CN108795880B - 产生人胸苷激酶1（tk1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

产生人胸苷激酶1（tk1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种TK1特异性单克隆抗体、制备方法及其在制备TK1免疫检测试剂中的应用。本发明通过杂交瘤技术，制备了杂交瘤细胞株1D3和2F6，分泌人TK1特异性单克隆抗体。两株抗体能进行配对和检测TK1蛋白，初步建立了检测人TK1的双抗体夹心ELISA方法。

Description

产生人胸苷激酶1（TK1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞 株及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，并且更具体地，涉及到两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种TK1特异性单克隆抗体、制备方法及其应用。
背景技术
胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1），也称为细胞质胸苷激酶，是线粒体胸苷激酶（又称肌苷激酶2，thymidine kinase 2，TK2）的同工酶。TK1催化胸苷（TdR）磷酸化为胸苷一磷酸（TMP），进而形成的胸苷三磷酸（TPP），为DNA合成提供必需的脱氧核苷酸原料，是DNA合成的关键酶之一。
TK1的表达与多种肿瘤细胞增殖紧密相关。在肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、骨肉瘤和前列腺癌等多种癌细胞中TK1表达水平不同程度升高。因此TK1表达水平能直观反映肿瘤细胞增殖速率，可实现动态、连续和评估，是一种是国际公认的优选肿瘤广谱标志物。目前认为，TK1检测的临床应用价值体现在：①动态监控手术放化疗效果；②独立的肿瘤预后评估因子；③更早评估肿瘤复发风险；④评估各类增殖疾病恶变风险。另外TK1检测在健康体检方面也有较好的应用价值，包括：①早期发现体内的恶性增殖状况，具有早期性；②筛查出进展期癌前病变，预防肿瘤发生。
有相关流行病学调查结果表明，人体外周血中TK1浓度在2 pM以下提示体内细胞增殖度正常；若在2 pM以上，则提示体内存在细胞异常增殖，包括炎症、脂肪肝、胆结石、乳腺增生、前列腺增生、消化道溃疡、肿瘤等，需要予以关注、进一步全面检查或者定期复查等。
目前临床和科研工作中对TK1的检测包括检测组织切片中的TK1和检测外周血中的TK1。前者通过免疫组化的方式实现，后者则通过各种免疫学检测方法实现，包括固相酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫化学发光等，其中酶免疫点印迹化学发光法，可以实现对外周血、细胞培养上清等标本中的TK1的高灵敏度、高特异性定量分析，应用尤为广泛。
无论是基于免疫组化的定性/半定量分析，还是基于ELISA和免疫化学发光的定性/定量分析，都离不开高质量的TK1特异性抗体。目前行业内应用的TK1特异性抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，前者主要是来自鸡的IgY，后者主要是来自于小鼠的IgG；从免疫原性方面，主要是应用TK1蛋白中的免疫原性多肽（表位肽），包括羧基端的多肽和氨基端的多肽，免疫鸡或者小鼠得到抗体；部分抗体是应用全长的TK1蛋白作为免疫原，但这些TK1蛋白均为体外原核重组表达而成。至于以体外真核重组表达的全长TK1蛋白作为免疫原制备的TK1特异性抗体尚未见报道。
根据生物信息学分析，人TK1蛋白中存在较多的糖基化、磷酸化和乙酰化等翻译后修饰靶点，这就导致了原核重组表达的TK1与真核表达的TK1在分子组成、分子结构上存在一定差异。因此，采用真核重组表达TK1蛋白，更好地代表真核细胞中TK1的天然分子状态，将其作为免疫原免疫动物，制备抗体，将有利于提升抗体制备的效率、抗体识别天然TK1蛋白的特异性和亲和力。
发明内容
本发明针对上述问题，目的在于提供两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种TK1特异性单克隆抗体、制备方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明公开了两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1D3）和（2F6），其分别于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018106；于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018105。保藏地址为：中国武汉武汉大学。
另一方面，本发明实施例还公开了采用上述两种杂交瘤细胞株产生的两种TK1特异性单克隆抗体。
第三方面，本发明实施例还公开了上述的杂交瘤细胞株的制备方法，其由纯化的真核重组表达的全长人TK1蛋白免疫小鼠后，小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养、筛选得到。
进一步地，所述筛选采用间接ELISA法和细胞克隆化。
第四方面，本发明实施例还公开了一种针对TK1的ELISA检测方法，其以上述的1D3产生的单克隆抗体为捕获抗体，以2F6产生的单克隆抗体为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA体系。
进一步地，该方法包括：
（1）采用HRP标记以2F6产生的TK1特异性单克隆抗体；
（2）以1D3产生的TK1特异性单克隆抗体作为捕获抗体，TK1校准品为测定对象，进行标本检测；
