CN101580545A - 抗h5n1来源的血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性抗禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体，所述抗体来源于保藏号为CCTCC NO：C200807、CCTCC NO：C200808或CCTCC NO：C200809的杂交瘤细胞株。所述单克隆抗体特异性和灵敏度高，抗原检出范围宽。本发明还公开了检测禽流感病毒的试剂盒。

Description

抗H5N1来源的血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，更具体的，本发明涉及一类抗禽流感病毒HA蛋白的抗体。

背景技术

禽流感(avain influenza，简称AI)是由A型禽流感病毒引起的一种家禽和野禽传染性疾病综合症。其病原禽流感病毒(avain influenza virus，AIV)属正粘病毒科，流感病毒属，基因组为单股、负链，由8个分节段的独立RNA片段组成。

血凝素基因(HA)是禽流感病毒基因组中变异最大的基因，到目前为止，已经发现16种不同的血凝素亚型。禽流感病毒毒株强弱主要体现在血凝素基因的变异，高致病力毒株通常是由非致病力毒株的血凝素基因变异而来。

血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，是流感病毒所有蛋白中最重要的一个，由片段4编码，分子量为75kDa。血凝素主要功能是结合宿主唾液酸之类的细胞受体，帮助穿透宿主的胞膜以及改变抗原性，从而逃脱宿主免疫系统的监视。血凝素以三聚体形式与膜结合成同聚物，形成头杆状大钉子般的结构，其变异性很强，尤其存在选择压力时，变异更快。HA变异幅度大小直接影响着AIV流行的程度。

HA糖蛋白一级结构具有4个结构域：信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。N端的信号大约由16个氨基酸残基组成，其作用是识别内质网膜。紧接信号肽之后的是328个氨基酸残基(分子是36kDa)的HA1部分，羧基端的221个氨基酸残基(分子量27kDa)构成HA2。HA蛋白从产生到发挥作用，需要经过两个切割加工过程：通过信号肽酶将信号肽切除，以及通过蛋白水解酶将HA切割为HA1和HA2，两条肽链被一个二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其它非共价键的相互作用，使HA形成一定的立体结构。

在正常禽类和人体内不存在凝血酶蛋白，而感染禽流感病毒的禽类和人类体内存在特异性的凝血酶蛋白，在感染者的咽、鼻拭子或含漱液、血清、粪便以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物、其它脏器中都能检测到凝血酶蛋白HA。对该蛋白的检测有助于早期诊断禽流感感染。

HA的临床诊断主要方法有：基于(1)免疫学原理的血清学诊断，(2)基因诊断。核酸扩增实验需时短，但是也需要专业的人员操作和专门的实验仪器。而现在常用的血清学诊断依赖于高特异性的抗原抗体。

现有技术中涉及到HA单抗的方法和检测形式虽然各有不同，但是这些方法所使用的HA的单克隆抗体非常有限，它们存在的缺陷例如特异性差。因此，通过筛选获得具有针对不同表位的鼠源单克隆抗体，以制备和开发特异、灵敏、低成本的诊断产品以及相关方法是必须的。

发明内容

本发明的目的在于提供一类特异性抗禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供特异性抗禽流感病毒的检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种特异性抗禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：

保藏号为CCTCC NO：C200807的杂交瘤细胞株(S-98-10)；

保藏号为CCTCC NO：C200808的杂交瘤细胞株(S-145-9)；或

保藏号为CCTCC NO：C200809的杂交瘤细胞株(S-157-6)。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体对于禽流感病毒血凝素蛋白的检测范围(线性范围)是：10ng/ml-10μg/ml。

在另一优选例中，所述单克隆抗体的亚型IgG1，κ。

在另一优选例中，所述单克隆抗体是结合禽流感病毒血凝素蛋白的线性表位的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述单克隆抗体用于制备检测禽流感病毒的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的禽流感病毒选自：H5N1型禽流感病毒，H5N2型禽流感病毒。

在本发明的第二方面，提供一种杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株选自：

保藏号为CCTCC NO：C200807的杂交瘤细胞株；

保藏号为CCTCC NO：C200808的杂交瘤细胞株；或

保藏号为CCTCC NO：C200809的杂交瘤细胞株。

在本发明的第三方面，提供一种检测禽流感病毒的试剂盒，所述的试剂盒含有所述的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有：

