CN114507287B - 一种抗cldn18.2重组兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗cldn18.2重组兔单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。相比市售的抗CLDN 18.2单克隆抗体，本发明的抗CLDN 18.2单克隆抗体具有更高的亲和力，能够高特异性和高灵敏度地识别CLDN 18.2抗原蛋白和肿瘤细胞和免疫细胞上的CLDN 18.2分子。该抗体可应用于免疫组织化学、间接ELISA、免疫印记、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得更准确的评估和检测结果，且在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，以降低成本。

Description

一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗 CLDN 18.2抗体及其应用，特别是在免疫组织化学检测方面的应用。
背景技术
Claudins（CLDNS）家族蛋白在人体上皮组织中广泛分部，其在上皮细胞维持渗透压、屏障功能、细胞极性以及细胞紧密连接等方面发挥着重要作用。此外，研究表明，在多种肿瘤形成过程中，CLDNS表达模式会发生不同程度的改变。因此，其可作为靶向治疗标志蛋白用于肿瘤治疗研究。CLDN 18蛋白作为CLDNs家族一员，其由人CLDN18基因编码，拥有CLDN18.1和CLDN 18.2两种剪切突变体。其中，CLDN 18.2是一种具有高度选择性的标志蛋白，仅有限度地表达于分化的胃黏膜上皮细胞，而在其余正常组织中表达高度受限。然而，在多种原发性和转移癌种，如胃癌，胰腺癌，食管癌和肺癌中，CLDN 18.2蛋白表达被异常激活。Claudin18.2的异常表达改变细胞原有的极性，并提供肿瘤细胞转移与生长的有利条件。同时，Claudin18.2蛋白表达于细胞膜表面。因此，Claudin18.2作为抗肿瘤潜在靶点具有极大的应用前景。
目前，数款以Claudin18 .2为靶点的抗肿瘤药物进入临床研究阶段，但如何评估恶性肿瘤中Claudin18 .2的表达水平仍无有效的检测手段。免疫组织化学检测是通过酶标抗体的显色反应来确定靶标蛋白位置和表达强度，是检测肿瘤中CLDN 18.2表达水平的有效手段，而CLDN 18.2抗体的质量直接影响最终的显色结果。因此，获得一株高灵敏度、强特异性的抗 CLDN 18.2抗体对CLDN 18.2表达水平的检测具有非常重要的意义。
发明内容
（一）要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，其与Claudin18.2蛋白的结合具有高特异性和灵敏度，可用于免疫组织化学检测，从而准确评估恶性肿瘤中Claudin18 .2的表达水平。本发明还涉及编码该抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组质粒、制备方法及抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体在Claudin18.2蛋白的检测方法或装置中的应用等。
（二）技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
第二方面，本发明提供编码基因，用于编码上述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。
优选地，所述编码基因包括如SEQ ID No.4所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的重链可变区的DNA序列，以及如SEQ ID No.5所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列。
第三方面，本发明涉及一种核酸分子，其包括用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的编码基因。
第四方面，本发明保护一种表达载体，其包括上述的核酸分子。
第五方面，本发明提供一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的制备方法，采用上述表达载体转染细胞，培养转染后的细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。
更优选地，所述制备方法包括如下步骤：
（1）免疫兔子：先对 CLDN 18.2分子序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择和使用合适的多肽序列作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后作为免疫原免疫兔子；所述多肽为SEQ ID No.1-3所示的人工合成多肽；
（2）制备杂交瘤细胞系：经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞系，从杂交瘤细胞系中分离出总RNA；
（3）获得抗体序列：利用特异性的引物，通过PCR扩增技术获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列；
（4）抗体表达和纯化：将所述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染方法瞬时转染培养的293细胞，培养后收集上清，使用Protein A纯化上清液，得到纯度＞95％的抗体。
第六方面，所述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体、编码基因、核酸分子、表达载体在制备CLDN18.2检测装置中的应用。所述检测装置包括但不限于试剂盒、抗体芯片等。
第七方面，本发明还提供一种CLDN18.2检测试剂盒，其包括上述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。
优选地，所述CLDN18.2检测试剂盒包括：抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体、HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素、返蓝液。
在进行免疫组织化检测时，检测步骤包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、复染、脱水、封片和镜检等。
（三）有益效果
