CN111705039B - 一种分泌抗sox17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

一种分泌抗sox17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用，本发明中分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D2F8的保藏号为CCTCC NO：C202097，保藏日期为2020年06月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。本发明提供的单克隆抗体能与SOX17蛋白特异结合，且效价高，亲和力好，能够用于特异检测人SOX17蛋白，并用于卵巢癌的免疫组化检测。

Description

一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用。
背景技术
卵巢癌是女性恶性肿瘤中最常见的肿瘤之一，其发病率占妇科肿瘤第2位，而其死亡率却是妇科恶性肿瘤首位，成为妇女肿瘤"沉默的的杀手"。近年来，我国卵巢癌发病率增高且呈年轻化趋势。由于卵巢位于盆腔深部，起病较隐匿，病变早期难以发现且病情发展迅速，加之缺乏有效地筛查及早期诊断的手段，多数患者就诊时已是晚期。尽管化疗在恶性肿瘤的治疗中占有非常重要的地位，但是在临床实践中结果往往不尽如人意。目前，包括卵巢癌在内的肿瘤异质性问题得到广泛重视，即使在临床表现上或传统病理分型上类同的肿瘤，其发病的分子根源也不尽相同，这就要求从分子病理水平更深入地探究肿瘤，提高诊疗的精准度。目前，利用免疫组织化学方法对关键肿瘤相关蛋白进行组织学检测是关系到肿瘤精准诊疗的重要节。本申请前期研究发现SOX17蛋白的表达水平与卵巢癌的恶性程度相关，自主研发的SOX17特异抗体可用于卵巢癌的免疫组化检测。因此对SOX17进行免疫组化检测将更客观准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。
现有的商业化SOX17抗体有几余种，由主流抗体试剂公司Santa、Cruz和Abcam等提供，但是均属于基础研究用试剂，没有依据表明这些抗体可以和我们的抗体一样具有合格的特异性并可用于卵巢癌免疫组化检测，特别是目前尚没有任何其它SOX17抗体经过大量组织标本的免疫组化验证并显示出可以通过对SOX17的组织细胞表达水平进行检测来达到对卵巢癌恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的。而且，由SOX17特异抗体制备的免疫组化试剂未见报道，SOX17抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用也没有先例。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明的第一目的提供一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D2F8，所述杂交瘤细胞株4D2F8的保藏号为CCTCC NO：C202097，保藏日期为2020年06月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
本发明的第二目的提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株4D2F8所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别人SOX17蛋白。
本发明的第三目的提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有上述的单克隆抗体。
作为优选，所述试剂盒中还含有柠檬酸盐缓冲液、内源性过氧化酶阻断剂、酶标羊抗鼠IgG聚合物、DAB缓冲液、DAB底物、DAB显色剂、PBS磷酸盐缓冲液。
本发明的第四目的提供一种单克隆抗体在制备用于卵巢癌免疫组化检测的试剂中的应用。
本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：本发明提供的单克隆抗体能与SOX17蛋白特异结合，且效价高，亲和力好，能够用于特异检测人SOX17蛋白，并用于卵巢癌的免疫组化检测。本发明提供抗体为核心的免疫组化检测方法，能很好地检测卵巢癌组织细胞中SOX17的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读SOX17在癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别卵巢癌的个体化异质性及其生存预后。
细胞保藏：
本发明提供一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D2F8，所述杂交瘤细胞株4D2F8是本发明的发明人自行筛选得到的，所述杂交瘤细胞株4D2F8的保藏号为CCTCCNO：C202097，保藏日期为2020年06月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
附图说明
图1是本发明实施例1中SDS-PAGE结果示意图；
图2是本发明实施例1中Western Blotting分析结果示意图；
图3是本发明实施例2中SDS-PAGE结果示意图；
图4是本发明实施例2中Western Blotting结果示意图；
图5是本发明实施例5中SOX17在浆中呈弱阳性着色的示意图；
图6是本发明实施例5中SOX17在浆中呈强阳性着色的示意图；
图7是本发明实施例7中鉴定结果对比示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中基因SOX17的GeneBank国际通用序列编号为：NC_000008.11，基因SOX17编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_071899.1。
实施例1：SOX17的重组蛋白表达、纯化及鉴定 。