（3）制作校准曲线，根据校准曲线确定样本中的TK1含量。
第五方面，本发明实施例还公开了上述的杂交瘤细胞株、TK1特异性单克隆抗体在制备TK1免疫检测试剂中的应用。
第六方面，本发明实施例还公开了一种检测人TK1的试剂盒，其包括上述两种TK1特异性单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
（1）本发明制备了能产生TK1特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株：构建人TK1真核表达质粒，在CHO细胞中表达TK1；用纯化的TK1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠，通过改良杂交瘤技术进行细胞融合，利用间接ELISA法进行筛选，克隆化筛选出能稳定分泌抗TK1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；小鼠腹水诱生法生产单克隆抗体，进行抗体效价和特异性鉴定。
（2）建立TK1的ELISA检测体系：利用已制备的TK1特异性单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以TK1作为目标抗原，进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，获得能检测TK1的抗体配对；以此为基础建立了检测TK1的双抗体夹心ELISA方法。
（3）本发明通过杂交瘤技术，制备了杂交瘤细胞株1D3和2F6，分泌人TK1特异性单克隆抗体。两株抗体能进行配对和检测TK1蛋白，初步建立了检测人TK1的双抗体夹心ELISA方法。
附图说明
图1 为基于新制备的人TK1单克隆抗体建立的ELISA方法检测重组TK1蛋白的校准曲线；
图2 为基于新制备的人TK1单克隆抗体建立的ELISA方法与市售的ELISA检测试剂盒“人可溶性胸苷激酶1(TK1) ELISA Kit”（购自武汉华美生物）检测临床血清标本结果比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
材料和来源
实验动物：Balb/C小鼠购自重庆医科大学实验动物中心（中国重庆）。
细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
HRP-山羊抗小鼠IgG购自北京中山公司。
纯化柱和填料购自美国GE公司。
其余试剂均为国产分析纯试剂。
实施例1 人TK1蛋白的真核重组表达
（1）人TK1真核表达载体的构建
根据美国NCBI网站中提供的信息（NM_003258.4），编码人TK1蛋白的DNA序列（5’—3’）如下（SEQ ID NO：1）：
Atgagctgcattaacctgcccactgtgctgcctggctcccccagcaagacccgggggcagatccaggtgattctcgggccgatgttctcaggaaaaagcacagagttgatgagacgcgtccgtcgcttccagattgctcagtacaagtgcctggtgatcaagtatgccaaagacactcgctacagcagcagcttctgcacacatgaccggaacaccatggaggcactgcccgcctgcctgctccgagacgtggcccaggaggccctgggcgtggctgtcataggcatcgacgaggggcagtttttccctgacatcgtggagttctgcgaggccatggccaacgccgggaagaccgtaattgtggctgcactggatgggaccttccagaggaagccatttggggccatcctgaacctggtgccgctggccgagagcgtggtgaagctgacggcggtgtgcatggagtgcttccgggaagccgcctataccaagaggctcggcacagagaaggaggtcgaggtgattgggggagcagacaagtaccactccgtgtgtcggctctgctacttcaagaaggcctcaggccagcctgccgggccggacaacaaagagaactgcccagtgccaggaaagccaggggaagccgtggctgccaggaagctctttgccccacagcagattctgcaatgcagccctgccaactga（最后3个碱基为终止密码子）
设计并合成引物，在TK1的5’加上Kozark序列（SEQ ID NO：2）：GCCACCATGG和信号肽mIgκ序列（SEQ ID NO：3）：ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC，在TK1的3’端终止密码子之前加上6×His 标签的编码序列（SEQ ID NO：4）：CATCATCATCATCATCAT。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
从乳腺癌细胞株MCF-7（购自NTCC典型培养物保藏中心）中应用细胞总RNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）提取总RNA，常规进行反转录（RT试剂购自北京天根生化科技有限公司），以合成的人TK1 PCR引物，常规进行PCR（试剂盒为Invitrogen公司的pcDNA™ 3.4-TOPO® TA Cloning Kit，Taq酶为Invitrogrn公司的Platinum™ Taq DNAPolymerase High Fidelity），对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收（DNA胶回收试剂盒购自购自北京天根生化科技有限公司）。
