CN112646036A - 一种抗cd23特异性单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗CD23特异性单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQ ID No：6所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。该抗CD23特异性单克隆抗体，编码所述抗CD23特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，编码所述抗CD23特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。本发明的抗CD23特异性单克隆抗体能准确识别淋巴造血系统中CD23分子，在慢性淋巴细胞白血病、纵隔大B细胞淋巴瘤和系统性红斑狼疮等疾病中呈阳性高表达。因此本发明抗CD23特异性单克隆抗体可用于准确诊断各种淋巴造血疾病，以提高诊断检测的准确度。

Description

一种抗CD23特异性单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种抗CD23特异性单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD23是一种相对分子量为45kDa的II型跨膜糖蛋白，为低亲和力IgE受体，是唯一不属于Ig超家族的Fc受体。CD23主要表达于免疫细胞，是B细胞活化及生长的重要分子。还可表达于T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、树突细胞、血小板、肠上皮细胞以及骨髓基质细胞表面。CD23在这些细胞表面表达发挥着各种功能，比如调节IgE合成、细胞与细胞粘附、抗原呈递、早期T细胞分化、肥大细胞及嗜碱性粒细胞释放组胺、对寄生虫的免疫攻击、防止生发中心B细胞凋亡、炎症反应调节、调节HIV1的扩增等。
经研究发现CD23可作为肿瘤性疾病诊断、预后的指标及潜在的治疗靶点。在淋巴造血疾病中，CD23标记胸腺髓质B细胞，据文献报道原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤60％-85％表达CD23,而在非纵隔弥漫大B细胞淋巴瘤和结外弥漫大B细胞淋巴瘤中表达率较低，具有较高的敏感性、特异性及阳性预测值。此外，一些研究发现CD23与变态反应性疾病、自身免疫性疾病、白血病和肾小球疾病等多种疾病相关。这些疾病外周血淋巴细胞CD23阳性率显著增加，并与疾病严重程度呈正相关，经有效治疗后CD23阳性率显著下降，这些研究为探索疾病发病机制和治疗提供了新途径。基于CD23的检测指标在各种恶性肿瘤、转移及预后等方面的重要应用，故获得一株高灵敏度、强特异性的抗CD23抗体具有重要意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术问题，本发明提供一种抗CD23特异性单克隆抗体，该抗体能广泛应用于各种淋巴造血疾病的诊断，且具有极高的特异性和灵敏度，有利于准确诊断。
本发明提供的抗CD23特异性单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞株产生，经过多种不同组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别淋巴造血系统中肿瘤的发生，可以用于淋巴造血系统等疾病的免疫学诊断。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种抗CD23特异性单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQID No：6所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种抗CD23特异性单克隆抗体，编码所述抗CD23特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，编码所述抗CD23特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
其中，用ELISA技术测定该抗CD23单克隆抗体的亚类为小鼠IgG1型单克隆抗体，亲和常数为7×10-7(mol/L)。免疫组织化学实验显示，该抗体能特异识别CD23蛋白，包括但不限于重组CD23抗原蛋白和淋巴造血系统中的CD23分子等。
第三方面，本发明提供一种抗CD23单克隆抗体的制备方法，包括：
S1:免疫：分别用SEQ ID No：1-3所示的氨基酸序列的合成多肽作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后，免疫不同的Balb/c小鼠，免疫后取血测定血清抗体效价，选取与各所述合成多肽一一对应的抗体效价最高的小鼠分别进行细胞融合；
S2:细胞融合：骨髓瘤细胞采用鼠来源的sp2/0鼠骨髓瘤样细胞；取小鼠脾淋巴细胞与sp2/0鼠骨髓瘤样细胞进行细胞融合，于HAT培养基中培养，得到杂交瘤细胞；
S3:筛选：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用CD23抗原进行ELISA测试，使用CD23阳性组织进行免疫组织化学检测，对阳性细胞进行有限稀释并进行ELISA测试及IHC检测，挑取全部稀释样品均为阳性且阳性值高的为单克隆稳定株，即杂交瘤细胞株365A2D1；
S4:抗体制备：用杂交瘤细胞株365A2D1的细胞系进行小鼠腹水的制备，收集腹水，使用Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得抗CD23特异性单克隆抗体；或者，
将杂交瘤细胞株365A2D1采用血清的DMEM培养基培养扩倍，低速离心，弃上清并将细胞转移到无血清培养基继续培养1-2周后，收取细胞悬液，离心后取上清，利用亲和层析法进行纯化，，获得抗CD23特异性单克隆抗体。
所述抗CD23单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系365A2D1分泌。
上述制备方法还包括单克隆抗体亚型鉴定及亲和常数测定：获得的抗CD23特异性单克隆抗体亚型经ELISA测定的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为7×10-7(mol/L)。
