonin,CT):Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-G ln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro
下钙素(Katacalcin,KAT):
Asp-Met-Ser-Ser-Asp-Leu-Glu-Arg-Asp-His-Arg-Pro-His-Val-Ser-Met-Pro-Gln-Asn-Ala-Asn
本发明所述的不同区域的PCT抗原的制备方法,具体步骤如下:
(1)取1份PCT全长抗原;
(2)配置2份酶解液:激素原转化酶(Prohormone Convertase,PC)、羧肽酶(Carboxypeptidase,CP)、氨肽酶(Aminopeptidase,AP)、肽酰甘氨酸羟单氧化酶(Pepeitdyl Glycine Amidating Mono-oxygenase,PAM)各30IU/g,溶解在2份20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷),500mM NaCl,pH 7.4或者PBS(磷酸盐)缓冲液,pH 7.4。
(3)加入酶解液,37℃水浴酶解2h~4h;
(4)将分别针对N端(N-proCT)、降钙素(Calcitonin,CT)以及下钙素(Katacalcin,KAT)抗原的三种单克隆抗体单独偶联到层析柱上,将酶解液依次过滤进行亲和纯化,从而获得N端(N-proCT)、降钙素(Calcitonin,CT)以及下钙素(Katacalcin,KAT)三种抗原,具体步骤如下:
a将上述抗体分别结合到蛋白A或蛋白G微珠上。每份湿的微珠结合2份单克隆抗体。将抗体和蛋白A或蛋白G微珠混合制成匀浆,在总量为10份的溶液中加入大约l份微珠,室温孵育1h,混匀。
b用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)洗涤微珠2次,每次以3000g离心2min或10,000g离心30s。
c用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠,留样。加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中,使终浓度为20mmol/L。
d室温孵育30min,并混匀,留样。
e用0.2mol/L乙醇胺(pH8.0)洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0.2mol/L乙醇胺,室温孵育2h,混匀。
f将抗体包被的微珠转入层析柱中,用PBS缓冲液(pH 7.4)冲洗容器。
g用20倍柱床体积与制备抗原相同的缓冲液洗柱。
h将抗原液加到柱上,按每毫升柱体积大约lmL/h的速度使抗原溶液流过层析柱。
i用20倍柱床体积的结合缓冲液(PBS)洗柱。
k采用分段洗脱法,连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱,分管收集每一组分。
l检测每管的抗原含量,将浓度高的各管合并。
将多肽偶联到BSA、OVA、KLH、乳胶微球等较大的蛋白载体上从而产生显著地免疫反应。KLH由于在ELISA或Western blotting检测中没有抑制作用不影响检测结果。合成抗原多肽时,在其N端或C端添加一个半胱氨酸残基有利于多肽与载体蛋白的偶联。
在KLH分子表面有大量的活性基团,最常用于偶联的是伯胺基团。小的多肽通常也带有不同基团可以用于偶联,常用的有伯胺基团,羧基和巯基。多肽与KLH的偶联就是利用这些基团,再通过交联剂(crosslinker),将多肽上的巯基/羧基/伯胺与KLH上的伯胺相连,从而形成共价偶联,制备成完全抗原,用于免疫动物获得抗体。所以偶联的伯胺应该是来自于赖氨酸侧链和N端,而偶联的羧基则来自于天冬氨酸,谷氨酸和C端,巯基则来自于半胱氨酸。
近年来,亲和乳胶微球已被广泛用作免疫载体。聚合物微球提供了一个应用于诊断和生物分离的平台。它们可以被涂覆有识别分子,如抗体,抗原,肽,或核酸探针,并且可以加载疏水性染料和其他化合物。未改性的聚合物微球也被广泛使用于标准仪器的安装和校准。微球直径范围从20nm到200μm,具有良好的尺寸均匀性。普通聚苯乙烯微球蛋白吸附效果很理想,并且已经被一系列的诊断测试和分析所证实。表面改性的微球可与羧基和伯胺基团进行共价配对。直径在22nm-99nm之间的微球,可作为优良的免疫原偶联物。
所得到的PCT各段抗原多肽通过交联剂(crosslinker),将多肽上的巯基/羧基/伯胺与KLH上的伯胺相连,从而形成共价偶联,制备成完全抗原,用于免疫动物获得抗体。偶联的伯胺是来自于赖氨酸侧链和N端,而偶联的羧基则来自于天冬氨酸,谷氨酸和C端,巯基则来自于半胱氨酸。
本发明中所述的单克隆抗体,优选为兔单克隆抗体,具有如下优势:
动物经过初次和加强免疫后,原始的B细胞被诱导分化为不同的细胞,包括分泌抗体的浆细胞和记忆细胞。T细胞表位的MHCI和MHCII而非典型的MHC分子参与多肽呈递。CD1家族分子呈递非多肽抗原,如脂质和糖类。CD1家族可以分为三类:第Ⅰ类包括CD1a,CD1b和CD1c,第Ⅱ类是CD1d,第Ⅲ类CD1e,兔子可以表达这三类,老鼠只能表达第Ⅱ类。第Ⅰ类分子主要根据脂质抗原的变化来表达不同的T细胞进行免疫反应,相比较而言,第Ⅱ类则根据脂质抗原而产生自然杀伤性T细胞,兔和鼠针对脂质或糖脂类抗原的决定簇的不同,因此针对多糖类分子免疫兔产生抗体优于鼠产生的抗体。
在兔体内抗体产生的初期和第二期具有几个特征:与人和鼠不同,兔B细胞不断的在肠相关的淋巴组织产生,由富含B细胞的淋巴组织和血液中的游离的B细胞产生抗体,通过进行非特异性免疫原的抗体扩增而形成大的抗体库;相对鼠和人,兔的免疫更加简单,兔的IgG没有亚基,而且很少会产生IgM。兔抗体仅有Cγ基因,而且轻链的大部分(90-95%)来自同型的Cκ1,IgG的全部轻链仅5%-10%来自同型的λ,兔IgG的这些特点使得基因克隆比鼠和人的更容易。
本发明所述的不同区域的PCT抗原的多克隆抗体的制备方法,步骤如下:
1.用制备好的各个区域的PCT抗原免疫动物。
2.测定免疫后动物的血清效价,从免疫后的动物体内取血。
3.用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清进行纯化,得到纯化的多克隆抗体。