本发明提供的抗 CLDN 18.2单克隆抗体，与Claudin18.2蛋白的结合具有高特异性和高灵敏度，能够特异性地识别CLDN 18.2抗原蛋白和肿瘤细胞和免疫细胞上的 CLDN18.2分子，在检测Claudin18.2蛋白时呈阳性高表达，因此该抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得更准确的评估和检测结果，同时在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，以降低生产成本，还可在保证灵敏度的情况下降低背景，使病理医生进行主观评判时更加方便，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。
附图说明
图1为本发明制备的抗 CLDN 18.2单克隆抗体与市售 CLDN 18.2单克隆抗体在胃癌的免疫组化检测代表性结果比对图，一抗使用浓度为1μg/mL。
图2为本发明的451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体与市售CLDN 18.2单克隆抗体在7个梯度浓度下效价检测的统计图。
图3为向表达CLDN18.2蛋白的细胞中加入等量的市售抗 CLDN 18.2抗体与451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体后进行流式细胞术染色分析，得到的空白对照、市售抗CLDN 18.2抗体样品、451I3V0抗 CLDN 18.2单抗样品三者的荧光信号强度（MFI）对比图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。人体组织样本是经过福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织样本，均进行了病理证实，并有患者知情同意书。
实施例1
本实施例为抗 CLDN 18.2单克隆抗体的制备和筛选，步骤包括：
（1）抗原制备
CLDN 18.2抗原具体序列如下所示的SEQ ID NO:1-3。
SEQ ID No. 1：DQWSTQDLYNNPV
SEQ ID No. 2：DLYNNPVTAV
SEQ ID No. 3：NPVTAVFNYQG
上述多肽序列是通过对 CLDN 18.2分子序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构后选择出来的。人工合成SEQ ID NO:1-3所示的多肽序列，并将合成的多肽作为免疫兔子用的抗原，且具体经由KLH或OVA偶联后作为免疫原免疫兔子。
（2）免疫
将SEQ ID NO:1-3的多肽序列分别与完全弗氏佐剂1:1混合并乳化，采用皮下注射方法分别免疫不同的新西兰大白兔，间隔两周后将含有上述具体序列（SEQ ID NO:1-3）的CLDN 18.2抗原与不完全弗氏佐剂1:1乳化进行第二次和第三次免疫。三次免疫后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；选取与SEQ ID NO:1-3抗原免疫一一对应的抗体效价最高的兔子分别进行下一步的细胞融合。
（3）细胞融合
提前准备鼠来源的sp2/0骨髓瘤细胞，使融合时该sp2/0骨髓瘤细胞处于对数生长期。取已免疫兔脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；兔脾淋巴细胞与所述骨髓瘤细胞混合，滴加50％PEG1500，加入IMDM培养基，离心弃上清后加入HAT培养基轻柔悬浮混匀，定容至800mL后分装于96孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。融合6-9天后观察96孔板中融合细胞状态，换液用HT继续置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
（4）筛选和克隆
融合7-10天后使用CLDN 18.2抗原（SEQ ID NO:1-3）进行ELISA测试来筛选克隆细胞。标记好相应细胞株号，对阳性孔细胞进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑选出阳性值高的单克隆稳定株，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株，记录为451I3V0。
（5）将筛选好的杂交瘤细胞株进行抗体测序
依据试剂TriZol说明书，从451I3V0杂交瘤细胞中分离出总RNA，依据TIANScript第一链cDNA合成试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，利用特异性引物（重链可变区引物，VH-F ：AGACTGGGCTGCGCTGGCTTC，VH-RGTGAGGGTGCCCGAG；轻链可变区引物：VK-FATGGACAYGAGGGCCCCCACTC，VK-R: GGTGGGAAGATGAGGACAGTAGG）扩增获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列，然后将抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列克隆至真核表达载体（InvivoGen，pfuse-rchg，pfuse2-rclk1）中，准备进行细胞转染。
（6）细胞转染与筛选
提前准备好待转染用的293细胞，离心换新鲜的培养基后分别放入24孔板中，按所需要的数量每孔1.5ml，密度为3*106个/ml。
将上述真核表达载体与PEI按比例1:6混合后加入到准备好的293细胞中，置于37℃、5％CO2的摇床中培养。培养3-5天后将转染的细胞上清与对应抗原进行ELISA检测来筛选阳性孔，再将阳性孔的细胞上清继续进行免疫组织化学法检测，如果免疫组织化学法检测阳性则确认测出的抗体序列正确。
（7）细胞上清单抗的制备与纯化
将确认阳性的表达载体进行大量的细胞转染，继续培养3-5天后，收取细胞悬液，离心后取上清，利用亲和层析法进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、于4-8℃冰箱中保存。
最终，451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ IDNo.4所示的DNA序列所编码，抗 CLDN 18.2单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.5所示的DNA序列所编码。
SEQ ID No.4-5具体序列如下：
SEQ ID No.4：
caggagcagctggtggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctgacactcacctgcacagcttctggattctccttcagtagcagctactggatgtgctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcggatgcatttatgctggtagtagtgataccacttactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacccggccacctatttctgtgcgagaggtgctaatgctgttggttatggtgatgatcgatttaatttgtggggcccaggcaccctggtcaccgtctcctcaa