经免疫组织化学实验检测，结果表明该抗体具有特异性识别恶性肿瘤组织中CD23蛋白分子的功能。
优选地，S1中作为免疫原的合成多肽为SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，SEQ IDNO:1为DPDGRLPTPSAPLHS；SEQ ID NO:2为CVMMRGSGRWNDAF；SEQ ID NO:3为SQELEELRAEQQRLK。
第四方面，本发明提供一种抗CD23特异性单克隆抗体的制备方法，根据抗CD23特异性单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列SEQ ID No：6，轻链可变区的氨基酸序列SEQID No：7，在体外构建CD23抗体的表达载体，该表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，转染Expi-293F细胞，转染后继续培养，收集细胞上清，亲和层析法纯化，获得抗CD23特异性单克隆抗体。
第五方面，本发明提供一种试剂盒或抗体芯片，其包含上述任一实施例记载的抗CD23特异性单克隆抗体。
优选的，所述抗CD23单克隆抗体用于检测淋巴造血系统和正常组织细胞中CD23的表达情况，检测方法包括以下一种或几种：免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法。
优选的，所述抗CD23单克隆抗体应用在免疫组化病理诊断剂中。
(三)有益效果
本发明获得的抗CD23单克隆抗体是由阳性杂交瘤细胞365A2D1的细胞系所分泌产生，为一种IgG1类抗体，能准确识别淋巴造血系统中CD23的表达，在慢性淋巴细胞白血病、纵隔大B细胞淋巴瘤和系统性红斑狼疮等疾病中呈阳性高表达。本发明获得的杂交瘤365A2D1细胞系产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备等检测与筛查，具有强特异性和高灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例制备的CD23单克隆抗体365A2D1和市售CD23(目前最常用的商品化CD23抗体)单克隆抗体在扁桃体组织样本上的免疫组化检测代表性结果(染色阳性信号)比对图，一抗使用浓度均为1μg/mL。
图2为本发明实施例制备的CD23单克隆抗体365A2D1和市售CD23(目前最常用的商品化CD23抗体)单克隆抗体在结肠癌组织样本上的免疫组化检测结果(染色阳性信号)比对图，一抗使用浓度均为1μg/mL。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明对CD23蛋白分子，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择SEQ ID No：1-3所示的合成多肽序列作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经与鼠骨髓瘤样细胞细胞融合、筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系365A2D1。利用该杂交瘤细胞系进行小鼠腹水的制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得抗CD23单克隆抗体(或采用血清的DMEM培养基培养扩倍，然后转入无血清培养基培养，离心取上清，亲和层析法进行纯化，进而制备抗CD23单克隆抗体)。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为7×10-7(mol/L)。免疫组织化学实验显示该抗体能特异识别CD23蛋白，包括但不限于重组CD23抗原蛋白和淋巴造血系统中的CD23分子等。
以下结合具体实施例对本发明的方案进行解释说明。
实施例1
分泌抗CD23特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株365A2D1的制备：
(1)化学合成得到如下氨基酸序列的合成多肽：
SEQ ID NO 1：DPDGRLPTPSAPLHS；
SEQ ID NO 2：CVMMRGSGRWNDAF；
SEQ ID NO 3：SQELEELRAEQQRLK。
(2)小鼠免疫：用上述SEQ ID NO1-3所示序列的多肽分别与弗氏完全佐剂1:1混合并乳化，分别采用皮下注射方法免疫不同的BALB/c小鼠，间隔两周后，以前述多肽与弗氏不完全佐剂1:1混合乳化，进行第二次免疫。免疫两次后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫。检测小鼠血清效价达到1:100000后用前述多肽(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后断尾采血，检测血清效价，选取与SEQ ID No:1-3抗原免疫一一对应的抗体效价最高的小鼠，准备进行细胞融合。
(3)杂交瘤细胞融合：骨髓瘤细胞采用鼠来源的sp2/0鼠骨髓瘤样细胞株，融合时处于对数生长期。取已免疫鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤样细胞大约按4:1比例混合在50mL离心管，滴加50％PEG1500，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基(HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择性培养基)悬浮混匀，MC培养基定容到50mL，分装到96孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
(4)筛选和克隆：融合8天挑选细胞克隆，使用CD23抗原进行ELISA测试。标记细胞株号。对ELISA阳性的细胞株上清，进行免疫组织化学检测(即IHC检测)。对ELISA及IHC的阳性孔细胞进行有限稀释，稀释后在96孔板中培养。每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。选出孔板全部为阳性且阳性值高的单克隆稳定株，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞1株，为365A2D1。
实施例2
