CN114516919B

CN114516919B - 一种抗pla2r重组兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN114516919B
Application number: CN202210413561.9A
Authority: CN
Inventors: 李静; 孟凡华; 程育苗; 刘杨; 张东旭
Original assignee: Suzhou Baidao Medical Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Baidao Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN114516919A

Abstract

本发明涉及一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。相比市售的抗PLA2R重组兔单克隆抗体，本发明提供的抗PLA2R重组兔单克隆抗体，与PLA2R蛋白具有更高亲和力，可高特异性和高灵敏度地识别和检测肿瘤细胞或免疫细胞上PLA2R蛋白的表达，可以更低浓度应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查过程中，有利于获得更准确的检测和评估结果，降低检测成本和背景信号的干扰。

Description

一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗PLA2R抗体及其应用，特别是在免疫组织化学检测方面的应用。

背景技术

特发性膜性肾病( idiopathic membranous nephropathy，IMN)是原发性肾小球疾病中的主要类型，近年来发病率呈逐渐上升且年轻化的趋势。作为一种自身免疫疾病，IMN靶抗原的寻找与检测一直是该疾病治疗的重点。国外相关文献指出，70% IMN 患者与靶抗原PLA2R（M-type phospholipase A2 receptor，M型磷脂酶A2受体）有关，这一数据在国内更高，另一种抗原为1型血小板反应蛋白7A 域( thrombospondin type1 domain-containing 7A，THSD7A)，仅占 IMN 的 2.5% -7.5%。

PLA2R是一种由肾小球足细胞表达，其介导产生的抗PLA2R抗体被认为是IMN的致病性抗体，是特发性膜性肾病诊断的合适标志物。当前国内诊断IMN主要以血清蛋白半定量法和免疫荧光法为主，但文献显示，血清蛋白半定量法敏感性仅为52-78％，而免疫荧光法也有无法长期保存的缺点。因此，免疫组织化学法可作为一种补充手段，可应用到IMN的诊断当中。

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过抗原抗体特异结合和组织化学显色反应，对靶标抗原进行定性、定位、定量的技术，是检测肿瘤中PLA2R免疫复合物表达水平的有效手段，PLA2R抗体的质量直接影响最终的显色结果。因此，获得一株高灵敏度、强特异性的抗PLA2R抗体对准确检测PLA2R的表达水平具有非常重要的作用。

发明内容

（一）要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种能准确识别PLA2R表达水平的抗PLA2R重组兔单克隆抗体（兔源抗体），该抗体可高特异性和灵敏度的识别细胞中PLA2R蛋白的表达，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域。本发明还涉及编码该抗PLA2R重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组质粒、制备方法及抗PLA2R重组兔单克隆抗体在PLA2R蛋白检测方法或装置中的应用等。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

优选地，所述抗 PLA2R单克隆抗体的重链恒定区亚型为IgG型，所述轻链恒定区的亚型为κ型，所述抗体能够识别重组PLA2R抗原蛋白和肿瘤细胞和免疫细胞上的PLA2R分子，因此可应用在免疫组化病理诊断剂中，用于免疫组织化学检测，以准确检测细胞中PLA2R蛋白的表达水平。

所述抗 PLA2R单克隆抗体由哺乳动物细胞重组表达获得。具体地，本发明提供的抗PLA2R重组兔单克隆抗体是通过兔杂交瘤融合筛选，293细胞真核表达产生。在制备所述抗 PLA2R单克隆抗体时，免疫兔子（新西兰大白兔）用的抗原为合成多肽，所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1-3所示，由人工化学合成得到。经免疫兔子、细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗PLA2R单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，分离其分离出总RNA，使用分子克隆技术获得编码所述抗体重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的核苷酸序列，将核苷酸序列构建在真核表达载体上，利用表达载体转染试剂转染到293细胞系，由真核细胞大量表达所述抗体，收集细胞上清，经Protein A柱亲和层析纯化细胞上清，获得兔单克隆抗体。免疫组织化学检测显示该抗体能特异性识别PLA2R蛋白。

第二方面，本发明提供编码基因，用于编码上述抗PLA2R重组兔单克隆抗体。

优选地，所述编码基因包括如SEQ ID No.4所示的DNA序列，用于编码所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体的重链可变区；以及如SEQ ID No.5所示的DNA序列用于编码所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体的轻链可变区。

第三方面，本发明涉及一种核酸分子，其包括用于编码所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体的编码基因。

第四方面，本发明保护一种表达载体，其包括上述的核酸分子。

第五方面，本发明提供一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体的制备方法，采用上述表达载体转染细胞，培养转染后的细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体。

更优选地，所述制备方法包括如下步骤：

（1）免疫兔子：先对 PLA2R蛋白分子序列进行分析，依据PLA2R在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择和使用合适的多肽序列作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后作为免疫原，免疫兔子；所述多肽为SEQ ID No.1-3所示的人工合成多肽；

