CN102532070B - 一类作为维甲酸受体(RARs)激动剂的天然产物及其用途 - Google Patents

一类作为维甲酸受体(RARs)激动剂的天然产物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类作为维甲酸受体(RARs)激动剂的天然产物及其用途，本发明发现海洋天然产物Luffariellolide和Manoalide是维甲酸受体RARs的特异激动剂，并且基于分子结构水平来阐述这种特异的选择性。值得注意的是，两者能够通过维甲酸受体RARs抑制多种肿瘤细胞的生长，包括对维甲酸有耐药性的结肠癌细胞。本发明通过大量实验归纳了Luffariellolide和Manoalide的医疗效果，从它与核受体RARs的相互作用揭示了迄今不明的这种多方面药效药物的信号通路机理。从分子结构水平来看，首次发现RAR与Luffariellolide配体所形成的共价结合模式。本发明表明了该类海洋天然产物及其衍生物能够提供一种设计策略以研发用于抑制肿瘤生长且有效减轻耐药性的药物。

Description

一类作为维甲酸受体(RARs)激动剂的天然产物及其用途
技术领域
本发明属于结构生物学、生物化学与药物化学领域。具体涉及一类维甲酸受体(RARs)激动剂的天然产物及其用途。
背景技术
维甲酸类化合物，也可称之为类维生素A，是对维生素A及其衍生物的统称。这类化合物对细胞的增殖与分化具有重要的调节作用。维甲酸类化合物通过激活维甲酸受体(RARs，RARα，β，γ)或维甲酸X受体(RXRs，RXRα，β，γ)发挥作用。这些小分子配体与受体结合后，RARs与RXRs就会以异源二聚体的形式募集辅因子(cofactor)从而调控下游靶基因。RARs这种配体依赖性的辅因子募集方式是通过RARs的配体结合域(LBDs)与辅因子的LXXLL基序(motif)的相互作用实现的，这一点与其他核受体相似。蛋白质晶体结构研究向我们展现了这种核受体与辅因子结合的经典模式：首先激动剂与受体结合，进而核受体结构发生变化会形成一个疏水区域，以便与辅因子(如steroidreceptor coactivators，SRCs)所含有的LXXLL基序结合。核受体helix 5和C端的AF-2螺旋所形成的“口袋”(charge clamp pocket)使LXXLL基序的结合更加稳定。
RARs配体所具有的减缓或阻抑细胞增殖的作用已经广泛应用于多种癌症的治疗中，例如急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)与乳腺癌。但是，过于强烈的副作用会限制维甲酸类RARs配体的临床应用。例如维甲酸对人体具有极为强烈的致畸作用。此外，维甲酸的临床使用还受到细胞耐药性的影响，这已经在多种癌细胞中得到证实。因此，改变针对RAR配体的药物研发策略，研制不同于维甲酸类化合物的RAR配体，可能会降低基于RAR配体的药物的副作用。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种不同于维甲酸类化合物的RAR配体，以降低基于RAR配体的药物的副作用。
本发明的另一目的，在于提供一种RAR配体药物的设计方法。
本发明的技术方案如下：
一种药物设计、药物合成和/或药物筛选的方法，其特征在于，目标药物化合物具有以下通式：
结构式I
R1主要代表含有一个或多个C＝C键的烯烃碳链，C6～C10烷基、C6～C10烷氧基、C3～C6环烷基、O、羰基、-SH、含氮杂环烷基或者任意上述结合。
一种具有结构式I的化合物用途，化合物通过高特异性与高结合亲和力来激活包括RARα，RARβ和RARγ在内的RARs，用作RARs激动剂。
前述的具有结构式I的化合物用途，其作为特异性的激活RARs靶基因的表达的药物。
前述的具有结构式I的化合物用途，其作为治疗RARs介导的疾病的药物。
前述的具有结构式I的化合物用途，其作为治疗包括急性早幼粒白血病、乳腺癌和结直肠癌在内的癌症的药物。
前述的具有结构式I的化合物用途，其作为治疗包括结直肠癌在内的对维甲酸类药物产生耐药性的疾病的药物。
前述的具有结构式I的化合物用途，其中，所述化合物为Luffariellolide或Manoalide：