抗CD23特异性单克隆抗体的制备和纯化，采用以下两种方式：
方式一：将细胞株365A2D1用含15％血清的DMEM培养基于10cm培养皿中培养，扩倍至约4×107个时，1200rpm离心6分钟，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基继续培养2周后，收取细胞悬液，离心后取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗365A2D1亚型为IgG1，采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100μL/管，浓度为1mg/mL)、于4-8℃冰箱中保存。
方式二:将液体石蜡注射入选取好的小鼠腹腔，刺激小鼠的免疫反应；一周后将细胞株365A2D1接种到小鼠腹腔中，一周后抽取腹水，将抽好的腹水放在离心管里，在天平上平衡，然后放进高速冷冻离心机中离心；离心结束后，弃除上层油脂及底部带血丝沉积物，将剩余液体用纱布过滤后加入饱和硫酸铵过夜，取沉淀，用PBS复溶，再利用亲和层析法进行纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗365A2D1亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100μL/管，浓度为1mg/mL)、保存在4-8℃。
为了便于描述(与现有抗CD23单克隆抗体区分)，以下对杂交瘤细胞分泌的抗CD23特异性单克隆抗体简称为365A2D1抗CD23单克隆抗体或365A2D1抗CD23单抗。
现对上述两种方式制备的365A2D1抗CD23单克隆抗体进行测序：
依据试剂TriZol说明书，从杂交瘤细胞中分离出总RNA，依据TIANScript第一链cDNA合成试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，根据特异性引物扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段，将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中、测序。
测序结果为：365A2D1抗CD23单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ ID No：4所示的DNA序列所编码，抗CD23单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No：5所示的DNA序列所编码。对应地，抗CD23单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：6所示的氨基酸序列，CD23单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
实施例3
通过ELISA方法检测365A2D1抗体的亚型。结果显示365A2D1抗体的亚型为IgG1。
实施例4
对扁桃体组织样本，使用365A2D1抗CD23单克隆抗体作为一抗的免疫组化检测。其步骤如下：
(1)样本准备：将福尔马林固定石蜡包埋切片于60℃恒温箱中烤片2h，室温保存备用。
(2)脱蜡：先将石蜡切片置于新鲜二甲苯中浸泡2次进行脱蜡，每次10min。
(3)切片水化：依次经过无水乙醇(2次，每次3min)，95％乙醇(3min)，85％乙醇(3min)，70％乙醇浸泡5min进行水化，后纯化水冲洗2次，每次3min。
(4)抗原修复：使用高温热修复法修复3min(如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20min)，待切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织(本实施例中为肺腺癌组织)圈起来，纯化水冲洗2次，每次3min。
(5)内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10min，纯化水冲洗2次，每次3min，PBST冲洗1次。
(6)一抗及空白对照抗体孵育：分别加入100ul的365A2D1抗CD23单克隆抗体和对照市售CD23抗体完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)冲洗3次,每次5min。
(7)二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。
(8)DAB显色：依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织，待颜色无加深终止染色，纯化水冲洗3次。
(9)苏木素衬染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染，PBST或自来水冲洗返蓝。
(10)脱水透明：依次浸泡70％，85％，95％，100％，100％梯度酒精，每次3min；2次二甲苯透明，每次5min。
(11)封片：用中性树胶对样品进行封片。
对上述制作的封片使用荧光显微镜观察，结果如图1所示，CD23蛋白在扁桃体组织中呈特异性细胞膜表达，并且365A2D1克隆的抗CD23单克隆抗体的检测信号(荧光强度)显著强于市售CD23组。同等抗体浓度下(1μg/mL)，365A2D1抗CD23单克隆抗体的染色阳性信号较市售CD23组染色阳性信号显著增强，说明本抗体灵敏度更高，在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，降低生产成本，同时在保证灵敏度的情况下降低背景。病理医生根据CD23检测结果和经验进行评判时更加方便，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。
实施例5
使用365A2D1抗CD23单克隆抗体作为一抗的免疫组化检测。实验过程参照实施例5，只是肺腺癌组织改为“结肠癌组织”。
对制作的封片使用荧光显微镜观察，结果如图2所示，CD23蛋白在结肠癌组织中呈特异性细胞膜表达，并且365A2D1抗CD23单克隆抗体的信号(荧光强度)均显著强市售CD23组。市售CD23组染色阳性信号较弱，在一些早期癌症组织中会存在检测灵敏度较低的问题。而本发明的365A2D1抗CD23单克隆抗体由于其具有特异性好，阳性信号强等特点，在IHC染色中评分更容易，对检测区分癌症更准确，特别是一些早期癌症组织检测。