上述步骤2中免疫的方法是多种多样的,如:脾内注射法,腹腔注射法等。免疫剂量可视具体动物种类而定。用于制备PCT多克隆抗体的动物可以是鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴等可用于免疫的动物。
上述步骤3中免疫后的动物可处死后采血,也可以不处死,饲养过程中每次采一定量的血。
上述步骤4中用于抗体纯化的方法可以是饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法等。
亲和层析法步骤如下:
(A)取2份抗血清样本,加等体积的生理盐水,再加入4份饱和硫酸铵溶液,于4℃沉淀过夜;
(B)10000g低温离心10分钟,弃上清,将沉淀用2份PBS溶解,缓慢滴加1份饱和硫酸铵溶液,在4℃静置1小时;
(C)10000g低温离心10分钟,弃上清,将沉淀用1份PBS溶解,用PBS溶液4℃透析过夜;
(D)用亲和层析的方法进一步纯化:
Ⅰ用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱;
Ⅱ用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱;
Ⅲ将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样;
Ⅳ用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱;
Ⅴ用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱,得到抗PCT抗原的多克隆抗体。
用上述方法制备得到的多克隆抗体及其他种属来源的多克隆抗体是需要本发明保护的。
本发明提供了抗PCT抗原的多克隆抗体和单克隆抗体,及抗PCT抗原的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法。实验证明,用本发明所属方法制得的多克隆抗体具有效价高,特异性好的特点,有很强的应用前景。
通过上述试剂盒,可利用多个PCT标准品建立标准曲线,即可得到待测样品的PCT浓度。
为了保证检测过程的顺利进行,本领域技术人员可以理解上述检测试剂盒还需要使用必要的缓冲液、终止液等,因此试剂盒内还包括洗液试剂瓶,其中装有用于洗涤酶标版的洗液;底液试剂瓶,其中装有受酶催化显色的底物溶液;终止液试剂瓶,其中装有终止显色反应的终止液。
对于上述应作广泛理解,即可以将这些缓冲液等成分的试剂瓶装在一个单独的盒子中与本发明的试剂盒组成配套试剂盒使用,以便避免材料浪费;也可以是这些试剂瓶均装在本发明的试剂盒中,以便于快速操作,分类方便。这两种试剂盒形式均涵盖于本发明的保护范围。
尽管只要使用两个标准品即可建立标准曲线,为了提高检测的准确度,所述PCT标准品试剂瓶为5个,所述PCT标准品浓度范围为0.05ng-100ng/mL,在此范围内的任意五个不同浓度。可以理解,更多的不同浓度的标准品可以进一步提高检测准确度,其它任意数目均涵盖于本发明。
在本发明中,优选的,用于标记抗PCT的单克隆多抗的酶为辣根过氧化物酶或或碱性磷酸酶。
其中,所述的浓缩洗液,样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如下:
浓缩洗液:按重量份数计,氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份;
样本稀释液:人工血清;
底物溶液:TMB溶液或PNPP溶液;
终止液:2mol/L硫酸溶液或3mol/L氢氧化钠溶液。
为了保证检测结果的可靠性,防止污染等导致的失真,试剂盒内还包括阳性质控试剂瓶和/或阴性质控试剂瓶。
在此基础上,本发明相应的提供了所述试剂盒的制备方法,包括下述步骤:
(1)制备PCT单克隆多抗包被的酶标板
(a)PCT单克隆多抗包被液的配制:采用以下任一缓冲溶液将GM稀释至25ng/100μL~2μg/100μL:0.01mol/L~0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS),其pH7.0~pH8.0;0.05~0.2mol/L碳酸盐缓冲液(CBS),其pH9.0~pH9.6;0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液,其pH10.0~pH10.6;
(b)封闭液的配制:将3%~5%的脱脂奶粉或者1%~4%BSA加入下述缓冲溶液中,配制成封闭液:缓冲溶液,0.01mol/L~0.2mol/L PBS,其pH7.0~pH8.0;
(c)包被酶标板:
①将配制的PCT单克隆多抗包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入60μL~200μL包被液;
②酶标板置于2-8℃环境下包被8~16h;
③将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入60μL~200μL封闭液,置于37℃温箱,30~90分钟;
④从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温30~90分钟,即得;
(2)标准品的制备
标准品的制备是将PCT抗原用含稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释而成;
(3)酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制
酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制是将HRP或AP标记的抗PCT的单克隆多抗用偶联物稳定剂以1:2000~1:20000的比例稀释而成。
本发明的试剂盒对于检测PCT的浓度具有非常好的效果,不仅快速准确,而且灵敏性高,因此本发明还公开了所述试剂盒在检测人降钙素原浓度中的应用,具体操作步骤如下所示:
1)将PCT标准品、待测样品加入到PCT单克隆多抗包被的酶标板的孔中,同时加入酶标记的抗PCT的单克隆多抗,孵育5-60min;2)甩掉反应液,采用洗液洗涤酶标板的孔;2)洗涤结束后在孔中加入底物溶液孵育15min,然后加入终止液混匀后,在OD450nm处读数;3)根据PCT标准品和待测样品的吸光度测定值,绘制标准曲线和方程,计算出待测样品中PCT的浓度。
