CN105238763A - 抗pr蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pr单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用。本发明所述抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC？NO：11083。本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗PR蛋白单克隆抗体，且与PR蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了PR蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织特别是乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和宫颈癌等肿瘤组织的检测和标记。

Description

抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全球每年有上百万妇女患乳腺癌，几十万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。在我国近年来乳腺癌发病率增长趋势明显，在一些城市已成为女性恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌已成为妇女健康的最大威胁。

内分泌治疗是乳腺癌主要治疗方法之一，已成为乳腺癌治疗的重要组成部分。影响乳腺癌内分泌治疗效果的主要因素是雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达情况。有学者统计，ER⁺/PR⁺患者TAM治疗有效率约60-75％，ER⁺/PR^-患者下降至35～50％，并且，即使是ER^-/PR^-患者接受TAM治疗后仍然有5％的患者可以从中获益。接受TAM治疗的ER⁺/PR⁺患者复发及死亡相对危险性与ER⁺/PR^-患者相比下降15％～30％，说明PR对内分泌治疗效果有较大的影响。

孕激素受体(PR)属于核受体家族转录因子，通过和孕激素结合导致受体二聚化，与特定靶基因启动子区的顺式作用元件结合，调节敏感靶基因的转录。PR是孕激素作用的靶点，其可促进孕激素刺激激素依赖性乳腺癌细胞的生长。PR至少包括两种不同亚型即94kD的hPR-A和116kD的hPR-B,在正常子宫内膜及乳腺上皮细胞中表达，同时也在部分乳腺癌的肿瘤细胞中表达，是乳腺癌预后及激素治疗的重要指示因子。同时，PR也在一些卵巢癌和子宫内膜癌病患肿瘤细胞中表达。

目前在临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理实验检测肿瘤细胞中PR的表达状况；而在科研上则多用蛋白印记和流式细胞术等方法来检测PR的表达水平；但这些实验方法的核心为特异性结合PR的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对PR蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与PR蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO：11083。

本发明所述抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据PR片段(1-298aa，PR-N298)ORF核苷酸序列(PR-N298ORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，894p；PR-N298氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点EcoRI和BglII，插入表达载体pET-23b(货号Cat.No.69771-3，Novagen公司)，构建PR-N298片段重组表达质粒pET-23b/PR-N298；

(2)PR片段重组蛋白的表达与纯化：将PR片段重组表达质粒转化E.Coli感受态细胞，挑单克隆扩增培养，IPTG诱导后收获细菌，裂解离心取上清，NTA亲和层析柱纯化，获得纯化的PR重组蛋白片段；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的PR重组蛋白片段免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗PR特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PR单克隆抗体。分别通过蛋白印记(Western-Blot)、流式细胞术(FC)、免疫组化(IHC)检测实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗PR单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UMAB136，亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11083。

同时，本发明还提供一种抗PR蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗PR蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PR单克隆抗体。

本发明所述保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体为IgG2a型，效价较高。所述单克隆抗体的免疫组化检测结果显示，其能够识别正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中的PR蛋白；在流式细胞术检测中，其能够检测人乳腺癌细胞系MCF-7中PR蛋白；在蛋白印记检测中，其能够检测到转染PR重组质粒(RC221303)的HEK293T细胞裂解液以及MCF-7中PR蛋白，分子量大小与预期相符，而239T细胞中则没有相应大小的条带，表明本发明所述单抗能检测到PR蛋白的特异性表达。

同时，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所述单克隆抗体与近10000种其他蛋白无交叉反应。

因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO：11083的的杂交瘤细胞在制备抗PR蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗PR蛋白单克隆抗体在制备检测PR蛋白的免疫检测产品中的应用。

作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

本发明还提供一种用于蛋白印记检测、流式细胞术检测和免疫组化检测的试剂盒，包括保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测组织(包括正常组织和肿瘤组织)细胞以及体外培养的PR阳性的肿瘤细胞系中PR的表达状况。

此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织的试剂盒中的应用。

作为优选，所述肿瘤包括乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和宫颈癌。

本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗PR蛋白单克隆抗体，且与PR蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了PR蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织特别是乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和宫颈癌等肿瘤组织的检测和标记。

生物保藏信息说明

UMAB136，分类命名为孕激素受体(PR)单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11083。

附图说明

图1所示为实施例1中PR蛋白Westernblot检测结果图，以anti-His检测PR蛋白在E.Coli中的表达，其中泳道L为转染空载体pET-23b的E.Coli裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pET-23b/PR-N298质粒的E.Coli裂解液抗原的检测结果；

图2所示为实施例2中PR-N298纯化蛋白SDS-PAGE结果图；

图3所示为实施例4中PR蛋白Westernblot检测结果图，以UMAB136分泌产生PR单克隆抗体(1:2000)检测阴性对照细胞293T，转染PR真核表达质粒RC221303的细胞裂解液，以及PR阳性的MCF-7细胞裂解液；