将回收的PCR产物亚克隆入真核表达载体pcDNA3.4（试剂盒为Invitrogen公司的pcDNA™ 3.4-TOPO® TA Cloning Kit）中（按照试剂盒说明书操作），挑取细菌克隆，常规培养，小量提取质粒（试剂盒购自北京天根生化科技有限公司），送上海英骏生物技术有限公司进行DNA测序，正向测序引物和反向测序引物参见Invitrogen公司的pcDNA™ 3.4-TOPO® TA Cloning Kit说明书。
选取测序结果正确的质粒pcDNA3.4-TK1进行TK1的真核表达。插入载体pcDNA3.4中的DNA片段序列（5’—3’）（SEQ ID NO：5）为：
GCCACCATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACatgagctgcattaacctgcccactgtgctgcctggctcccccagcaagacccgggggcagatccaggtgattctcgggccgatgttctcaggaaaaagcacagagttgatgagacgcgtccgtcgcttccagattgctcagtacaagtgcctggtgatcaagtatgccaaagacactcgctacagcagcagcttctgcacacatgaccggaacaccatggaggcactgcccgcctgcctgctccgagacgtggcccaggaggccctgggcgtggctgtcataggcatcgacgaggggcagtttttccctgacatcgtggagttctgcgaggccatggccaacgccgggaagaccgtaattgtggctgcactggatgggaccttccagaggaagccatttggggccatcctgaacctggtgccgctggccgagagcgtggtgaagctgacggcggtgtgcatggagtgcttccgggaagccgcctataccaagaggctcggcacagagaaggaggtcgaggtgattgggggagcagacaagtaccactccgtgtgtcggctctgctacttcaagaaggcctcaggccagcctgccgggccggacaacaaagagaactgcccagtgccaggaaagccaggggaagccgtggctgccaggaagctctttgccccacagcagattctgcaatgcagccctgccaacCATCATCATCATCATCATTGA（5’端大写部分为Kozark序列和信号肽编码序列，中间小写部分为人TK1的编码序列，3’端大写部分为6×His 标签编码序列和终止密码子）。
质粒pcDNA3.4-TK1所编码的成熟蛋白氨基酸序列（N端—C端，不含信号肽）（SEQID NO：6）为：
MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPANHHHHHH（其中C端的6个H为6×His标签）
应用试剂盒Invitrogen公司的PureLink™ HiPure Plasmid FP (Filter andPrecipitator) Maxiprep Kit，按照说明书操作，常规大量提取质粒pcDNA3.4-TK1备用，确保制备的质粒产物无菌。
（2）人TK1的真核重组表达
应用高效真核表达系统Expi293F™Expression System Kit （购自LifeTechology公司）进行人TK1的真核表达，按照说明书操作，简述如下：
使用70%乙醇常规清洁细胞冻存管后，于超净工作台中，快速融化细胞，将管中293F细胞全部转入容量为125mL的细胞培养瓶中，瓶中含有29mL预温的细胞培养基（试剂盒自带的Expi293™ Expression Medium）。
常规细胞计数和台盼蓝拒染法判断细胞的活率，要求细胞数在0.3×106/mL，细胞活率超过90%。
旋转培养细胞，条件为温度37℃，饱和湿度，CO2浓度8%，水平旋转速度125r/m。
培养约3天，细胞数超过1×106/mL，用细胞培养基Expi293™ Expression Medium稀释，细胞密度约为0.4×106/mL，容积为125mL的锥形培养瓶，培养体积不超过50mL，培养条件同上，常规培养。
每3～4天，细胞密度达到4×106/mL，同上稀释细胞至约为0.4×106/mL，继续培养。
进行转染时，于容积为125mL的锥形细胞培养瓶中，加入细胞培养基Expi293™Expression Medium 25.5mL，加入状态良好的293F细胞总量7.5×107，细胞密度为2.9×106/mL；用试剂盒自带的低血清培养基（Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium）稀释30μg质粒pcDNA3.4-TK1至1.5mL，混匀；用Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium培养基稀释81μl转染试剂（试剂盒自带的ExpiFectamine™ 293 Reagent）至1.5mL，室温孵育5min；将稀释后的质粒和稀释后的转染试剂混合，混匀，室温孵育20min；将该混合物转入细胞培养瓶中，总体积为28.5mL；按照上述方法进行旋转培养。
培养20小时后，往细胞培养瓶中加入150μl增强剂1（试剂盒自带的ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancer 1）和1.5mL增强剂2（试剂盒自带的ExpiFectamine™ 293Transfection Enhancer2），总体积为30mL，按照上述方法常规培养。
培养10天，收集细胞，离心，收集细胞培养上清。
（3）人TK1的纯化
由于在重组表达的人TK1蛋白羧基端带有6×His标签，可以应用镍柱通过亲和层析纯化目标蛋白，操作过程简述如下：
含有重组表达TK1蛋白的细胞培养上清经0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
