CN102775473A

CN102775473A - 人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的b细胞表位肽段及其应用

Info

Publication number: CN102775473A
Application number: CN2012102692826A
Authority: CN
Inventors: 黄洪涛; 石延宾; 姚静; 张宪; 胡伟; 秦川; 魏勇
Original assignee: CHONGQING NOVEAGENE BIOTECH Co Ltd
Current assignee: Chongqing Novegent Biotech Co ltd
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-07-30
Also published as: CN102775473B

Abstract

本发明属于医学领域，特别涉及急性肾损伤的诊断技术，所述人NGAL的B细胞表位肽段及其制备的杂交瘤细胞；B细胞表位肽段、其特异性抗体及特异性抗体的免疫复合物在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用；本发明制备的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶256000)、特异性好、可大批量制备等优点；通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人尿液NGAL含量的检测，如可采用“双抗体夹心”ELISA反应模式，即酶标记人抗NGAL单抗、酶标板包被抗NGAL多抗和被测样品NGAL抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。

Description

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段及其应用

技术领域

本发明属于医学领域，特别涉及急性肾损伤的诊断技术。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，有时混淆于急性肾功能衰竭(acute renal failure，ARF)，尚无统一的定义。目前普遍接受的AKI概念是指各种原发或继发损伤因素导致的肾脏结构的改变、肾功能下降以及最终肾衰竭的整个过程。有研究表明，冠状动脉旁路移植术后病人AKI发病率达到26.6％，严重创伤后AKI发病率达到50％，而AKI在重症监护病房(ICU)中病死率高达37％～76.19％，是一种发病率和病死率很高的临床综合症。早期治疗对AKI的逆转十分重要，而早期诊断是早期治疗的前提和关键所在。

目前AKI的诊断和分级标准，主要是AKIN(Acute Kidney Injury Network)国际组织于2007年提出的AKIN标准，该标准将AK1分为三级：一级为血肌酐(sCr)升高到基础值的150～200％；二级为sCr升高到基础值的200～300％；三级为sCr升高到基础值的300％以上。这种主要以sCr水平为基础的标准，对AKI的早期诊断缺乏敏感性和特异性。如当肾功能下降50％时，sCr水平才开始上升，因此将sCr作为AKI诊断指标几乎起不到肾功能保护的作用，这也是长期以来AKI临床治疗效果不佳的主要原因。为更好地进行AKI的预防、诊断、治疗以及预后评估，发现和鉴定AKI新的敏感生物标志物并建立准确的测定方法是AKI防治研究的重要方向。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是Kjeldsen L等人1993年在中性粒细胞特异性颗粒中发现的一种小分子分泌型蛋白。后续的研究发现NGAL也在人体多种组织如肾、前列腺、呼吸道和消化道上皮中低水平表达，而在炎症时的中性粒细胞、乳腺癌及膀胱上皮癌细胞中表达显著增高。更为重要的发现是Mishra J等2003年研究观察到在缺血再灌注损伤后的小鼠肾脏和顺铂诱导的中毒性肾损害中，小鼠尿液中NGAL在损伤后3h测定值升高大于三倍，在12h可达正常的12倍，72h恢复到正常水平，能很好地反应AKI的病程和损伤程度；2005年Lancet杂志上报道了71例接受心脏手术的患儿的研究发现，体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)后2h的血和尿NGAL是预测AKI的可靠指标，其曲线下面积(under the curve，AUC)分别为0.910和0.998。2008年Nickola等另一项研究监测了635例急诊科患者的尿NGAL水平，结果发现，尿NGAL在诊断AKI具有较高的敏感性和特异性(分别为90％和99％)，引起了人们对NGAL检测的广泛关注。