一种药物设计、药物合成和/或药物筛选的方法，其特征在于：该方法根据Luffariellolide与RARs的结合结构及位点，该晶体结构见附录1的结构，以Luffariellolide与Manoalide及其衍生物作为模板进行药物设计、药物合成和/或药物筛选。
前述的一种药物设计、药物合成和/或药物筛选的方法，该药物结构中包含与RARα，β和γ通过共价键特异性结合的γ-羟基丁烯酸内酯环。
前述的一种药物设计、药物合成和/或药物筛选的方法，该方法根据Luffariellolide与Manoalide及其衍生物的结构，将现有RARs配体相同位置上的基团替换为γ-羟基丁烯酸内酯环。
前述的一种药物设计、药物合成和/或药物筛选的方法，全反式维甲酸，13-顺式维甲酸与9-顺式维甲酸，框内相应位置基团被γ-羟基丁烯酸内酯环取代，表示为以下的结构式：
全反式维甲酸        γ-羟基丁烯酸内酯环
13-顺式维甲酸       γ-羟基丁烯酸内酯环
9-顺式维甲酸            γ-羟基丁烯酸内酯环
本发明发现海洋天然产物Luffariellolide和Manoalide是维甲酸受体RARs的特异激动剂，并且基于分子结构水平来阐述这种特异的选择性。Luffariellolide和Manoalide两者都是来自用海洋生物海绵，具有消炎的作用。值得注意的是，两者能够通过维甲酸受体RARs抑制多种肿瘤细胞的生长，同时降低了维甲酸类药物引起的剧烈副作用。本发明通过证明了Luffariellolide和Manoalide的医疗效果，从它与核受体RARs的相互作用揭示了迄今不明的这种多方面药效药物的信号通路机理。从分子结构水平来看，RARa与Luffariellolide所形成的蛋白复合物的结构展现了RARα的配体结合袋与Luffariellolide的共价结合模式，这种模式符合RAR受体的典型活性构象，同时又是配体与维甲酸受体RAR共价结合模式的首次发现。此外，本发明还发现Luffariellolide和Manoalide能够调节维甲酸受体RAR的重要靶向基因的表达从而抑制肿瘤细胞的生长。因此，通过实验得出的结果表明，通过优化Luffariellolide和Manoalide，能够提供一种设计策略以研发用于抑制肿瘤生长且有效减轻耐药性的药物。
附图说明：
附图1.All-trans RA，Luffariellolide和Manoalide的化学结构式。(A)All-trans RA的化学结构式。(B)Luffariellolide的化学结构式。(C)Manoalide的化学结构式。
附图2.Luffariellolide和Manoalide对不同核受体转录激活作用的检测。将pG5Luc质粒和连接有Gal-4DNA结合域的编码核受体LBDs的质粒转染进入Cos7细胞中，分别向培养细胞中加入1μM的Luffariellolide，Manoalide或DMSO作为对照。
附图3.Luffariellolide和Manoalide剂量对RARα的转录激活的影响。(A)将pG5Luc质粒和连接有Gal-4 DNA结合域的编码RARαLBD与Gal4DBD的质粒共转染Cos7细胞，向培养细胞中加入中加入不同浓度的Luffariellolide或DMSO作为对照。(B)将pG5Luc质粒和连接有Gal-4 DNA结合域的编码RARαLBD与Gal4 DBD的质粒共转染Cos7细胞，向培养细胞中加入中加入不同浓度的Manoalide或DMSO作为对照。
附图4.Luffariellolide是一种“泛RAR”激动剂。将pG5Luc质粒和连接有Gal-4 DNA 结合域的编码核受体LBDs的质粒转染进入Cos7细胞中，分别向培养细胞中加入1μM的Luffariellolide或其他作为阳性对照核受体配体(RARs，全反式维甲酸；RXRα，9-顺式维甲酸；GR，地塞米松；PPARγ，罗格列酮)。此外，一部分细胞培养液中会加入拮抗剂BMS493以供检测Luffariellolide的作用机制。
