CN114874327B - 一种检测孕激素受体的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测孕激素受体的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于免疫检测技术领域。本发明的用于检测孕激素的单克隆抗体利用SEQ ID NO:2所示的免疫原重组蛋白片段免疫实验兔得到，其重链可变区的CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3序列和轻链可变区的CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3序列分别如SEQ ID NO:13～18所示。利用本发明的用于检测孕激素的单克隆抗体对孕激素进行检测，特异性强、准确度高，对于临床上乳腺癌的预测、诊断、用药指导和预后具有非常大的临床应用价值。

Description

一种检测孕激素受体的单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体地，涉及一种检测孕激素受体的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌在恶性肿瘤中的比例为23％，属于常见的恶性肿瘤。乳腺癌的诊断、治疗及预后与乳腺癌的组织病理学分期与雌激素受体α(Estrogen receptor-α，ER-α)和孕激素受体(Progesterone receptor，PR)的表达及表达程度有很大相关性，已知PR可以被ER-α诱导，并在ER-α蛋白的调控中发挥重要作用，因此，PR常作为ER-α功能的一项指标。ER-α和PR的表达情况与患者的内分泌治疗效果相关。目前，ER-α、PR检测广泛应用于乳腺癌患者的预后判断与指导用药，因此，对ER-α和PR的准确检测，是乳腺癌患者接受恰当治疗的重要依据。
我国相关乳腺癌诊治指南已将ER-α、PR的免疫组织化学检测列为乳腺癌患者的常规检测项目，并用于指导患者的内分泌治疗。ER-α和PR抗体试剂及检测试剂盒是利用免疫组织化学法，对病理组织切片中雌激素受体或孕激素受体进行检测的试剂。此类试剂为特异性单克隆或多克隆抗体，或抗体与显色系统、对照试剂、质控片(如有)及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂，用于乳腺癌患者的预后判断、指导用药及对其它肿瘤的鉴别诊断。
然而，由于抗体试剂的特异性和亲和力不足，目前ER-α、PR检测在不同临床检测机构之间、不同检测试剂之间存在测定结果差异，甚至检测结果中存在一定比例的假阳性和假阴性结果。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采取的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种用于检测孕激素受体(PR)的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1，获得孕激素受体的免疫原重组蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S2，将所述免疫原重组蛋白片段与免疫佐剂混合后注射实验兔进行免疫；
S3，取实验兔抗凝血分离外周血单核细胞，使用生物素标记并筛选外周血单核细胞中的B细胞，获取表达抗孕激素受体的B细胞遗传信息进行扩增重组，载入载体后转染载体细胞，载体细胞培养分泌的抗体经过纯化后获得所述单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，将所述免疫原重组蛋白片段利用PBS缓冲液稀释至0.5～2mg/mL。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，所述免疫佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，共免疫4次。进一步地，首次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫使用弗氏不完全佐剂，如此能够获得更好的免疫效果。
在本发明的一些实施方案中，步骤S3中，所述筛选外周血单核细胞中的B细胞是指筛选血清滴度满足要求的B细胞。
本发明的第二方面提供利用本发明第一方面任一所述的制备方法得到的用于检测孕激素受体的单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列和轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列分别如SEQID NO:13～18所示。
进一步地，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体包括SEQ ID NO:11所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
本发明的第三方面提供一种用于检测孕激素受体的单克隆抗体，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列和轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列分别如SEQ ID NO:13～18所示。值得说明的是，虽然本方面提供的单克隆抗体与本发明第二方面的一些实施方案相同，但是，本方面的抗体不局限于利用本发明第一方面所述的制备方法得到。本领域技术人员可以利用任意生物的或化学的方法得到本方面的单克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方案中，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体包括SEQ ID NO:11所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