为了在理论上回答NGAL是否是检测诊断AKI理想的标志物，美国哥伦比亚大学Barasch研究小组进行了深入研究，并在2011年Nature Medcine上报道了用Luciferase -2和mCherry双萤光报告基因在NGAL启动子和其5’UTR驱动下的knock in小鼠模型的实验结果，揭示了缺血性和细胞毒性AKI时NGAL基因表达活性在肾组织中的Henles管和集合管的上皮细胞呈剂量依赖性的显著变化；AKI时尿中NGAL主要来自肾组织，而不是来自正常时也低表达NGAL的中性粒细胞、肝细胞、呼吸道和肠道等上皮细胞；尿NGAL的检测比血和尿Cr检测更能特异性地代表AKI的损伤程度，其检测的敏感性有极为显著的差异(P＜0.001)。这项重要的研究发现，不仅从理论上说明了肾上皮特征性尿NGAL检测诊断AKI的高特异性和高灵敏性的原因和临床应用前景，也解释了过去一段时间里NGAL免疫检测中存在的主要问题。

2010年Linjun Cai等用ELISA发现AKI、细菌感染和结肠癌患者尿NGAL与正常对照相比均显著增高，进一步实验发现，AKI时增加的是NGAL单体(25KD)，细菌感染增加的主要是NGAL同源二聚体(45KD)，而结肠癌增加的是NGAL与金属蛋白酶9(MMP-9)结合形成的异源二聚体(135KD)。根据Barasch研究小组实验动物的研究结果推测患者发生AKI时，其肾Henles管和集合管上皮细胞NGAL基因反应性高表达参与了肾上皮的抗损伤作用，因为已有研究揭示NGAL可通过介导铁的转运促进原始肾上皮细胞的成熟时同时以肾上皮特征性单体形式分泌入尿液。

丹麦Bioporto Diagnostic公司研发的人NGAL快速ELISA检测试剂盒，所用的NGAL抗体均是用人外周血白细胞来源的NGAL同源二聚体免疫动物后制备，忽略了不同组织来源NGAL之间可能存在的差异。事实上，这些试剂盒检测结果在人群中存在太大的变异，例如Bioporto Diagnostic报道医院ICU病人尿液中NGAL浓度在110～40000ng/ml之间，血液中NGAL浓度在25～3491ng/ml，这种个体间巨大差异，其原因可能就是AKI损伤时，尿液中的主要NGAL形式是损伤上皮重新合成和分泌的单体NGAL，未能开发出针对肾上皮特征性NGAL特异性的抗体，影响了其对AKI诊断的应用。上述的研究发现和目前NGAL检测试剂的不足，迫切地要求对临床AKI患者尿中的肾上皮特征性NGAL分子形式进行深入的研究并获得特异性的检测抗体，用以建立适合临床AKI诊断的尿NGAL定量检测方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供NGAL B细胞表位肽段，其能作为NGAL单克隆抗体的抗原。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：

人NGAL的B细胞表位肽段，所述人NGAL的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。上述氨基酸序列是通过如下手段获取的：从NCBIProtein数据库中获取如SEQ ID NO：2所示的NGAL蛋白序列；分别对NGAL蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性、柔韧性以及可能的糖基化位点，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域，其序列如SEQID NO：3所示。

所述的B细胞表位肽段化学合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA或KLH交联。将所述的B细胞表位肽段与载体蛋白BSA或KLH交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。

本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌NGAL单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的人NGAL的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述NGAL的B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的最强阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出最强阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO：C201262，其可稳定分泌所述单克隆抗体。

本发明的目的之三在于提供所述一种特异性抗体，其可作为检测NGAL抗原的试剂。同时，还提供含有上述抗体的试剂盒，该试剂盒可用于急性肾损伤的诊断。

所述的人NGAL的B细胞表位肽段制备的特异性抗体。所述特异性抗体为所述人NGAL的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

作为优选的，所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO：C201262。

基于诊断急性肾损伤的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201262的杂交瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体。

本发明的目的之四在于提供三种新应用，该应用为急性肾损伤的诊断提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的人NGAL的B细胞表位肽段在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。所述的人NGAL的B细胞表位肽为免疫原性多肽，其可被B细胞抗原受体(BCR)识别并结合，或与人NGAL抗原的抗体特异性识别并相互结合；所以，所述B细胞表位肽段可以制备成诊断试剂，用于检测标本中的NGAL抗原的特异性抗体含量，进一步判断是否为急性肾损伤患者提供指标参数。