固相载体，所述的固相载体上包被有第一抗体，该第一抗体是所述的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

第二抗体，该第二抗体是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

酶联免疫检测试剂，包括但不限于：标记物(如酶)，标记物对应的底物，显色剂，洗涤液或终止液。

在本发明的第四方面，提供体外(非诊断或治疗性地)检测禽流感病毒的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体选自所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-血凝素蛋白-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体；且所述的第二抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否；

或者，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体选自所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了HA抗原包被浓度摸索曲线，其中，

A为对应于S-98-10单克隆抗体的HA抗原包被浓度线性范围；

B为对应于S-145-9单克隆抗体的HA抗原包被浓度线性范围；

C为对应于S-157-6单克隆抗体的HA抗原包被浓度线性范围；

其中，无关蛋白是人源谷氨酸脱羧酶GAD蛋白。

图2显示了间接ELISA实验检测三株单抗对灭活病毒(H5N2来源)的识别，无关蛋白是人源谷氨酸脱羧酶GAD。

图3显示了抗体配对ELISA实验确定三株单抗是否由一个抗原决定簇决定。其中，

A：S-98-10单克隆抗体作为包被抗体，多抗以及S-98-10、S-145-9、S-157-6单克隆抗体作为第二抗体；

B：S-145-9单克隆抗体作为包被抗体，多抗以及S-98-10、S-145-9、S-157-6单克隆抗体作为第二抗体；

C：S-157-6单克隆抗体作为包被抗体，多抗以及S-98-10、S-145-9、S-157-6单克隆抗体作为第二抗体；

其中，抗原为HA抗原和无关抗原，该无关抗原是重组人源谷氨酸脱羧酶GAD。

图4显示了双抗体夹心ELISA法检测各包被的抗体对于抗原量的线性检测范围。其中，

A：S-98-10单克隆抗体作为包被抗体，HA抗原作为抗原，以HRP标记的多抗作为第二抗体；

B：S-145-9单克隆抗体作为包被抗体，HA抗原作为抗原，以HRP标记的多抗作为第二抗体；

C：S-157-6单克隆抗体作为包被抗体，HA抗原作为抗原，以HRP标记的多抗作为第二抗体。

图5显示了双抗体夹心ELISA法检测各抗体H5N2灭活病毒的识别作用。以S-98-10单克隆抗体(#98)；S-145-9单克隆抗体(#145)；S-157-6单克隆抗体(#157)作为包被抗体，以HRP标记的多抗作为第二抗体。其中，无关蛋白是人源谷氨酸脱羧酶GAD。

图6显示了间接ELISA检测各单抗(S-98-10，S-145-9，S-157-6，S-315-12，S-337-7，S-445-11)对天然蛋白的识别。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次找到一类特异性抗禽流感血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体，其是结合禽流感病毒血凝素蛋白的线性表位的单克隆抗体。所述的单克隆抗体对于抗禽流感病毒血凝素蛋白的检测范围宽。并且，其可良好地识别复杂体系中的HA抗原，不与其它蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。

在本领域人员的实践中经常发现，禽流感血凝素蛋白HA氨基酸序列长，抗原决定簇很多被包在蛋白结构的内部，因此难以找到一种特异性高的单克隆抗体。HA的很多抗体识别表位为空间表位，很多表位是在序列中间，没有在蛋白序列N端或者C端。本发明的抗原在制备过程中因为是变性纯化的，所以识别该变性蛋白的抗体是识别HA空间结构上的线性表位区而非空间表位区。目前，尽管本领域已经开发出一些抗HA单克隆抗体，然而当将这些抗体用于实际检测时，仍然遭遇到与天然HA蛋白结合特性差的问题，这是由于待测样品中HA蛋白的抗原决定簇被包在蛋白结构内部，无法接触到抗体造成的。当用这种单克隆抗体检测样品时，需要将样品进行处理(如加热变性)，使被包埋的抗原决定簇暴露出来，这一方面造成临床检测程序的复杂化，使得检测时间过长；另一方面，由于加热变性会导致待测样品中其它各种蛋白的变性，从而大大提高非特异性结合的发生率，造成干扰，降低检测的准确性。

