CN104031149B - 抗pml蛋白核定位信号抗体的制备及其在apl诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗PML蛋白核定位信号(NLS)抗体的制备及其在APL诊断中的应用。该抗体以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,即NLS多肽作为免疫原制备得到。该抗体可用于区分PML蛋白和缺失核定位信号的PML蛋白,以及应用于急性早幼粒细胞白血病诊断剂的制备中。另外,本发明还提供一种PML蛋白的定位方法。由此,为进一步研究PML在基因转录层面诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长奠定了基础;同时,区别检测了野生型PML蛋白和PML(NLS‑)蛋白,为APL临床诊断以及深入研究APL的发病机制,提供了新的依据。

Description

抗PML蛋白核定位信号抗体的制备及其在APL诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,特别涉及一种抗PML蛋白核定位信号(NLS)抗体的制备及其在APL诊断中的应用。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(APL)的发生与染色体易位密切相关,95%以上的APL为特征性的染色体t(15,17)易位,形成并表达PML-RARα融合蛋白。研究发现,PML-RARα融合蛋白可以被中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase,NE)切割成约52KDa和61KDa大小的两种变异蛋白。由于NE酶的这一特异性的切割作用,产生了一种缺失核定位信号(nuclearlocalization signal,NLS)的突变型PML蛋白即PML(NLS-)蛋白和带上核定位信号的NLS-RARα蛋白。
PML蛋白作为一种肿瘤生长抑制因子,对不同组织起源肿瘤的发生发展具有一定抑制作用,PML基因的失活能够明显促进白血病的发生,同时PML蛋白参与多条凋亡途径以及DNA损伤修复。由于PML参与形成PML-RARα融合蛋白在APL的发生发展中扮演着重要的角色,对PML与肿瘤形成方面的研究越来越激烈。在正常细胞中,PML蛋白主要分布于细胞核内呈斑点状,属于核体(nuclear bodies,NBs)亚核区域的成分。只有个别PML蛋白如PML VIb、PML VIIb,因缺乏NLS而定位于胞浆。PML蛋白具有内在的抗病毒活性,具有抑制肿瘤的生长、参与造血祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等多种生物学功能,所有这些功能的发挥与PML蛋白NBs内定位息息相关。而PML蛋白定位于NBs有赖于其自身的NLS序列,通过NLS介导PML蛋白入核,从而参与NBs的形成发挥其正常生物学功能。
所有PML蛋白的亚型均含有相同N-末端区域,即RBCC(ring finger,B-box,coiled-coil domain,总称RBCC)结构域,PML(NLS-)蛋白也含有RBCC结构域。目前,国际上普遍采用合成PML蛋白N-末端或者RBCC结构域部分多肽作为免疫原,免疫家兔或小鼠来制备特异性抗体,这样获得的抗体不仅能特异性检测野生型PML蛋白,同时也能检测PML(NLS-)蛋白,不能对二者进行区分。
因此,选择合适的特异性序列多肽作为免疫原,制备能有效区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白的抗体异常重要,可为APL临床诊断提供新的依据。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种能有效区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白的抗体。
为实现上述目的,发明人经反复研究,创造性的发现以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,即NLS多肽作为免疫原可制备得到抗PML蛋白核定位信号抗体,能区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白。具体地,本发明要求保护:
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列与KLH的偶联复合体作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
上述制备得到的抗体在区分PML蛋白(野生型PML蛋白)和缺失核定位信号的PML蛋白(PML(NLS-)蛋白)中的应用。
一种PML蛋白特异性抗体,所述抗体为抗PML蛋白核定位信号抗体,由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原制备得到。