（2）制备杂交瘤细胞系：经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞系，从杂交瘤细胞系中分离出总RNA；

（3）获得抗体序列：利用特异性的引物，通过PCR扩增技术获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列；

（4）抗体表达和纯化：将所述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染方法瞬时转染培养的细胞，培养后收集上清，使用Protein A纯化上清液，得到纯度＞95％的抗体。所述细胞为239细胞。

第六方面，所述的抗PLA2R重组兔单克隆抗体、编码基因、核酸分子、表达载体在制备PLA2R蛋白分子检测装置中的应用。所述检测装置包括但不限于试剂盒、抗体芯片等。

第七方面，本发明还提供一种PLA2R检测试剂盒，其包括上述的抗PLA2R重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。

优选地，所述PLA2R检测试剂盒包括：抗PLA2R重组兔单克隆抗体、HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素、返蓝液。

在进行免疫组织化检测时，检测步骤包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、复染、脱水、封片和镜检等步骤。

（三）有益效果

本发明提供的抗PLA2R重组兔单克隆抗体，与PLA2R蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度，能够特异性地识别和检测细胞中PLA2R蛋白的表达，在检测PLA2R蛋白时呈阳性高表达，因此该抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Westernblotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得准确的评估和检测结果。与市售抗PLA2R单克隆抗体相比，本发明的54D11克隆的PLA2R重组兔单克隆抗体由于其特异性好，阳性信号强等特点，在IHC染色中评分更容易，对于检测区分肾病类型更准确。

附图说明

图1为本发明制备的抗PLA2R单克隆抗体与市售抗PLA2R单克隆抗体在肾癌组织的免疫组化检测结果比对图，一抗使用浓度为0.5μg/mL。

图2为本发明的54D11抗PLA2R单克隆抗体与市售抗PLA2R单克隆抗体在7个梯度浓度下效价检测的统计图。

图3为向表达PLA2R蛋白的细胞中加入等量的市售抗PLA2R抗体与54D11抗PLA2R单克隆抗体后进行流式细胞术染色分析，得到的空白对照、市售抗 PLA2R抗体样品、54D11抗PLA2R单抗样品三者的荧光信号强度（MFI）对比图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。人体组织样本是经过福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织样本，均进行了病理证实，并有患者知情同意书。

实施例1

本实施例为抗PLA2R重组兔单克隆抗体的制备和筛选，步骤包括：

（1）抗原制备

PLA2R抗原具体序列如下所示的SEQ ID NO:1-3。

SEQ ID No. 1：IGLQEERANDEFRWRDGTPVIYQNWD

SEQ ID No. 2：SNWGIRKPDTDYFKP

SEQ ID No. 3：DTGEYTWKPVGQKPE。

上述多肽序列是通过对 PLA2R分子序列进行分析，依据 PLA2R蛋白分子在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构后选择出来的。人工合成SEQ IDNO:1-3所示序列的多肽，并将合成的多肽作为免疫兔子用的抗原。免疫时，将SEQ ID NO:1-3所示序列的多肽经由KLH或OVA偶联后作为免疫原免疫兔子。

（2）免疫

将SEQ ID NO:1-3的多肽序列分别与完全弗氏佐剂1:1混合并乳化，采用皮下注射方法分别免疫不同的新西兰大白兔，间隔两周后将含有上述具体序列（SEQ ID NO:1-3）的PLA2R抗原与不完全弗氏佐剂1:1乳化进行第二次和第三次免疫。三次免疫后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；选取与SEQ ID NO:1-3抗原免疫一一对应的抗体效价最高的兔子分别进行下一步的细胞融合。

（3）细胞融合

提前准备鼠来源的sp2/0骨髓瘤细胞，使融合时该sp2/0骨髓瘤细胞处于对数生长期。取已免疫兔脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；兔脾淋巴细胞与所述骨髓瘤细胞混合，滴加50％PEG1500，加入IMDM培养基，离心弃上清后加入HAT培养基轻柔悬浮混匀，定容至800mL后分装于96孔板中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。融合6-9天后观察96孔板中融合细胞状态，换液用HT继续置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。

（4）筛选和克隆

融合7-10天后使用PLA2R抗原（SEQ ID NO:1-3）进行ELISA测试来筛选克隆细胞。标记好相应细胞株号，对阳性孔细胞进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑选出阳性值高的单克隆稳定株，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株，记录为54D11。

（5）将筛选好的杂交瘤细胞株进行抗体测序

依据试剂TriZol说明书，从54D11杂交瘤细胞中分离出总RNA，依据TIANScript第一链cDNA合成试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，利用特异性引物（重链可变区引物，VH-F ：AGACTGGGCTGCGCTGGCTTC，VH-RGTGAGGGTGCCCGAG；轻链可变区引物：VK-FATGGACAYGAGGGCCCCCACTC，VK-R: GGTGGGAAGATGAGGACAGTAGG）扩增获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列，然后将抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列克隆至真核表达载体（InvivoGen，pfuse-rchg，pfuse2-rclk1）中，准备进行细胞转染。

