CN104181305B

CN104181305B - 抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其用途

Info

Publication number: CN104181305B
Application number: CN201310202421.8A
Authority: CN
Inventors: 孙兵; 伊春艳; 凌志洋; 边超
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation of molecular cell science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN104181305A

Abstract

本发明涉及一种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其用途。揭示了用于特异性检测NGAL的单克隆抗体，以及含有所述单克隆抗体的检测试剂盒。相对于传统诊断方法、核酸诊断方法，本发明的试剂盒不仅具有诊断速度快、准确度高、高通量的特点，而且具有成本低廉，操作简便等特点。

Description

抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域；更特别地，本发明涉及一种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其用途。

背景技术

急性肾损伤(Acutekidneyinjury，AKI)是肾功能在短时期(几小时至几天内)突然下降而出现的临床综合症状。迄今为止，AKI依然是十分常见而严重的临床问题，住院病人中AKI的发生率占5%，重症监护室AKI的发生率占30-50%，尽管医疗水平明显的提高，但是目前AKI的死亡率和发病率仍然很高[P.Devarajan，Biomarkersfortheearlydetectionofacutekidneyinjury.Currentopinioninpediatrics23(2011)194-200]。

缺乏特异性的早期临床诊断指标，是治疗该病的主要障碍。目前的临床实践中，诊断AKI的标准是血清肌酐水平。不幸的是，肌酐作为急性肾损伤的诊断标准，特异性和灵敏度不高。主要有以下两方面原因：首先，血清肌酐浓度易受多种因素的影响，例如年龄、性别、肌肉代谢率和水合状态等，不能及时准确的反应肾小球滤过率的变化。第二，由于肾脏强大的代偿能力，肾小球滤过率下降到正常人1/3时，血清肌酐浓度才明显上升，而这时肾脏功能已经丧失50%[P.Devarajan，Updateonmechanismsofischemicacutekidneyinjury.JournaloftheAmericanSocietyofNephrology:JASN17(2006)1503-1520]，从而错失了最佳的干预时机。研究表明，在血清肌酐上升阶段前，及时采取措施进行干预，可以阻止AKI的发生并降低肾损伤的严重程度。但是目前因为缺少针对AKI的早期诊断标志物，一些有希望的治疗方案的临床效果被大大降低[A.Urbschat，N.Obermuller，A.Haferkamp，Biomarkersofkidneyinjury.Biomarkers:biochemicalindicatorsofexposure，response，andsusceptibilitytochemicals16Suppl1(2011)S22-30]。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)是中性粒细胞中与基质金属蛋白酶9(MMP-9)共价结合的一种糖基化蛋白才是，NGAL是新近发展起来的一种新型AKI早期诊断标志物。在缺血性、脓毒性AKI及肾移植等情况下均能在血液和尿液中测到NGAL的大量增加[KaiM.Schmidt-Ott，Neutrophilgelatinase-associatedlipocalinasabiomarkerofacutekidneyinjury–wheredowestandtoday?NephrolDialTransplant(2011)26:762–764.]。作为AKI的早期诊断指标，NGAL的诊断意义和价值已经为临床实践所公认。与其他诊断标志物相比，NGAL具有指标变化明显，特异性强，稳定等优势，可以被广泛应用于重症监护室、急救中心、心外外科手术、肾脏移植等情况下出现的急性肾脏损伤的诊断中。

综上，本领域亟需开发针对NGAL的检测试剂，来用于急性肾损伤的诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种检测试剂盒，其特征在于，其中包括：(1)第一抗体，所述的第一抗体是特异性抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO.C201305的杂交瘤细胞株产生；和(2)第二抗体，所述的第二抗体是特异性抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO.C201306的杂交瘤细胞株产生。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：固相载体。

在本发明的另一方面，提供一种检测试剂盒，其中包括：

(a)包被有第一抗体的固相载体；所述的第一抗体是特异性抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO.C201305的杂交瘤细胞株产生；和

(b)第二抗体，所述的第二抗体是特异性抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO.C201306的杂交瘤细胞株产生。

在一个优选例中，所述的第二抗体还连接(如偶联)有标记物。

在另一优选例中，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：

与标记物相对应的底物；

显色剂；

洗涤液；和/或

终止液。

在另一优选例中，所述的底物选自(但不限于)：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：使用说明书。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，所述的试剂盒用于特异性检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCNO.C201305的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCNO.C201306的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201305。