本发明还提供一种PML蛋白特异性抗体的制备方法,该抗体可区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白,可广泛用于APL研究和临床诊断中。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种PML蛋白特异性抗体的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
(2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法,将纯化后的多肽与KLH交联;
(3)制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原,免疫家兔或小鼠制备抗体血清,分离,即得PML蛋白特异性抗体。
进一步,所述步骤(3)的免疫由首次免疫和加强免疫组成,首次免疫辅助采用完全弗氏佐剂,加强免疫辅助采用不完全弗氏佐剂。
上述制备的PML蛋白特异性抗体可应用于急性早幼粒细胞白血病诊断剂的制备中。
此外,本发明还提供一种PML蛋白的定位方法,该方法可定位PML蛋白的胞内位置,为PML蛋白的相关研究开辟新的途径。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种PML蛋白的定位方法,包括以下步骤:
(1)制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
(2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法,将纯化后的多肽与KLH交联;
(3)制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原,免疫家兔或小鼠制备抗体血清,分离,即得PML蛋白特异性抗体;
(4)PML蛋白定位:用上述制备的抗体血清,采用间接免疫荧光检测PML蛋白在胞内定位。
进一步,所述步骤(4)中,间接免疫荧光检测包括以下步骤:取靶细胞,转染前12h,将细胞按1×105/孔铺于24孔板中,转染48h后,弃去培养基,用PBS洗三次,用4%的多聚甲醛固定20min后,PBS漂洗三次,再用0.1%Triton透膜处理10min;然后,用10%山羊血清室温封闭30min,加上抗体血清,4℃过夜,PBS洗3次,加罗丹明标记的山羊抗鼠荧光二抗,37℃孵育1h;再PBS洗3次,加入核染色液DAPI 5min,PBS漂洗3次,用70%甘油封固,荧光显微镜下观察拍照。
进一步,所述抗体血清和山羊抗鼠荧光二抗均为1:200倍体积稀释。
本发明的有益技术效果是:
本发明通过分析PML蛋白NLS序列免疫原性,合成NLS多肽,以此多肽作为免疫原,制备了抗PML蛋白抗体,为进一步研究PML在基因转录层面诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长奠定了基础;同时,区别检测了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白,为APL临床诊断以及深入研究APL的发病机制,提供了新的依据。
附图说明
图1为NLS-RARα在宿主菌BL21中表达的检测结果;
图2为ELISA检测抗体效价(初次免疫)结果;
图3为ELISA检测抗体效价(加强免疫)结果;
图4为Western blot验证抗体特异性结果;
图5为间接免疫荧光验证抗体特异性——过表达PML蛋白免疫荧光结果;
图6为间接免疫荧光验证抗体特异性——正常人与M3型病人中性粒细胞免疫荧光结果。
具体实施方式
以下参照附图对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规条件进行。
1.材料
1.1 质粒、菌株和动物
E.coli BL21菌由重庆医科大学临床诊断实验室保存。
原核表达质粒PET-His-NLS-RARα的构建:以PCMV-HA-NLS-RARα质粒为模板,分别以p1:5’-TTA GGATCC ACAGTCAGTGCCCGGGC-3’和p2:5’-GCC AAGCTTTCACGGGGAGTGGGTGGC-3’为上下游引物,PCR扩增NLS-RARα基因并在其两端分别引入BamHI和Hind III酶切位点(下划线部分),将其插入原核表达载体pET-his中,构建原核表达质粒pET-his-NLS-RARα,经酶切和测序验证其构建正确。真核表达质粒PCMV-HA-PML的构建参照文献《人联苯样水解酶(BPHL)在急性早幼粒细胞白血病发生中的分子机制研究》(初晨,重庆医科大学硕士学位论文,2012年5月)。PCMV-HA-PML(NLS-)的构建参照文献《RANBP9在急性早幼粒细胞白血病发生中的作用研究》(黎亮,重庆医科大学硕士学位论文,2012年5月)。PCMV-HA-NLS-RARα的构建参照文献《带核定位信号的维甲酸受体与Ubiquilin1蛋白相互作用的验证》(朱丹等,中南大学学报(医学版),2010年07期)。
清洁级健康雄性BLAB/c小鼠,6~8周龄,体重18~22g,购自重庆医科大学实验动物中心。