人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。或人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。所述人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体或人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物，可用于免疫原及筛选原的检测，或建立NGAL定量检测。当NGAL的含量超过正常人的标准，NGAL的含量可作为判定急性肾损伤的判定辅助参数。

本发明的有益效果在于：本发明制备的人NGAL是高纯度的NGAL单体重组蛋白(rhNGAL)，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立NGAL定量检测时的校准品。通过NGAL蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶256000)、特异性好、可大批量制备等优点。人NGAL蛋白中B细胞表位肽段化学合成时在其N端引入半胱氨酸，提高了其与KLH或BSA交联率(＞50％)，可作为优质免疫原。通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人尿液NGAL含量的检测，如可采用“双抗体夹心”ELISA反应模式，即酶标记人抗NGAL单抗、酶标板包被抗NGAL多抗(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体)和被测样品NGAL抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。

附图说明

图1为重组pET42a-NGAL质粒经Sal I、BamH I酶切鉴定图，箭头显示目的酶切产物。

图2为NGAL重组蛋白的非变性PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果。

图3为Western Blot分析重组NGAL的免疫特异性，图中MIF为对照蛋；NGAL(左)为上样量40μg结果；NGAL(右)为上样量20μg结果。

图4为人NGAL表位特异性单克隆抗体的纯化图。

图5为人NGAL多克隆抗体(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体)的纯化图。

图6为人NGAL多克隆抗体斑点杂交图。

本发明中杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6-NGAL送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC NO：201262，地址位于中国武汉武汉大学，保存日期为2012年6月27日，保藏的培养物名称为小鼠杂交瘤细胞。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆：实验手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。

实施例1NGAL重组蛋白的制备

从GENBANK获取NGAL编码基因的基础上，进行密码子偏嗜性改造，化学合成编码基因片段，克隆入原核表达载体经DNA测序鉴定后诱导蛋白表达，经性质鉴定后，大量纯化制备NGAL重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为后续实验中建立NGAL定量检测时的校准品，具体的：

一NGAL重组蛋白基因克隆：

从GENBANK获得人NGAL蛋白的基因序列(登录号为NM 005564.3)，将其递交于Graphical codon usage analyzer(http://guca.schoedl.del)，分析其密码子偏性情况；具体的，将人NGAL基因密码子在大肠杆菌中使用率＜10％的同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，使其更加容易在大肠杆菌中表达，优化后的NGAL CDS核苷酸序列为SEQ ID NO：1；相应的多肽序列如SEQ ID NO：2所示。

为进行有效表达及纯化，在序列SEQ ID NO：1的5′-及3′-端分别添加限制性酶切位点Sal I(5′GTCGAC3′)、BamH I(5′GGATCC3′)，其中BamH I位点后加入gatgatgatgataag序列，其编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys多肽序列为EK酶的识别位点。然后委托上海英骏生物工程有限公司进行全基因合成。合成的过程为常规基技术，可参考分子克隆：实验手册一书。

二pET42a-NGAL重组质粒构建：

将pET42a载体与合成基因经Sal I、BamH I酶切4小时后用T₄ DNA连接酶4℃过夜连接。将制备好的感受态DH5α菌200μl，冰浴，吸取1μl连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μl室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1小时，分别将50μl、200μl及剩下的全部转化菌涂于3个含卡那霉素抗性的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑去白色菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用Sal I、BamH I双酶切4小时，酶切体系为：pET42a-NGAL质粒DNA 10μl，Sal I 1μl，BamH I 1μl，10×缓冲液K 2μl，ddH₂O 6μl，并取酶切产物10μl行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(详见图1)。