附图5.Luffariellolide促进SRC1辅激活因子LXXLL基序与RARs的相互作用。利用AlphaScreen技术检测终浓度为1μM的Luffariellolide对RARs与RXRα的LBD与SRC1的LXXLL基序相互作用的影响。另外还检测了RARs的拮抗剂BMS493对Luffariellolide作用的影响。
附图6.Luffariellolide/RARαLBD复合体结构的示意图。绿色带状部分表示RARαLBD，红色带状部分表示SRC1。Luffariellolide用棒状图来表示，黄色棒状部分表示该化合物的碳原子，红色棒状部分表示氧原子。
附图7.Luffariellolide/RARα结构与功能的联系。在下列各图中带状图表示核受体蛋白质的结构，棒状图表示配体化合物的结构。(A)RARα/Luffariellolide复合体(绿色)与RARα/ATRA复合体(蓝色)三维结构重叠比较，在配体的重叠图像中，绿色和红色分别代表ATRA的碳原子和氧原子，黄色代表Luffariellolide的碳原子(B)SRC1-4(红色)与Luffariellolide/RARαLBD复合体的结合模式图(C-D)RARαLBD与Luffariellolide相互作用的分子基础(E)RARα的关键氨基酸突变后对Luffariellolide诱导的转录活性的影响。将编码RARα全长和含有βRARE报道基因的质粒共转染到Cos7细胞后用浓度为1μMRAR激动剂处理细胞。
附图8.MALDI-TOF质谱分析Luffariellolide与RARαLBD的相互作用。RARαLBD分别与DMSO，ATRA，或Luffariellolide孵育，然后利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)进行分析。此外还对RARαLBD与DMSO和Luffariellolide的混合物进行孵育后进行质谱分析。这两个峰分别是RARαLBD和结合了Luffariellolide的RARαLBD。
附图9.Luffariellolide和Manoalide对急性早幼粒白血病细胞THP-1的影响。(A)利用MTT实验检测Luffariellolide或Manoalide对THP-1细胞增殖的抑制作用。以细胞存 活率作为检测指标(纵坐标)，利用浓度为5μM的配体或DMSO处理细胞24小时。(B)利用流式细胞术检测Luffariellolide和Manoalide处理后G1，S，and G2/M期细胞所占比例。(C)Luffariellolide或者Manoalide诱导RAR关键靶基因在THP-1细胞中的表达。利用浓度为5μM的Luffariellolide或Manoalide处理急性早幼粒白血病细胞THP-1然后使用荧光定量PCR实验检测RAR关键靶基因的表达。
附图10.Luffariellolide和Manoalide对人原髓细胞白血病细胞HL-60的影响。(A)利用MTT实验检测Luffariellolide或Manoalide对HL-60细胞增殖的抑制作用。以细胞存活率作为检测指标(纵坐标)，利用浓度为5μM的配体或DMSO处理细胞24小时。(B)Luffariellolide或Manoalide诱导RAR关键靶基因在肿瘤细胞中的表达。利用浓度为5μM的Luffariellolide或Manoalide处理多种肿瘤细胞然后使用荧光定量PCR实验检测RAR关键靶基因的表达。
附图11.Luffariellolide和Manoalide对人乳腺癌细胞MCF-7的影响。(A)利用MTT实验检测Luffariellolide或Manoalide对MCF-7细胞增殖的抑制作用。以细胞存活率作为检测指标(纵坐标)，利用浓度为5μM的配体或DMSO处理细胞24小时。(B)Luffariellolide或Manoalide诱导RAR关键靶基因在肿瘤细胞中的表达。利用浓度为5μM的Luffariellolide或Manoalide处理多种肿瘤细胞然后使用荧光定量PCR实验检测RAR关键靶基因的表达。
附图12.Luffariellolide对具有ATRA耐药性的结直肠癌细胞HCT-116的作用。(A)MTT实验检测Luffariellolide对HCT-116细胞增殖的抑制作用。结果表示为相对对照组的百分比。(B-C)Luffariellolide诱导HCT-116细胞RAR关键的靶基因RARβ(B)和CRABPII(C)的表达。使用1μM Luffariellolide和10μM BMS493处理HCT-116细胞。使用荧光实时定量PCR技术检测mRNA表达量。