用His-Binding buffer (20 mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，pH7.4，分析纯) 按照1:9的比例稀释滤液。
稀释液上HisTrap HP 层析柱（GE Healthcare），His-Binding buffer平衡后用His-Elution buffer (20 mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，0.5M 咪唑 pH7.4，分析纯) 先10% B洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100% B将目的蛋白洗下。收集洗脱液。
通过SDS-PAGE加上考马斯亮蓝染色鉴定产品的纯度，用BCA法（试剂购自碧云天生物）进行蛋白定量测定，SDS-PAGE法鉴定产品的纯度。
实施例2 TK1特异性单克隆抗体的制备
(1) TK1单克隆抗体的制备
将纯化的TK1与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对4只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫（100μg/mL，每只小鼠200μl）。2周后，将TK1与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫（100μg/mL，每只小鼠200μl）；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后处死小鼠取出小鼠脾脏，将脾细胞进行细胞融合。
融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0）以8:1混合，以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置于6% CO2中在37℃培养。
用间接ELISA法进行筛选。筛选时，重组表达的人TK1为筛选原包被酶标板，封闭后加入各杂交瘤细胞培养上清，孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（购自北京中山生物技术有限公司），孵育后洗涤，加入底物TAB（购自北京中山生物技术有限公司）显色。对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于6% CO2中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行杂交瘤细胞的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液体石蜡0.5 mL，1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×105个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL杂交瘤细胞。10～14天后收集腹水。
(2) TK1单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行纯化，具体方案简述如下。配制抗体纯化所需缓冲液（所用试剂均为分析纯）：结合缓冲液（A液)）20 mmol/L磷酸钠，0.8 mol/L (NH4)2SO4，pH 7.5；洗脱缓冲液（B液） 20 mmol/L 磷酸钠，pH 7.5；再生缓冲液（C液） 20 mmol/L磷酸钠，pH 7.5，并按体积比30%加入异丙醇。在含有单克隆抗体的腹水中加入硫酸铵，使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致，0.45 μm滤膜过滤等待上样；选用HiTrap IgG Purification HP柱（购自GE Healthcare）接入AKTA prime蛋白纯化仪，先后A、B液和C液对柱子进行充分洗涤；用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7.0～8.0，将抗体分装冷冻于-20℃保存；用再生缓冲液对填料进行再生，然后用结合缓冲液进行平衡。
(3) ELISA鉴定抗TK1单克隆抗体
将纯化的重组TK1抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/mL，酶标板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入1:3000 HRP标记山羊抗小鼠IgG（酶标二抗），按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40 min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。在450nm 处测定吸光度值。
（4）抗TK1单克隆抗体的免疫印迹鉴定
①将蛋白质分子量marker 3 μl、TK1抗原20 μl、相关对照抗原20 μl行SDS-PAGE。
②电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10 min。
③将0.22 μm PVDF膜先用无水甲醇处理20 s，再用ddH2O洗涤5 min。然后再浸入Transfer Buffer超过5 min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。
④转膜：从下至上依次排列：滤纸—PVDF膜—胶—滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18V恒压电转移1.5 h。