图4所示实施例5人乳腺癌细胞系中流式细胞术检测结果图(一抗为UMAB136分泌产生PR单克隆抗体)；其中，A信号区域表示检测人乳腺癌细胞系MCF-7中PR蛋白，图中B信号代表阴性对照抗体信号；

图5所示实施例6正常乳腺组织中免疫组化检测结果图(一抗为UMAB136分泌产生PR单克隆抗体)；

图6所示实施例6正常子宫内膜组织中免疫组化检测结果图(一抗为UMAB136分泌产生PR单克隆抗体)；

图7所示实施例6子宫内膜癌组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB136分泌产生PR单克隆抗体，1:150)；

图8所示实施例7Origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为UMAB136分泌产生PR单克隆抗体，1:150；二抗为Alexa647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)。

具体实施方式：

本发明公开了抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面就本发明提供的抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用做进一步说明。

实施例1：PR重组表达质粒的构建

(1)、实验方法：

1、载体构建：以Origene公司PR的cDNA克隆质粒RC221303为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点EcoRI和BglII，克隆入表达载体pET-23b，建立PRN端片段(1～298aa)的重组表达质粒pET-23b/PR-N298。

2、转化E.Coli感受态细菌：取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入2ul质粒pET-23b/PR-N298，用移液器轻柔混匀。冰上静置20min；42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min；加入1mlLB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时；取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀；待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。

3、阳性菌株鉴定：挑上述单菌落菌株于5mlLB(Amp+)培养基220rpm培养至OD280＝0.6，加入IPTG诱37度培养5小时，收集菌体裂解；同时以转化空载体pET-23b的细菌裂解液为对照，加入5XLoadingBuffer，制样进行SDS-PAGE电泳、用anti-His抗体进行Western-Blot检测蛋白表达，见图1。

(2)、实验结果：

由图1结果可见，Anti-His单抗(1:2000)能检测到转化PR重组质粒pET-23b/PR-N298的细菌裂解液中约40kDa大小条带(R)，与预期相符，而转化空载体的对照裂解液(L)中则没有相应大小的条带，表明重组蛋白PR-N298正确表达。

实施例2：PR重组蛋白的表达与纯化

(1)、实验方法：

1、细菌培养与菌体收集：挑上述单菌落菌株于5mlLB(Amp+)培养基220rpm培养8小时后转移至1升LB(Amp+)培养基扩大培养，待其生长到OD280＝0.6后加入IPTG至终浓度为0.25mM诱导蛋白表达，继续4度200rpm振荡培养12～14小时后，4度离心菌液，收集菌体沉淀。

2、蛋白纯化：将上步收集的菌体沉淀用PBS缓冲液重选并进行超声破碎(超声探头为6Ф，功率为400W，全程工作时间30min,每个循环超声3秒间隔5秒)，离心(12000rpm,5min)，收集上清，并按照Novagen公司蛋白纯化方法进行纯化(Novagen,Ni-NTAHis-BindResin试剂盒，货号：70666-5)，收获得到纯化的带His标签的重组蛋白PR-N298。

3、纯化蛋白鉴定：纯化后的PR蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图2。

(2)、实验结果：

由图2结果可见，经过His亲和层析柱纯化，洗脱可得到高纯度的PR片段重组蛋白PR-N298。

实施例3：抗PR单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的PR片段(PR-N298)重组蛋白(以下简称为PR抗原)用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的PR抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的PR片段重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB136。

4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株UMAB136用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株UMAB136分泌产生的单抗亚型为IgG2a，采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100uL/管，浓度为1mg/ml)、保存在4-8℃。

实施例4：UMAB136分泌产生的单克隆抗体为一抗的蛋白印记(Western-Blot)检测

(1)、实验方法：

1、准备细胞：准备HEK293T细胞(293T，ATCCCatlogNo.CRL-3216)以及人乳腺癌细胞系MCF-7(ATCCCatlogNo.HTB-22^TM)，培养于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中。

2、转染：将人源全长PR质粒pCMV6-PR(RC221303，OriGene公司)和空载体pCMV6(PS100001，OriGene公司)转染293T细胞，36小时收获活细胞。

3、制备细胞裂解液：将上述细胞消化，水平离心机800-1000rpm/5min离心,PBS洗2次，细胞沉淀用PBS定容到400ul-EP管，加入细胞裂解液，冰浴裂解20分钟后，12000rpm离心10分钟，收集上清加入5XLoadingBuffer稀释成1X作为细胞裂解液，-80℃存储备用。

4、SDS-PAGE电泳：恒压180V50min溴酚兰至凝胶底部。

5、转膜：提前用转移缓冲液浸泡Nc膜与滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序为：电极(-)-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-电极(+)，一定要保证胶在下膜在上，即凝胶靠近负极。恒流600mA,45分钟。