在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201306。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、CHO细胞表达重组NGAL蛋白的SDS-PAGE和WesternBlotting验证。

(a)：SDS-PAGE验证NGAL的纯度，泳道1：标准蛋白分子量，泳道2和泳道3：镍离子亲和层析纯化后的NGAL蛋白；

(b)：WesternBlotting验证NGAL蛋白的表达，一抗为抗6×His标签鼠单抗，泳道1：细胞培养上清，泳道2：细胞裂解液，泳道3和4：镍离子亲和层析纯化后的NGAL蛋白。

图2、在ELISA读板仪上，测定各待测孔样品在波长在450nm下的吸光度(OD)值结果。

图3、S-455-1亲和力测定拟合曲线。

图4、ELISA组装试剂盒的标准品浓度测定曲线。

图5、ELISA定量血清中NGAL在DGF和EGF病人中术前和术后变化的趋势，DGF代表移植后肾功能延迟恢复，EGF代表移植后肾功能正常恢复。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种用于特异性检测NGAL的检测试剂盒，所述试剂盒中的试剂或材料经过了本发明人的优化。相对于传统诊断方法、核酸诊断方法，本发明的试剂盒不仅具有诊断速度快、准确度高、高通量的特点，而且具有成本低廉，操作简便等特点。

术语

如本文所用，所述的“第一单克隆抗体”、“第一抗体”、“一抗”、“捕获抗体”或“包被抗体”可互换使用，都是指用于固定于固相载体上的、特异性抗NGAL蛋白的抗体。所述的第一抗体较佳地是S-301-9单抗，其是由杂交瘤细胞分泌表达，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO.C201305。

如本文所用，所述的“第二抗体”、“检测抗体”、“酶标(记)抗体”或“二抗”可互换使用，都是指特异性地抗NGAL的单克隆抗体。所述的第二抗体较佳地是S-455-1单抗，其是由杂交瘤细胞分泌表达，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO.C201306。

如本文所用，所述的“标记物”是指位于第二抗体上的，用于指示抗原存在与否以及存在的量的标志物。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被第二抗体的标记物所催化显色，用于显示第二抗体与NGAL发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)；等等。

基本原理

酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunoadSorbentAssay，ELISA)是一种敏感性高、特异性强、重复性好的免疫学检测方法，其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可以做定性研究也可以做定量分析。其中，具备针对所检测目标的单克隆抗体是ELISA实验、尤其是双抗夹心法ELISA实验能否开展的关键条件。ELISA对目标抗原检测的灵敏度、特异性主要取决于其中所应用的抗体的性质和质量。

本发明的试剂盒设计的基本原理是基于双抗夹心法。常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与带标记的二抗反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。

抗原

本发明的试剂盒检测的抗原是NGAL蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本领域已知的。例如，其核苷酸序列如GenBank号为NM_005564所示。

生产NGAL蛋白的方法也是已知的。例如，通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用NGAL蛋白的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的NGAL蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用编码NGAL蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

抗NGAL蛋白的第一抗体

用于本发明的第一抗体是对NGAL具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于NGAL蛋白或其片段。更特别地，指那些能与NGAL蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

针对本领域中还没有优异的、特异性地针对NGAL的单克隆抗体的技术缺陷，本发明人经过大量的、反复的研究试验，最终找到了有效的抗NGAL的单克隆抗体(由杂交瘤细胞株S-301-9产生)，所述单克隆抗体(第一抗体)对于NGAL蛋白具有很高的特异性，不结合于NGAL以外的其它蛋白。并且，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地获得精确的检测结果。所述的第一抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心、保藏号CCTCCNO：C201305的杂交瘤细胞株分泌。

用于本发明的第二抗体是另一特异性识别NGAL的单克隆抗体S-455-1，其与S-301-9单抗所结合的NGAL上的表位是不同的。所述的S-301-9单抗与S-455-1单抗组合应用，检测的准确性非常高。

本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以采用多种方法方便地获得所述的抗体。

在本发明的一个实例中，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种优选方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用ProteinG预装层析柱纯化，获得高纯度的PSA单克隆抗体。

此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。

试剂盒

本发明利用特异性识别NGAL蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，根据双抗夹心法原理，制备了可方便、快速且准确地检测NGAL的试剂盒，且进行了优化。