⑤转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH2O清洗两遍，TBST洗5 min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2 h。
⑥弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每次15 min。
⑦加入以1:1000稀释的纯化抗体，4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次，每次15 min。
⑧加入已按照1:10000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育3h。
⑨1×TBST洗涤3次，每次15 min。
⑩用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在TK1对应分子量处可见TK1特异性单克隆抗体结合的清晰条带。
实施例3双抗体夹心ELISA法检测TK1
（1）HRP标记抗体（所用试剂均为分析纯）
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下：
①HRP酶的准备：称取10 mg HRP酶，加2 mL纯水配置为5 mg/mL的HRP液体，按照每mg HRP酶加入34 µL计算，加340 µL NaIO4，4℃避光放置，1 h后，按照每mg HRP酶加入250µL的量加入乙二醇250µL，避光放置4℃，30 min后转入透析袋中，用1 mM醋酸缓冲液（pH 4.0～4.4）透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。
②抗体的准备：0.01 M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜，并测定蛋白浓度。
③标记：抗体与HRP酶按1:1（质量比）混合，加入1 mol/L Na2CO3缓冲液（1:80），调节反应的pH为9.5，25℃反应2～3 h。
④终止：新鲜配制0.1 mol/L NaH4B（4 mg/mL），按照每mg HRP酶加入47 μL。4℃放置2 h后，转入透析袋。用0.01 mol/L PBS缓冲液（pH7.0～7.2）透析过夜，期间至少换液两次，避光。
⑤分装保存：标记好的抗体用棕色EP管分装，并测定抗体效价。-20℃避光保存。
(2) 抗体配对及校准曲线的制备
①抗体配对：选取单克隆抗体1D3作为捕获抗体，HRP标记单克隆抗体2F6作为检测抗体，TK1校准品为测定对象。
②包被酶标板：用包被液将抗体稀释为5 μg/mL，每孔加100 μL， 4℃包被过夜。
③将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。
④封闭：每孔加封闭液350 μL，37℃孵育1 h，洗涤3遍，甩干。
⑤用抗体稀释液将TK1校准品从50 μg/mL开始倍比稀释，每孔加100 μL，第一孔为空白对照，做校准曲线。
⑥洗板3遍，甩干。
⑦将相对应的酶标二抗以1:5000稀释，每孔加入100 μL，37℃孵育30 min。
⑧洗板5遍，甩干。
⑨每孔加入100 μL底物显色液，室温避光显色5 min。
⑩每孔加入50 μL终止液，450 nm处读取吸光度值，以重组TK1的浓度为横坐标，相应的450nm处吸光度为纵坐标，制作校准曲线（如图1所示）。
实施例4
采用本发明实施例新制备的人TK1单克隆抗体建立的ELISA检测方法，与市售的ELISA检测试剂盒“人可溶性胸苷激酶1(TK1) ELISA Kit”（购自武汉华美生物）检测临床收集血清标本并比较检测结果。
①标本收集：从重庆肿瘤医院收集临床血清标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，离心取上清后做好标记分装于1.5 mL Ep管中，-80℃保存，并将相关信息录入电脑，作好编号。
②按照实施例3所描述的方法建立ELISA体系，并制备校准曲线。
③按照实施例3所描述的方法测定临床收集标本，每份血清标本添加100 μL，根据校准曲线计算各标本中TK1的浓度。
④采用市售的ELISA检测试剂盒“人可溶性胸苷激酶1(TK1) ELISA Kit”（购自武汉华美生物）检测临床收集血清标本，按照说明书操作，计算各标本中TK1的浓度。
⑤以市售试剂盒的检测结果为横坐标（对照方法），新建方法检测结果为纵坐标（新建方法），制作散点图，比较两种方法的检测结果（图2，图中每个圆点代表一个标本，圆点所在的横坐标为对照方法的检测结果，圆点所在的纵坐标代表新建方法的检测结果）。
综上所述，本发明实施例以纯化真核重组表达的全长人TK1蛋白免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术进行细胞融合，利用间接ELISA法和细胞克隆化操作筛选出能稳定分泌人TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，收集腹水经HiTrapIgG Purification HP亲和层析柱纯化，对所得的单克隆抗体进行效价测定和亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3和2F6，ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
本发明实施例建立了针对TK1的ELISA检测方法：以TK1特异性抗体1D3为捕获抗体，2F6为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA体系，能够准确检测标本中的TK1，并以此成功建立了检测人TK1的双抗体夹心ELISA方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110> 重庆探生科技有限公司