针对上述技术难题，本发明人制备了许多种针对HA蛋白的单克隆抗体，经过大量的、反复的研究试验，最终找到了本发明的抗HA单克隆抗体(分别由杂交瘤细胞株S-98-10；S-145-9；S-157-6产生)，所述单克隆抗体对于HA蛋白具有很高的特异性，不结合于HA以外的其它蛋白。并且，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地获得精确的检测结果。

为了获得较好的效果，本发明人选择HA蛋白的片段来免疫免疫动物，获取动物的脾细胞用于制备杂交瘤细胞株。优选的HA蛋白的片段是去除了信号肽的HA1蛋白；更佳地由HA1基因第75-1049位序列编码而成。

并且，以所述的单克隆抗体为基础，可制备方便、快速且准确地检测禽流感病毒的试剂盒。

禽流感病毒血凝素蛋白的原核表达

本发明提供了一种表达禽流感病毒血凝素蛋白HA的方法，所述方法包括：

(a)PCR扩增获得血凝素蛋白(HA蛋白)的编码序列；

(b)将(a)所述的血凝素蛋白的编码序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了血凝素蛋白编码序列的表达载体；

(c)使(b)获得的插入了血凝素蛋白编码序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；

(d)培养转化的宿主细胞，从而表达出血凝素蛋白；

(e)分离获得禽流感病毒血凝素蛋白HA。

作为本发明的一种优选方式，PCR扩增HA1蛋白或其蛋白片段的编码基因。更优选的，扩增HA1编码基因的第75-1049位。

作为本发明的一种优选方式，所述的表达载体为pET28a载体(购自Novagen公司)，其中自带有His标签。

将表达载体引入到基因工程化的宿主细胞中，即可表达所述的蛋白。在本发明的优选方式中，采用的宿主细胞为大肠杆菌ROSSETA。

单克隆抗体

本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合的单抗。本发明人做了大量的工作，找到了本发明的抗HA单克隆抗体(分别由杂交瘤细胞株S-98-10；S-145-9；S-157-6产生)，其具有高特异性结合HA蛋白的能力，可见其结合的是HA蛋白(或含该蛋白的复合物)空间结构上被暴露于表面的抗原决定簇(表位)。且与HA蛋白以外的其它蛋白没有交叉反应。

本发明的抗体是对禽流感病毒HA具有特异性的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1，κ型。这里，“特异性”是指所述抗体能结合于HA蛋白或其片段；更特别地，指那些能与HA蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的单克隆抗体的一种杂交瘤的制备方法是：(1)利用抗血凝素蛋白HA免疫小鼠；(2)分离经免疫的小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞株融合；(3)加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株；(4)有限稀释法克隆化筛选，从而获得单克隆抗体细胞株，从所述细胞株中筛选可生产所需单克隆抗体的细胞株。

本发明的单克隆抗体还可以利用HA基因产物或片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。

作为本发明的一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的抗HA单克隆抗体。

此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。

在获得了本发明的抗HA单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中HA蛋白及其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。

检测试剂盒

本发明提供了一种用于检测样品中是否存在禽流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有一种或多种本发明的抗HA单克隆抗体(分别由杂交瘤细胞株S-98-10；S-145-9；S-157-6产生)。

在获得了本发明提供的抗HA单克隆抗体后，可以方便地制备出用于特异性检测禽流感病毒的检测试剂盒。所述试剂盒中除了含有本发明的抗HA单克隆抗体以外，还可以包含其它检测试剂或辅剂，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要其中利用了本发明的抗HA单克隆抗体作为与HA特异性结合的试剂。

作为本发明的一种优选方式，本发明人根据双抗夹心法的原理，制备了一种用于检测HA蛋白水平的试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

本发明人发现，采用本发明的抗HA单克隆抗体与另一种抗体(优选的为一种抗HA多克隆抗体)来将目标抗原HA吸附及定位，其定位和放大效果更好，从而进一步提高特异性和精密度。相对于单抗体的竞争法来说，双抗体夹心法的测定效果更为优良，因而测定时只需很少的样品量。所以采用双抗体夹心法无论在灵敏度、精确度、准确度、特异性及稳定性上更具有优势。

