CN103412131B - 带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法 - Google Patents
带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物领域，特别涉及蛋白的检测技术，具体为带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述方法为激光共聚焦法，将经染色后的靶细胞置于激光共聚焦显微镜的适应波长的双色荧光通道中，以捕获靶细胞中各部位的荧光强度数据，对靶细胞各部位荧光强度数据进行分析以判断靶细胞中带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的存在；另，本发明还通过集成多种检测NLS‑RARα蛋白的方法，为进一步研究急性早幼粒细胞白血病的早期诊断及复发监测奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，特别涉及蛋白的检测技术，特别涉及带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病（acute promyeolic leukemia,APL）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，是急性髓细胞白血病的一个特殊类型，发病迅速，致死率高，在FAB分型系统中被定义为M3型。大量临床研究发现，约97％的APL发生特征性的t(15;17)(15q22;17q21)染色体易位，形成早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α融合基因（PML-RARα）。该基因表达的PML-RARα融合蛋白是APL发生发展的分子基础。但PML-RARα融合蛋白并非始终以整体的形式发挥作用。Lane等[2]发现，中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)可将PML-RARα融合蛋白裂解成52KDa的PML(NLS-)和61KDa的NLS-RARα两种变异蛋白。并且已经有文献报道，PML-RARα转染入在早期髓细胞中，很容易发展成为APL白血病细胞，将其转染入晚期髓细胞，结果却不能发展为APL细胞。Lane等的后继研究也表明，在不含NE的早期髓细胞中，单纯导入的PML-RARα未被裂解，其发生APL的概率仅为2%～3%，远低于富含NE的早期髓细胞。因此我们可以通过检测血细胞中的切割产物NLS-RARα蛋白，为早期诊断APL提供依据,本研究就是初步探讨NLS-RARα蛋白的检测方法，为以后运用于临床奠定基础。
本发明是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进发明的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，该方法准确度高，精度高。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述方法为激光共聚焦法，将染色后的靶细胞置于激光共聚焦显微镜的适应波长的荧光通道中，所述染料方式可以为FITC-Annexin V/DAPI双染色，捕获靶细胞中各部位的荧光强度数据，对靶细胞各部位荧光强度数据进行分析以判断靶细胞中带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的存在。所述荧光通道为蓝绿双色荧光通道，所述适应波长是指：蓝光的激发波长为488nm,在600nm波长以上观察。绿光的激发波长为543nm,在600nm波长以上观察。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述靶细胞为HL-60或急性早幼粒细胞白血病病人血中性粒细胞。进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，还设置有阴性对照组和/或空白对照组。主要是检测HL-60细胞或病人血中性粒细胞中NLS-RARα的表达及定位，以K562细胞中野生型RARα的表达及定位作阴性对照。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述靶细胞被制成切片，具体为：取靶细胞涂片，并用多聚甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，对靶细胞进行染色，具体为：用RARα特异性抗体与所述靶细胞结合，再用FITC-Annexin V标记的荧光二抗孵育。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述RARα特异性抗体为兔抗人RARα的多克隆抗体；所述RARα特异性抗体和所述荧光二抗按1:200的体积比稀释。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，在激光共聚焦法之前，还包括预实验Ⅰ，所述预实验为采用Western blotting验证HL-60细胞中的NE酶，中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)可将PML-RARα融合蛋白裂解成52KDa的PML(NLS-)和61KDa的NLS-RARα两种变异蛋白。NE的这一特异性切割在APL的发生发展中起到了非常重要的作用。NE酶的检测方式具体为：分别收集对数生长期的目的细胞和对照细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白，定量称取，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，封闭，加入兔抗人NE多抗，所述兔抗人NE多抗作1:500体积稀释，进行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，然后洗膜，于暗室化学发光显影成像判断NE酶是否存在，以β-actin作为对照。