（6）细胞转染与筛选

提前准备好待转染用的293细胞，离心换新鲜的培养基后分别放入24孔板中，按所需要的数量每孔1.5ml，密度为3×10⁶个/ml。

将上述真核表达载体与PEI按比例1:6混合后加入到准备好的293细胞中，置于37℃、5％CO₂的摇床中培养。培养3-5天后将转染的细胞上清与对应抗原进行ELISA检测来筛选阳性孔，再将阳性孔的细胞上清继续进行免疫组织化学法检测，如果免疫组织化学法检测阳性则确认测出的抗体序列正确。

（7）细胞上清单抗的制备与纯化

将确认阳性的表达载体进行大量的细胞转染，继续培养3-5天后，收取细胞悬液，离心后取上清，利用亲和层析法进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、于4-8℃冰箱中保存。

最终，54D11抗 PLA2R单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ IDNo.4所示的DNA序列所编码，抗 PLA2R单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.5所示的DNA序列所编码。

SEQ ID No.4-5具体序列如下：

SEQ ID No.4：

cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcacagtctctggaatcgacctcagtagccatggaatgggctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggatacattaatactggtggtagcgcatactacgcgagctgggcaaaaggccgattcaccatctccagaacctcgaccacggtggatctgaaaatgaccagtctgacaaccgaggacacggccactatttctgtgccagaggcgatcctgattatactagtggttttcccatctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcctcag

SEQ ID No.5：

gacattgtgatgacccagactccagcctccgtgtctgaacctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcattagcagttggttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagcgcctgatctaccaggcatccaaactggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacagagtacactctcaccatcagcgacctggagtgtgccgatgctgccacttactactgtcaaaacaattatggtcgtagtagtagtagttatgggggggggtgtgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaag。

将获得的碱基序列翻译成氨基酸序列，分析，获得54D11抗PLA2R重组兔单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.7所示。

SEQ ID No.6-7具体序列如下：

SEQ ID No.6：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSHGMGWVRQAPGKGLEWIGYINTGGSAYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDPDYTSGFPIWGPGTLVTVSS

SEQ ID No.7:

AFEMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASESISSWLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYSSHNIDNIFGGGTEVVVR。

实施例2

本实施例为抗PLA2R重组兔单克隆抗体作为一抗的免疫组化检测，方法如下：

（1）样本切片准备：将经福尔马林固定石蜡包埋后的肾癌组织切片于60℃恒温箱中烤片1-2h，保存备用。

（2）切片脱蜡：石蜡切片先置于新鲜二甲苯中进行脱蜡，浸泡2次，每次10 min。

（3）切片水化：依次经过无水乙醇，无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡5分钟进行水化，后纯化水冲洗2次，每次3 min。

（4）抗原修复：推荐使用高温热修复法修复3min（如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20 min），切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织圈起来，纯化水冲洗2次，每次3 min。

（5）内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10 min后，纯化水冲洗2次，每次3 min，PBST冲洗一次。

（6）一抗及市售对照抗体孵育：分别加入100μL的54D11抗PLA2R重组兔单克隆抗体和市售 PLA2R对照抗体完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST冲洗3次,每次5min。

（7）二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。

（8）DAB显色：依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织，待颜色无加深终止染色，纯化水冲洗3次。

（9）苏木素复染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染，PBST或自来水冲洗返蓝。

（10）脱水透明：依次浸泡70％，85％，95％，100％，100％梯度酒精，每次3 min；2次二甲苯透明，每次5 min。

（11）封片：用中性树胶对样品进行封片。

由图1结果可见， PLA2R1蛋白在肾组织中呈特异性肾小球膜染色，在肾小管等其他区域则无特异性染色，并且在抗体浓度相同的情况下（0.6μg/ml），54D11抗PLA2R重组兔单克隆抗体样品组PLA2R信号强于市售 PLA2R抗体组。这就意味着，本发明的54D11克隆的PLA2R重组兔单克隆抗体在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，以降低生产成本，同时在保证灵敏度的情况下降低背景，使病理医生进行主观评判时更加方便，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。

实施例3

本实施例为对54D11抗PLA2R重组兔单克隆抗体亲和力的测定，测定方法如下：

（1）从4℃中取出纯化的PLA2R的蛋白，恢复至室温。稀释至浓度1μg/ml，按100μL/孔加到96孔酶标板上4℃孵育过夜，随后用2% BSA进行4℃封闭过夜。

