CN101270161B - 抗人Reg4的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株 - Google Patents
抗人Reg4的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗人再生基因4(Regenrating gene 4)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸(即SEQ ID No.3所示核苷酸序列)编码的多肽具有特异性。本发明的有益效果主要体现在：提供了及一种抗人再生基因4(Regenratinggene 4)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为进一步明确Reg4在结直肠组织中的表达提供了基础，并可用于结直肠癌的早期检测试剂盒的制备，具有重要应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种抗人再生基因4(Regenrating gene 4，简称Reg4)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(二)背景技术
结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。早期诊断、早期治疗已被公认为改善结直肠癌疗效和预后的关键，其意义远大于任何一种治疗方案。绝大部分结直肠腺癌是由腺瘤癌变而来，如能及时发现并切除腺瘤，很可能会将发病率不断攀升的结直肠癌防范于未然，或使其治愈率得到根本的改观。但目前常用的结直肠肿瘤标志物，如CEA、TP53、K-RAS、CD95等，均存在特异性和灵敏度不能兼顾的问题，尤其在结直肠腺瘤和早期癌症患者中更是如此。为了寻找更理想，与结直肠癌发生、发展相关的新的肿瘤标志物，为协助结直肠癌的临床诊断，监视病情发展及判断预后提供新的手段，同时加深对结直肠癌发生的分子机制的认识，本实验室自1999年起利用抑制性差减杂交的方法来筛选结直肠肿瘤发生的相关基因，并利用同一病人的正常粘膜，腺瘤和腺癌建立了三个差减文库，即腺瘤相对于正常粘膜的差异片断文库(A-N)，腺癌相对于正常粘膜的差异片断文库(T-N)和腺癌相对于腺瘤的差异片断文库(T-A)。其中在A-N文库中筛选出一个未知基因，通过表达序列标签(EST)组装，BLAST搜索，发现该基因即2001年从炎症性肠病文库中发现的Reg4基因。在此基础上做了很多工作，积累了不少资料。其中RT-PCR，Northern blot和原位杂交的结果均显示Reg4在结直肠腺瘤和腺癌中的表达较配对的正常粘膜高，且在腺瘤癌变时表达最高，提示Reg4可能是腺瘤癌变的预警指标，是结直肠癌发生的早期分子标志。
Reg家族属于钙依赖的植物血凝素超家族，它代表一组分泌蛋白，主要作为急性期反应蛋白、促进生长、抗凋亡因子参与到损伤，炎症，糖尿病以及肿瘤发生过程中。Reg4是该家族的新成员，人们对其了解不很详尽。由于Reg4在Crohn病和溃疡性结肠炎中高表达，因此hartupee认为Reg4可能具有丝裂原和生长因子的作用。近年来随着研究的深入，Reg4在肿瘤尤其是消化道肿瘤中的作用日渐被重视。最近来自日本实验室的一篇文章报道Reg4在胰腺导管腺癌中高表达，并且发现Reg4具有促进细胞增殖的作用。同时也有研究表明Reg4在结直肠癌中表达上调。华盛顿大学一实验室研究发现Reg4可能是EGF受体/AKT/AP-1信号通路的激活物。但是作为一种新发现的基因，对Reg4的功能知之甚少，因此有必要对Reg4进行深入的研究。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种抗人再生基因4的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明采用的技术方案是：
一种抗人再生基因4的单克隆抗体，所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸(即SEQ ID No.3所示核苷酸序列)编码的多肽具有特异性。所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC No：C200728的细胞株分泌产生。本发明关键在于免疫抗原的确定，选择SEQID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸编码的多肽作为抗原，在已知抗原前提下，抗体可通过本领域熟知的技术方便的获得。
所述单克隆抗体对Reg4-his融合蛋白(分子量为17KD)具有反应性，所述Reg4-his融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述单克隆抗体为IgG1亚型，命名为Reg4-G7。