<120> 产生人胸苷激酶1（TK1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株及其应用
<141> 2018-06-13
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagctgca ttaacctgcc cactgtgctg cctggctccc ccagcaagac ccgggggcag 60
atccaggtga ttctcgggcc gatgttctca ggaaaaagca cagagttgat gagacgcgtc 120
cgtcgcttcc agattgctca gtacaagtgc ctggtgatca agtatgccaa agacactcgc 180
tacagcagca gcttctgcac acatgaccgg aacaccatgg aggcactgcc cgcctgcctg 240
ctccgagacg tggcccagga ggccctgggc gtggctgtca taggcatcga cgaggggcag 300
tttttccctg acatcgtgga gttctgcgag gccatggcca acgccgggaa gaccgtaatt 360
gtggctgcac tggatgggac cttccagagg aagccatttg gggccatcct gaacctggtg 420
ccgctggccg agagcgtggt gaagctgacg gcggtgtgca tggagtgctt ccgggaagcc 480
gcctatacca agaggctcgg cacagagaag gaggtcgagg tgattggggg agcagacaag 540
taccactccg tgtgtcggct ctgctacttc aagaaggcct caggccagcc tgccgggccg 600
gacaacaaag agaactgccc agtgccagga aagccagggg aagccgtggc tgccaggaag 660
ctctttgccc cacagcagat tctgcaatgc agccctgcca actga 705
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccaccatgg 10
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagtcag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gac 63
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catcatcatc atcatcat 18
<210> 5
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccaccatgg agtcagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60
actggtgaca tgagctgcat taacctgccc actgtgctgc ctggctcccc cagcaagacc 120
cgggggcaga tccaggtgat tctcgggccg atgttctcag gaaaaagcac agagttgatg 180
agacgcgtcc gtcgcttcca gattgctcag tacaagtgcc tggtgatcaa gtatgccaaa 240
gacactcgct acagcagcag cttctgcaca catgaccgga acaccatgga ggcactgccc 300
gcctgcctgc tccgagacgt ggcccaggag gccctgggcg tggctgtcat aggcatcgac 360
gaggggcagt ttttccctga catcgtggag ttctgcgagg ccatggccaa cgccgggaag 420
accgtaattg tggctgcact ggatgggacc ttccagagga agccatttgg ggccatcctg 480
aacctggtgc cgctggccga gagcgtggtg aagctgacgg cggtgtgcat ggagtgcttc 540
cgggaagccg cctataccaa gaggctcggc acagagaagg aggtcgaggt gattggggga 600
gcagacaagt accactccgt gtgtcggctc tgctacttca agaaggcctc aggccagcct 660
gccgggccgg acaacaaaga gaactgccca gtgccaggaa agccagggga agccgtggct 720
gccaggaagc tctttgcccc acagcagatt ctgcaatgca gccctgccaa ccatcatcat 780
catcatcatt ga 792
<210> 6
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Cys Ile Ala Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ala Gly Gly Ile Gly Val Ile Leu Gly Pro Met Pro Ser Gly Leu
20 25 30
Ser Thr Gly Leu Met Ala Ala Val Ala Ala Pro Gly Ile Ala Gly Thr
35 40 45
Leu Cys Leu Val Ile Leu Thr Ala Leu Ala Thr Ala Thr Ser Ser Ser