三NGAL重组蛋白诱导表达

将转化pET42a-NGAL的细菌扩大培养及诱导表达，测细菌OD值达0.6-0.8时加入IPTG(至终浓度1mmol/L)诱导表达6小时。培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH 7.3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4℃ 10,000rpm离心15min，上清以0.45μm微孔滤膜过滤。分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性，经鉴定表达蛋白破菌后几乎都存在上清中，为可溶性表达。

四NGAL重组蛋白纯化

上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱纯化，Binding buffer平衡后用Elution buffer线性洗脱，收集主洗脱峰，用His-Binding buffer稀释10倍后进行HisTrap HP再次纯化，纯化后的产物用PBS平衡过的分子筛，收集蛋白。将获得的蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割buffer(50mmol/LTris-HCl，PH8.0)，按EK酶与蛋白1∶1000的质量比加入EK酶，4℃摇床60rpm切割24h。切割后用His-Binding buffer稀释后HisTrap HP纯化，15％SDS-PAGE电泳鉴定，NGAL重组蛋白分子量为25Kda左右，详见图2，纯化后目的蛋白纯度达到95％以上。

五 NGAL重组蛋白浓度、纯度测定

1 Lowry法测定NGAL蛋白含量

Lowry法测定的试剂盒购于上海美季生物技术有限公司。

试剂A：1)10克Na₂CO₃，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC₄H₄O₆·4H₂O)。溶解于500毫升蒸馏水中；2)0.5克硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份(A)与1份(B)混合，即为试剂甲。

试剂B：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O)，25克钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85％磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li₂SO₄)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。

标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9％NaCl溶液。

详见下表：

在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A₂₆₀值与A₂₈₀值。根据公式，蛋白浓度C＝(1.45×A₂₈₀-0.75×A₂₆₀)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25～150μg范围，按照上表的操作程序反应，测定处650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为1.050g/ml。

2高效液相色谱法(HPLC)进行纯度测定和NGAL获得量计算

将纯化的蛋白用HPLC分析其纯度，可知经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱初纯化后NGAL蛋白的纯度达94.5％以上，再次过分子筛纯化后NGAL纯度可达98％。经计算，每升诱导菌可获得30.5mg该融合蛋白，经切割后可以获得9.0mg左右的NGAL重组蛋白。

六Western blot对NGAL重组蛋白进行免疫反应特异性鉴定

取最后纯化的NGAL蛋白行15％SDS-PAGE鉴定，用Abcam公司生产的抗NGAL单克隆抗体(货号：ab23477)对其进行Western Blot分析，选用MilliporeImmobilon Western Chemiluminescent HRP Subscrate系统显色，结果显示抗NGAL单抗结合NGAL蛋白处可见清晰条带(图3)。

七稳定性研究

采用冻干保存的方式在4℃的条件下保存180天，其检测值降低＜5％，而用校准品稀释液保存一个月即降低25％以上，6个月减少60％以上，说明长期保存宜采用冻干的形式。此外，在冻干品用校准品稀释液溶解后，7天内降低＜10％，因此在这期间可用于定量检测。

实施例2NGAL分子B细胞表位预测和多肽合成

所述的化学合成的B细胞表位肽段的序列来自生物信息学分析结果，从NCBI Protein数据库中获取NGAL蛋白序列，序列如SEQ ID NO：2所示。综合分析NGAL蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性、柔韧性以及可能的糖基化位点，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域。具体的，利用Chou & Fasman预测β转角、Emini法预测抗原表面可及性、Karplus & Schulz法预测蛋白柔韧性、Kolaskar & Tongaonkar蛋白质抗原性分析、Parker法蛋白质疏水分析、Bepipred线性抗原表位预测以及通过UniProt数据库中获得NGAL糖基化信息，选出B细胞表位特征明显、免疫原性强的人NGAL蛋白中潜在的B细胞表位肽段。化学合成的肽段不少于15个氨基酸。所述的化学合成的表位肽段为(SEQ ID NO：3)：

NGAL183199：N--LPENHIVFPVPIDQCIDG-C(为SEQ ID NO：3的缩写)