本发明提供一种检测NGAL的试剂盒，所述的试剂盒可用于特异性地鉴别NGAL，且与蛋白显著区分。

所述的试剂盒含有：(1)第一抗体；(2)第二抗体。或者，所述的试剂盒含有：(a)包被有第一抗体的固相载体；和(b)第二抗体。

在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体(第一抗体)和检测抗体(第二抗体)后，可以采用本领域常规可用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中NGAL的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如(但不限于)：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)。

为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控(对照)。质控的设置是本领域技术人员熟知的。

此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个抗原的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是双抗夹心法中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液，增敏稀释液。

所述的第一单克隆抗体被包被在固相载体上，其能够与第一单克隆抗体相偶联(连接)。例如，所述的固相载体工作容积为360μl/孔的96孔酶标板。

本发明的试剂盒中还可包含有使用说明书，以指导人们以合适的操作方式使用该试剂盒。

检测NGAL方法

本发明提供一种体外(优选非治疗性、非诊断性地)检测NGAL的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的NGAL与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“NGAL-第一抗体”二元复合物的固相载体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-NGAL-第一抗体”三元复合物的固相载体；且所述的第二抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中NGAL的存在与否以及存在的量。

由于本发明的试剂盒采用了经过反复筛选而获得的抗体，大大提高了检测的灵敏度和准确性，还具有低交叉反应的特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、杂交瘤细胞株的制备

1、免疫用DNA抗原的构建

利用pBudCE4.1构建pBud-Dse双启动子分泌性表达载体，具体如下：将人的IgE重链信号肽(IgE-leaderpeptide)的编码序列进行密码子优化以提高表达。起始密码子ATG前引入真核细胞核糖体识别位点Kozak序列GCCGCCACC；信号肽序列后是多克隆位点，全基因合成两段优化的信号肽和多克隆位点序列，一段用限制性内切酶NotI和BglII消化，进而将其连接在pBudCE4.1载体的hEF1α启动子后面的多克隆位点，另一段核苷酸序列用限制性内切酶BamHI和HindIII消化，连接到上一步构建的载体里，通过测序检测分离的克隆，证实没有错误带入。

最终，构建的pBud-Dse双启动子分泌性表达载体上hEF1α启动子调控的读码框序列如下(SEQIDNO:1)：

GCGGCCGCGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATCTTATTCCTGGTGGCCGCCGCCACCAGGGTGCACAGCGGTACCAGCACAGTGGACTCGAGAGATCT

构建的pBud-Dse双启动子分泌性表达载体上CMV-启动子调控的读码框序列如下(SEQIDNO:2)：

AAGCTTGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATCTTATTCCTGGTGGCCGCCGCCACCAGGGTGCACAGCTTGCATTCCTGCAGGTCGACATCGATCTTAAGCAGTACTTCTAGAGGATCC

根据GenBank(登录号：NM_005564)提供的人NGAL的基因序列，设计合成一对特异性引物pNGAL-sp-5’和pNGAL-asp-5’，以人肾小管上皮细胞(HK-2)(购自ATCC)反转录的cDNA为模板特异性扩增出NGAL的全长基因，以KpnI/BglII，酶切后将其克隆到为pBud-Dse质粒(购自上海生化细胞所抗体中心提供)的EF-1а启动子启动子下游KpnI/BglII位点，获得pBud-Dse-NGAL重组质粒，此重组质粒即为免疫动物用DNA抗原。

设计的引物为：

pNGAL-sp-5’-CGGGTACCGCCGTCGATACACTGGT(SEQIDNO:3)

pNGAL-asp-5’-GAAGATCTTCGCCGTCGATACACTGGT(SEQIDNO:4)

下划线部分为引入的酶切位点，pNGAL-sp为NGAL基因上游扩增引物，引入的酶切位点为KpnI；pNGAL-asp为NGAL基因下游扩增引物，引入的酶切位点为BglII。

2、动物免疫

准备SPF级6周龄雌性Balb/c品系小鼠(中国科学院上海实验动物中心)4只，肌肉(两后腿股四头肌)多点注射pBud-Dse-NGAL质粒。每只小鼠注射80μgDNA质粒(溶于100μl无菌10mMPBS缓冲液中，pH为7.4)。注射后，马上使用5mm距离的电极，在针孔两侧插入注射区域的肌肉进行电击，电压为100v，时长为50ms，共进行5个脉冲。电击仪器为ElectroSquarePoratorT830M(BTX，SanDiego，CA)。每隔三周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后十天，眼眶取血，离心制备血清，储存于-20℃备用。做细胞融合前3天，加强免疫小鼠一次，免疫方法同前。