从卵巢癌组织中利用RT-PCR的方法，利用SOX17-F、SOX17-R为引物克隆SOX17基因（其中，SOX17-F的基因序列如SEQ ID NO：3所示，SOX17-R的基因序列如SEQ ID NO：4所示，SOX17基因的基因序列如SEQ ID NO：1所示），然后将克隆的SOX17基因插入含有His标签的改造过pc DNA3.1载体上，得SOX17S-pc DNA3.1。然后将SOX17-pc DNA3.1转化DH5α，挑取阳性克隆，将挑取的阳性克隆扩大培养后，提取重组质粒SOX17-pc DNA3.1，然后以HindⅢ、BamHI进行酶切分析，结果显示得到了与预期大小相符的酶切片段。将酶切正确的重组SOX17-pc DNA3.1经测序确认基因正确后利用Lipofectamine2000转染入cos-7细胞中，经过G418筛选阳性克隆，以含10%胎牛血清的DEME培养基培养（37℃，5%CO2），收集培养上清并纯化，细胞表达产物经SDS-PAGE分析，结果如图1所示。结果显示，发现在46 KD左右有特异表达带，根据基因序列预测SOX17重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。用anti 6xHis 抗体进行Western Blotting分析，结果如图2所示，仅有一条特异性条带，表明蛋白为目的蛋白。
将利用镍柱纯化细胞培养上清。具体方法为收集细胞培养液，1200rpm离心分离细胞，收集上清，并利用0.45um 滤器过滤上清液。将滤液上样到5ml Ni-NTA 柱上，经5倍柱体积10mM 咪唑溶液清洗，然后用300mM 咪唑洗脱，收集各管洗脱蛋白溶液。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度并定量，获得的蛋白纯度达到95%，浓度为5mg/ml。
实施例2：SOX17单克隆抗体的制备、纯化及鉴定。
用实施例1纯化的SOX17重组蛋白利用皮下注射方法免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50ug抗原，免疫体积为100ul。首次免疫SOX17 与弗氏完全佐剂1：1混合每隔两周免疫一次，SOX17与弗氏不完全完全佐剂1：1混合，共免疫3次；最后经过SOX17（不含佐剂）腹腔加强免疫（30ug），3天后取免疫小鼠的脾脏细胞，然后利用PEG-4000融合免疫小鼠脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0，利用HAT选择培养基在96孔细胞培养板上选择杂交瘤细胞，并利用ELISA方法鉴定产生抗SOX17蛋白（SOX17单克隆抗体）的细胞；分别为杂交瘤细胞株4D2F8、杂交瘤细胞系4E6G8、杂交瘤细胞系3G7B9、杂交瘤细胞系1F2G6和杂交瘤细胞系2E4B6，然后利用转瓶培养获得的杂交瘤细胞系株，收集细胞培养上清，利用0.45um的滤器过滤溶液，加入终浓度为50%的硫酸铵固体，4°搅拌均匀后，静置1小时，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到粗纯化抗体在AKTA 纯化系统上，以1ml/min 流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mM PBS pH7.0)清洗，然后用0.1M 甘氨酸-盐酸溶液 pH2.7洗脱抗体（每个收集管预先加入1M pH 9.0 Tris缓冲液中和），得到目的抗体。然后SDS-PAGE及Western Blotting鉴定分离纯化的单抗，并分别命名为4D2F8单克隆抗体、4E6G8单克隆抗体、3G7B9单克隆抗体、1F2G6单克隆抗体和2E4B6单克隆抗体。SDS-PAGE结果如图3所示，纯化后的单克隆抗体仅有50kd处的重链和25kd处的轻链，灰度分析显示，抗体纯度达到95%。重组蛋白SOX17 5ug 每孔上样，上述单克隆抗体1:10000 稀释，Western Blotting结果如图4所示，显示抗体特异性与重组蛋白反应。
实施例3：SOX17免疫组化抗体筛选。
取卵巢癌及癌旁组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，以1：200分别滴加上述制备得到的鼠抗人SOX17单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜。缓冲液洗三次，每次5min。滴加酶标羊抗鼠IgG聚合物 ，在室温下孵育30min。缓冲液洗三次，每次5min。DAB显色，复染，脱水封片后显微镜下观察染色情况。结果显示4D2F8单克隆抗体特异性较高，与酶标抗体无特异性交叉反应。
实施例4：SOX17免疫组化试剂盒。
试剂盒组分：试剂1：柠檬酸盐缓冲液（100x）；试剂2：内源性过氧化酶阻断剂；试剂3：酶标羊抗鼠IgG聚合物 ；试剂4：鼠抗人SOX17单克隆抗体
（4D2F8）；试剂5A：DAB缓冲液（20X）；试剂5B：DAB底物(20X) ；试剂5C：DAB显色剂（20X）；其他组成：PBS磷酸盐缓冲液。
实施例5：SOX17免疫组化试剂盒检测样本。
卵巢癌切片取自上海交通大学附属仁济医院肿瘤组织标本库，组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，以1：200滴加鼠抗人SOX17单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜。缓冲液洗三次，每次5min。滴加酶标羊抗鼠IgG聚合物 ，在室温下孵育30min。缓冲液洗三次，每次5min。DAB显色，复染，脱水封片后显微镜下观察染色情况。
结果：卵巢癌患者组织细胞中SOX17在浆中呈不同程度的着色，浆中弱阳性着色见图5，浆中强阳性着色见图6。综合临床预后资料，发现浆中弱阳性患者的生存预后明显好于浆中强阳性患者。以上试验结果表明，采用本发明提供抗体为核心的免疫组化检测方法，能很好地检测卵巢癌组织细胞中SOX17的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读SOX17在癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别卵巢癌的个体化异质性及其生存预后。
实施例6：SOX17单克隆抗体亚型分析、效价检测及特异性分析。
单克隆抗体亚型分析：对分泌特异单克隆抗体的4株杂交瘤细胞产生的抗体，分别为4D2F8、4E6G8、3G7B9和1F2G6鉴定抗体亚型，结果显示4D2F8、4E6G8和1F2G6为IgG2a，3G7B9为IgG2b。