一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2007年10月1日，保藏编号CCTCC No：C200728。所述杂交瘤细胞株由免疫的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系Reg4-G7，能稳定分泌单克隆抗体Reg4-G7。
一种所述单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：用SEQ ID No.2所示Reg4-his融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸编码的多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。
所述Reg4-his融合蛋白由以下方法获得：将含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得Reg4-his包涵体，对Reg4-his包涵体进行纯化，得到所述的Reg4-his融合蛋白，本发明所指的IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D硫代半乳糖苷)可以诱导蛋白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应，是强诱导物。
具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到：
(1)免疫原的准备：将SEQ ID No.3所示核苷酸序列的pReceiver-B01-reg4载体转化BL21(DE3)pLysS大肠杆菌，在IPTG诱导下，分子量约17KD的Reg4-his以包涵体的形式存在。在本发明的一个优选实施方案中，以简便的方法对上述包涵体进行了纯化，并以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠；
(2)动物免疫：用上述纯化过的Reg4融合蛋白免疫BALB/c小鼠，以期产生针对Reg4蛋白的特异性单克隆抗体。每只小鼠以100ug的量进行背部皮下注射，每两周一次共三次，第四次冲击免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。
(3)杂交瘤细胞系的建立：取免疫小鼠的脾脏细胞作为能够产生抗体的浆细胞，与同系动物的骨髓瘤细胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG1500)介导进行融合。融合后细胞经HAT培养基选择性培养，以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性克隆。用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率为100％。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，直到细胞系能稳定分泌单克隆抗体。
(4)单克隆抗体的制备与纯化：将建系的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理的小鼠腹腔，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。
本发明还涉及所述的单克隆抗体在检测Reg4及其编码蛋白在人组织中分布及表达的应用。例如：通过免疫组化，免疫印迹，酶联免疫吸附试验检测Reg4蛋白；用抗人再生基因4单克隆抗体Reg4-G7，采用免疫组织化学染色法检测人全身各组织Reg4蛋白的表达及定位情况；用抗人再生基因4单克隆抗体Reg4-G7，采用免疫印迹法(Western-blot)检测单克隆抗体相应抗原在消化道正常及肿瘤组织中的表达。
为了进一步明确Reg4在结直肠组织中的表达情况，对大样本的结直肠正常粘膜、腺瘤以及腺癌配对组织进行了Real-time PCR、western-blot及免疫组化检测，试验结果表明Reg4在癌旁粘膜及腺瘤中高表达。以上结果均表明，Reg4具有作为一种结直肠癌早期诊断标志物的应用前景。因此，本发明还涉及所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、放射性标记物或酶标记物。所述检测试剂盒为结直肠癌早期检测试剂盒。例如，用抗人再生基因4单克隆抗体Reg4-G7，结合该蛋白的多克隆抗体，采用酶联免疫吸附反应检测大肠癌患者外周血中Reg4的水平。