3、杂交瘤细胞建株

3.1细胞准备

骨髓瘤细胞的准备：收集经8-氮鸟嘌呤(Invitrogen)筛选过的骨髓瘤细胞SP2/0，显微镜下观察细胞活性，将活性良好的对数增殖期的细胞洗涤后计数，细胞悬浮在DMEM(Invitrogen)培养液中备用。

饲养层细胞的准备：融合前一天，将5mlDMEM培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心，计数，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，接种到96孔培养板内，50μl/孔。

脾脏细胞的准备：解剖小鼠，取脾脏，用机械法分散脾细胞，经滤网过滤得脾细胞悬液，DMEM培养液洗涤后计数。

3.2细胞融合

取1×10⁷SP2/0细胞与5×10⁷脾细胞(按1:5比例)混合于50ml离心管中，加入DMEM无血清培养液，离心，1500rpm，3min，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50%(v/v)PEG(分子量1500)1ml，边加边摇晃，1min内加完。静置90秒，让PEG继续作用。然后在2.5min内逐滴加入37℃预温的无血清DMEM培养液10ml，静置5min，终止PEG的作用。融合后细胞悬液离心，1000rpm，3min。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，加入25ml完全培养液(DMEM+10%FBS)，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μl/孔，置37℃，5%CO₂培养箱内培养。第二天，加入含2×NGALT(Sigma-Aldrich)的完全培养液，100μl/孔，杀死未融合的骨髓瘤细胞。

3.3杂交瘤细胞筛选

3.3.1生物素NGAL蛋白制备

设计引物pBirA-NGAL-sp-5’和pBirA-NGAL-asp-5’，扩增NGAL基因，正反向5’端分别引入KpnI和BglII两个酶切位点，通过限制内切酶KpnI和BglII双酶切，克隆到同样双酶切处理的pBud-BirA(N)真核细胞内特异位点生物素化载体(也称为pBirA-N质粒，购自上海中科英沐生物科技有限公司)上。挑取阳性克隆测序，测序结果正确，采用XtraMidiPlus质粒抽提试剂盒(MN公司)大量抽提质粒，去除内毒素，OD260测量浓度。

设计的引物为：

pBirA-NGAL-sp-5’-CGGGTACCGCCGTCGATACACTGGT(SEQIDNO:5)；

pBirA-NGAL-asp-5’-GAAGATCTTCAGCCGTCGATACACTGGT(SEQIDNO:6)。

下划线部分为引入的酶切位点，pBirA-NGAL-sp为NGAL基因上游扩增引物，引入的酶切位点为KpnI；pBirA-NGAL-asp为NGAL基因下游扩增引物，引入的酶切位点为BglII。

采用Invitrogen公司Lipo2000将质粒瞬时转染到293T细胞，具体转染操作步骤参照Invitrogen公司提供的Lipo2000产品使用说明书，转染6h后，更换新的细胞培养液(含有100μM的生物素)。瞬时转染48h后，吸掉细胞上清原液，用1ml预冷的1×PBS(PH=7.4)洗涤细胞两次，尽量的除掉未被结合的生物素。加入500μl-1000μl的细胞裂解液(购自Cellsignaling)混匀，冰上放置5-10min。用细胞刮样器收集细胞，收集细胞裂解液置离心管中，4℃10000rpm离心10min，吸取上清-20℃分装保存。裂解细胞的整个过程要求在低温环境中进行。

3.3.2ELISA检测方法的建立

将链霉亲和素蛋白(购自上海中科英沐生物科技有限公司)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/ml，包被到96孔微孔板(Corning)内，4℃，过夜，100μl/孔。用稀释液(含10%(v/v)FBS的PBS，pH7.4)封闭37℃，2小时。然后加入含有生物素化NGAL蛋白的细胞裂解液(工作浓度：300倍稀释)，37℃孵育30分钟。然后用PBST(PBS按1/1000比例加入Tween20)洗板。检测抗体时，加入待测孔内杂交瘤细胞培养上清(100μl/孔)。同时设置阳性、阴性对照，阳性对照为稀释过的免疫后小鼠血清，阴性对照为新鲜DMEM培养液，在37℃孵育2小时。洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体(上海中科英沐)(50μl/孔)，37℃孵育1小时后，洗板，用TMB底物(Sigma-Aldrich)显色(100ul/孔)，反应10min后，加入2MH₂SO₄终止反应(50μl/孔)。在ELISA读板仪(ThermoScientific)上，测定各待测孔样品在波长在450nm下的吸光度(OD)值。