进一步，所述的的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，在激光共聚焦法之前，还包括预实验Ⅱ，所述预实验为采用Western blotting验证带核定位信号的维甲酸受体α蛋白，具体为：分别收集对数生长期的HL-60细胞和K562细胞，用试剂盒提取胞核蛋白，定量称取，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，封闭，加入兔抗人RARα多抗，所述多抗作1:500体积稀释，进行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，所述羊抗兔二抗作1:1000倍体积稀释，然后洗膜，于暗室化学发光显影成像判断带核定位信号的维甲酸受体α蛋白是否存在，以Histone H3作为对照。其中，当实验组涂片的荧光强度平均值为正常对照组切片的Z值的平均值的Y倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在带核定位信号的维甲酸受体α蛋白;所述Y为1.40除以0.42的值；所述Z值等于目的条带灰度值（光强度）除以核内参灰度值（光强度）的值。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，在激光共聚焦法同时，还包括平行实验，所述平行实验采用了细胞荧光免疫法，具体为：
A制备涂片
取靶细胞涂片，并用多聚甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片；
B荧光染色
对步骤A所得切片封闭处理后，用RARα抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；
C荧光强度的获取和分析
在荧光显微镜下扫描荧光染色切片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果。
进一步，所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述平行实验中，设置有实验组、正常对照组；步骤C中，当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的X倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在带核定位信号的维甲酸受体α蛋白;所述X为0.8600±0.04084除以0.2933±0.04726的值。
本发明的有益效果在于：本发明以HL-60细胞为急性早幼粒细胞白血病的模型，成功建立一种集合检测NLS-RARα蛋白的方法，该方法集成了几个实验基础为一体，为APL的早期诊断和复发监测提供了新思路，为进一步研究APL的临床诊断和治疗奠定基础。
附图说明
图1为Western blot验证HL-60细胞中的NE酶，其中，1：HL-60组；2：K562组。
图2为Western blot检测HL-60细胞中的NLS-RARα蛋白；其中，1：HL-60组；2：K562组。
图3为细胞免疫荧光图，其中，A:HL-60细胞PI染色的胞核；B:HL-60细胞中FITC染色区域；C:A与B融合图；D:K562细胞PI染色的胞核；E:K562细胞中FITC染色区域;F:D与E融合图。
图4为激光共聚焦结果，其中，A:HL-60细胞PI染色的胞核；B:HL-60细胞中FITC染色区域；C:A与B融合图；D:K562细胞PI染色的胞核；E:K562细胞中FITC染色区域;F:D与E融合图。
图5为PCR产物凝胶电泳图，其中，M：DNA marker(DL2000)；1-2：HL-60组；3-4：K562组。
图6为患者和正常人中性粒细胞western的结果的分析图。
图7为患者和正常人中性粒细胞共聚焦显微镜图片荧光强度的结果的分析图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如细胞培养技术(第三版，谷鸿喜等著，北京大学医学出版社有限公司)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
下述各实施例中，涉及到的主要试剂为：HL-60、K562细胞株均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源库；培养HL-60细胞的RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO公司；培养K562细胞的RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；总RNA提取试剂盒、高保真Taq DNA多聚酶、逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；琼脂糖购自美国Invtrogen公司；所有引物均有上海生工生物工程有限公司合成；细胞浆核蛋白提取试剂盒、RIPA细胞裂解液、核染料DAPI购自碧云天生物技术研究所；兔抗人NE多抗，兔抗人RARα多抗购自美国Santa Cruz公司；兔抗人Histone H3抗体购自Bioworld公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG均购自北京中山金桥生物技术有限公司。