所述的B细胞表位肽段化学合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA交联。交联率(＞50％)，得NGAL B细胞表位肽段抗原。另外，如SEQ ID NO：2所示的表位肽段也可选择同KLH进行交联。具体方法参见《现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)》。

实施例3单克隆抗体的制备与鉴定

一NGAL B细胞表位肽段衍生物免疫Balb/c小鼠

将实施例2获得NGAL B细胞表位肽段抗原从-80℃冰箱取出作抗原，溶解后过滤。选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将如SEQ ID NO：3所示的NGAL B细胞表位肽段抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，得抗原混合物，每只小鼠按100μg的量皮内多点加腹腔注射。第14和第28天分别进行第二次第三次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μgNGAL，3天后细胞融合。

二被免疫Balb/c小鼠血清效价测定

第3次免疫后10天从小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价。将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用；用包被液(0.05mol/L碳酸钠缓冲液：0.16gNa₂CO₃，0.293g NaHCO₃，0.02g NaN₃，加去离子水溶解定容100ml)将实施例1所得NGAL重组蛋白抗原稀释为最佳工作浓度5μg/ml，每孔加100μl抗原稀释液，37℃温育1小时后，以胶带封口，于4℃过夜，倒尽板孔中液体，吸干孔内残余反应液，加满洗涤液过一次，再注满洗涤液缓缓晃动2min，倾去，反复五次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。自然干燥后以胶带封口，此为实施例1制备的NGAL重组蛋白抗原包被的酶标板，加封闭液300μl，37℃孵育1.5小时，洗涤5次；采血及稀释血清：捏住鼠尾，75％酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20μl，2000rpm离心30min，取上清1μl加入999μl抗体稀释液混匀，并进行体积倍比稀释，从1∶100至1∶3200，将稀释的被检血清每孔加入100μl，同时取小鼠免疫前血清1∶100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37℃孵育1～1.5小时，洗涤5次；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG(上海亿欣生物科技有限公司)稀释到1∶10000，每孔加100μl，37℃孵育1.5小时，洗涤5次；加邻苯二胺溶液100μl/孔，室温暗处15分钟，每孔加终止液100μl观察结果，OPD氧化后的产物呈橙红色，用酶联免疫检测仪记录492nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。血清效价达到1∶3200，可用于细胞融合。

三小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液的制备

取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有10ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10ml玻璃离心管中，800rpm水平离心10min，去上清。同法用不完全培养基10ml洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10ml不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×10⁸个细胞。

将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10ml离心管中，800rpm水平离心10min，弃上清，10ml完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50ml培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10ml不完全培养基重悬，细胞计数，约为5×10⁷。

四滋养细胞的制备

取一只未免疫的Balb/c小鼠，摘眼球放血处死，体积分数为75％乙醇浸泡消毒5分钟，剪开小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50ml离心管中。同法用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10min，去上清，10ml不完全培养基重悬细胞并计数。

五骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合

融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×10⁷个骨髓瘤细胞悬液和1×10⁸个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶10)至一个50ml离心管中，补加30ml不完全培养基，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1min左右加完，然后静置90s，逐滴加入37℃预温的不完全培养基30ml终止融合，3min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5分钟，取出离心管，1000rpm离心5分钟，弃去上清，加入10ml HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

六融合细胞的选择性培养及杂交瘤细胞的筛选

融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μl，第14天换HT培养基培养。融合后10～14天，待细胞长到满培养孔的1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以实施例1制备的纯化后NGAL重组蛋白包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5min，拍干液体，每孔加入封闭液300μl，37℃孵育2h，加入100μl细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育2h；洗涤酶标板：每孔加入100μl 1∶10000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IG抗体，37℃孵育2h；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的邻苯二胺溶液100μl/孔，室温暗处反应10～15分钟，加终止液每孔100μl终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。结果为以NGAL表位肽段为抗原，免疫BALB/C小鼠，融合成功后，经克隆化和间接ELISA(方法参照现代免疫学实验技术沈关心周汝麟主编)筛选后，得到分泌NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其细胞培养上清效价达到1∶6400。这株杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌抗体。