具体实施例：
蛋白纯化
构建N-端含有6个组氨酸的pET24a(Novagen)人类的RARαLBD(配体结合域)(氨基酸残基数176-411)的质粒。将该质粒转化进BL21感受态细胞，并在25℃条件下 的LB培养基中生长，当OD600达到1.0左右，使用0.1mM的IPTG在16℃下诱导。收集细胞，每6升菌液用纯化缓冲液200ml(20mM Tris pH8.0，150mM NaCl，10％ glycerol，and 25mM imadazole)重悬细胞。破碎细胞，以20,000rpm转速离心30分钟。将上清过5ml的镍离子交换柱(NiSO4-loaded HisTrap HP column GE Healthcare)。用洗脱缓冲液梯度洗脱该柱子上蛋白，控制咪唑浓度梯度变化在25-500mM。用凝胶过滤柱(GEHealthcare)进一步纯化蛋白。将纯化浓缩后的蛋白滤出液与5倍数量的Luffariellolide和2倍数量的SRC1多肽(AQQKSLLQQLLTE)共同混合孵育。
蛋白结晶，晶体数据收集与结构解析
RARα/Luffariellolide复合物蛋白质晶体在室温条件下，生长于特定缓冲液(2％V/VTacsimate pH7.0，5％ 2-propanol，0.1M Imadazole and 8％PEG 3350)中的晶体筛选盘中，将1μL缓冲液与1μL蛋白液混合倒挂在晶体筛选盘的玻璃上。生长出的晶体用液氮速冻后收集以备数据采集使用。在美国先进光源(Advanced Photon Source)的生物21号实验站进行数据采集。数据使用HKL2000软件(Otwinowski and Minor 1997)进行初步分析整理。具体结构解析使用CCP4软件包(http://www.ccp4.ac.uk)进行处理。使用手动模式的Coot软件(Emsley and Cowtan 2004)进行三维图像构建，进一步使用REFMAC(CCP4)软件优化。
辅因子结合实验
使用AlphaScreen试剂盒(Perkins-Elmer)实验能够检测出RARa LBD与配体结合所需的各种不同基序的多肽(Li et al.2005)。该实验的反应体系是20nM的受体LBD蛋白，20nM生物素化的辅因子多肽(SRC1-2，SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP)，5μg/ml的供体和受体玻璃珠，缓冲液(25mM Hepes，100mM NaCl and 0.1mg/ml bovine serumalbumin，pH7.0)。
瞬时转染实验
使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基进行Cos-7细胞培养，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂盒进行瞬时转染(Li et al.2005)。使用Quick-Change site-directedmutagenesis试剂盒(Stratagene)进行RARα质粒突变。在24孔培养板中当细胞密度达 到每孔5x104后进行转染。在Gal-4驱动的报告实验中，使用200ng的Gal4-LBD与200ng的pG5Luc(Promega)进行共转染。在天然启动子报告实验中，用含有全长核受体质粒与荧光酶报告基因质粒共转染。转染后5小时加入配体。处理24小时后，收集细胞用于荧光素酶检测实验。荧光检测实验通过共转染Renilla报告基因来做内源参照。
基因表达分析
简明地说，细胞用1μM全反式维甲酸ATRA或Luffariellolide处理24小时。使用Trizol试剂(Life Technologies，Inc.)提取细胞的总RNA。使用iScript cDNA Synthesis试剂盒(Bio-Rad)来转录RNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)进行实时荧光定量PCR实验。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析