本发明的有益效果主要体现在：提供了及一种抗人再生基因4(Regenrating gene 4)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为进一步明确Reg4在结直肠组织中的表达提供了基础，并可用于结直肠癌的早期检测试剂盒的制备，具有重要应用前景。
(四)附图说明
图1为Reg4融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE(PolyAcrylamide GelElectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶)图；1为包涵体蛋白；2为菌培养上清；3为菌体总蛋白；4为菌体超声后上清；5为marker；
图2为纯化后Reg4融合蛋白的SDS-PAGE图；1为marker；2～4均为Reg4融合蛋白；
图3为Reg4单抗纯化后SDS-PAGE图；
图4为纯化后的Reg4-G7单克隆抗体ELISA方法检测效价结果；
图5为Reg4-G7单克隆抗体经流式细胞术进行亚型鉴定；
图6为免疫印迹杂交检测Reg4-G7单克隆抗体特异性的结果；
图7为免疫组化法检测不同组织中Reg4的表达情况；
图8显示了大肠癌癌前病变腺瘤和溃疡性结肠炎中Reg4的表达情况。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：Reg4原核表达载体
含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的pReceiver-B01/Reg4质粒，由广州复能基因公司构建。
实施例2：Reg4-his融合蛋白的表达及纯化
(1)重组蛋白诱导：
挑取含有pReceiver-B01-reg4质粒的单克隆菌落，接种于100ml含有氯霉素，氨苄青霉素的2YT培养基，37℃220转震荡过夜。次日，以1∶100稀释到1000ml2YT培养基中，37℃培养至OD600介于0.5～1.0之间，加入IPTG，使其终浓度为1mM.。37℃继续培养5小时。4℃，10000rpm离心20分钟，收集沉淀并用PBS(Phosphate Buffer Solution)磷酸缓冲液洗涤，称量湿菌体的重量，本发明所用的IPTG来自德国Merck(Calbiochem)生产商。2YT培养基配方：Tryptone 16g，Yeast extract 10g，NaCl 5g，水1000ml，pH7.0；
(2)盐酸胍变性提取包涵体：
1)按4ml/100ml菌液(该菌液体积为IPTG诱导时的菌液体积)的比例加入PH8.结合缓冲液，重悬菌体。
2)按照每克湿菌加入40ul 10mM PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)，80ul 10mg/ml溶菌酶；
3)超声30分钟，每超声5秒，间隔5秒，在冰上操作；
4)4℃离心10000rpm，20分钟；
5)去上清，用1％triton X-100洗涤沉淀，离心10000rpm，10分钟；
6)去上清，用2M尿素洗涤沉淀，离心10000rpm，10分钟；
7)加入6M盐酸胍裂解菌体，冰上孵育1小时；
8)4℃离心10000rpm，20分钟，收集上清，-20℃冻存备用。
(3)Reg4-his融合蛋白纯化
1)将2ml Ni-NAT HIS.Binding Resin(购自美国Novagen公司)与6ml蛋白样品混合，固定在混合旋转仪上，在4℃条件下使之充分混合接触2小时；
2)以上述Ni-NAT HIS.Binding Resin与蛋白样品的混合液装柱；
3)用5个柱体积缓冲液1平衡镍柱，注意控制流速；
4)用5个柱体积50nM的咪唑洗脱液洗脱；
5)用5个柱体积400nM的咪唑洗脱液洗脱，并以1ml每管收集洗脱液；
6)用10个柱体积纯水过柱清洗；
7)用20％乙醇过柱，并将其4℃保存。
以考马氏亮蓝法初步判断所得纯化蛋白峰值管所在，并做SDS-PAGE进行蛋白鉴定。最后考马氏亮蓝法测定蛋白的准确浓度值。
Reg4融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE图见图1；1为包涵体蛋白；2为菌培养上清；3为菌体总蛋白；4为菌体超声后上清；5为marker。该图说明pReceiver-B01-reg4在1mM IPTG诱导5个小时后能稳定表达Reg4-his融合蛋白。融合蛋白以包涵体形式存在，其分子量约为17KD。纯化后Reg4-his融合蛋白的SDS-PAGE图见图2；1为marker；2～4均为纯化后的Reg4-his融合蛋白。该图说明通过亲和层析纯化方法获得了较纯的Reg4-his融合蛋白。
实施例3：抗血清的制备