七阳性杂交瘤细胞的克隆化

筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备饲养细胞，用10ml不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20ml，取一块预先已加有滋养细胞的96孔细胞培养板，加入200μl细胞悬液，将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37℃，5％CO₂培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，10天后用间接ELISA法检测效价，并将最强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100％，即可定株；测取定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价后再将定株的杂交瘤细胞扩大培养，并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO：C201262，其可稳定分泌所述单克隆抗体。

八小鼠腹水制备、抗体纯化及效价测定

选用健康雌性Balb/c小鼠10只，腹腔注射0.5ml灭菌石蜡油/鼠，1-2周后每只小鼠腹腔注射0.5×10⁶～1×10⁶个杂交瘤细胞，同时注射0.25ml等量混合的液体石蜡与不完全弗氏佐剂的混合物。小鼠明显产生腹水后拉颈处死，用吸管从腹腔取出腹水，4℃离心15min，分离收集中段的澄清腹水液。选用HiTraprProtein A HP柱接入AKTA Explorer纯化抗体(图4)，经SDS-PAGE检测纯度大于96％。纯化的(保藏号为CCTCC NO：C201262)抗体用间接ELISA法(方法参照现代免疫学实验技术沈关心周汝麟主编)检测效价达1∶512000，初步说明获得的单克隆抗体对NGAL分子有较高结合能力，分装冷冻保存，待实施例5使用。

九NGAL单克隆抗体的亲和力测定

为检验NGAL单克隆抗体的对NGAL抗原的结合能力，运用基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法对所获单抗进行亲和力测定。将纯化好的NGAL抗原溶解在0.05mol/l的碳酸缓冲液(pH9.5)中，调整NGAL的终浓度为1μg/ml，于ELISA板孔中每孔加100μl，胶带封闭条板4℃过夜。次日拍干孔中液体，以含1％BSA的PBS溶液对各孔封闭2h，洗板并干燥后4℃保存备用。根据测定原理及方法建立抗原抗体反应系统，NGAL单克隆抗体初始反应浓度稀释至40ng/ml，NGAL抗原初始浓度稀释至360mg/ml。抗原浓度倍比稀释按30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.235(单位为10^-12mol/l)进行，计算NGAL单抗的亲和力常数。结果显示其具有高亲和力，Kd＝4.8×10^-8mol/L。本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。

实施例4NGAL多克隆抗体(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体)的制备

一免疫动物

以实施例1所得纯化NGAL重组蛋白为抗原，采用背部皮下及四肢多点注射免疫新西兰大白兔。免疫程序：基础免疫前耳缘静脉取血5ml分离血清作为阴性对照。每只用抗原500μg与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后进行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐剂加强免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐剂第3次免疫。第3次免疫后7天，耳缘静脉取血5ml分离血清，用间接ELISA检测抗血清的效价。效价达1∶64000时颈动脉插管收集全血，4℃放置过夜，4000rpm离心收集血清，-70℃保存。效价达不到要求可再加强免疫1次。

二特异性亲和纯化抗体

将待纯化的血清用上样缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸三钠，pH7.0)适当稀释后加入到Protein A柱中，用洗脱缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸钠，pH3.0)洗脱柱子，收集单峰。收集的纯化产物再经抗原抗体特异性亲和纯化，得到纯化的抗NGAL多克隆抗体(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体)(图5)，即NGAL重组蛋白的特异性多克隆抗体。将纯化后的抗体通过斑点杂交的方式鉴定其识别并结合抗原的能力(图6)

所述的抗原抗体特异性亲和纯化方法：NGAL抗原用buffer A(0.1mol/L碳酸氢钠，0.5mol/L氯化钠，pH 8.0)，按照0.5:1(buffer:sample)处理，将填料NHS-activated Sepharose 4FAST Flow装柱，室温下将NGAL重组蛋白偶联在柱上，经过纯化过量的抗原决定簇及大量清洗柱体后，备用。反复上样，保证特异性的抗NGAL抗体充分与柱结合，用100mol/L甘氨酸，pH 2.5洗脱，特异性抗体蛋白直接被洗脱收集入1mol/L Tris，pH 9.0，-20℃保存备用。