1.2 主要试剂
匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)和牛血清白蛋白(albuminbovine serum albumin,BSA)完全福氏佐剂及不完全福氏佐剂、辣根酶标记山羊抗大鼠IgG均购自北京鼎国生物公司;NI-NTA spin kits蛋白纯化试剂盒购自Qiagen公司。蛋白Marker购自美国Fermentas公司;红细胞裂解液、人外周血中性粒细胞分离液购自天津灏洋生物;RIPA细胞裂解液、核染料DAPI,均购自碧云天生物技术研究所;HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠的IgG、异硫氰酸荧光素(F I T C)和标记的羊抗兔IgG和罗丹明(TRITC)标记的羊抗鼠IgG均购自北京中山金桥生物技术有限公司。其它所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售购买产品。
1.3 标本来源
急性早幼粒细胞白血病病人血(初诊)及正常人血皆由重庆医科大学附属第一医院提供,病人为18-35岁女性。正常人血来源于24岁男性。
2.实验步骤及结果
2.1 原核表达NLS-RARα蛋白制备
蛋白的诱导表达与纯化:将原核表达质粒PET-His-NLS-RARα转化宿主菌BL21(DE3),诱导温度为37℃,诱导时间4h,IPTG 1mmol/L,超声裂解,离心后分别取沉淀和上清电泳。纯化时采用镍柱亲和层析法进行非变性条件下纯化:溶菌酶+超声裂解法裂解细菌,5mmol/L咪唑浓度挂柱纯化,10mmol/L和20mmol/L洗涤,250mmol/L和300mmol/L洗脱。
Western blot鉴定蛋白:200ng/孔纯化蛋白,12.5%的分离胶SDS-PAGE电泳,电泳后转至PVDF膜,封闭液封闭1h(5%脱脂奶粉的TBST液),Anti-His抗体按1:1 000稀释4℃孵育过夜,二抗山羊鼠IgG按1:2000稀释,室温孵育1h,最后应用ECL化学发光法显色。
检测及结果:采用丽春红膜染色和Western blot对外源蛋白NLS-RARα进行检测,在37℃诱导条件下,转化PET-His-NLS-RARα质粒的菌株内检测到有外源蛋白NLS-RARα的表达,蛋白分子量大小61KDa,与预期分子量大小相符,而未经诱导组则检测不到相应蛋白的表达。检测结果见图1,图中代号为:A:丽春红染色;B:Western blot;M:蛋白marker;1:未诱导上清;2:未诱导沉淀;3:诱导组上清;4:诱导组沉淀;5:阴性对照组;6:阳性对照组。
2.2 NLS序列分析及免疫原的制备
NLS多肽制备:从Gene Bank中获取PML蛋白全长560个氨基酸,其中NLS序列位于476到490之间,其序列为CKRKCSQTQCPRKVIK。采用Fmoc固相合成法,在ABI-431A多肽合成仪上进行合成,使用HPLC进行纯化。
分析:采用DNAstar软件对NLS序列进行分析,其中易形成二硫键,因此合成两条多肽,多肽信息见表1。
表1 合成NLS多肽信息
Peptide1:CKRKCSQTQCPRKVIK
Peptide2:CKRKCSQTQCPRKVIK
注:有下划线的半胱氨酸(C)之间需要形成二硫键
2.3 制备多肽偶联复合体
采用戊二醛连接法将纯化后的多肽分别与KLH和BSA交联(NLS-KLH偶联复合体后续用作抗原,NLS-BSA偶联复合体用于检测)。即将5mg步骤2.2制备的NLS合成多肽分别加入7mg KLH和BSA中,振荡并缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液(1ml),室温2h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜。
2.4 免疫小鼠制备抗体血清
以NLS-KLH偶联复合体做抗原,首次免疫用完全弗氏佐剂,充分乳化后腹腔注射,每只50ug多肽偶联产物,0.2ml/只。2周后加强免疫,采用不完全弗氏佐剂。分别在初次免疫2周后、末次免疫10天后取小鼠尾血,检测抗体效价。
2.5 ELISA检测抗体效价
2.5.1 制备血清标本
末次免疫10天,小鼠剪尾取血。从小鼠尾部吸取20μl全血,立即加入含980μl PBS(0.01mol/L,pH7.4)的小离心管,轻轻混匀,离心1 500r/min 5min,收集全部上清,转入另一小试管,此为1:100血清标本。平行处理阴性血清标本。
2.5.2 包被抗原、封闭、加入一抗二抗、显色
用包被液稀释NLS-BSA多肽偶联复合体1mg/L,100ul每孔加至酶标板,4℃过夜。去包被液,以PBS+3%BSA封闭,每孔200ul,37℃放置1.5h。洗涤3次,500ul洗液/次,拍干。将小鼠阳性血清做不同梯度稀释,37℃放置1h,洗涤三次,拍干。加入酶标二抗:Goat antiMouse IgG(Fc 1+2a+2b+3),以40%小牛血清和60%去离子水1:1000稀释,100ul每孔,37℃放置1h。洗涤3次,拍干。加底物TMB显色液,37℃避光显色15~20m in后,加入2mol/L硫酸终止反应。