实施例中，涉及一些常规的手段，具体如下：
HL-60细胞用含20％优质胎牛血清的GIBCO-1640的培养基，于37℃，5％CO2，饱和湿度孵箱内常规培养，每1-2d换液传代，选择对数生长期的细胞用于后续实验。K562细胞用含10%优质胎牛血清的HYCLONE-1640的培养基，于37℃，5％CO2，饱和湿度孵箱内常规培养，每1-2d换液传代，选择对数生长期的细胞用于后续实验。
K562细胞的培养条件是：置于含10%优质胎牛血清的Hyclone-1640的培养基，于37℃，5％CO2培养箱内常规培养，每1～2d换液传代，选择对数生长期的细胞用于后续实验。
预实验Ⅰ：western-blotting法验证HL-60细胞中NE酶
分别收集对数生长期的HL-60细胞和K562细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白，用BCA法定量，分别取60μg蛋白，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭4h后，加入兔抗人NE多抗（5%脱脂奶粉1:500稀释），4℃8h。洗膜：用TBST洗2次，每次10min，再用TBS洗10min.加入羊抗兔二抗（5%脱脂奶粉1：1000稀释），37℃孵育1h，然后洗膜（步骤同上）。于暗室化学发光显影成像。以β-actin作为对照。
HL-60组在29kda附近出现了与NE蛋白分子量大小相近的特异性条带，而K562组细胞在相同位置未出现条带。说明HL-60组细胞含有NE酶，能发生融合蛋白被切割的情况。而K562细胞不含NE酶。以β-actin作为对照。见图1。
预实验Ⅱ：western-blotting法检测HL-60中NLS-RARα蛋白
分别收集对数生长期的HL-60细胞，K562细胞，按说明书分别提取胞核蛋白，用BCA法定量，分别取100μg蛋白，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭4h后，加入兔抗人RARα多抗（5%脱脂奶粉1:500稀释），4℃8h。洗膜：用TBST洗2次，每次10min，再用TBS洗10min.加入羊抗兔二抗（5%脱脂奶粉1：1000稀释），37度孵育1h，然后洗膜（步骤同上），最后进行化学发光显色和成像分析。以Histone H3作为对照。
HL-60组在蛋白分子量约69kda处出现了与NLS-RARα蛋白分子量大小相近的特异性条带，而K562组细胞在相同位置未出现条带。说明可以通过Western blotting检测HL-60细胞中NLS-RARα蛋白的表达情况。以Histone H3作为对照，其蛋白分子量约20kda。见图2。
分别取病人（急性早幼粒细胞白血病患者）和正常人的中性粒细胞作为检测标本，参照预实验Ⅱ的方法进行检测，并对目的条带的灰度值进行分析，具体结果详见表1，所述表1的数据分析表详见图6。
表1：western的结果
平行实验：免疫荧光法检测经FITC-Annexin V/DAPI双染色的HL60细胞中NLS-RARα的表达及定位
分别收集对数生长期的HL-60细胞、K562细胞，用PBS洗三次，各取15μl涂片；用4%的多聚甲醛固定20min后，PBS漂洗三次；再用0.1%triton透膜处理10min。10%山羊血清室温封闭30min，加上兔抗人RARα抗体（封闭血清1:200），4℃过夜。PBS洗3次，加上FITC-AnnexinV标记的荧光二抗（封闭血清1:200），37度孵育1h。PBS洗3次，加入核染色液DAPI5min，PBS漂洗3次，用70%甘油封固，荧光显微镜下观察拍照。
HL-60细胞中FITC染色区域与胞核PI染色几乎重叠，说明NLS-RARα蛋白在HL-60中主要在胞核内表达。K562细胞中FITC染色区域明显大于胞核PI染色区域，且胞核区域染色较浅，说明野生型RARα蛋白在K562中主要在胞浆表达。见图3。
分别取病人（急性早幼粒细胞白血病患者）和正常人的中性粒细胞作为检测标本，参照上述平行方法进行检测，并对靶部位的灰度值进行分析，具体结果详见表2，所述表2的数据分析表详见图7。
表2荧光显微镜结果
表2中，目的指的是显微镜下的绿色荧光的量（包括胞浆和胞核），核指的是核区域的绿色荧光的量。
采用spss17.0软件进行数据t检验分析，t值为-15.880，病人组为0.8600±0.04084，正常人组为0.2933±0.04726，p<0.05，两组间差异有统计学意义。说明病人组蛋白表达与正常人相比主要在胞核。
激光共聚焦检测经FITC-Annexin V/DAPI双染色的HL60细胞中NLS-RARα的表达及定位
制作片子方法与免疫荧光相同，激光共聚焦显微镜检测NLS-RARα蛋白在HL-60和K562细胞胞浆胞核的表达情况。以蓝绿双色荧光通道扫描观察。蓝光的激发波长为488nm,在600nm波长以上观察。绿光的激发波长为543nm,在600nm波长以上观察。每张切片选取荧光表达最强的10个视野观察并由计算机扫描软件LAS AF lite进行扫描分析。
HL-60细胞中FITC染色区域与胞核PI染色几乎重叠，说明NLS-RARα蛋白在HL-60中主要在胞核内表达。K562细胞中FITC染色区域明显大于胞核PI染色区域，说明野生型RARα蛋白在K562中在胞浆胞核皆有表达。如图4。
验证实验：PCR法验证HL-60中的PML-RARα融合基因