本发明第四方面提供一种用于对乳腺癌进行预测、诊断、提供用药指导或判断预后的试剂盒，其特征在于，包括本发明第二方面或本发明第三方面任一所述的用于检测孕激素受体的单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括PR阳性对照组织和/或PR阴性对照组织。
进一步地，所述PR阳性对照组织选自包括宫颈组织、子宫内膜组织和已知PR表达阳性的乳腺癌组织的阳性组织的组中的至少一种。其中宫颈组织阳性着色区域为复层上皮基底层细胞和间质细胞；子宫内膜阳性着色区域为腺泡上皮细胞和间质细胞；PR表达阳性的乳腺癌组织阳性着色区域为阳性肿瘤细胞和癌旁正常乳腺导管上皮细胞。
进一步地，所述PR阴性对照组织选自包括已知PR表达阴性的乳腺癌组织的组中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测雌激素受体α(ER-α)的单克隆抗体。孕激素受体和雌激素受体是与乳腺癌密切相关的两种激素受体，对两者进行检测，能够更加准备地对乳腺癌进行预测、诊断、提供用药指导和/或预后。在这里，所述的用于检测孕激素受体的单克隆抗体没有任何限定，其可以是任意商用的或实验室制备的能够与孕激素受体特异性结合的单克隆抗体。
在本发明中，进一步根据ER检测结果提供用药指导，具体地，PR阳性(ER+/PR+及ER－/PR+)患者优先使用他莫昔芬，而PR阴性(ER+/PR-)患者常对他莫昔芬产生耐药，可优先推荐芳香酶类药物进行治疗。
在本发明的一些实施方案中，所述用于检测雌激素受体α的单克隆抗体利用以下步骤制备得到：
S1'，获得雌激素受体α的免疫原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
S2'，将所述免疫原多肽与血蓝蛋白交联，与免疫佐剂混合后注射实验兔进行免疫；
S3'，取实验兔抗凝血分离外周血单核细胞，使用生物素标记并筛选外周血单核细胞中的B细胞，获取表达抗雌激素受体α抗体的B细胞遗传信息进行扩增重组，载入载体后转染载体细胞，载体细胞培养分泌的抗体经过纯化后获得所述用于检测雌激素受体α的单克隆抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述用于检测雌激素受体α的单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列和轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列分别如SEQ ID NO:5～10所示。
在本发明的一些优选实施方案中，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括ER-α阳性对照组织和/或ER-α阴性对照组织。
进一步地，所述ER-α阳性对照组织选自包括宫颈组织、子宫内膜组织和已知ER-α表达阳性的乳腺癌组织的阳性组织的组中的至少一种。其中宫颈组织阳性着色区域为大多数鳞状上皮细胞和间质细胞；子宫内膜阳性着色区域为腺泡上皮细胞和间质细胞；ER-α表达阳性的乳腺癌组织阳性着色区域为阳性肿瘤细胞和癌旁正常乳腺导管上皮细胞。
进一步地，所述ER-α阴性对照组织选自包括已知ER-α表达阴性的乳腺癌组织的组中的至少一种。
在本发明中，所述试剂盒基于免疫方法进行检测。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫方法选自包括免疫组织化学法、免疫荧光法、酶联免疫法、免疫印迹法的组中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方案中，所述免疫方法为免疫组织化学法，所述试剂盒还包括二抗和/或显色剂。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明利用特定序列的雌激素受体α免疫原多肽和孕激素受体免疫原重组蛋白片段，分别制备了抗雌激素受体α单克隆抗体和抗孕激素受体单克隆抗体，方法简单。
本发明的抗雌激素受体α单克隆抗体和抗孕激素受体单克隆抗体亲和力强，其中，抗ER-α单克隆抗体竞争ELISA检测结果显示，该抗体识别ER-α全长重组蛋白的半数抑制浓度(IC50)为6.71ng/mL，亲和力解离常数Kd值达到9.2×10-11。抗PR单克隆抗体B竞争ELISA检测，该抗体识别PR重组蛋白片段的半数抑制浓度(IC50)为33.1ng/mL，亲和力解离常数Kd值达到1.18×10-9。
本发明的抗雌激素受体α单克隆抗体和抗孕激素受体单克隆抗体特异性强，抗雌激素受体α单克隆抗体能够与雌激素受体α结合而不能与雌激素受体β结合，抗孕激素受体单克隆抗体能够与孕激素受体特异性结合。
分别利用本发明的抗雌激素受体α单克隆抗体和抗孕激素受体单克隆抗体对正常组织和非正常组织进行免疫组织化学检测，特异性强，准度度高。
利用本发明的抗雌激素受体α单克隆抗体和抗孕激素受体单克隆抗体进行联合检测，能够进一步提高检测的准确度，用于乳腺癌的预测、诊断、用药指导和预后。
附图说明
图1示出了本发明实施例2中抗ER-α单克隆抗体iELISA检测结果。
图2示出了本发明实施例2中抗PR单克隆抗体iELISA检测结果。
图3示出了本发明实施例3中抗ER-α单克隆抗体B亲和力检测结果。
图4示出了本发明实施例3中抗PR单克隆抗体B亲和力检测结果。
图5示出了本发明实施例4中抗ER-α单克隆抗体B特异性检测结果，M：蛋白质Marker。
图6示出了本发明实施例4中抗PR单克隆抗体B特异性检测结果，M：蛋白质Marker。
图7未出了本发明实施例5中抗ER-α单克隆抗体B对阳性和阴性组织样本进行检测的结果。
图8未出了本发明实施例5中抗PR单克隆抗体B对阳性和阴性组织样本进行检测的结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1抗ER-α单克隆抗体和抗PR单克隆抗体的制备