作为另一种可选择的检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的单克隆抗体检测HA。

如本文所用，所述的“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一单克隆抗体”、“第一抗体”与“一抗”可互换使用，都是指本发明的抗HA单克隆抗体。

所述的第一抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与第一单克隆抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(如96孔板)、或微球等。

如本文所用，所述的“第二抗体”与“二抗”可互换使用，都是指特异性地抗HA的抗体。对于抗原HA而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的HA的不同表位(抗原决定簇)。

所述的第二抗体可以是不同于本发明的抗HA单克隆抗体的另一种可特异性结合HA蛋白的单克隆抗体(即其与本发明的抗HA单克隆抗体所结合的HA表位是不相同的)；或者，所述的第二抗体可以是一种多克隆抗体。在本发明的优选实例中，采用了抗HA多克隆抗体作为第二抗体。

所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的HA蛋白导入动物中来获得，例如将HA蛋白或灭活的病毒与弗氏佐剂按照适当比例(如1∶1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。免疫方法例如可使用动物皮下注射。例如将HA蛋白与Freund’s佐剂按照适当比例(如1∶1)混合后免疫动物；兔免疫1.5-4个月(更优选的，为2个月左右)，优选间隔2-4周重复免疫；然后可从兔静脉血中收获抗血清并纯化，获得抗HA多克隆抗体。H5N1疫苗免疫多抗的制备例如：将H5N1疫苗免疫兔，免疫的间隔时间为3周；第三次免疫后1周，兔放血，收集抗血清，获得H5N1疫苗免疫多抗。

如本文所用，所述的“标记物”是指用于确定待检测样品中HA的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中HA蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗检测抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与HA发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个HA蛋白的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

利用所述的标准品，标准曲线如下设置：以标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成用于定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中HA蛋白的浓度。

为了消除假阳性和假阴性，也可在检测过程中设置质控(对照)。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液、增敏稀释液。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

检测禽流感病毒的方法

在获得了本发明提供的抗HA单克隆抗体和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中HA蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染禽流感，这些方法均被包含在本发明中。

作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测禽流感病毒的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒HA与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“HA-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是本发明所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-HA-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗HA的多克隆抗体且携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中禽流感病毒HA的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

作为另一种可选择的检测方式，采用间接ELISA法，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒HA与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“HA-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体是本发明所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒HA的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的HA含量。

作为本发明的一种优选方式，定量检测HA蛋白的方法具体如下：

(i)抗原抗体反应：将本发明的抗HA单克隆抗体包被在多孔板上，之后在多孔板的不同微孔内分别加入不同浓度的标准品、质控品(可选)，或待测血清样品；

(ii)酶联反应：将第二抗体(其上设置有标记物或可与携带标记物的抗体结合)溶液加入各孔，振荡、孵育、洗涤；

(iii)显色反应：每孔加入对应于标记物的底物、显色剂，孵育，每孔加入反应终止液，结束反应；

(iv)酶标仪测定OD值；

(v)结果计算：

A)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线；

B)评判质控品浓度(可选)：根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；

C)计算待测样品浓度：当标准曲线和质控品(可选)被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的HA蛋白浓度。

作为本发明的另一种方式，定量检测HA蛋白的方法具体如下：

(1)分别以不同浓度HA标准品和待测样品包被固相载体；

(2)在经包被的固相载体上加入本发明的单克隆抗体，该单克隆抗体上连接有标记物或可与标记物相连接(还包括加入标记物使之连接于该单克隆抗体)；

(3)加入对应于标记物的底物、显色；

(4)结果计算(同前述)。

本发明的主要优点在于：

(1)提供一类新的针对禽流感病毒HA的特异性单克隆抗体，是结合HA的线性表位的单克隆抗体。

(2)所述的单克隆抗体的检测范围达10ng/ml-10μg/ml，具有敏感、特异、制备成本低的特点，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地检测出样品中HA的含量，且与样品中的其它蛋白无交叉反应。所述单克隆抗体在细胞生物学、生物大分子检测和医学临床诊断等领域具有重要应用前景。