实施例6
365A2D1抗CD23单克隆抗体的亲和力测定，方法如下：
(1)从4℃中取出如序列SEQ ID NO:1-3的CD23的多肽抗原。恢复至室温。配置不同多肽摩尔浓度，取100μL/孔加到96孔板上。
(2)将365A2D1抗体稀释成初始质量浓度0.125μg/mL，抗体分子量为150kD，摩尔浓度约为0.83nmol/L。
(3)将稀释好的365A2D1抗CD23单克隆抗体按照100μL/孔添加至有多肽的96孔酶标板上，盖上封板膜，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。
(4)将酶标板从37℃孵育室取出，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。
(5)按照二抗使用说明书，将稀释HRP标记羊抗鼠IgG，以100μL/孔加入酶标板中，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。
(6)将酶标板从37℃孵育室取出，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。
(7)每孔100μL加入TMB显色液，室温反应6分钟。
(8)每孔50μL 2M H2SO4终止显色。
(9)在酶标仪上于450nm读取OD值，整理数据，分析结果。
结果显示，在多肽摩尔浓度0.56μmol/L时，365A2D1抗CD23单克隆抗体亲和力常数为：7×10-7(mol/L)。
实施例7
利用本发明公开的365A2D1抗CD23单克隆抗体的氨基酸序列及DNA序列见SEQ IDNO：4-7，体外构建CD23抗体的表达载体。该表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，转染Expi-293F细胞，转染后继续培养，收集细胞上清，采用亲和层析法纯化，获得抗CD23特异性单克隆抗体。
具体方法如下：
(1)表达载体构建：将抗CD23特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)序列(SEQ IDNO：7)构建至鼠抗体轻链的κ链恒定区(SEQ ID NO:8)，将抗CD23特异性单克隆抗体的重链可变区(VH)的序列(SEQ ID NO：6)构建至鼠抗体重链的恒定区，优选为鼠IgG1(SEQ ID NO:9)。重组抗体重链/轻链氨基酸的N端加入优化信号肽进行分泌表达，将重组抗体的氨基酸进行密码子优化，核苷酸的5’端加入Kozak序列GCCGCCACC，核苷酸两端加入pcDNA3.4的酶切位点EcoRI/HindIII，合成的基因经酶切后连接到pcDNA3.4载体，得到表达载体。
(2)转染：表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，按照质粒：培养基＝1μg/ml转染Expi-293F细胞。所用转染试剂为ExpiFectamine 293Transfection Kit(Theromfisher，Lot#：A14524)，转染时细胞密度为25*105cells/ml，转染后18h添加表达增强剂Enhancer1及Enhancer2，转染后5天收集细胞上清。
(3)Protein A纯化：在4℃条件下以10000rpm/min，离心30min上清液去除细胞碎片，Protein A柱子用平衡液(0.02MPB、0.15M NaCl、pH7.0)平衡10个柱体积后，以2ml/min的速度使上清液流过柱子，上样完成后，使用平衡液对结合后的柱子清洗5个柱体积，加入洗脱液(0.02M PB、0.15M NaCl、pH3.0)洗脱，洗脱液滴入到加入中和液(1M Tris，pH9.0)收集管中。收集到蛋白洗脱液，使用超滤管(Millipore UFC903096)4000G超滤浓缩并置换buffer成PBS(HyClone SH30256.01)，SDS-PAGE电泳检测后放到-20℃保存。去内毒素，过滤除菌，SDS-PAGE电泳检测纯度。
使用上述方法制备的抗CD23特异性单克隆抗体，加入扁桃体组织的细胞裂解液中，进行Western Blot检测，能够检测到明显的CD23蛋白的条带。
除上述制备方法外，在进行大规模生产本发明的365A2D1抗CD23单克隆抗体时，还可以根据本发明公开的抗体编码序列，构建质粒载体，转到细胞中得到稳定表达细胞株，用发酵罐发酵培养，获取稳转株细胞上清液或裂解液，采用亲和层析法纯化(根据抗体亚型选择相应柱料，如protein A/G柱)，生产制备365A2D1抗CD23单克隆抗体。
最后应说明的是：本领域技术人员，在基于本申请公开的365A2D1抗CD23单克隆抗体的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的DNA序列上，采用任何现有方法或将来可能的方法生产制备365A2D1抗CD23单克隆抗体，也均应当被涵盖在本申请要求专利保护的范围内。同样地，对本发明365A2D1抗CD23单克隆抗体的任何形式的商业化应用，包括但不限于试剂盒、抗体芯片等相应产品，也均应当被涵盖在本申请要求专利保护的范围内。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Figure BDA0002909976030000121
Figure BDA0002909976030000131
Figure BDA0002909976030000141
Figure BDA0002909976030000151
Figure BDA0002909976030000161
Figure BDA0002909976030000171
序列表
<110> 苏州百道医疗科技有限公司
<120> 一种抗CD23特异性单克隆抗体及其应用
<130> EJS201442I
<141> 2021-01-19
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Ser Gln Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gln Gln Arg Leu Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ctaagggcag cctgaagctg 60