本发明的试剂盒,通过将针对特异片段PCT的单克隆多抗包被在固相载体上,制成固相抗体,然后将待检样本与酶标的抗PCT的单克隆多抗分别加入所得固相上,恒温反应并经过彻底洗涤后使待检抗原与单克隆多抗结合形成免疫复合物;由于酶的反应底物TMB显色,颜色的深浅和待检样本中PCT浓度呈正相关,因此用酶标仪在一定波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线实现对抗原的定量检测分析,快速准确的检测PCT抗原,有利于相关疾病的早期诊断;同时,本发明的试剂盒敏感性和特异性好,能提供更准确可靠的检验结果;具体到检测操作,本发明的试剂盒采用一步式操作,实验操作简便易行,检测快速敏感,不需要精密的仪器设备,是一种面向不同级别医院及临床检验机构进行PCT检测的有效方法。
附图说明
图1为本发明试剂盒实际应用生成的标准曲线图。
图2为对应于检测结果的ROC曲线图。
图3显示了兔IgG型多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果,其中,pAb泳道为多抗,M泳道为蛋白Marker。
图4显示了兔IgG型多克隆抗体的效价测定的结果。
具体实施方式
在下述实施例中,本发明提供了所述试剂盒的优选实现方式,通常本发明的PCT诊断试剂盒在盒体内放置海绵托架和单克隆多抗包被的酶标板R1,在海绵托架上防治符合要求的试剂瓶,例如R2a试剂瓶(PCT标准品a)、R2b试剂瓶(PCT标准品b)、R2c试剂瓶(PCT标准品c)、R2d试剂瓶(PCT标准品d)、R2e试剂瓶(PCT标准品e)、R3试剂瓶(辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗)、R4试剂瓶(浓缩洗液)、R5试剂瓶(TMB溶液)、R6试剂瓶(终止液)、R7试剂瓶(阳性质控)、R8试剂瓶(阴性质控)、封板膜和海绵托架组成。
其中,所用的洗液为了尽可能减少体积占用,采用浓缩洗液,所用的浓缩洗液、底物溶液和终止液的组分及配比如下:
浓缩洗液:氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份;
底物溶液:TMB或PNPP;
终止液:2mol/L硫酸溶液或3mol/L氢氧化钠溶液。
上述所公开的组成以及浓度均为免疫学领域最常用的,根据需要,可以对其进行合理调整。
实施例1PCT抗原的制备
(1)取1mg PCT全长抗原;
(2)配置2ml酶解液:激素原转化酶(Prohormone Convertase,PC)、羧肽酶(Carboxypeptidase,CP)、氨肽酶(Aminopeptidase,AP)、肽酰甘氨酸羟单氧化酶(Pepeitdyl Glycine Amidating Mono-oxygenase,PAM)各30IU/g溶解于20mM Tris,500mMNaCl,pH 7.4缓冲液中。
(3)加入酶解液,37℃水浴酶解2h;
(4)将分别针对N端(N-proCT)、降钙素(Calcitonin,CT)以及下钙素(Katacalcin,KAT)抗原的三种单克隆抗体单独偶联到层析柱上,将酶解液依次过滤进行亲和纯化,从而获得N端(N-proCT)、降钙素(Calcitonin,CT)以及抗降钙素原(Katacalcin,KAT)三种抗原,具体步骤如下:
a将上述抗体分别结合到蛋白A微珠上。2mg的单克隆抗体结合1mL湿的微珠。将抗体和蛋白A微珠混合制成稀薄的匀浆,在总量为10mL的溶液中加入lmL微珠,室温孵育1h,混匀。
b用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)洗涤微珠2次,每次以3000g离心2min。
c用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠,留样。加入二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中,使终浓度为20mmol/L。
d室温孵育30min,并混匀,留样。
e用0.2mol/L乙醇胺(pH8.0)洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0.2mol/L乙醇胺,室温孵育2h,混匀。
f将抗体包被的微珠转入层析柱中,用PBS缓冲液(pH 7.4)冲洗容器。
g用20倍柱床体积的20mM Tris,500mM NaCl,pH 7.4缓冲液洗柱。
h将抗原液加到柱上,按每毫升柱体积大约lml/h的速度使抗原溶液流过层析柱。
i用20倍柱床体积的结合缓冲液(PBS,pH7.4)洗柱。
k采用分段洗脱法,连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl,pH2.8)通过
层析柱,分管收集每一组分,洗脱产物用1.0M Tris-HCl,pH9.0中和。
l用蛋白定量检测每管的抗原含量,将浓度高的各管合并。
实施例2PCT表位肽段的检测
Western blot对PCT抗原多肽进行免疫反应特异性鉴定:取最后纯化的降钙素原多肽进行15%SDS-PAGE鉴定,用Abcam公司生产的抗PCT单克隆抗体对其进行western blot分析,选用Millipore Immobilon Western Chemiluminescent HRP Subscrate系统显色,结果显示抗PCT单抗结合PCT蛋白处可见清晰条带。
实施例3PCT表位肽段抗原的制备
由实施例1得到的相关抗原,与相关大分子物质偶联以提高其免疫原性:所述的PCT N端(N-proCT)、降钙素(Calcitonin,CT)以及下钙素(Katacalcin,KAT)分别与乳胶微球,KLH,BSA,GST等进行偶联,部分偶联需加入交联剂,以促进其交联率的提高,获得的抗原多肽片段可用于免疫动物。
实施例4PCT单克隆抗体的制备
一、动物免疫
选取3公斤左右健康新西兰大白兔2只,免疫前先从耳缘静脉抽取静脉血,析出的血清作为阴性对照。剪去兔背部部分毛发,并用酒精擦拭消毒,防止感染。第一次免疫时使用弗氏完全佐剂,将lml抗原(0.4mg/ml)与等体积佐剂充分乳化后,背部皮下多点注射。3周后进行第二次免疫,抗原量减半,并和弗氏不完全佐剂乳化后免疫兔子,方法同第一次。此后每二周免疫一次,并在第3次免疫后12天和第五次免疫后12天耳缘静脉取血获得抗血清,用间接ELISA法进行抗血清效价测试。获得抗体滴度结果后可以进行最后一次加强免疫。方法是耳缘静脉注射lml(0.4mg/m1)抗原,不使用佐剂。免疫后四天,处死动物,收集多抗血清,暴露腹部皮肤,酒精擦洗,相对无菌条件下取出脾脏。
二、细胞融合
1骨髓瘤细胞的准备