用含纯化的50mgReg4-his蛋白与等体积完全弗氏佐剂充分混匀，使其乳化，以形成油包水状为混合成功的标志。取雌性6-8周龄的BALB/c小鼠，于背部皮下多点注射，进行初次免疫。两周后以等体积的不完全代替弗氏佐剂与50mgReg4-his蛋白进行乳化，加强免疫BALB/c小鼠，此后每隔两周加强免疫一次。加强免疫3次后，小鼠眼眶采血并分离血清，以间接ELISA法测定效价，当达到10-4后准备融合。融合前三天加强免疫一次。
实施例4：单克隆抗体的制备
1、饲养细胞铺板
取一只16周龄的BALB/c小鼠，将其拉颈处死后，75％酒精浸泡消毒。打开其腹腔，取饲养细胞，铺板，37℃孵箱培养，备用次日。
2、免疫后的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合
无菌条件下取免疫后的BALB/c小鼠脾脏，剥离包膜使细胞游离，过100目钢丝网，收集滤过的脾细胞。将生长状态好，处于对数生长期的SP2/0细胞与脾细胞混合，比例为1∶10，以50％的PEG(分子量为1500)为介导进行融合，离心后用HAT培养基重悬细胞，并用该含有细胞的HAT培养基铺96孔板，每孔2滴。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。融合后第3天用HAT培养基半量换液，第五天、第七天分别半量换液一次。两周后换HT培养基。
HT培养基的配制方法：将100倍浓缩的HT液体(1mL)及100倍浓缩的谷氨酰胺稀(1mL)释入1640培养基(98mL，美国GIBCO公司)HAT培养基的配制方法：将100倍浓缩的HT液体(1mL)、100倍浓缩A液体(1mL)及100倍浓缩的谷氨酰胺(1mL)稀释入1640培养基(97mL)。
100倍浓缩的HT液配制方法：称取136.1mg次黄嘌呤(hypoxanthine，H)，38.8mg胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，逐次溶解在100ml双蒸水中。过滤除菌，分装，储存于-20℃。
100倍浓缩的A液配制方法：称取1.76mg氨基喋呤(aminopterin，A)，加入90ml双蒸水，滴加1mol/L NaOH溶液，不断摇动直至氨基喋呤完全溶解，再滴加等量1mol/L盐酸溶液，恢复pH值至7.0左右，双蒸水补足溶液至100ml，过滤除菌，分装，储存于-20℃。
100倍浓缩的谷氨酰胺的配置方法：称取2.92g L-谷氨酰胺溶于100ml双蒸水中，过滤除菌，分装，储存于-20℃。
所用的次黄嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷和L-谷氨酰胺均来自sigma公司。
3、杂交瘤细胞筛选
观察杂交瘤细胞的生长情况，当克隆生长至孔底面积的1/3～1/2时，取上清100ul，用间接ELISA方法进行检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，四次后克隆化细胞抗体阳性率为100％。将阳性克隆细胞进行进一步扩大培养。杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上，反复冻存，复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。
实施例5：单克隆抗体的大量生产及纯化
1、选用12周龄以上的BALB/c小鼠，腹腔注射1ml液体石蜡，一周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞，每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。7～10天后小鼠腹部可见明显膨隆，收集腹水。3000rpm离心5分钟，取上清，分装，-20℃保存。用饱和硫酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用ProteinA亲和层析法将其进一步纯化，Reg4单抗纯化后的SDS-PAGE图见图3。该图显示了抗体的轻链及重链聚合体，初步证明前述步骤收获了纯度较高的抗体。
2、抗人Reg4单克隆抗体Reg4-G7腹水效价及亚型鉴定
用间接ELISA方法，检测纯化后单克隆抗体的效价为1∶10-4(结果见图4)。
收集杂交瘤细胞，用流式细胞术检测抗体的亚型(所用试剂盒购买自Southembiotech公司货号为Cat5500-01)，亚型为IgG1型，轻链为κ型(结果见图5)。
图6为免疫印迹杂交检测Reg4-G7单克隆抗体特异性的结果，显示19KD下方约17KD处出现条带，证明该抗体特异性佳。
实施例6：Reg4蛋白在人体组织中的分布及表达
Envision加强法免疫组织化学染色：
(1)脱蜡水化：将烘干的切片依次置于：
二甲苯三道 每道15分钟
100％酒精 5分钟
90％酒精 5分钟
75％酒精 5分钟