agctgcgccg ccagcggcta caccttcaac acctacgcca tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtggccagg atcaggagca agagcaacaa ctacgagcct 180
tactacgccg acagcgtgaa ggacaggttc accatcagca gggacgacag ccagagcatc 240
ctgtacctgc agatgaacaa cctgaagacc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgtgagg 300
gagtactacg acgccatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgaccgt gagcagc 357
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gagatcgtga tgacccaggc cgcccctagc gtgagcgtga cccctggcga gagcgtgagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg cacagcaacg gcaacaccta cctgtactgg 120
ttcctgcaga ggcctggcca gagccctcac ctgctgatca gcagggtgag caacctggcc 180
agcggcgtgc ctgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgccttcac cctgaggatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagggcct ggagttccct 300
tggaccttcg gcggcggcac caagctggag atcaag 336
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Pro Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Glu Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Glu Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro His Leu Leu Ile Ser Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 324
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys

Claims (6)

1.一种抗CD23特异性单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区具有如SEQ ID No：6所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
2.一种抗CD23特异性单克隆抗体，其特征在于，编码所述抗CD23特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，编码所述抗CD23特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo：5所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗CD23特异性单克隆抗体，其特征在于，所述抗CD23单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。
4.一种抗CD23特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1:免疫：分别用SEQ ID No：1-3所示的氨基酸序列的合成多肽作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后，免疫不同的Balb/c小鼠，免疫后取血测定血清抗体效价，选取与各所述合成多肽一一对应的抗体效价最高的小鼠分别进行细胞融合；
S2:细胞融合：骨髓瘤细胞采用鼠来源的sp2/0鼠骨髓瘤样细胞；取小鼠脾淋巴细胞与sp2/0鼠骨髓瘤样细胞进行细胞融合，于HAT培养基中培养，得到杂交瘤细胞；
S3:筛选：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用CD23抗原进行ELISA测试，使用CD23阳性组织进行免疫组织化学检测，对阳性细胞进行有限稀释并进行ELISA测试及IHC检测，挑取全部稀释样品均为阳性且阳性值高的为单克隆稳定株，为阳性杂交瘤细胞株；
S4:抗体制备：使用上述阳性杂交瘤细胞株的细胞系的细胞系进行小鼠腹水的制备，收集腹水，使用Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得抗CD23特异性单克隆抗体；或者，
将上述阳性杂交瘤细胞株的细胞系用血清的DMEM培养基培养扩倍，低速离心，弃上清并将细胞转移到无血清培养基继续培养1-2周后，收取细胞悬液，离心后取上清，利用亲和层析法进行纯化，获得抗CD23特异性单克隆抗体。
5.一种抗CD23特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于，按照抗CD23特异性单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列SEQ ID No：6，抗CD23特异性单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID No：7，在体外构建CD23抗体的表达载体，该表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，转染Expi-293F细胞，转染后继续培养，收集细胞上清，采用亲和层析法纯化，获得抗CD23特异性单克隆抗体。
6.一种试剂盒或抗体芯片，其包含权利要求1-3任一项所述的抗CD23特异性单克隆抗体或权利要求4-5任一项所述制备方法制备的抗CD23特异性单克隆抗体。
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