单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的SOX17的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1：64000、1:128000、1：256000、1:512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，4D2F8、4E6G8、3G7B9和1F2G6单克隆抗体效价分别均为1：512000、1：128000、1：128000、1：256000。其中4D2F8的抗体效价最高。
实施例7：单克隆抗体表位鉴定。
重组截短SOX17蛋白构建表达：根据SOX17蛋白氨基酸序列，设计了N、M、C端的序列以及SOX17全长蛋白，连接至表达载体pET28a，并装入表达菌株BL21(DE3)中。在LB培养基中，IPTG 0.5mmol/L 25度条件下过夜诱导SOX17截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×His标签亲和纯化，纯化后的蛋白的蛋白进行SDS-PAGE电泳，纯度均在90%以上。
SOX17-N片段，其序列如SEQ ID NO:6所示：
MSSDAGYASDDSTSAAVMAGGCWASSIGDMKVKGAANSGAAGAAGRAKGSRIRRMNAMVWAKDRKRANDHNASKMGKSWK
SOX17-M片段，其序列如SEQ ID NO:7所示：
ATAKRVARRVHMDHNYKYRRRRKVKRKRVGGHGAAAAGGGRVAMDGGGAGHMGGHYRDCSGADGYTDTSDGVDDAAAMGDCAAGTYSYAVSDYAGAG
SOX17-C片段，其序列如SEQ ID NO:8所示：
MHRGAGSIGASAHVYYGAMGSGAGGGRGMHHHHHHGGSACRDGTDSAGVDRTYHVCKMGYGHDSGVNDSHGAISSVVSDASSAVYYCNYDV
SOX17全长，其序列如SEQ ID NO:9所示：
MSSDAGYASDDSTSAAVMAGGCWASSIGDMKVKGAANSGAAGAAGRAKGSRIRRMNAMVWAKDRKRANDHNASKMGKSWKATAKRVARRVHMDHNYKYRRRRKVKRKRVGGHGAAAAGGGRVAMDGGGAGHMGGHYRDCSGADGYTDTSDGVDDAAAMGDCAAGTYSYAVSDYAGAGMHRGAGSIGASAHVYYGAMGSGAGGGRGMHHHHHHGGSACRDGTDSAGVDRTYHVCKMGYGHDSGVNDSHGAISSVVSDASSAVYYCNYDV
蛋白免疫印迹法WB确认抗体识别表位：重组蛋白SOX17-N、M、C和SOX17全长4种蛋白取5μg 上样，进行12％SDS-PAGE电泳。电泳完成后，150V恒压条件下，蛋白转入0.45umPVDF。转膜完成后利用含10％脱脂奶粉的PBST溶液37℃封闭两小时。用0.5μg/mL的4D2F8单克隆抗体溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的羊抗鼠IgG-HRP孵育1小时。清洗完成后，加入显色液进行显色。SOX17全长蛋白作为阳性对照，结果显示，4D2F8抗体识别SOX17蛋白的N段，见图7。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州仁端生物医药科技有限公司
<120> 一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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165 170 175
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacacgtca ggatagttgc 20
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Met Lys Val Lys Gly Ala Ala Asn Ser Gly Ala Ala Gly Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Ser Asp Ala Gly Tyr Ala Ser Asp Asp Ser Thr Ser Ala Ala
1 5 10 15
Val Met Ala Gly Gly Cys Trp Ala Ser Ser Ile Gly Asp Met Lys Val
20 25 30
Lys Gly Ala Ala Asn Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Arg Ala Lys
35 40 45
Gly Ser Arg Ile Arg Arg Met Asn Ala Met Val Trp Ala Lys Asp Arg
50 55 60
Lys Arg Ala Asn Asp His Asn Ala Ser Lys Met Gly Lys Ser Trp Lys
65 70 75 80
<210> 7
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Thr Ala Lys Arg Val Ala Arg Arg Val His Met Asp His Asn Tyr
1 5 10 15
Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Lys Val Lys Arg Lys Arg Val Gly Gly His
20 25 30
Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Arg Val Ala Met Asp Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Gly His Met Gly Gly His Tyr Arg Asp Cys Ser Gly Ala Asp Gly
50 55 60
Tyr Thr Asp Thr Ser Asp Gly Val Asp Asp Ala Ala Ala Met Gly Asp
65 70 75 80
Cys Ala Ala Gly Thr Tyr Ser Tyr Ala Val Ser Asp Tyr Ala Gly Ala
85 90 95
Gly
<210> 8