SEQ ID No.5：
gcgcaagtgctgacccagactccatcttccaagtctgtcgctgtgggagacacagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttgctagtggcgacgacttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctacgaatcatccagactggcatatggggtcccaccgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgttcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcagttatttgtatgttggtttgtacgcagctttcggcggagggaccgaggtggtcgtcaaag
将获得的碱基序列翻译成氨基酸序列，分析，获得451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，所述抗 CLDN 18.2单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.7所示。
SEQ ID No.6-7具体序列如下：
SEQ ID No.6：
QEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYWMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSSDTTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADPATYFCARGANAVGYGDDRFNLWGPGTLVTVSS
SEQ ID No.7:
AQVLTQTPSSKSVAVGDTVTINCQSSQSVASGDDLAWYQQKPGQPPKLLIYESSRLAYGVPPRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYLYVGLYAAFGGGTEVVVK。
实施例2
本实施例为抗 CLDN 18.2单克隆抗体作为一抗的免疫组化检测，方法如下：
（1）样本切片准备：将经福尔马林固定石蜡包埋后的人体胃癌组织及正常胰腺组织切片于60℃恒温箱中烤片1-2h，保存备用。
（2）切片脱蜡：石蜡切片先置于新鲜二甲苯中进行脱蜡，浸泡2次，每次10 min。
（3）切片水化：依次经过无水乙醇，无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡5分钟进行水化，后纯化水冲洗2次，每次3 min。
（4）抗原修复：推荐使用高温热修复法修复3min（如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20 min），切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织圈起来，纯化水冲洗2次，每次3 min。
（5）内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10 min后，纯化水冲洗2次，每次3 min，PBST冲洗一次。
（6）一抗及市售对照抗体孵育：分别加入100μL的抗 CLDN 18.2单克隆抗体和市售CLDN 18.2对照抗体完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST冲洗3次,每次5min。
（7）二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。
（8）DAB显色：依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织，待颜色无加深终止染色，纯化水冲洗3次。
（9）苏木素复染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染，PBST或自来水冲洗返蓝。
（10）脱水透明：依次浸泡70％，85％，95％，100％，100％梯度酒精，每次3 min；2次二甲苯透明，每次5 min。
（11）封片：用中性树胶对样品进行封片和检测。
由图1结果可见，CLDN 18.2蛋白在胃癌组织中呈特异性细胞膜染色，在正常胰腺和CLDN18.1细胞系中均无特异性染色。在胃癌组织中，451I3V0抗CLDN 18.2重组兔单克隆抗体样品组CLDN 18.2信号强于市售 CLDN 18.2单抗组。在抗体浓度相同的情况下（0.5μg/ml）, 451I3V0克隆的抗体染色阳性信号较市售 CLDN 18.2单抗组染色阳性信号更强，这意味着451I3V0克隆的抗体灵敏度更高。如此，有利于获得更准确的评估和检测结果，同时在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，以降低生产成本，还可在保证灵敏度的情况下降低背景，使病理医生进行主观评判时更加方便，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。
实施例3
本实施例为对451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体亲和力的测定，测定方法如下：
（1）从4℃中取出如序列SEQ ID NO:1-3的 CLDN 18.2的多肽抗原，恢复至室温。稀释至浓度1μg/ml，按100μL/孔加到96孔酶标板上4℃孵育过夜，随后用2% BSA进行4℃封闭过夜。
（2）将451I3V0克隆的抗 CLDN 18.2重组兔单克隆抗体与市售抗 CLDN 18.2抗体分别稀释成初始浓度为2μg/mL，并依次进行2倍梯度稀释，共设7个浓度梯度进行对比。
（3）分别将稀释好的抗 CLDN 18.2单克隆抗体按照100μL/孔添加至有多肽的96孔酶标板上，盖上封板膜，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。
（4）反应结束后取出酶标板，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。
（5）按照二抗使用说明书稀释HRP标记羊抗兔IgG，以100μL/孔加入酶标板中，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。
（6）反应结束后取出酶标板，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。
（7）按100μL/孔加入TMB显色液，室温反应6分钟。
（8）反应结束后，按50μL/孔加入2M H2SO4终止显色。
（9）在酶标仪上于450nm读取OD值，整理数据，分析结果如图2所示。结果显示，在7个浓度梯度对比试验中，每个梯度浓度下，本发明的451I3V0克隆的抗 CLDN18.2单克隆抗体对Claudin18.2蛋白的亲和力相比市售抗体均更强、灵敏度也更高，可在较低抗体浓度条件下仍可以达到较高OD值，可以节约实验和检测成本。