将纯化后的RARαLBD(30μM)蛋白溶液与DMSO，ATRA或Luffariellolide 4℃共同孵育24小时。利用Reflex III time-of-flight质谱仪(Bruker-Daltonics，Bremen，Germany)进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析。利用强度为19keV的脉冲UV激光束(λ＝337nm)使其离子化并加速。所用的样品均利用过饱和的芥子酸(3，5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid)，50％乙腈和0.1％的TFA作为基质。将样品和基质按照同样的体积(0.8μL)混合后点样检测。
MTT法检测细胞增殖
按照每孔1x104的数量将细胞培养于24孔板。培养过夜后加入ATRA，Luffariellolide或Manoalide处理24小时。然后加入MTT(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5--diphenytetrazoliumromide)再处理4小时。最后将包括培养基，药物和多余的MTT一起去除后利用DMSO溶解甲瓒，检测490nm处和630nm处的吸光度。
流式细胞术分析细胞周期
按照每孔5x105的数量将细胞培养于24孔板。细胞培养24小时后用5μM的ATRA，Luffariellolide或者Manoalide处理24小时。然后收集细胞，利用70％乙醇固定过夜后利用碘化丙啶染色1小时。至少20,000个细胞利用Epics XL Flow Cytometer(Beckman Coulter， Minnesota，USA)检测。结果使用Modfit software version 3.2(Verity Software House，Inc.，Topsham，ME)分析。
我们的发明表明Luffariellolide和Manoalide及通过设计两者的衍生物，能够特异地以维甲酸受体RAR为靶点，作为治疗多种癌症的可选替代药物。基于我们所展示的结构与构效(SAR)的分析，我们提供了一种用以提高RAR亲和性和特异性，降低耐药性的合理的设计范本。
实施例1，证明Luffariellolide和Manoalide是维甲酸受体RAR的配体。
在寻找RAR配体的过程中，将RARs的LBD当做“诱饵”利用AlphaScreen技术对化合物库进行筛选，这一技术目前已经广泛应用于基于核受体与配体相互作用的药物研发中。Luffariellolide是一种海洋天然产物，化学本质为二倍半萜，最初分离自海绵(包括Luffariella sp.和Fascaplysinopsis)。与全反式维甲酸(ATRA)类似，Luffariellolide由一条疏水的碳链和一个三甲基环己烯基团组成(附图1)。值得注意的是在Luffariellolide与ATRA的化学结构对比中，关键位置的基团是完全不同的。ATRA为丁烯酸(羧基)，而在Luffariellolide的相应位置上则为γ-羟基丁烯酸内酯环。这一点不同是极其重要的，是药物研发新策略的关键所在。Manoalide也是分离自海绵的天然产物，属于倍半萜类化合物。Manoalide与Luffariellolide的结构基本相同(附图1)，都含有三甲基环己烯环和γ-羟基丁烯酸内酯环这两个主要基团。不同之处在于Manoalide中与γ-羟基丁烯酸内酯环相连的是一个二氢吡喃环，而Luffariellolide不含有此二氢吡喃环。
为了进一步研究Luffariellolide和Manoalide对RARs的激活作用，我们将编码Gal4DNA结合域、报道基因、多种核受体LBD的质粒共转染到Cos7细胞中。实验结果与最初对化合物的筛选结果一致，Luffariellolide和Manoalide均可以激活维甲酸受体RAR，但不能激活其他核受体(包括RXRα、PPARγ、GR、RTR、ERRα、RORo，β，γ以及TR3)(附图2)，说明Luffariellolide和Manoalide是维甲酸受体RAR的独特配体。