Trizol法分别提取HL-60、K562细胞的总RNA，取2μl测浓度。分别取RNA各500ng逆转录成cDNA。分别取1.5μl cDNA产物进行PCR。前期实验参照胡秀秀等人“重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达”。已知PML-RARα基因的CDS序列，设计引物如下，PML-RARα-F：5’-aggaggcagagagagtgaagg-3’，PML-RARα-R：5’-gtcctgacagacaaagcaagg-3’。扩增产物500bp。PCR反应体系:25μl，含cDNA1.5μl，上下游引物各0.5μl，Premix Taq酶12.5ul，用灭菌水补足至25μl。反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火56.5℃30s，延伸72℃2min5s，共35个循环。取PCR产物各10μl经1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳仪拍照观察。
HL-60组特异性条带位于约500bp处，大小符合预期；而K562组在相同位置未出现条带。说明HL-60细胞存在PML-RARα融合基因，而K562细胞不存在PML-RARα融合基因。见图5。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，所述检测方法为非治疗目的和诊断目的的检测方法，所述方法为激光共聚焦法，其特征在于：将经染色后的靶细胞置于激光共聚焦显微镜的适应波长的双色荧光通道中，捕获靶细胞中各部位的荧光强度数据，对靶细胞各部位荧光强度数据进行分析以判断靶细胞中带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的存在；所述靶细胞为HL-60或急性早幼粒细胞病人血中性粒细胞；
另设立平行试验，所述平行实验中，设置有实验组、正常对照组；当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的X倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在带核定位信号的维甲酸受体α蛋白；X为0.8600±0.04084除以0.2933±0.04726的值。
2.根据权利要求1所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：还设置有阴性对照组和/或空白对照组。
3.根据权利要求1所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：所述靶细胞被制成涂片，具体为：取靶细胞涂片，并用多聚甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得涂片。
4.根据权利要求1或3所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：对靶细胞进行染色，具体为：用RARα特异性抗体与所述靶细胞结合，再用FITC-AnnexinV标记的荧光二抗孵育。
5.根据权利要求4所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：所述RARα特异性抗体为兔抗人RARα的多克隆抗体；所述RARα特异性抗体和所述荧光二抗按1:200的体积比稀释。
6.根据权利要求4所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：在激光共聚焦法之前，还包括预实验Ⅰ，所述预实验为采用Western blotting验证HL-60细胞中的NE酶，具体为：
分别收集对数生长期的HL-60细胞和K562细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白，定量称取，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，封闭，加入兔抗人NE多抗，所述兔抗人NE多抗作1:500体积稀释，进行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，然后洗膜，于暗室化学发光显影成像判断NE酶是否存在，以β-actin作为对照。
7.根据权利要求6所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：
在激光共聚焦法之前，还包括预实验Ⅱ，所述预实验为采用Western blotting验证带核定位信号的维甲酸受体α蛋白，具体为：分别收集对数生长期的HL-60细胞和K562细胞，分别提取胞核蛋白，定量称取，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，封闭，加入兔抗人RARα多抗，所述多抗作1:500体积稀释，进行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，所述羊抗兔二抗作1:1000倍体积稀释，然后洗膜，于暗室化学发光显影成像判断带核定位信号的维甲酸受体α蛋白是否存在，以Histone H3作为对照。
8.根据权利要求6所述的带核定位信号的维甲酸受体α蛋白的检测方法，其特征在于：在激光共聚焦法同时，还包括平行实验，所述平行实验采用了细胞荧光免疫法，具体为：
A制备涂片
取靶细胞涂片，并用多聚甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片；
B荧光染色
对步骤A所得涂片封闭处理后，用RARα抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；
C荧光强度的获取和分析
在荧光显微镜下扫描荧光染色涂片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果。
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