（2）将54D11克隆的PLA2R重组兔单克隆抗体与市售抗PLA2R抗体分别稀释成初始浓度为0.5μg/mL，并依次进行2倍梯度稀释，共设7个浓度梯度进行对比。

（3）分别将稀释好的抗PLA2R重组兔单克隆抗体按照100μL/孔添加至有多肽的96孔酶标板上，盖上封板膜，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。

（4）反应结束后取出酶标板，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。

（5）按照二抗使用说明书稀释HRP标记羊抗兔IgG，以100μL/孔加入酶标板中，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。

（6）反应结束后取出酶标板，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。

（7）按100μL/孔加入TMB显色液，室温反应6分钟。

（8）反应结束后，按50μL/孔加入2M H₂SO₄终止显色。

（9）在酶标仪上于450nm读取OD值，整理数据，分析结果如图2所示。

结果显示，在7个浓度梯度对比试验中，每个梯度浓度下，本发明的54D11克隆的抗PLA2R重组兔单克隆抗体对PLA2R蛋白分子的亲和力相比市售抗体均更强、灵敏度也更高，可在较低抗体浓度条件下仍可以达到较高OD值，可以节约实验和检测成本。

实施例4

本实施例对54D11分泌抗 PLA2R抗体与市售抗 PLA2R抗体进行流式细胞术染色分析，实施方案如下：

（1）收集表达PLA2R蛋白细胞1×10^6个，用500μL PBS清洗一次，并用100μL PBS进行细胞重悬。

（2）分别向细胞内加入0.5μg市售抗 PLA2R抗体与54D11克隆的抗PLA2R重组兔单克隆抗体，轻吹混合均匀并室温孵育15min。

（3）用500μL PBS清洗孵育完成细胞2次，并用100μL PBS进行重悬。

（4）向细胞内加入0.5μg Alexa fluor 488荧光标价羊抗兔荧光二抗，轻吹混合均匀后室温避光孵育15min。

（5）用500μL PBS清洗细胞2次，以洗净残余荧光二抗并重悬于500μL PBS内进行流式上机检测，采样20000个细胞进行分析两种抗体荧光信号强弱。荧光信号强度（MFI）结果如表1所示，流式分析检测结果如图3所示。

表1: 不同样品测得的荧光信号强度（MFI）对比

上述实验结果显示，本发明的54D11抗PLA2R重组兔单克隆抗体具有更好的抗体亲和力，相同抗体用量条件下可以得到更高的荧光信号强度。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 苏州百道医疗科技有限公司

<120> 一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体及其应用

<130> EJS220191I

<141> 2022-02-15

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Ile Gly Leu Gln Glu Glu Arg Ala Asn Asp Glu Phe Arg Trp Arg Asp

1 5 10 15

Gly Thr Pro Val Ile Tyr Gln Asn Trp Asp

20 25

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ser Asn Trp Gly Ile Arg Lys Pro Asp Thr Asp Tyr Phe Lys Pro

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Asp Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Pro Val Gly Gln Lys Pro Glu

1 5 10 15

<210> 4

<211> 348

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60

tgcacagtct ctggaatcga cctcagtagc catggaatgg gctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggaatggat cggatacatt aatactggtg gtagcgcata ctacgcgagc 180

tgggcaaaag gccgattcac catctccaga acctcgacca cggtggatct gaaaatgacc 240

agtctgacaa ccgaggacac ggccactatt tctgtgccag aggcgatcct gattatacta 300

gtggttttcc catctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctcag 348

<210> 5

<211> 343

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaagtgcc aggccagtca gagcattagc agttggttat cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcctc ccaagcgcct gatctaccag gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatcg 180

cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt 240

gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaaac aattatggtc gtagtagtag tagttatggg 300

ggggggtgtg ctttcggcgg agggaccgag gtggtggtca aag 343

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser His Gly

20 25 30

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp

85 90 95

Pro Asp Tyr Thr Ser Gly Phe Pro Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Ala Phe Glu Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ser His Asn

85 90 95

Ile Asp Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Arg

100 105 110

Claims

1.一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.7所示。

2.编码基因，其特征在于，用于编码权利要求1所述的抗PLA2R重组兔单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其包括：如SEQ ID No.4所示的DNA序列，以用于编码所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体的重链可变区，以及如SEQ ID No.5所示的DNA序列，以用于编码所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体的轻链可变区。

4.一种核酸分子，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的编码基因。

5.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子。

6.一种抗PLA2R重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其采用权利要求5所述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗PLA2R重组兔单克隆抗体。

7.权利要求1所述的抗PLA2R重组兔单克隆抗体、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体在制备PLA2R检测装置中的应用。

8.一种PLA2R检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的抗PLA2R重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。

9.根据权利要求8所述的PLA2R检测试剂盒，其特征在于，其包括：抗PLA2R重组兔单克隆抗体、HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素和返蓝液。