50 55 60
Pro Cys Thr His Ala Ala Ala Thr Met Gly Ala Leu Pro Ala Cys Leu
65 70 75 80
Leu Ala Ala Val Ala Gly Gly Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Pro Pro Pro Ala Ile Val Gly Pro Cys Gly Ala Met
100 105 110
Ala Ala Ala Gly Leu Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Ala Gly Thr Pro
115 120 125
Gly Ala Leu Pro Pro Gly Ala Ile Leu Ala Leu Val Pro Leu Ala Gly
130 135 140
Ser Val Val Leu Leu Thr Ala Val Cys Met Gly Cys Pro Ala Gly Ala
145 150 155 160
Ala Thr Thr Leu Ala Leu Gly Thr Gly Leu Gly Val Gly Val Ile Gly
165 170 175
Gly Ala Ala Leu Thr His Ser Val Cys Ala Leu Cys Thr Pro Leu Leu
180 185 190
Ala Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Ala Ala Leu Gly Ala Cys Pro Val
195 200 205
Pro Gly Leu Pro Gly Gly Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ala Pro
210 215 220
Gly Gly Ile Leu Gly Cys Ser Pro Ala Ala His His His His His His
225 230 235 240

Claims (1)

1.一种针对TK1的ELISA检测方法，其特征在于，以由保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018106的杂交瘤细胞株产生的TK1特异性单克隆抗体为捕获抗体，以由保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018105的杂交瘤细胞株产生的TK1特异性单克隆抗体为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA体系；
其中，还包括：
（1）采用HRP标记由保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018105的杂交瘤细胞株产生的TK1特异性单克隆抗体；
（2）选取由保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018106的杂交瘤细胞株产生的TK1特异性单克隆抗体作为捕获抗体，TK1校准品为测定对象，进行标本检测；
（3）制作校准曲线，根据校准曲线确定样本中的TK1含量。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110346569A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 安徽恩禾生物技术有限公司 一种胸苷激酶化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CN113773389B (zh) * 2020-06-10 2022-08-30 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体及其制药用途
CN112646039B (zh) * 2021-01-06 2022-07-22 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 Tk1抗体、试剂盒及其用途
CN113533726A (zh) * 2021-07-13 2021-10-22 深圳上泰生物工程有限公司 用于检测胸苷激酶1的试剂盒及其应用
CN114107339B (zh) * 2021-12-09 2024-06-07 菏泽学院 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186922A (zh) * 2007-12-21 2008-05-28 丁克祥 一种基因免疫制备人类ⅰ型胸苷激酶单克隆抗体的新方法
CN106556592A (zh) * 2015-09-24 2017-04-05 深圳市安群生物工程有限公司 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186922A (zh) * 2007-12-21 2008-05-28 丁克祥 一种基因免疫制备人类ⅰ型胸苷激酶单克隆抗体的新方法
CN106556592A (zh) * 2015-09-24 2017-04-05 深圳市安群生物工程有限公司 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Thymidine Kinase 1 ( TK1) 重组蛋白的表达、纯化及鉴定;王云龙;《中国生物工程杂志》;20171231;第37卷(第9期);第15-22页 *
血清胸苷激酶1在中老年人肿瘤免疫监测中的作用;张国庆;《现代肿瘤医学》;20050531;第16卷(第5期);第831-832页 *

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