选择生长状态良好的SP2/0细胞,覆盖瓶底80%时弃上清,以不完全培养基洗涤一次后,用l0mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。
2脾淋巴细胞的准备
颈动脉放血处死兔子,暴露腹部皮肤,酒精擦洗,相对无菌条件下取出脾脏。在超净台中去除脾脏周围残余脂肪和结缔组织。用不含血清,含2×双抗(200单位青/链霉素/ml)的不完全培养液漂洗脾脏。将脾脏组织剪碎后过不锈钢筛网。冲洗筛网,收集细胞悬液,离心去上清。红细胞裂解液处理以去除红细胞。加不完全培养液中止。离心去上清。再洗一次细胞,重悬细胞后台盼蓝染色测活计数。记录细胞总数(染色细胞十未染色细胞)、活细胞数(未染色细胞),计算细胞存活率(活细胞数/细胞总数X10O%)。
将细胞悬液离心去上清,将细胞用冻存液悬浮后,分装至冻存管中,放入装有异丙醇的程序降温盒内,-80℃低温冰箱过夜,第二日转入液氮罐中冻存。
3融合
将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的融合管中,1000rpm离心10min,弃上清。将融合管置于手掌中,轻轻摩擦底部,使两种细胞充分混匀;在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG-1500到融合管中,边加边轻轻摇匀;随即在90s内先慢后快滴加30mL 37℃预热的不完全DMEM培养基,使PEG稀释而失去作用,37℃静置10min,1000rpm离心10min;弃上清,用60mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞,再加入适量的腹腔巨噬细胞;分装于96孔细胞培养板,然后将培养板置37℃6%CO2培养箱内培养;5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基;10d后用预热的HT换出HAT;观察杂交瘤细胞的生长情况,待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时,吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。
三、杂交瘤细胞的克隆化及建株
采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。阳性细胞计数,取100个细胞放入5mL含饲养细胞的培养液中,即20个细胞/mL,100μL/孔滴加于96孔细胞培养板,即每孔1个细胞:再将余下的细胞悬液倍比稀释,细胞数为10个/mL,100μL/孔滴加于96孔细胞培养板,即每孔0.5个细胞。第8~9d时,肉眼可见细胞克隆,对出现单个细胞克隆的孔再按筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法进行筛选。连续进行三次以上亚克隆,判为阳性的细胞株扩大培养,建株冻存。
实施例5PCT多克隆抗体的制备
一、多克隆抗体的制备
1.免疫动物
将上述实施例1亲和层析得到的N端(N-proCT)抗原与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射,每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血,分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次,方法与第1次相同。
2.多克隆抗体的获得
1)效价测定:免疫过程中,免疫后每隔几天采血测效价1次,免疫次数不少于3次。
2)分离抗血清:血清效价达到最高时,用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固,血清分离出后,高速离心,取上清,-20℃保存。
3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
(1)取2ml抗血清样本,加等体积的生理盐水,再加入4ml饱和硫酸铵溶液,4℃沉淀过夜。
(2)10000g低温离心10分钟,弃上清,将沉淀用2ml PBS溶解,缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液,4℃静置1小时。
(3)10000g低温离心10分钟,弃上清,将沉淀用1ml PBS溶解,用PBS溶液4℃透析过夜。
4)用亲和层析的方法进一步纯化
Ⅰ用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱;
Ⅱ用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱;
Ⅲ将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样;
Ⅳ用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱;
Ⅴ用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱,得到抗N端(N-proCT)抗原的多克隆抗体。
实施例6PCT多克隆抗体的制备
采用上述实施例2亲和层析得到的降钙素(Calcitonin,CT)制备抗降钙素(Calcitonin,CT)抗原的多克隆抗体。
具体步骤与实施例5相同。
实施例7PCT多克隆抗体的制备
采用上述实施例3亲和层析得到的下钙素(Katacalcin,KAT)抗原制备抗降钙素原(Katacalcin,KAT)的多克隆抗体。
具体步骤与实施例5相同。
实施例8抗体的检测
1.Tricine-SDS-PAGE电泳检测
对实施例4制得的抗体进行Tricine-SDS-PAGE电泳,对得到的凝胶进行固定后染色。实验结果见图1(M泳道为蛋白Marker,另一泳道为多抗)。由图中可看出,在2.3KD、3.6KD和6.8KD分子量区有清晰明显的条带,说明抗体纯度很高。
2.效价测定
用间接ELISA法对抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,阴性对照为PBS溶液。检测结果见图2。从结果可看出,该抗体效价很高,大于1:1×106。
在本发明基础上做出的改进仍属本发明范畴。
实施例9人降钙素原检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1、包被液的配置:
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL pH7.0~pH 7.4。
2、封闭液的配制:
1)所述的封闭液,采用0.01M磷酸盐缓冲溶液,其pH7.0~pH7.4;
2)将3%的脱脂奶粉加入上述溶液中,配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法:
1)将配制的包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入60μL包被液;
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被8h;
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入60μL封闭液,置于37℃温箱,30分钟;
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温30分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将PCT抗原用含稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释而成,稀释浓度分别是10ng/ml,5ng/ml,2ng/ml,0.5ng/ml,0.25ng/ml。
三、辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制
辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗用偶联物稳定剂以1:2000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液:氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份。
五、底物溶液(TMB)
六、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释,配置成终止液
实施例10人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL,pH7.6~pH8.0,其余步骤同实施例9。
实施例11人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL,pH7.6~pH8.0,其余步骤同实施例9。
实施例12人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL,pH9.0~pH9.6,其余步骤同实施例9。
实施例13人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.1mol/L碳酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL,pH9.0~pH9.6,其余步骤同实施例9。
实施例14人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.2mol/L碳酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL,pH9.0~pH9.6,其余步骤同实施例9。
实施例15人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.05mol/L Tris缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至25ng/100μL,pH8.0~pH8.6,其余步骤同实施例9。
实施例16人降钙素原检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1、包被液的配置:
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至500ng/100μL,其pH7.2~pH7.4。
2、封闭液的配制:
1)所述的封闭液,采用0.1mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.2~pH7.4;
2)将4%的脱脂奶粉加入上述溶液中,配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法:
1)将配制的包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入100μL包被液;
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被12h;
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入100μL封闭液,置于37℃温箱,60分钟;
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温60分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将PCT抗原用含稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释而成,稀释浓度分别是10ng/ml,5ng/ml,2ng/ml,0.5ng/ml,0.25ng/ml。
三、辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制
辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗用偶联物稳定剂以1:20000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液:氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份。
五、底物溶液(TMB)
六、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释,配置成终止液。
实施例17人降钙素原检测试剂盒的制备
封闭液采用0.2mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.6~pH8.0,将5%的脱脂奶粉加入上述溶液中,配制成封闭液,其余步骤同实施例16。