(3)提供一种基于所述单克隆抗体的试剂盒，所述的试剂盒灵敏度和准确性非常高。且所述的试剂盒在操作时不需要加热等处理步骤，可以准确快速地测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1抗原的制备

扩增表达的基因HA来自Influenza A virus(A/Goose/Guangdong/3/97(H5N1))这株病毒，该病毒购自上海英沐生物科技有限公司。

制备含有HA-1基因第75-1049位序列(975bp，编码含有325个氨基酸的蛋白)的抗原。

正向引物：CGCGGATCCATTTGCATTGGTTACC；反向引物：CCGCTCGAGTAATTCTTCTTCTCTCTCT。

以前述病毒株基因序列为模版，PCR扩增如下：94℃5min；(94℃45s，60℃45s，72℃1min，进行33个循环)；72℃7min。

将PCR产物进行回收，双酶切，连接进入表达载体PET28a(Novagen公司)多克隆位点(该表达载体多克隆位点上游含有编码6个His组氨酸tag的基因，因此重组载体翻译得到的融合蛋白N段为His-tag，该tag能特异性地与Ni-NTA亲和填料(Qiagen公司)结合，从而对该融合蛋白进行亲和纯化)，转化大肠杆菌ROSSETA(Novagen公司购买)，PCR验证，测序验证均为阳性。

蛋白诱导表达如下：

1.挑阳性单克隆菌落于7ml含有卡那抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜(8-16h)。

2.37℃，1mM IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD₆₀₀＝0.4-0.6时加入终浓度为1mM的IPTG。

3.诱导3-4h后收集菌液，4℃，7000rpm离心15min，去上清得到菌体。

蛋白纯化如下：

1.菌体超声破碎，4℃，12000rpm离心15min，去上清得到蛋白包涵体；

2.8M尿素的磷酸盐缓冲液溶解包涵体，4℃混匀过夜；

3.4℃，12000rpm离心15min，留上清；

4.取50％Ni-NTA亲和填料装柱，Beads与菌液体积比为：1ml∶1000ml；

5.将上清匀速流过Beads，使上清中蛋白与Ni-NTA Beads结合；

6.PBS将无关蛋白洗脱；

7.用含500mM咪唑的8M尿素的磷酸盐缓冲液将目的蛋白洗脱，获得纯化的蛋白(称为His-HA或His-HA1)。

实施例2动物免疫

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。采用实施例1制备的His-HA1为抗原，抗原原液浓度：1.84mg/mL，Balb/c小鼠免疫剂量：100μg血凝素蛋白HA(H5N1来源)每只每次。注射方式为肌肉多点注射。使用时用PBS或生理盐水稀释。免疫程序：0，3，6周三次免疫。融合前3天取100μg血凝素蛋白HA加PBS稀释至0.5mL腹腔注射，进行回忆刺激。末次免疫3天后，分离脾细胞融合。第三次用HA免疫之后#1小鼠血清中的抗体滴度见表1。

表1

小鼠	抗体滴度
		#1	＞64,000
正常小鼠(阴性对照)	＜1,000

实施例3杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备

1.骨髓瘤细胞株的培养

选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，本发明人采用的是SP2/0细胞株(购自上海第二医科大学的)。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×10⁵/mL，倍增时间通常为10～15h。融合细胞选择在处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性大于95％)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×10⁵/mL，次日一般即为对数生长期细胞。

2.饲养细胞的制备

在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞(feeder cell)。本发明人所有的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用常规的冷冻培养液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中有巨噬细胞和其他细胞。

饲养细胞调至1×10⁵/mL，提前一天置板孔中培养。

3.细胞融合

回忆刺激后3天进行融合。

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后把培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1∶2到1∶10不等，本发明人用1∶4的比例，保证了两种细胞在融合前都具有较高活性。

4.有限稀释法

筛选阳性株选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能持续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔)，按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体分泌量，所用筛选用免疫所用抗原。首先把抗体的分泌含量按照OD450＞1划分为阳性和阴性孔，对阳性孔进行克隆化；连续三次克隆化均为100％阳性的克隆，再选做扩大培养或冻存。