(1)杂交瘤细胞克隆化

选择抗体阳性且OD值高的孔用有限稀释法对其中的杂交瘤细胞进行克隆化，一般稀释到0.8个细胞/孔。待细胞培养至20%板底面积时，吸取细胞培养上清用ELISA方法再次筛选抗体阳性孔。若连续3次克隆，每次克隆率小于2/3和阳性率都为100%，这样获得的细胞即为单克隆。1×10⁶细胞在10ml培养上清培养3日后，取上清进行ELISA检测，以OD值较高的孔为指标进行筛选，结果共获得7株杂交瘤细胞系，各株杂交瘤细胞的滴度见表1，从中筛选到本发明的杂交瘤细胞系，命名为S-455-1，其分泌的单克隆抗体属于IgG₁，κ型(Bio-Rad抗体亚型鉴定试剂盒)。

表1、7株杂交瘤细胞株的抗体效价及亚型鉴定

其中，效价是指培养杂交瘤细胞时上清中的抗体效价。

将哺乳动物细胞来源的NGAL蛋白，用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成0.3μg/ml，包被到96孔微孔板(Corning)内，4℃，过夜，100μl/孔。用稀释液(含10%(v/v)FBS的PBS，pH7.4)封闭37℃，2小时。加入待测孔内杂交瘤细胞培养上清，倍比稀释，共8个梯度，(100μl/孔)。阴性对照为新鲜DMEM培养液，在37℃孵育2小时。洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体(上海中科英沐)(50μl/孔)，37℃孵育1小时后，洗板，用TMB底物(Sigma-Aldrich)显色(100ul/孔)，反应10min后，加入2MH₂SO₄终止反应(50μl/孔)。在ELISA读板仪(ThermoScientific)上，测定各待测孔样品在波长在450nm下的吸光度(OD)值，结果如图2所示。

S-455-1和S-301-9杂交瘤细胞株分泌的抗体与NGAL蛋白的亲和力显著优于其它5株单克隆抗体，且是能够识别NGAL的不同表位，进行夹心配对，用于基于双抗夹心原理的NGALELISA试剂盒的组装。具体见下文。

(2)杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存液：50%小牛血清，40%RPMI1640溶液，10%二甲基亚砜。

将杂交瘤细胞离心，重新悬细胞于预冷的冻存液中，浓度为10⁶-10⁷/ml，转移至冻存瓶1ml。置于-70℃冰箱中，次日转入液氮中。将制备抗人NGAL单克隆抗体S-455-1的杂交瘤细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO.C201306，其分泌的单抗也称为S-455-1单抗。将S-301-9同样保藏于CCTCC，保藏号为CCTCCNO.C201305，其分泌的单抗也称为S-301-9单抗。

实施例2、哺乳动物细胞重组NGAL蛋白

为了评价单克隆抗体的亲和力及为检测试剂盒的组装提供标准品，本发明采用Invitrogen公司提供的FreeStyleMAXCHO表达系统表达和纯化了可分泌性的NGAL蛋白。该蛋白是融合蛋白，C端带有6×His标签，大小是28kD。参照Invitrogen公司提供的使用说明书将pBud-Dse-NGAL质粒瞬时转染到CHO-S细胞(Invitrogen)，悬浮培养72h后收集细胞培养上清，4℃、6000rpm离心半小时，去掉细胞碎片，利用AKTAPurifierUPC100快速蛋白纯化系统(FPLC)，通过NiSepharoseHighPerformance层析柱(GE)将细胞培养上清中细胞分泌的C端带有6×His标签的NGAL蛋白高效结合，最后300mM咪唑洗脱目的蛋白，分段取两次样，将上述溶液装入透析袋中，对10mM、pH为7.4的PBS缓冲液透析，4小时换液一次，换液3次，然后用Ultra离心超滤管，截留分子量3kD(millipore)浓缩，分装后，-70℃冰箱保存。使用BCA法测定纯化后NGAL蛋白含量，为0.5mg/ml，取少量的蛋白，用6×上样缓冲液处理后，100℃煮沸10分钟，经SDS-PAGE(图1(a))、WesternBlotting鉴定(图1(b))，获得较单一条带，纯度在95%以上。