2.5.3 酶标仪读数,490nm波长测定OD值。
2.5.4 抗体效价检测
初次免疫2周后,取小鼠尾血制备抗体血清,运用ELISA方法检测抗体血清效价,NLS-KLH多肽免疫3只小鼠所获得的抗体血清效价均明显高于阴性对照。NLS-1-BSA及NLS-2-BSA都有信号,且NLS-1-BSA信号强于NLS-2-BSA。识别原核表达蛋白3只鼠都有信号,2号小鼠稍强,结果见表2和图2,表中数据与图中样品从左至右、由上往下依次对应。该检测条件为:包被:100ng/孔;一抗:小鼠尾血清;二抗:山羊抗鼠IgG;阴性对照:以5%milk-PBS为一抗;阳性对照:以Anti-His 6E2为一抗,浓度5ug/ml。
加强免疫10天后,ELISA方法检测抗体血清效价,针对多肽信号明显增强,其中2号小鼠最强,结果见表3和图3,表中数据与图中样品从左至右、由上往下依次对应,检测条件同上。上述结果表明成功制备了针对PML蛋白NLS序列的多克隆抗体,由于2号小鼠的抗体效价最强,因此采用2号抗体血清用于后续检测。
表2 ELISA检测抗体效价(初次免疫)结果
备注:其中的*.***表示数值很高,大大大于其他测试数值。
表3 ELISA检测抗体效价(加强免疫)结果
2.6 人外周血中性粒细胞的提取
取2ml新鲜抗凝血,与PBS稀释液1:1混匀后,小心加于一份4ml人血中性粒细胞分离液之液面上,1800r/min,25min。此时离心管中由上至下细胞分四层,弃去第一层和第二层,收集第三层和第四层,放入含10ml的PBS的试管中,充分混匀后,以1800r/min离心30min洗涤,去上清后加入3-5倍体积的红细胞裂解液,吹打混匀,反应2min后1800r/min离心3min,然后再用PBS反复洗涤3次,离心后即为所需的中性粒细胞,可用于后续实验。
2.7 细胞转染
按1×106/孔接种293T细胞至六孔板中,待细胞长至80~90%融合时分别转染pCMV-HA-PML,pCMV-HA-PML(NLS-)和pCMV-HA-NLS-RARα。在6ul Lipofectamin 2000介导下转染3ug质粒DNA,6h后,更换完全DMEM培养基,于37℃,5%CO2孵箱中继续培养48h。
2.8 Western blot验证抗体特异性
转染48h后,收集细胞,RIPA裂解后提取细胞总蛋白,用BCA法定量,分别取50μg蛋白,进行10%SDS-PADE电泳,以半干转膜法转至PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h后,加入抗体血清(1:1000稀释),4℃12h。以购买自Abcam兔抗人PML多抗作为阳性对照,洗膜:用TBST洗2次,每次10min,再用TBS洗10min,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:2000稀释),37℃孵育1h,然后洗膜(步骤同上),于暗室化学发光显影成像。
Western blot结果显示,真核表达质粒PCMV-HA-PML,PCMV-HA-PML(NLS-)和PCMV-HA-NLS-RARα均成功表达,分子量大小分别为70KDa,52KDa和61KDa,应用抗NLS抗体(2号抗体血清)则在转染PCMV-HA-PML组70KDa处有明显的条带,而在转染PCMV-HA-PML(NLS-)和PCMV-HA-NLS-RARα组均未出现相应分子大小的条带;阳性对照组分别在转染PCMV-HA-PML和PCMV-HA-PML(NLS-)组70KDa和52KDa处出现相应的条带,见图4。上述结果表明在真核表达层面,抗NLS抗体能够成功检测PML蛋白,由于PML(NLS-)缺失NLS而无法指示,从而成功将PML和PML(NLS-)区别开来。另外,应用抗NLS抗体能够成功区别检测PML于PML(NLS-),但是却未能检测NLS-RARα,分析其原因主要是因为用于ELISA分析检测原的NLS-RARα蛋白为原核表达与真核表达的NLS-RARα蛋白结构上存在差异,由于真核表达的NLA-RARα针对NLS的抗原识别位点被覆盖了没有暴露于表面因此不能检测。
2.9 间接免疫荧光验证抗体特异性
制备细胞爬片:转染前12h,将293T细胞按1×105/孔铺于24孔板中,转染48h后,弃去培养基,用PBS洗三次,用4%的多聚甲醛固定20min后,PBS漂洗三次;再用0.1%Triton透膜处理10min。10%山羊血清室温封闭30min,加上抗体血清(封闭血清1:200),4℃过夜,PBS洗3次,加TRITC标记的山羊抗鼠荧光二抗(封闭血清1:200),37℃孵育1h。PBS洗3次,加入核染色液DAPI 5min,PBS漂洗3次,用70%甘油封固,荧光显微镜下观察拍照。以购买自Abcam兔抗人PML多抗作为阳性对照,二抗使用FITC标记的山羊抗鼠荧光二抗。
结果:
过表达PML蛋白免疫荧光结果显示,应用所制备抗NLS抗体检测过表达PML蛋白(红色指示)主要定位于胞核呈斑块状分布,这一结果与阳性对照组(绿色)相同,见图5中A;PML(NLS-)蛋白则主要在胞浆表达而应用抗NLS抗体组则无明显红色荧光,见图5中B。这一结果表明,间接免疫荧光检测PML和PML(NLS-)胞内定位,在过表达PML293t细胞和正常人中性粒细胞中,应用抗NLS抗体和抗PML抗体结果一致,PML蛋白均定位与胞核,呈斑点状分布;而在过表达PML(NLS-)293t细胞中,应用抗PML抗体指示目标蛋白主要定位于胞浆,而抗NLS则不能检测目标蛋白。
同时,比较正常人与M3型病人中性粒细胞免疫荧光结果显示,正常人中性粒细胞核(蓝色)呈明显分叶状,M3型病人由于粒细胞分化阻滞在早幼粒细胞阶段,因此胞核主要呈单个核状。抗NLS抗体检测正常人中性粒细胞中PML蛋白(红色)主要定位与胞核呈斑点状分布,这一结果与阳性对照组(绿色)相同,见图6中A;在APL病人中性粒细胞中,PML蛋白主要定位于胞浆呈弥散状分布,而应用抗NLS抗体则指示胞核有红色荧光,胞浆无明显红色荧光,见图6中B。这一结果表明,在M3型病人中性粒细胞中,应用抗PML抗体指示目标蛋白主要定位于胞浆,而抗NLS抗体则集中定位与胞核。说明抗NLS抗体能够应用于免疫荧光,区别检测PML和PML(NLS-)蛋白,并有效区分正常人和M3型病人外周血中性粒细胞中PML蛋白的定位。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>重庆医科大学附属永川医院
<120>抗PML蛋白核定位信号抗体的制备及其在APL诊断中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223>NLS序列
<400> 1
Cys Lys Arg Lys Cys Ser Gln Thr Gln Cys Pro Arg Lys Val Ile Lys
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种PML蛋白特异性抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
(2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法,将纯化后的多肽与KLH交联;
(3)制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原,免疫家兔或小鼠制备抗体血清,分离,即得PML蛋白特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的PML蛋白特异性抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)的免疫由首次免疫和加强免疫组成,首次免疫辅助采用完全弗氏佐剂,加强免疫辅助采用不完全弗氏佐剂。
3.权利要求1或2制备的PML蛋白特异性抗体在制备急性早幼粒细胞白血病诊断剂中的应用。
4.一种PML蛋白的定位方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
(2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法,将纯化后的多肽与KLH交联;
(3)制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原,免疫家兔或小鼠制备抗体血清,分离,即得PML蛋白特异性抗体;
(4)PML蛋白定位:用上述制备的抗体血清,采用间接免疫荧光检测PML蛋白在胞内定位。
5.根据权利要求4所述的PML蛋白的定位方法,其特征在于,所述步骤(4)中,间接免疫荧光检测包括以下步骤:取靶细胞,转染前12h,将细胞按1×105/孔铺于24孔板中,转染48h后,弃去培养基,用PBS洗三次,用4%的多聚甲醛固定20min后,PBS漂洗三次,再用0.1%Triton透膜处理10min;然后,用10%山羊血清室温封闭30min,加上抗体血清,4℃过夜,PBS洗3次,加罗丹明标记的山羊抗鼠荧光二抗,37℃孵育1h;再PBS洗3次,加入核染色液DAPI5min,PBS漂洗3次,用70%甘油封固,荧光显微镜下观察拍照。
6.根据权利要求5所述的PML蛋白的定位方法,其特征在于:所述抗体血清和山羊抗鼠荧光二抗均为1:200倍体积稀释。
7.SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
8.SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列与KLH的偶联复合体作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
9.权利要求7或8中所述的抗体在区分PML蛋白和缺失核定位信号的PML蛋白中的应用。
10.一种PML蛋白特异性抗体,其特征在于:所述抗体为抗PML蛋白核定位信号抗体,由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原制备得到。
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