本实施例利用以下步骤制备抗ER-α和抗PR兔单克隆抗体：
(1)合成或获得包含ER-α氨基酸序列aa560至aa595的多肽，如下所示(SEQ ID NO:1)：
VEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATV
合成或获得包含PR氨基酸序列aa750至aa933的重组蛋白片段，氨基酸序列序列如下所示(SEQ ID NO:2)：
LIQYSWMSLMVFGLGWRSYKHVSGQMLYFAPDLILNEQRMKESSFYSLCLTMWQIPQEFVKLQVSQEEFLCMKVLLLLNTIPLEGLRSQTQEMRSSYIRELIKAIGLRQKGVVSSSQRFYQLTKLLDNLHDLVKQLHLYCLNTFIQSRALSVEFPEMMSEVIAAQLPKI LAGMVKPLLF HKK
(2)将上述ER-α的多肽与KLH(Thermo ScientificTM，货号：77649)交联并使用PBS缓冲液稀释至1mg/mL。将上述PR的重组蛋白片段直接用PBS缓冲液稀释至1mg/mL。
(3)免疫原与佐剂等体积混合后通过腹股沟皮下注射实验兔进行免疫，共免疫4次，每种免疫原免疫2只实验兔。首次免疫时使用弗氏完全佐剂混合抗原注射，后续免疫使用弗氏不完全佐剂混合抗原注射。
(4)第4次免疫后第7天取实验兔血分离血清，使用2μg/mL ER-α免疫原多肽和PR免疫原重组蛋白分别包被96孔酶标板，利用间接酶联免疫吸附试验(iELISA)检测实验兔的血清滴度。实验兔血清从1:200开始按照4倍倍比稀释6个梯度最终取1:64000时OD450读值高于0.5血清合格。
(5)血清值合格的实验兔采抗凝血，使用淋巴细胞分离液分离并收集外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。
(6)分离的淋巴细胞分别使用生物素交联的ER-α免疫原多肽和PR免疫原重组蛋白孵育结合后，加入填充抗生物素磁珠的吸附柱的和磁力架吸附并洗脱杂细胞后收集特异性淋巴细胞。
(7)将收集的特异性淋巴细胞进行稀释，种至96孔板培养。
(8)细胞培养7天后天取上清进行iELISA检测。使用2μg/mL ER-α免疫原多肽和PR免疫原重组蛋白片段分别包被96孔酶标板，利用间接ELISA法检测细胞上清滴度，取OD450读值高于0.5的上清合格。
(9)将上清合格孔内的淋巴细胞裂解提取mRNA为模板，逆转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得阳性B细胞克隆抗体的H链和L链基因，并将其转入大肠杆菌中，提取其质粒后转入真核细胞内表达为抗ER-α单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。
利用以上方法分别得到抗ER-α单克隆抗体A和抗ER-α单克隆抗体B，来自两个不同的利用实验兔；分别得到抗PR单克隆抗体A和抗PR单克隆抗体B，来自另外两个不同的实验兔。
实施例2抗ER-α单克隆抗体和抗PR单克隆抗体效价的检测
使用间接酶联免疫吸附试验(简称iELISA)方法检测实施例1制备的抗ER-α兔单克隆抗体和抗PR兔单克隆抗体的效价，并根据标准曲线计算每个抗体的半数有效浓度(EC50)。
分别使用ER-α免疫原多肽和PR重组蛋白片段包被96孔酶标板，包被浓度为1μg/ml。4个一抗样品起始稀释浓度均为1000ng/mL，随后在稀释板上利用5％脱脂奶粉作为稀释液纵向作4倍倍比稀释，共7个梯度，第8孔加稀释液作为阴性对照孔。检测结果如表1、图1和图2所示。
表1抗ER-α兔单克隆抗体和抗PR兔单克隆抗体iELISA检测结果
Figure BDA0003706400990000091
抗ER-α单克隆抗体B经过iELISA检测，其EC50为6.34ng/mL，抗ER-α单克隆抗体A经过iELISA检测，其EC50为676ng/mL。抗PR单克隆抗体B经过iELISA检测，其EC50为7.88ng/mL，抗PR单克隆抗体A经过iELISA检测，其EC50为966ng/mL。
由此可见，抗ER-α单克隆抗体B和抗PR单克隆抗体B效价均比抗ER-α单克隆抗体A和抗PR单克隆抗体A高出2个数量级。
经检测可知，抗ER-α单克隆抗体B的重链可变区序列如下：
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGVDLSSYAMTWVRQAPGEGLEWIGGIGSRGSTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTAADTATYFCTGTGIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)
其轻链可变区序列如下：
DPVMTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSESVYNGNNLSWHQQKPGQPPKRLIYFTSTLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAGGYSSSSGWYTTFGGGTEVVVKGDP(SEQ ID NO:4)
抗ER-α单克隆抗体B的6个CDR序列分别如下：
(1)CDR-H1氨基酸序列为：SYAMT(SEQ ID NO:5)。
(2)CDR-H2氨基酸序列为：GIGSRGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:6)。
(3)CDR-H3氨基酸序列为；TGI(SEQ ID NO:7)。
(1)CDR-L1氨基酸序列为：QSSESVYNGNNLS(SEQ ID NO:8)。
(2)CDR-L2氨基酸序列为：FTSTLES(SEQ ID NO:9)。
(3)CDR-L3氨基酸序列为：AGGYSSSSGWYTT(SEQ ID NO:10)。