经过有限稀释法克隆化，从众多的抗体株中筛选得到三株抗体，分别命名为：S-98-10，S-145-9，S-157-6(见表2)。经亚型鉴定，S-98-10，S-145-9，S-157-6均为IgG1、k型(亚型检测采用BIO-RAD公司小鼠亚型检测试剂盒CatalogNo.172-2055)，见表3。

表2抗HA杂交瘤细胞的克隆

^*杂交瘤细胞增殖之前的ELISA结果。

表3抗HA的单克隆抗体特性

^*细胞培养上清为1×10⁶杂交瘤细胞在9mL培养基中培养三天获得的细胞培养上清。

5.间接ELISA检测各单抗对天然蛋白的识别

包被的HA抗原，无关蛋白和灭活病毒总蛋白浓度均为0.005mg/ml，50ul/孔；一抗为含单克隆抗体的腹水，稀释1∶3000倍，二抗用羊抗鼠-HRP检测。实验结果显示：6株单抗株(S-98-10，S-145-9，S-157-6，S-315-12，S-337-7，S-445-11；后三株抗体株获自上海英沐生物科技有限公司)腹水对于特异性抗原HA均有良好的识别作用，但其中只有S-98-10，S-145-9，S-157-6三株单抗对天然灭活病毒(H5N2来源)有较好的识别作用。结果见图6。三株单抗从原核表达的His-HA1抗原制备而来，且既可良好识别天然灭活病毒，又可良好识别HA抗原，因此其是结合禽流感病毒血凝素蛋白的线性表位的单克隆抗体。

6.单克隆抗体的大量制备

取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5mL液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。ELISA检测抗HA单抗的腹水效价结果见表4。

表4

^*抗体滴度由腹水稀释度的倒数表示，腹水第一次稀释度数为1∶1,000。

实施例4单克隆抗体的应用

1.抗原包被量梯度曲线

包被的HA抗原量从10μg到1ng/mL变化，一抗为3个克隆株的纯化抗体，稀释1∶3000倍，二抗用羊抗鼠-HRP检测。通过曲线斜率可看出抗原包被在10ng/mL时，检测OD值接近本底值了。在10μg到10ng/mL区间，检测OD值与包被抗原浓度呈线性关系，说明这一区间为HA抗原较好的检测范围。其中无关蛋白为重组人源谷氨酸脱羧酶GAD(GenBank登录号：NM_000818)。

HA包被浓度摸索曲线如图1所示。

2.间接ELISA实验三株单抗对灭活病毒(H5N2来源)的识别

包被抗原分别为HA抗原，无关蛋白(为重组人源谷氨酸脱羧酶GAD)，和H5N2型禽流感灭活病毒(购自上海英沐生物科技有限公司)，总蛋白浓度均为10μg/ml，一抗为3个克隆株的纯化抗体，稀释1∶3000倍，然后用羊抗鼠-HRP检测。实验结果显示三株单抗对天然灭活病毒(H5N2来源)有较好的识别作用，识别特异性高于H5N1疫苗免疫多抗。

间接ELISA实验识别灭活病毒(H5N2来源)如图2所示。

3.抗体配对ELISA实验决定三株单抗是否由一个抗原决定簇决定

HA免疫多抗-HRP的制备：免疫动物为新西兰白兔，雄性，体重为2-2.5kg。免疫流程：用前述制备的His-HA1与Freund’s佐剂1∶1混合，乳化后，皮下和皮内多点注射进行免疫。HA1-His的剂量为0.9mg/次/兔。首次免疫用完全Freund’s佐剂，再次免疫用不完全Freund’s佐剂。免疫的间隔时间为3周。第三次免疫后1周，兔放血，收集抗血清，获得H5N1疫苗免疫多抗。常规戊二醛二步法进行HRP标记抗体，获得H5N1疫苗免疫多抗-HRP。