实施例3、单克隆抗体制备

本发明中，大量制备单克隆抗体的方案为小鼠腹水法，步骤为如下：

1、腹水制备

取经产F1代小鼠，于腹腔注射0.5ml降植烷(pristane)。7-10天后，再次腹腔注射0.5ml1×10⁶杂交瘤细胞。每天观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。

2、单抗纯化

上述获得的单抗腹水，采用ProteinG亲和层析的纯化方法：预装ProteinG-sepHarose4B(GE)柱子，并用约50mlPB平衡；取2ml腹水，经0.45μm的滤膜过滤，20mMPB缓冲液稀释，最后过柱，20mM、pH为7.0的PB缓冲液洗脱未结合于柱的蛋白，测蛋白浓度，直至洗脱液内无蛋白为止；用100mMpH2.7Glycin洗脱结合在柱上的抗体，同时洗脱下来的液体用1MpH9.0Tris-HCl中和，使其pH值为中性；收集洗脱液，测蛋白浓度。将上述溶液装入透析袋中，对10mM、pH为7.4的PBS缓冲液透析，4小时换液一次，换液3次，透析后的单克隆抗体分装，-70℃冰箱保存。

3、单抗亲和力测定

BIA(BiomolecularInteractionAnalysis)提供了实时观察生物分子间相互作用的技术，所使用仪器为GE的BiacoreT100，具体操作流程和分析方法参考GE公司提供BiacoreT100使用说明书。通过Biacore分析能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强。本发明人在传感器芯片CM5上偶联CHO细胞表达的NGAL蛋白，工作浓为10ug/ml，通过不同浓度梯度的抗体与抗原的结合和解离的折射率变化(RU值)的比较，得出待测抗体的亲和力。具体方法是将待测抗体从高到低稀释，分别是：10nM、8nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0nM(10mMPBS，pH=7.4)。为了确定实验的稳定性，选中间浓度的稀释度重复1次。经过BIAEvaluation软件对测出的结果进行拟合分析(图3)，S-455-1与哺乳动物表达的NGAL蛋白的亲和常数(KD)是8.643×10^-11M。

4、抗体辣根过氧化物酶标记

称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，入0.2ml新配的100mMNaIO₄溶液，室温下避光搅拌20min。将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。将纯化好的S-455-1抗体，在10mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)4℃透析过夜。加20μl200mMpH为9.5碳酸盐缓冲液使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgS-455-1，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/mlNaBH₄液，混匀，再置4℃2小时。将上述液装入透析袋中，对10mMpH为7.4的PBS透析，4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵(50%饱和度)洗二次，最后沉淀物溶于少量pH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对10mMpH为7.4的PBS缓冲盐水透析，4小时换液一次。去除铵离子后10,000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为HRP酶标记的S-455-1抗体，分装后，冰冻保存。

实施例4、NGAL蛋白ELISA检测试剂盒的组装

本发明所述的S-455-1单克隆抗体与采用同样方法制备的另一株杂交瘤细胞系S-301-9(保藏号为C201305，保藏于CCTCC)单克隆抗体可以夹心配对，用来开发NGAL的定量分析的ELISA试剂盒。

1、NGAL快速检测试剂盒组份

①常规方法将S-301-9单克隆抗体包被于96孔酶标板，获得已包被S-301-9单克隆抗体的96孔酶标板；

②前述制备的HRP标记的S-455-1抗体；

③经CHO系统表达和纯化的分泌性的NGAL全长蛋白作为试剂盒参考标准品，稀释后的系列浓度分别为：20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、0.2ng/ml及稀释液(作为阴性对照)；

④含2%BSA的PBS(pH为7.4)稀释液；

⑤PBST(PBS按1/1000比例加入Tween20)为洗涤液；

⑥2MH₂SO₄为酶反应终止液；

⑦TMB为底物(Sigma-Aldrich)；

⑧样品稀释板、产说明书及标签纸。

上述①～⑧的组分置于合适大小的盒中，获得NGAL蛋白ELISA检测试剂盒。

2、NGAL的ELISA试剂盒的应用操作

将预包被板从4℃取出，室温操作。

(1)设计实验，准备好实验说明书，分配好将要加入NGAL快速标准品准备好标准品、稀释好的病人样本和实验对照样本，每个样本设置两个复孔，如果酶标仪不具备650或者620nm波长，则可以设置一个空白对照，即指加入样本用稀释液代替。