实施例18人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的封闭液,采用0.2mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.6~pH8.0,将1%的BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中,配制成封闭液,其余步骤同实施例16。
实施例19人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的封闭液,采用0.2mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.6~pH8.0,将2%的BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中,配制成封闭液,其余步骤同实施例16。
实施例20人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的封闭液,采用0.2mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.6~pH8.0,将4%的BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中,配制成封闭液,其余步骤同实施例16。
实施例21人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至2μg/100μL,其pH7.2~pH7.4。
2、封闭液的配制:
1)所述的封闭液,采用0.1mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.2~pH7.4;
2)将4%BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中,配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法:
1)将配制的包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入200μL包被液;
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被16h;
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入100μL封闭液,置于37℃温箱,60分钟;
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温90分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将PCT抗原用含稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释而成,稀释浓度分别是10ng/ml,5ng/ml,2ng/ml,0.5ng/ml,0.25ng/ml。
三、辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制
辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗用偶联物稳定剂以1:20000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液:氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份。
五、底物溶液(TMB)
六、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释,配置成终止液。
实施例22人降钙素原检测试剂盒的制备
所述的PCT单克隆多抗包被液,采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液将PCT单克隆多抗稀释至2μg/100μL,其pH7.2~pH7.4。
2、封闭液的配制:
1)所述的封闭液,采用0.2mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液,其pH7.2~pH7.4;
2)将3%BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中,配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法:
1)将配制的包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入200μL包被液;
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被16h;
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入100μL封闭液,置于37℃温箱,60分钟;
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温90分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将PCT抗原用含稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释而成,稀释浓度分别是10ng/ml,5ng/ml,2ng/ml,0.5ng/ml,0.25ng/ml。
三、辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制
辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗用偶联物稳定剂以1:10000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液:氯化钠96.0份,氯化钾2.40份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-20 0.05份,超纯水1000份。
五、底物溶液(TMB)
六、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释,配置成终止液。