6、染色：用立春红S染色2min，用蒸馏水清洗，至marker条带显出，用圆珠笔做好标记。蒸馏水冲洗膜。

7、封闭：用封闭液(含5％脱脂奶的TBST)浸没NC膜并置于37℃孵育1小时。

8、一抗孵育：将NC膜置于PR鼠单抗UMAB136(以封闭液将抗体稀释2000倍)中，37℃温箱孵育1小时后，再用15mLTBST洗膜15min*3次。(根据容器大小可调整TBST用量)

9、二抗孵育：将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Jackson，CatlogNo.115-035-146；1：5000)中，室温摇床孵育1小时后，TBST洗膜5次，15min/次。

10、底物曝光：鲁米诺和双氧水1：1混匀后加在NC膜上(1ml/膜),压上X射线胶片曝光，然后将胶片进行显影和定影(暗室中可根据胶片上的荧光估算艳片时间)。

11、根据阴性，阳性，空白对照来进行结果分析和判定，见图3。

(2)、实验结果：

由图3结果可见，UMAB136分泌产生的PR鼠单抗(1:2000)能检测到转染PR重组质粒(RC221303)的HEK293T细胞裂解液以及MCF-7中PR蛋白，分子量大小与预期相符，而阴性对照239T细胞中则没有相应大小的条带，表明本发明所述单抗能检测到PR蛋白的特异性表达。

实施例5：UMAB136分泌产生的单克隆抗体为一抗的流式细胞术检测

(1)、实验方法：

1、准备细胞：准备人乳腺癌细胞系MCF-7培养与含5％CO₂的37℃细胞培养箱中。

2、收获细胞：MCF-7细胞消化，水平离心机800-1000rpm/5min离心,PBS洗细胞2次，800rpm离心；细胞沉淀用PBST(含0.05％TritonX-100)于冰浴上处理10min使细胞膜穿孔；然后离心弃上清，细胞沉淀用PBS定容到400ul-EP管，制备细胞悬液。

4、孵育抗体：将PR鼠单抗UMAB136(工作浓度为10ug/ml)以及阴性对照抗体分别上述细胞悬液于冰浴中共孵育1小时。

5、孵育二抗：将上述的细胞-抗体混合液用PBS洗涤3次，800rpm/5min；然后加入驴抗鼠Alexa488标记二抗(Jackson,CatlogNo.715-545-151)200ul/孔，冰浴1小时。

6、洗涤后流式细胞仪分析：用PBS洗涤3次，800rpm/5min,之后加含PI(1000X)的缓冲液250ul/孔混悬，将细胞悬液经过流式细胞仪分析。

7、根据阴性，阳性，空白对照来进行结果分析和判定，见图4。

(2)、实验结果：

由图4结果可见，UMAB136分泌产生的PR鼠单抗能通过流式细胞术检测人乳腺癌细胞系MCF-7中PR蛋白(A信号区域)，图中B信号代表阴性对照抗体信号。

实施例6：UMAB136分泌产生的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、分别取正常乳腺、正常子宫内膜和子宫内膜癌组织块进行石蜡包埋，使用SAKURA组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(1mMEDTA,pH8.5的10mMTris-HCL缓冲液)高压锅高压热修复2.5min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入PR单抗(UMAB136分泌产生)，稀释比：1:500，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加聚合物HRP染色试剂盒中试剂PV6000(CatlogNo.PV-6000)，37℃孵育15分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-7。

(2)、实验结果：

由于PR蛋白为细胞核定位的蛋白，由图5结果可见，PR蛋白在正常乳腺组织上呈现特异性细胞核表达，如图箭头深色细胞核所示。

由图6结果可见，PR蛋白在正常子宫内膜组织上特异性细胞核表达，如图箭头深色细胞核所示。

由图7结果可见，PR蛋白在子宫内膜癌组织的肿瘤细胞中特异性细胞核高表达，如图箭头深色细胞核所示。

结果表明本发明所述的单克隆抗体UMAB136能够识别正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中的PR蛋白。

实施例7：UMAB136分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGeneCatPA100001)芯片进行UMAB136分泌产生的单克隆抗体鉴定实验的方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗UMAB136，稀释比列为1：100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mLPBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗Alexa647-标记的驴抗鼠IgG，稀释比例为1：500。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accessionnumber)，蛋白ID，蛋白大小等信息。结果见图8。

图8结果显示，在10K蛋白芯片(OriGeneCatPA100001)上呈现出全阴性反应，表明本发明所述抗体UMAB136与10000个其他蛋白并无交叉反应，而结合本发明其他的试验结果，说明UMAB136分泌产生的单抗是特异性识别PR蛋白的抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO：11083。

2.保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞在制备抗PR蛋白单克隆抗体中的应用。

3.抗PR蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生。

4.保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体在制备检测PR蛋白的免疫检测产品中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

6.一种用于蛋白印记检测、流式细胞术检测和免疫组化检测的试剂盒，其特征在于，包括保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体。

7.保藏编号为CGMCCNO：11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌，子宫内膜癌、卵巢癌和宫颈癌。