抗PR单克隆抗体B的重链可变区序列如下：
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGIDLNKNGIHWVRQAPGEGLEWIGYIWSDSSTDYASWAKGRFTISETSTTVELKIASPTTEDTASYFCSRGGFGLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)
其轻链可变区序列如下：
QVLTQTASPVSAAVGGTVTINCQSSKSVYNNNWLSWFQQKPGQPPKLLIYEISTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGGYDCNSDDCNVFGGGTEVVVKGDP(SEQ ID NO:12)
抗PR单克隆抗体B的6个CDR序列分别如下：
(1)CDR-H1氨基酸序列为：KNGIH(SEQ ID NO:13)。
(2)CDR-H2氨基酸序列为：YIWSDSSTDYASWAKG(SEQ ID NO:14)。
(3)CDR-H3氨基酸序列为；GGFGL(SEQ ID NO:15)。
(4)CDR-L1氨基酸序列为：QSSKSVYNNNWLS(SEQ ID NO:16)。
(5)CDR-L2氨基酸序列为：EISTLAS(SEQ ID NO:17)。
(6)CDR-L3氨基酸序列为：LGGYDCNSDDCNV(SEQ ID NO:18)。
实施例3抗ER-α单克隆抗体和抗PR单克隆抗体亲和力的检测
使用竞争ELISA方法检测抗ER-α单克隆抗体B和抗PR单克隆抗体B的抗体亲和力，并根据亲和力标准曲线计算抗体的半数有效抑制浓度(50％of EffectiveConcentration，IC50)所对应的摩尔浓度，即亲和力常数。
抗原抗体的结合是一个可逆的反应：A+B AB(A表示抗体，B表示抗原，AB表示抗原抗体结合物)。当反应达到平衡时，解离常数Kd＝[A][B]/[AB]，[AB]表示反应平衡时抗原抗体结合物的浓度，[A]表示反应平衡时游离抗体的浓度，[B]表示反应平衡时游离抗原的浓度。当反应体系中抗体量远小于抗原量时，反应平衡后[AB]>[A]；当反应体系中抗原量远小于抗体量时，反应达到平衡后[AB]<[A]；当反应体系中抗原抗体的量刚好合适时，反应达到平衡后处于半饱和状态，此时[AB]＝[A],则Kd＝[A][B]/[AB]＝[B]。
在半饱和状态下，如果抗体的浓度很低，反应消耗的抗原很少，则反应后游离的抗原浓度[B]约等于总的抗体浓度[B]总，此时Kd＝[B]≈[B]总。因此，只要在抗体浓度较低的情况下，找到可以在反应平衡后达到半饱和状态的抗原浓度[B]总，便可以得到解离常数。
分别使用ER-α免疫原多肽和PR重组蛋白片段包被96孔酶标板，包被浓度为0.1μg/mL，抗ER-α单克隆抗体B的使用浓度为200ng/mL，抗PR单克隆抗体B的使用浓度为10ng/mL。竞争物ER-α和PR重组蛋白片段的初始浓度为2.5μg/mL，随后在稀释板上横向作4倍倍比系列稀释，共10个梯度。取50μL/孔系列稀释的竞争物与50μL/孔单克隆抗体样品置于30℃，孵育1小时。另取抗ER-α单克隆抗体B和抗PR单克隆抗体B和稀释液分别作为系统对照和空白对照，同样置于30℃孵育60分钟。
使用竞争法ELISA检测上述样品，检测结果如表2～表3、图3～图4所示。
表2 ER-α竞争ELISA亲和力检测结果
Figure BDA0003706400990000111
表3 PR竞争ELISA亲和力检测结果
Figure BDA0003706400990000112
抗ER-α单克隆抗体B竞争ELISA检测结果显示，该抗体识别ER-α全长重组蛋白的半数抑制浓度(IC50)为6.71ng/mL，亲和力解离常数Kd值为9.2×10-11。
抗PR单克隆抗体B竞争ELISA检测，该抗体识别PR重组蛋白片段的半数抑制浓度(IC50)为33.1ng/mL，亲和力解离常数Kd值为1.18×10-9。
实施例4抗ER-α单克隆抗体和抗PR单克隆抗体特异性的检测
使用蛋白质免疫印迹法，即Western Blot(WB)方法检测抗ER-α单克隆抗体B和抗PR单克隆抗体B的抗体结合特异性。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白、细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
实验详细步骤按照常规蛋白质免疫印迹法进行，羊抗兔IgG HRP(H+L)二抗稀释度为1:4000，ECL底物显色后置于化学发光成像仪中曝光并拍照，曝光时间为5秒。
蛋白上样量如表4所示：
表4蛋白上样量
蛋白上样信息 上样量(μg/lane)
ER-α全长重组蛋白裂解液 2
ER-β全长重组蛋白裂解液 2
PR重组蛋白片段裂解液 2
样品稀释如表5所示：
表5样品稀释度
Figure BDA0003706400990000121
抗ER-α单克隆抗体B与ER-α全长蛋白裂解液进行Western Blot检测后，结果为阳性，且阳性条带在66kD附近，与理论分子量一致；与ER-β全长蛋白裂解液进行Western Blot检测后，结果为阴性(如图5所示)。表明抗ER-α单克隆抗体B不识别ER-β全长蛋白，只识别ER-α全长重组蛋白，表明抗ER-α单克隆抗体B具有非常高的特异性。
抗PR单克隆抗体B与PR重组蛋白片段裂解液进行Western Blot检测后，结果为阳性，且阳性条带在25-37kD之间，与理论分子量一致。说明抗PR单克隆抗体B对PR重组蛋白片段具有特异性。
实施例4抗ER-α单克隆抗体和抗PR单克隆抗体在免疫组织化学检测中的应用