50％酒精 5分钟
取出切片，用0.01M，pH7.4PBS(Phosphate Buffer Solution)磷酸缓冲液洗涤3次，每次10分钟。
(2)阻断内源性过氧化物酶：将脱蜡水化后的切片置于3％的过氧化氢甲醇中15分钟。
(3)PBS洗涤3次，每次5分钟。
(4)抗原修复：将切片置于盛有0.01M，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液的容器中，进行微波修复(80火力8分钟，60火力6分钟两次)。
(5)取出后室温自然冷却，PBS洗涤3次，每次5分钟。
(6)根据抗体需要以血清对组织进行封闭。
(7)滴加Reg4-G7(1∶800稀释)，置4℃冰箱中过夜。
(8)第二日取出玻片以PBS洗涤3次，每次5分钟。
(9)滴加抗鼠二抗，室温下孵育40分钟。
(10)PBS洗涤3次，每次5分钟。
(11)每张切片滴加新配制的DAB(3，3’-diaminobenzidine，二氨基联苯胺)显色液，光学显微镜下观察3～5分钟，以出现特异性的细胞着色为显色成功。DAB显色液的配置方法为：称取0.003gDAB，溶于5mlPBS中，加入3.5ul过氧化氢溶液，过滤。本发明所用的DAB粉剂购买自sigma公司。
(12)流水冲洗30分钟终止显色。
(13)苏木素复染胞核：将上述冲洗干净的玻片置于苏木素液中20-30秒，取出后自来水冲洗蓝化。
(14)切片脱水：依次经梯度酒精脱水干燥。
(15)二甲苯透明5分钟。
(16)封片：每片滴加中性树胶，覆盖以盖玻片，光学显微镜下观察结果。
(17)阴性对照以PBS代替一抗。
全身组织Reg4免疫组织化学结果显示，Reg4在胃肠道中的表达较特异，另外在个别甲状腺癌中也有表达。图7为Reg4在正常大肠(A)及甲状腺癌(B)中的表达。该结果说明Reg4表达具有胃肠道相对特异性。
图8为大肠癌癌前病变腺瘤和溃疡性结肠炎中的表达情况，结果显示Reg4在结直肠癌癌前病变中有高表达趋势，由此可见，Reg4对于结直肠癌早期诊断可能具有重要价值。
实施例7：
双抗夹心ELISA法检测结直肠癌患者与正常人群外周血中Reg4蛋白水平
1.用稀释后Reg4多克隆抗体包被酶标板，4℃过夜；
2.弃去孔内液体，PBST洗涤3次，每次3分钟；
3.加入待测血清，37℃，湿盒，孵育2小时；
4.弃去孔内液体，PBST洗涤3次，每次3分钟；
5.加入10％小牛血清37℃封闭30分钟；
6.弃去孔内液体，PBST洗涤3次，每次3分钟；
7.加入稀释后的Reg4-G7单克隆抗体，37℃，湿盒，孵育2小时；
8.弃去孔内液体，PBST洗涤3次，每次3分钟；
9.加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗，37℃，湿盒，孵育1小时；
10.分别加入TMB(Tetramethylbenzidine，四甲基联苯胺)显色液A和B液；
11.避光显色3～5分钟后，加入终止液；
12.用酶标仪读取吸光度值。
包被缓冲液配方：Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
ddH2O定容至1L，pH调节至9.6
2)PBST配方：在PBS中加入0.05％tween20(购自上海生工)及1％小牛血清；
3)显色液配方：
A：TMB(TMB.2HCl)20mg，无水乙醇10ml，溶解后加ddH2O定容至100ml；
B：NaAc-HAc缓冲液，1.36g NaAc.3H2O，HAc调pH值5.4～5.6，0.004％过氧化尿素(过碳酰胺)用时1∶1混合，每孔100ul；
4)终止液：2M H2SO4
建立了标准曲线，检测了健康人群及结直肠癌患者外周血中的Reg4蛋白，初步结果显示，Reg4蛋白在164例结直肠癌患者的外周血中有80例为阳性，而在124例健康人群外周血中，仅有5例为阳性，Reg4蛋白在结直肠癌患者中的水平明显增高，因此结合其他临床病例资料，以Reg4作为结直肠癌早期诊断指标具有很大的潜力。
序列表_ST25
SEQUENCE LISTING
Claims (2)
1.一种抗人再生基因4的单克隆抗体，所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸编码的多肽具有特异性，所述的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC No：C200728的细胞株分泌产生。
2.一种产生如权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏日期2007年10月1日，保藏编号CCTCC No：C200728。
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