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met His Arg Gly Ala Gly Ser Ile Gly Ala Ser Ala His Val Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Met Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Arg Gly Met His His His
20 25 30
His His His Gly Gly Ser Ala Cys Arg Asp Gly Thr Asp Ser Ala Gly
35 40 45
Val Asp Arg Thr Tyr His Val Cys Lys Met Gly Tyr Gly His Asp Ser
50 55 60
Gly Val Asn Asp Ser His Gly Ala Ile Ser Ser Val Val Ser Asp Ala
65 70 75 80
Ser Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Tyr Asp Val
85 90
<210> 9
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ser Ser Asp Ala Gly Tyr Ala Ser Asp Asp Ser Thr Ser Ala Ala
1 5 10 15
Val Met Ala Gly Gly Cys Trp Ala Ser Ser Ile Gly Asp Met Lys Val
20 25 30
Lys Gly Ala Ala Asn Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Arg Ala Lys
35 40 45
Gly Ser Arg Ile Arg Arg Met Asn Ala Met Val Trp Ala Lys Asp Arg
50 55 60
Lys Arg Ala Asn Asp His Asn Ala Ser Lys Met Gly Lys Ser Trp Lys
65 70 75 80
Ala Thr Ala Lys Arg Val Ala Arg Arg Val His Met Asp His Asn Tyr
85 90 95
Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Lys Val Lys Arg Lys Arg Val Gly Gly His
100 105 110
Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Arg Val Ala Met Asp Gly Gly Gly
115 120 125
Ala Gly His Met Gly Gly His Tyr Arg Asp Cys Ser Gly Ala Asp Gly
130 135 140
Tyr Thr Asp Thr Ser Asp Gly Val Asp Asp Ala Ala Ala Met Gly Asp
145 150 155 160
Cys Ala Ala Gly Thr Tyr Ser Tyr Ala Val Ser Asp Tyr Ala Gly Ala
165 170 175
Gly Met His Arg Gly Ala Gly Ser Ile Gly Ala Ser Ala His Val Tyr
180 185 190
Tyr Gly Ala Met Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Arg Gly Met His His
195 200 205
His His His His Gly Gly Ser Ala Cys Arg Asp Gly Thr Asp Ser Ala
210 215 220
Gly Val Asp Arg Thr Tyr His Val Cys Lys Met Gly Tyr Gly His Asp
225 230 235 240
Ser Gly Val Asn Asp Ser His Gly Ala Ile Ser Ser Val Val Ser Asp
245 250 255
Ala Ser Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Tyr Asp Val
260 265

Claims (5)

1.一种分泌抗SOX17单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D2F8，其特征在于，所述杂交瘤细胞株4D2F8的保藏号为CCTCC NO：C202097，保藏日期为2020年06月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株4D2F8所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别人SOX17蛋白。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求2所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有柠檬酸盐缓冲液、内源性过氧化酶阻断剂、酶标羊抗鼠IgG聚合物、DAB缓冲液、DAB底物、DAB显色剂、PBS磷酸盐缓冲液。
5.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于卵巢癌免疫组化检测的试剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

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Non-Patent Citations (1)

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Title
Identification of Sox17 as a Transcription Factor That Regulates Oligodendrocyte Development;Jiho Sohn et al.;《The Journal of Neuroscience》;20060920;第26卷(第38期);第9722-9735页 *

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