免疫组织化学即Immunohistochemistry(IHC)，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量的技术。实验切片经抗原热修复处理后与一抗试剂进行孵育，在原位形成一抗与目标抗原的抗原-抗体复合物；抗原-抗体复合物中一抗分子再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的聚合物二抗通过孵育结合，在原位进一步形成抗原-抗体-二抗聚合物的复合物；最后通过HRP催化二氨基联苯胺(DAB)在抗原部位形成棕色沉积物。光学显微镜下通过观察棕色部位来确定是否有目标抗原及其表达情况。
(1)ER检测
抗ER-α单克隆抗体在阳性对照组织上的染色结果为阳性，阳性着色的定位应准确，无背景染色；空白对照和阴性对照染色结果为阴性，如图7所示。
阳性对照组织可选择：宫颈、子宫内膜、已知ER-α表达阳性的乳腺癌或其它阳性组织。亚细胞定位为细胞核，细胞质和细胞膜为阴性。其中宫颈阳性着色区域为大多数鳞状上皮细胞和间质细胞阳性；子宫内膜阳性着色区域为腺泡上皮细胞、间质细胞；ER-α表达阳性的乳腺癌阳性着色区域为阳性肿瘤细胞、癌旁正常乳腺导管上皮细胞。对照组织中血管内皮细胞均为阴性。
阴性对照组织可选择：已知ER-α表达阴性的乳腺癌组织或其它阴性组织。ER-α表达阴性的乳腺癌组织其肿瘤细胞为阴性，但癌旁正常乳腺导管上皮细胞为阳性。
阳性判断值：依据《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南》的判读要求，乳腺癌标本中，肿瘤细胞的ER-α细胞核着色≥1％均解读为阳性；在有阳性内外参对照情况下，肿瘤细胞的ER-α细胞核着色＜1％，则为阴性。
根据《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南》及ASCO指南，推荐质控方法如下：
阳性外对照：已知明确的呈现阳性表达的细胞株、子宫内膜或已知ER-α表达阳性的乳腺癌组织；
阳性内对照：癌旁正常乳腺导管上皮细胞表现为强度不一的着色；
阴性外对照：已知ER-α表达阴性的乳腺癌组织；
阴性内对照：染色标本中正常乳腺组织中的肌上皮细胞和间质细胞。
利用抗ER-α单克隆抗体B对34种正常组织进行IHC检测，检测结果如表6所示：
表6 ER正常组织IHC检测结果
Figure BDA0003706400990000131
Figure BDA0003706400990000141
利用抗ER-α单克隆抗体B对18种肿瘤组织进行IHC检测，检测结果如表7所示：
表7 18种肿瘤组织的IHC检测结果
Figure BDA0003706400990000142
Figure BDA0003706400990000151
(2)PR检测
抗PR单克隆抗体在阳性对照组织上的染色结果为阳性，阳性着色的定位应准确，无背景染色；空白对照和阴性对照染色结果为阴性，如图8所示。
阳性对照组织可选择：宫颈、子宫内膜、已知PR表达阳性的乳腺癌或其它阳性组织。亚细胞定位为细胞核，细胞质和细胞膜为阴性。其中宫颈阳性着色区域为复层上皮基底层细胞和大多数间质细胞阳性；子宫内膜阳性着色区域为腺泡上皮细胞、间质细胞；PR表达阳性的乳腺癌阳性着色区域为阳性肿瘤细胞、癌旁正常乳腺导管上皮细胞。对照组织中血管内皮细胞均为阴性。
阴性对照组织可选择：已知PR表达阴性的乳腺癌组织或其它阴性组织。PR表达阴性的乳腺癌组织其肿瘤细胞为阴性，但癌旁正常乳腺导管上皮细胞为阳性。
阳性判断值：依据《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南》的判读要求，乳腺癌标本中，肿瘤细胞的PR细胞核着色≥1％均解读为阳性；在有阳性内外参对照情况下，肿瘤细胞的PR细胞核着色＜1％，则为阴性。
根据《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南》及ASCO指南，推荐质控方法如下：
阳性外对照：已知明确的呈现阳性表达的细胞株、子宫内膜或已知PR表达阳性的乳腺癌组织；
阳性内对照：癌旁正常乳腺导管上皮细胞表现为强度不一的着色；
阴性外对照：已知PR表达阴性的乳腺癌组织；
阴性内对照：染色标本中正常乳腺组织中的肌上皮细胞和间质细胞。
利用抗PR单克隆抗体B对34种正常组织进行IHC检测，检测结果如表8所示：
表8PR正常组织IHC检测结果
Figure BDA0003706400990000161
Figure BDA0003706400990000171
利用抗PR单克隆抗体B对18种肿瘤进行IHC检测，检测结果如表9所示：
表9 18种肿瘤组织的IHC检测结果
组织类型(检测例数) 肿瘤细胞出现阳性的例数
黑色素瘤(3) 0/3
淋巴瘤(3) 0/3
胃腺癌(3) 0/3
肺鳞癌(3) 0/3
肺腺癌(3) 0/3
结直肠腺癌(3) 0/3
食管鳞癌(3) 0/3
肝细胞肝癌(3) 1/3肿瘤细胞核阳性
肾透明细胞癌(3) 0/3
子宫内膜癌(3) 3/3肿瘤细胞核阳性
前列腺癌(3) 0/3
膀胱癌(3) 0/3
卵巢癌(3) 2/3肿瘤细胞核阳
子宫鳞状细胞癌(3) 1/3肿瘤细胞核阳
胰腺导管癌(3) 0/3
乳腺纤维腺瘤(3) 0/3
前列腺增生症(3) 0/3
乳腺癌(3) 2/3肿瘤细胞核阳
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 图凌（杭州）生物医药有限公司
<120> 一种检测孕激素受体的单克隆抗体及其制备方法和应用
<130> XYY202210922
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser
1               5                   10                  15
Ser His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe
            20                  25                  30
Pro Ala Thr Val
        35