实施例22PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~10ng/ml)
待测样本组:待测样本
4)将标准品与待测样本分别取40μL加入到酶标板中,同时加入40μL的辣根过氧化物酶标记的PCT抗体。孵育30min。
5)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤2次;
6)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育20min,避光;
7)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
8)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例23PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~10ng/ml)
待测样本组:待测样本
4)将标准品与待测样本分别取50μL加入到酶标板中,同时加入50μL的辣根过氧化物酶标记的PCT抗体。孵育10min。
5)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤3次;
6)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育10min,避光;
7)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
8)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例24PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~10ng/ml)
待测样本组:待测样本
4)将标准品与待测样本分别取80μL加入到酶标板中,同时加入80μL的辣根过氧化物酶标记的PCT抗体。孵育20min。
5)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤4次;
6)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育15min,避光;
7)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
8)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例25PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~10ng/ml)
待测样本组:待测样本
4)将标准品与待测样本分别取100μL加入到酶标板中,同时加入100μL的辣根过氧化物酶标记的PCT抗体。孵育15min。
5)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤5次;
6)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育10min,避光;
7)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
8)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例26PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~5ng/ml)
待测样本组:处理后的待测样本
4将标准品与待测样本分别取100μL加入到酶标板中,孵育30min。
4)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤3次;
5)加入酶标抗体:洗涤结束后,每孔加入辣根过氧化物酶标记的PCT单克隆多抗100μL,在37℃下孵育30min;
6)洗涤:同步骤4);
7)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育15min,避光;
8)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
9)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例27PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~5ng/ml)
待测样本组:处理后的待测样本
4将标准品与待测样本分别取50μL加入到酶标板中,孵育60min。
4)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤2次;
5)加入酶标抗体:洗涤结束后,每孔加入辣根过氧化物酶标记的PCT单克隆多抗50μL,在37℃下孵育30min;
6)洗涤:同步骤4);
7)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育20min,避光;
8)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
9)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例28PCT免疫检测试剂盒检测步骤
一、检测步骤
1)取出已预包被PCT单克隆多抗的96孔酶标板;
2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水);
3)分别设标准曲线组、待测样品组,其中
标准曲线组:各标准曲线点(0.25ng/ml~5ng/ml)
待测样本组:处理后的待测样本
4将标准品与待测样本分别取150μL加入到酶标板中,孵育20min。
4)洗涤:甩掉反应液,每孔每次加入不少于300μL的洗液,静置40s后拍干,重复上述洗涤操作,共洗涤4次;
5)加入酶标抗体:洗涤结束后,每孔加入辣根过氧化物酶标记的PCT单克隆多抗150μL,在37℃下孵育20min;
6)洗涤:同步骤4);
7)显色:洗涤结束后,每孔加入底物溶液100μL,在37℃孵育10min,避光;
8)终止:每孔内加入50μL终止液,混匀后,在OD450nm处读数;