3株单抗和多抗进行纯化标记以后，两两夹心ELISA实验，各抗体包被浓度为10μg/ml，抗原为前述制备的His-HA1(50ul/孔，终浓度为1μg/mL)，然后分别用不同于包被抗体的另一抗体-HRP进行检测；同时也用与包被抗体相同的抗体-HRP进行检测，作为阴性对照值。通过实验结果可以得知，S-98-10，S-145-9，S-157-6相互之间不能夹心，说明三株抗体由相同或相近的抗原决定簇决定。而采用三株单抗或多抗包被，多抗检测则可行。

抗体配对实验如图3所示。

实施例5双抗体夹心ELISA实验检测抗原量的范围

抗体包被浓度为10μg/ml，抗原为前述制备的His-HA1(50ul/孔，终浓度从1μg到1ng/mL)，然后用HA免疫多抗-HRP检测。结果均显示了抗体在1μg到1ng/mL HA范围内，OD450读数与被检测的HA浓度具有良好的线性关系。

夹心法检测HA浓度梯度实验如图4所示。

实施例6双抗体夹心ELISA实验检测灭活病毒(H5N2来源)

H5N1疫苗免疫多抗-HRP的制备：H5N1疫苗(哈尔滨微科生物技术开发公司H5N1亚型，RE-1株)免疫新西兰白兔，雄性，体重为2-2.5kg。免疫流程如下：皮下和皮内多点注射进行免疫。H5N1疫苗注射剂量为1.5ml/次/兔。免疫的间隔时间为3周。第三次免疫后1周，兔放血，收集抗血清，获得H5N1疫苗免疫多抗。采用常规戊二醛二步法进行HRP标记抗体，从而获得H5N1疫苗免疫多抗-HRP。

H5N1疫苗免疫多抗、各单抗包被浓度为10μg/ml，一抗为H5N2灭活病毒(灭活病毒总蛋白浓度为0.5mg/ml，1∶50稀释，50ul/孔)，然后用H5N1疫苗免疫多抗-HRP检测。结果显示了抗体通过夹心法对H5N2灭活病毒有良好的识别作用。并且，本发明的单抗的识别效果显著优于多抗。

双抗体夹心ELISA实验检测灭活病毒实验如图5所示。

实施例7试剂盒

将S-98-10抗体以10μg/ml的浓度(溶于PBS中)包被酶标板，4℃过夜。用ELISA洗涤液(配方为：Tris 1M 2 Tween20 0.5ml，调pH值为7.0左右，加水定容至1L)洗板；每孔加入200μl的0ml，1M HCl 16.8ml，1％BSA，于37℃封闭2h。用ELISA洗涤液洗板。

将上述处理的酶标板晾干，装于合适的包装中，同时还在其中装入前述制备的HA免疫多抗-HRP，以及四甲基联苯胺和TMB-H₂O₂显色剂，从而获得所述的试剂盒。

生物材料保藏

本发明制备的杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，分别为：

杂交瘤细胞株S-98-10：保藏号CCTCC NO：C200807；保藏日2008年3月27日；

杂交瘤细胞株S-145-9：保藏号CCTCC NO：C200808；保藏日2008年3月27日；

杂交瘤细胞株S-157-6：保藏号CCTCC NO：C200809；保藏日2008年3月27日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种特异性抗禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：

保藏号为CCTCC NO：C200807的杂交瘤细胞株；

保藏号为CCTCC NO：C200808的杂交瘤细胞株；或

保藏号为CCTCC NO：C200809的杂交瘤细胞株。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体对于禽流感病毒血凝素蛋白的检测范围是：10ng/ml-10μg/ml。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是结合禽流感病毒血凝素蛋白的线性表位的单克隆抗体。

4.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备检测禽流感病毒的试剂或试剂盒。

5.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株选自：

保藏号为CCTCC NO：C200807的杂交瘤细胞株；

保藏号为CCTCC NO：C200808的杂交瘤细胞株；或

保藏号为CCTCC NO：C200809的杂交瘤细胞株。

6.一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的一个或多个单克隆抗体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：

固相载体，所述的固相载体上包被有第一抗体，该第一抗体是权利要求1所述的单克隆抗体。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：

第二抗体，该第二抗体是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：

酶联免疫检测试剂。

10.体外检测禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体选自权利要求1所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-血凝素蛋白-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体；且所述的第二抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否；

或者，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体选自权利要求1所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

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