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Ile Gln Tyr Ser Trp Met Ser Leu Met Val Phe Gly Leu Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Ser Tyr Lys His Val Ser Gly Gln Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp
            20                  25                  30
Leu Ile Leu Asn Glu Gln Arg Met Lys Glu Ser Ser Phe Tyr Ser Leu
        35                  40                  45
Cys Leu Thr Met Trp Gln Ile Pro Gln Glu Phe Val Lys Leu Gln Val
    50                  55                  60
Ser Gln Glu Glu Phe Leu Cys Met Lys Val Leu Leu Leu Leu Asn Thr
65                  70                  75                  80
Ile Pro Leu Glu Gly Leu Arg Ser Gln Thr Gln Glu Met Arg Ser Ser
                85                  90                  95
Tyr Ile Arg Glu Leu Ile Lys Ala Ile Gly Leu Arg Gln Lys Gly Val
            100                 105                 110
Val Ser Ser Ser Gln Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Asn
        115                 120                 125
Leu His Asp Leu Val Lys Gln Leu His Leu Tyr Cys Leu Asn Thr Phe
    130                 135                 140
Ile Gln Ser Arg Ala Leu Ser Val Glu Phe Pro Glu Met Met Ser Glu
145                 150                 155                 160
Val Ile Ala Ala Gln Leu Pro Lys Ile Leu Ala Gly Met Val Lys Pro
                165                 170                 175
Leu Leu Phe His Lys Lys
            180
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Asp Leu Ser Ser Tyr Ala
            20                  25                  30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
    50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65                  70                  75                  80
Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Gly Thr
                85                  90                  95
Gly Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Pro Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Gly
            20                  25                  30
Asn Asn Leu Ser Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Ser
                85                  90                  95
Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
            100                 105                 110
Lys Gly Asp Pro
        115
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Tyr Ala Met Thr
1               5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ile Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Gly Ile
1
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Gly Asn Asn Leu Ser
1               5                   10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Phe Thr Ser Thr Leu Glu Ser