为了检测了Luffariellolide和Manoalide与RARs的结合特性，我们使用一系列不同浓度的RARs配体进行荧光素酶报道基因检测来进行比较(附图3)。全剂量曲线表明Luffariellolide对RARs的激活具有浓度依赖性，其EC50＝600nM(附图3A)。我们同时检 测了Manoalide，实验结果表明Manoalide对RAR的激活也具有浓度依赖性，其EC50＝600nM(附图3B)。我们进一步利用荧光素酶报告基因实验将编码Gal4 DNA结合域、报道基因、多种核受体LBD的质粒共转染到Cos7细胞中。结果显示Luffariellolide可以激活RARα，RARβ，RARγ，表明Luffariellolide是一种“泛RAR”激动剂(附图4)。此外RARs特异性的拮抗剂BMS493会抑制Luffariellolide对RARs的激活作用，进一步证明Luffariellolide是通过与RARs直接结合的方式发挥作用的(附图4)。
为了研究Luffariellolide与RARs相互作用的生化机理，我们采用AlphaScreen技术检测了Luffariellolide对RARs募集辅激活因子(含LXXLL)的影响。如附图5所示，Luffariellolide极大地增强了RARs对辅激活因子的募集，但是对RXRα没有影响。并且Luffariellolide对RARs的这种增强作用会因为拮抗剂BMS493的加入而被抑制，从而进一步说明Luffariellolide是RARs的激动剂。
实施例2，RARα配体结合域片段与Luffariellolide的复合物的分子结构验证实验
为了研究Luffariellolide与RARs结合的分子基础，我们解析了RARα与Luffariellolide复合体的晶体结构。晶体结构表明结合Luffariellolide后的RARαLBD形成二聚体，其构象与RAR/ATRA复合体相似，配体均锚定于RARα的相似位置(附图6和附图7A)。RAR/Luffariellolide复合体的AF-2与α螺旋H3、H4和H5共同构成一个“口袋”，与辅激活子SRC1的LXXLL基序发生相互作用(附图6和附图7B)。这是一种核受体与辅激活因子相互作用的典型模式。其中，位于H3的K244和位于AF-2的E412是其相互作用的关键位点。对这两个关键氨基酸残基进行突变(K244E，E412K)，然后进行报告基因检测实验(附图7E)。实验结果表明，任何一个关键残基的突变均会导致RARα被ATRA或Luffariellolide的激活作用显著减弱。这一实验结果有力证明了由配体调控的RARs激活作用的典型机制。
将RAR/Luffariellolide复合体与RAR/ATRA复合体的结构重叠后进行对比发现与ATRA相比，Luffariellolide分子更大，导致所对应的配体结合口袋也增大，表现为部分α螺旋H10向外移动 (附图7A)。除此之外Luffariellolide在RARα配体结合口袋中的结合方式还有其独特之处：Luffariellolide通过范德华引力与RARα的a螺旋H3的W225 氨基酸残基相互作用，这一作用有利于Luffariellolide的结合(附图7C)。对这一位点进行点突变处理(W225F)破坏了相互作用，导致Luffariellolide对RARs的激活作用显著降低，但是同样的点突变对ATRA的结合能力与功能均没有影响。值得注意的是，电子密度图显示RARα的C235氨基酸残基与Luffariellolide的γ-羟基丁烯酸内酯环上的酮基形成共价键，而在维甲酸类化合物相应的位置上则是一个羧基(附图7D)。质谱分析的结果为Luffariellolide与RARα形成共价键提供了有力的证据(附图8)。为了检测这个共价修饰对Luffariellolide结合以及激活RARα作用的影响，对C235残基进行点突变(C235A，C235L)，使用荧光素酶报道基因检测的方法发现：C235A和C235L均会使Luffariellolide对RARα的激活作用丧失或显著下降，而对ATRA却没用影响(附图7E)，这说明该共价键对Luffariellolide与RARα的结合是至关重要的。