本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。

实施例5单克隆抗体在制备用于检测NGAL的诊断试剂中的应用

一双抗体夹心ELISA的建立

用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释所述NGAL单克隆抗体包被酶标板，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201262的杂交瘤细胞分泌或体内诱生法所得，100μl/孔，4℃过夜，用洗液(0.05％PBST，pH 7.4)洗3次；5％BSA封闭，200μl/孔，37℃孵育2h后洗3次；加入NGAL标准品(即实施例1所得纯化的NGAL重组蛋白)和待测血清样本，100μl/孔，标准品做倍比稀释。37℃孵育1h后洗3次；加入抗NGAL多抗(即实施例4所得抗NGAL多抗)，100μl/孔，37℃孵育1h后洗3次；再加入HRP标记的羊抗兔IgG(上海亿欣生物科技有限公司)，37℃孵育45min后用洗涤液(0.1％PBST，pH 7.4)洗6次；加TMB底物，100μl/孔，37℃显色10min，以2mol/L硫酸终止反应，在酶标板450nm处测吸光度值(OD₄₅₀)。

二ELISA最佳反应条件的确定

用棋盘滴定法确定各抗体的最佳工作浓度，将所述NGAL单克隆抗体(所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201262的杂交瘤细胞分泌或体内诱生法所得)按照1∶2000、1∶10000、1∶50000稀释3个浓度包被酶标板，阳性对照(0.5μg/ml NGAL重组蛋白为标准品)和阴性对照(PBS)为样品，多抗按1∶2000、1∶5000、1∶10000稀释3个浓度，HRP标记羊抗兔IgG按实际说明书推荐稀释度，按照上述实验步骤操作，确定抗体的最佳工作浓度。然后将HRP标记羊抗兔IgG倍比稀释，再次做棋盘滴定。阳性对照OD₄₅₀值在1.5左右，阴性对照OD₄₅₀值小于0.1的条件下为最佳，初次结果不理想，可进一步缩小或扩大稀释度以取得抗原抗体的最佳反应浓度。结果：在捕获抗体(所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201262的杂交瘤细胞分泌或体内诱生法所得)稀释度为1∶10000、夹心抗体(为实施例4所得抗NGAL兔多克隆抗体)的稀释度为1∶5000和所述HRP标记的羊抗兔igG稀释度为1∶5000条件下该ELISA检测方法的性价比最高。

实施例6急性肾损伤的诊断试剂

肾功能损伤过程中NGAL水平偏高，预后将可能发展成为急性肾功能衰竭。Bioporto Diadnostics的研究表明：健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布0.7-9.6ng/ml，平均值为5.3ng/ml；而血浆中的含量检测结果为37-106ng/mL，平均值为63ng/mL。当肾损伤后，NGAL水平将迅速陡增，随机检测重病患者，尿液NGAL的浓度为110ng/mL到40000ng/mL不等。根据急性肾衰竭患者检测的90％阳性预测值判断，尿液中NGAL的阳性判断值为350ng/mL，而血浆检测的阳性判断值为400ng/mL。运用实施例5中“二ELISA最佳反应条件的确定”提及的方法验证，结果和Bioporto Diadnostics的研究一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段，其特征在于：所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段，其特征在于：所述人NGAL的B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。

3.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段，其特征在于：所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段N末端引入半胱氨酸。

4.权利要求1-3任一项所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。

5.根据权利要求4所述的交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO：C201262。

6.权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段制备的特异性单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的特异性抗体，其特征在于：所述特异性抗体为所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

8.权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。

9.权利要求6所述的特异性抗体及特异性抗体的免疫复合物在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。

10.基于诊断急性肾损伤的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201262的杂交瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体。