1               5
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Thr
1               5                   10
<210> 11
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Asn Lys Asn Gly
            20                  25                  30
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
        35                  40                  45
Tyr Ile Trp Ser Asp Ser Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
    50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Glu Thr Ser Thr Thr Val Glu Leu Lys Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ser Arg Gly Gly
                85                  90                  95
Phe Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Lys Ser Val Tyr Asn Asn Asn
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Glu Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln
65                  70                  75                  80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Asn
                85                  90                  95
Ser Asp Asp Cys Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
Gly Asp Pro
        115
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Lys Asn Gly Ile His
1               5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Tyr Ile Trp Ser Asp Ser Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Gly Phe Gly Leu
1               5
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Ser Lys Ser Val Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser
1               5                   10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Ile Ser Thr Leu Ala Ser
1               5
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Asn Ser Asp Asp Cys Asn Val
1               5                   10

Claims (7)

1. 一种用于检测孕激素受体的单克隆抗体，其特征在于，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列和轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列分别如SEQ ID NO: 13~18所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测孕激素受体的单克隆抗体，其特征在于，所述用于检测孕激素受体的单克隆抗体包括SEQ ID NO: 11所示的重链可变区和SEQ ID NO: 12所示的轻链可变区。
3.一种用于检测孕激素受体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一所述的用于检测孕激素受体的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在，所述试剂盒基于免疫方法进行检测。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在，所述免疫方法选自包括免疫组织化学法、免疫荧光法、酶联免疫法、免疫印迹法的组中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫方法为免疫组织化学法，所述试剂盒还包括二抗和/或显色剂。
7.根据权利要求3-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括孕激素受体阳性对照组织和/或孕激素受体阴性对照组织。
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