实施例3，Luffariellolide和Manoalide对多种癌细胞增殖和基因表达的调控
申请人设计了一系列细胞生物学实验来进一步研究Luffariellolide和Manoalide的生理功能。通过对急性早幼粒白血病THP-1细胞系进行的MTT和流式细胞术实验，结果发现：Luffariellolide和Manoalide与ATRA相似，可以抑制THP-1细胞增殖并且使THP-1细胞周期G1期的细胞所占比例上升(附图9A和附图9B)。申请人还检测了经过Luffariellolide或Manoalide处理的THP-1细胞RAR靶基因的表达情况。如附图9C所示，两者均可诱导一些已知的RAR靶基因(RARα，β和interferon regulatory factor-1，IRF-1)上调。这进一步证明了Luffariellolide和Manoalide对RAR靶基因的表达有很强的诱导作用。此外，申请人还在人原髓细胞白血病细胞(HL-60)和人乳腺癌细胞(MCF-7)中进行了相关实验，进一步证明了Luffariellolide对多种肿瘤细胞均具有抑制增殖的作用(附图10和附图11)。
实施例4，Luffariellolide对具有ATRA耐药性的结直肠癌细胞的作用
申请人进一步的研究了Luffariellolide对结直肠癌细胞系HCT-116和HCT-15增殖的抑制作用。两种细胞系的不同之处在于：HCT-116具有维甲酸药物耐药性，而HCT-15则是维甲酸药物敏感型的。如附图12A所示，ATRA和Luffariellolide都可以抑制HCT-15的增殖。对于HCT-116细胞而言，ATRA对HCT-116的增殖没有影响，但是Luffariellolide 可以有效抑制HCT-116的增殖(附图12A)，这表明在抗癌方面Luffariellolide可能要优于ATRA。基于以往研究，RARβ和CRABPII这两个基因在维甲酸药物耐药性方面有着重要指示作用，选取这两个基因作为研究对象。正如附图12B，12C所示，ATRA和Luffariellolide都可以诱导HCT-15中这两个基因的表达；而由于HCT-116细胞耐药性的影响，ATRA不能诱导该细胞中RARβ和CRABPII这两个基因的表达，但是Luffariellolide可以诱导HCT-116细胞的RARβ和CRABPII基因表达上调。另外，我们还在以上检测细胞增殖和基因表达的实验体系的基础上加入了拮抗剂BMS493，结果发现Luffariellolide的作用因为BMS493的加入明显减弱，更进一步说明Luffariellolide对癌细胞发挥作用是通过RARs对癌细胞发挥作用的。
鉴于RAR配体在药物开发尤其是抗癌药物的研制方面具有重要作用，近年来针对可以调控RARs活性的小分子化合物(包括激动剂和拮抗剂)的研发深受相关工作者的重视。但是到目前为止，大多数已经发现的RAR配体都在结构上与维甲酸相似。因此，这些配体也同样面临着严重的副作用和广泛的耐药性。而本发明研究的Luffariellolide和Manoalide首先在结构上与维甲酸类化合物不同，其独特之处在于通过共价键与RARs结合，这一特点此前尚未在RARs配体中发现。更为重要的是，Luffariellolide和Manoalide对已经具有维甲酸药物耐药性的癌细胞(如HCT-116)也有治疗作用。因此，Luffariellolide和Manoalide的发现对针对以RARs为代表的重要核受体的药物研发指明了新的方向。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
。

Claims (1)

1.Luffariellolide在制备一种维甲酸受体RAR激动剂中的应用,所述的激动剂的应用不包括癌症的应用，下式为luffariellolide的结构式:
其中所述的维甲酸受体RAR包括RARα，RARβ和RARγ。
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