(2)根据预测的样本中的NGAL浓度稀释样本，一般情况下血浆1:100稀释，尿液1:50稀释。

(3)吸取足够量的标准品、待测样本及对照样本至试剂盒提供的聚丙烯U型微孔板中。

(4)吸取50μLHRP标记的检测抗体至对应的包被的微孔板中，然后用多道移液器快速吸取U型聚丙烯微孔板中的标准品、待测样本和对照样本至已加入检测抗体的包被的微孔板中。推荐使用这种加样方法以减少首先加入的和最后加入的样品孵育时间的差别。

(5)将加好样本的微孔板用封板膜封起来，在室温孵育30min。

(6)吸走微孔板中的液体，然后用预先稀释好的洗涤液洗三次，推荐洗涤时微孔中应加入最少300μL的洗涤液，并让洗涤液在空中停留最少1分钟。

(7)每孔加入100μLTMB底物，推荐使用多道移液器。用封板膜将微孔板封起来，室温避光反应15分钟，加完第一排微孔后开始计时。

(8)按照与第(7)步同样的加样顺序和频率每孔加入100μL反应终止液，轻轻摇晃20秒，使反应液充分混匀，避免液体溅出来，30分钟内测OD值。

(9)用酶标仪读取OD450，如果没有650或者620nm参照波长，在后面的计算和数据处理过程中可以将减掉空白对照的OD450读数。

3、NGAL组装试剂盒评价

采用Logistic曲线拟合(五参数)确定组装试剂盒的检测范围为：0.2-20ng/ml(R²=0.99998)，最低检测限值为0.017ng/ml，与尿液中的其他杂蛋白不结合。如图4。

采用本发明的ELISA试剂盒，分别对1例肾脏移植后发生肾移植功能延迟恢复(DGF)和1例移植后肾脏功能正常恢复病人(EGF)术前和术后1-8天血浆中的NGAL进行了定量分析(图5)，随着肾移植病人肾功能的恢复，血清中NGAL迅速下降，接近正常人水平，说明肾小球的滤过功能在恢复，在DGF病人中，血清中的NGAL无论是术前还是术后都维持较高水平，均大于500ng/ml。进一步说明了血清中NGAL是判断肾移植手术后的肾功能恢复情况的一个敏感标志物。本发明的试剂盒具有重要的应用价值。

总结

ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析。

目前，市场上进口NGAL检测试剂盒价格昂贵，主要占据三甲医院市场；国内少数几家企业开发过此类试剂盒，目前只限于研究应用，而且质量与进口试剂存在一定差距。如果开发出高质量的NGAL检测试剂盒，其市场前景看好。

如果检测样本中的NGAL水平预测AKI能够产生临床效益，需要快速提供结果。基于传统ELSA的方法，步骤繁琐，检测时间较长，整个过程历时4个小时，本发明人利用获得的两株高亲和力抗体，采用双抗夹心的原理，建立快速酶联免疫方法，操作过程简单，检测时间由原先的4个小时缩短到了1个小时以内，基本能满足临床上快速提供诊断结果的要求。通过不断的条件优化和性能调整，该产品灵敏度较高，与进口试剂盒灵敏度和精确度相当。

生物材料保藏

本申请中，杂交瘤细胞株S-301-9已经保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为：CCTCCNO:C201305，保藏日为：2013年1月22日。

本申请中，杂交瘤细胞株S-455-1已经保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为：CCTCCNO:C201306，保藏日为：2013年1月22日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测试剂盒，其特征在于，其中包括：(1)第一抗体，所述的第一抗体是特异性抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO.C201305的杂交瘤细胞株产生；和(2)第二抗体，所述的第二抗体是特异性抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO.C201306的杂交瘤细胞株产生。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：固相载体。

3.一种检测试剂盒，其特征在于，其中包括：

4.如权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体还连接有标记物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

6.如权利要求1-3或5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：

与标记物相对应的底物；

显色剂；

洗涤液；和/或

终止液。

7.如权利要求1-6任一所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于特异性检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；所述的用途为非诊断性的用途。

8.一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCNO.C201305的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

9.一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCNO.C201306的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

10.权利要求8或9所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂盒。

11.一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201305。

12.一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201306。