实施例4
本实施例对451I3V0分泌抗 CLDN 18.2抗体与市售抗 CLDN 18.2抗体进行流式细胞术染色分析，实施方案如下：
（1）收集表达CLDN18.2蛋白细胞1*10^6个，用500μL PBS清洗一次，并用100μL PBS进行细胞重悬。
（2）分别向细胞内加入0.5μg市售抗 CLDN 18.2抗体与451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体，轻吹混合均匀并室温孵育15min。
（3）用500μL PBS清洗孵育完成细胞2次，并用100μL PBS进行重悬。
（4）向细胞内加入0.5μg Alexa fluor 488荧光标价羊抗兔荧光二抗，轻吹混合均匀后室温避光孵育15min。
（5）用500μL PBS清洗细胞2次，以洗净残余荧光二抗并重悬于500μL PBS内进行流式上机检测，采样20000个细胞进行分析两种抗体荧光信号强弱。
（6）荧光信号强度（MFI）结果如表1所示，流式分析检测结果如图3所示。
表1: 不同样品测得的荧光信号强度（MFI）对比
Figure 349819DEST_PATH_IMAGE001
上述实验结果显示，本发明的451I3V0抗 CLDN 18.2单克隆抗体具有更好的抗体亲和力，相同抗体用量条件下可以得到更高的荧光信号强度。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 苏州百道医疗科技有限公司
<120> 一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体及其应用
<130> EJS220189I
<141> 2022-02-15
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 373
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc 60
acctgcacag cttctggatt ctccttcagt agcagctact ggatgtgctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcatttatg ctggtagtag tgataccact 180
tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacccggcca cctatttctg tgcgagaggt 300
gctaatgctg ttggttatgg tgatgatcga tttaatttgt ggggcccagg caccctggtc 360
accgtctcct caa 373
<210> 5
<211> 337
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcgcaagtgc tgacccagac tccatcttcc aagtctgtcg ctgtgggaga cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtgttgct agtggcgacg acttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaatcat ccagactggc atatggggtc 180
ccaccgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtt 240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt caaggcagtt atttgtatgt tggtttgtac 300
gcagctttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaag 337
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Pro Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ala Asn Ala Val Gly Tyr Gly Asp Asp Arg Phe Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Ala Ser Gly
20 25 30
Asp Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ser Ser Arg Leu Ala Tyr Gly Val Pro Pro Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Leu Tyr
85 90 95
Val Gly Leu Tyr Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110

Claims (9)

1.一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.7所示。
2.编码基因，其特征在于，用于编码权利要求1所述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其包括：如SEQ ID No.4所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的重链可变区的DNA序列，以及如SEQ ID No.5所示的用于编码所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列。
4.一种核酸分子，其特征在于，其包括权利要求2或3所述的编码基因。
5.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求4所述的核酸分子。
6.一种抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其采用权利要求5所述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体。
7.权利要求1所述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体在制备CLDN18.2检测装置中的应用。
8.一种CLDN18.2检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。
9.根据权利要求8所述的CLDN18.2检测试剂盒，其特征在于，其包括：抗CLDN18.2重组兔单克隆抗体、HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素和返蓝液。
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