9)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值,根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程,即可自动计算出各待测样品中PCT的浓度值。
实施例29试剂盒的临床应用
(应用了实施例10的试剂盒和实施例23的检测步骤)
上述检测得到的标准品浓度与吸光度对应关系如下表1所示:
表1检测标准曲线
将表1所得数据绘制成图,即为附图1的标准曲线,通过附图可以看出,本发明的试剂盒用于PCT浓度检测具有极好的线性,可以非常准确的用于待测样品PCT浓度检测。
实施例30人降钙素原免疫检测试剂盒参考值的确定
临床确诊为PCT阳性样本60例,同时检测正常人样本200例,测定OD450值,根据标准曲线计算抗原浓度值,最终确定参考值判断标准,如下表2所示:
表2:参考值判断标准
如果样本的检测结果落在可疑区间,则需要进行第二次检测。
表3PCT免疫检测试剂盒参考值的确定ELISA临床检测结果
注:*表示与正常人比较P<0.01;
根据标准曲线的结果计算检测抗原的浓度,通过检测200例正常人样本,取95%置信区间的抗原的浓度值为Cut-off上限:通过检测60例阳性病人,取95%置信区间的抗原的浓度值为Cut-off下限: 抗原的浓度值0.25ng/ml~0.50ng/ml之间为疑似病人。
实施例30本发明试剂盒与传统二步法试剂盒的临床对比试验
本次临床试验实际检测样本总量为219例,经法国梅里埃VIDAS PCT试剂盒检测其中阳性样本73例,阴性样本146例。
用本发明试剂盒对73例PCT抗原阳性样本和146例PCT抗原阴性样本进行检测。73例PCT抗原阳性样本中,本发明产品结果有68例为阳性,5例为疑似。146例PCT抗原阴性样本中,本发明产品结果143例为阴性,3例为疑似。
敏感性和特异性分析,统计结果如下表4所示:
表4:本发明试剂盒与已有VIDAS试剂盒检测结果对比
(1)敏感性:
(2)特异性:
本发明产品检测的样本数量为219例,敏感性93.2%,特异性97.9%。
2.将上述数据进行ROC分析,得到附图2的ROC曲线。其对应的数学含义为:
表5:ROC曲线下面积
ROC曲线下面积达0.991,说明本发明产品的检测性能优越,有较高准确性。
同时,从上述结果我们还可以看到,本发明的试剂盒由于具有更好的检测灵敏度、准确度,能够更好地区分患者PCT抗原的阴性、阳性和疑似,以提供准确的诊疗依据,而已有的试剂盒由于检测灵敏度不足,会导致部分误诊。
实施例31试剂盒的方法学考察
(应用了实施例10的试剂盒和实施例30的检测步骤)
1、敏感性实验
收集临床确诊样本20例进行检验。
诊断敏感性=阳性样本检出例数/阳性样本总例数×100%,由实验结果见表7,说明本实验的敏感性在95%以上。
表6敏感性检测实验结果
2、特异性实验
检测20例健康人样本。
特异性=阴性样本检出例数/阴性样本总例数×100%,由实验结果见表8,说明本实验的特异性在95%以上。
表7特异性检测实验结果
序号 |
OD450 |
计算抗原浓度(μg/L) |
结果判断 |
1 |
0.053 |
0.09 |
阴性 |
2 |
0.045 |
0.05 |
阴性 |
3 |
0.045 |
0.05 |
阴性 |
4 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
5 |
0.045 |
0.05 |
阴性 |
6 |
0.047 |
0.06 |
阴性 |
7 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
8 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
9 |
0.047 |
0.06 |
阴性 |
10 |
0.049 |
0.07 |
阴性 |
11 |
0.049 |
0.07 |
阴性 |
12 |
0.047 |
0.06 |
阴性 |
13 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
14 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
15 |
0.047 |
0.06 |
阴性 |
16 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
17 |
0.051 |
0.08 |
阴性 |
18 |
0.049 |
0.07 |
阴性 |
19 |
0.047 |
0.06 |
阴性 |
20 |
0.053 |
0.09 |
阴性 |
3、回收率实验
选择正常人血液添加人降钙素原抗原2μg/L、1μg/L后检测,计算真实值与期望值的比值,得到回收率,见表9。回收率介于80-120%之间认为合格。由实验结果说明本实验的回收率介于80%-120%之间,回收率良好。
表8回收率结果实验
4、重复性实验
1)批间精密度
合格标准:将同一标本每天一次测试,连续11个工作日,计算其均值M、标准差SD与变异系数CV,变异系数CV≤25%为合格,见表9。结论:本产品批间精密度(即变异系数CV)为2%,小于25%,符合标准,证明本产品批间精密度良好。
表9批间精密度结果实验
2)批内精密度
合格标准:将同一标本在同一批次实验中平行测定10组数据。计算其均值M、标准差SD与变异系数CV,变异系数CV≤15%为合格,见表10。本产品批内精密度(即变异系数CV)为3%,小于15%,符合标准,验证合格。
表10:批内精密度结果实验
序号 |
OD450 |
计算抗原浓度(μg/L) |
1 |
0.376 |
1.70 |
2 |
0.394 |
1.79 |
3 |
0.360 |
1.62 |
4 |
0.386 |
1.75 |
5 |
0.398 |
1.81 |
6 |
0.384 |
1.74 |
7 |
0.392 |
1.78 |
8 |
0.376 |
1.70 |
9 |
0.384 |
1.74 |
10 |
0.380 |
1.72 |
|
M |
1.74 |
|
SD |
0.05 |
|
CV |
3% |
5、稳定性实验
将组装好的试剂盒在37℃环境中放置,每天做标准曲线检测已知浓度的抗原溶液,连续检测5天,检测值变化率(即变异系数CV)小于20%,见表11,证明试剂盒稳定。其结果显示5天的变异系数CV≤20%,说明本发明稳定性良好。
表11稳定性试验结果
上述参照具体实施方式对本发明人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。