CN108467433A

CN108467433A - 抗Napsin A蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Info

Publication number: CN108467433A
Application number: CN201810541424.7A
Authority: CN
Inventors: 胡滨阳; 杨清海; 陈惠玲; 赵普; 王小亚
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108467433B

Abstract

本发明涉及一种新的胃蛋白酶样天门冬氨酸蛋白酶(Napsin A)的单克隆抗体，及其杂交瘤细胞株21A5的制备方法，该单克隆抗体在肿瘤发生及预后评价的用途。制备该抗体的抗原为一段优选的抗原肽，经化学合成后与KLH载体蛋白偶联为免疫原后免疫小鼠，最终获得的抗体属于IgG2b亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得。最终获得的抗体对多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可以用于这些肿瘤的免疫学诊断。

Description

抗Napsin A蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗Napsin A蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

原发性肺癌(以下简称肺癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。中国肿瘤统计报告(Chen W,Zheng R,Baade PD,Zhang S,Zeng H,Bray F,Jemal A,Yu XQ,He J.Cancerstatistics in China,2015.CA Cancer J Clin.2016, 66(2):115-32)指出，肺癌是发病率最高的癌症，其死亡率也位居前列。2015 年新发肺癌病例为73.33万(男性50.93，女性22.40万)，同期，我国肺癌死亡人数为61.02万(男性43.24万，女性17.78万)，占恶性肿瘤死因的21.68％。

在高危人群中开展肺癌筛查有益于早期发现早期肺癌，提高治愈率。低剂量CT(low-dose computed tomography，LDCT)发现早期肺癌的敏感度是常规胸片的4-10倍，可以早期检出早期周围型肺癌。肺癌筛查还可结合免疫组化等技术开展，包含的信息应满足临床分期的需要，并给出pTNM分期。

2015版的WHO在肺癌分类方法中融入了更多的遗传信息，更加重视免疫组化和分子诊断对肺癌分类的重要性，然而没有任何一种分类可以囊括肺癌的所有特性，病理分类的重要性在于指导治疗和预后。William D.Travis根据细胞起源提出把类癌、小细胞肺癌和大细胞神经内分泌统归入神经内分泌肿瘤，这个分类存在巨大争议。腺癌与鳞状细胞癌鉴别的免疫组化标记物宜选用TTF-1、NapsinA、p63、P40和CK5/6；神经内分泌肿瘤标记物宜选用 CD56、Syn、CgA、Ki-67和TTF-1，在第2015版分类方法中还指出，在浸润性黏液型腺癌的诊断中，不表达TTF-1和NapsinA，胶样腺癌中弱表达或病灶表达TTF-1和NapsinA，肺大细胞癌的先决条件是表达TTF-1和NapsinA和鳞癌标志物及黏液染色均为阴性，诊断时需注重与腺癌实体亚型(TTF-1、 NapsinA、黏液染色阳性；P40、P63(4Aa)、CK5/6阴性)、非角化性鳞癌(TTF-1、 NapsinA、黏液染色阴性；P40、P63(4Aa)、CK5/6阳性)和腺鳞癌(不同区域有腺癌和鳞癌，且每一种成分要＞10％)鉴别。因为Napsin A蛋白表达情况和肿瘤发生、发展的密切关系，因此，获得针对Napsin A的优质抗体一直受到重视。

Napsin A,即新的胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶A(noval aspartic proteinase ofthe pepsin family A)是一种分子量接近38KDa的单链蛋白，表达于Ⅱ型肺上皮细胞和肺腺癌细胞。免疫组化研究显示，该蛋白在人类的肺和肾中高表达，而在脾脏中低表达。同属Napsin的还包括napsinB基因，该基因被认定为无翻译产物的假基因。NapsinA在肺腺癌中的表达敏感性明显高于SP-A和SP-B，而且有极高的特异性，在部分TTF-1为阴性的低分化肺腺癌病例中NapsinA通常为阳性表达，故该抗体被推荐同TTF-1联用，用于原发性肺腺癌与其他组织器官源性腺癌的鉴别。Vesna Schauer-Vukasinovic等在分析了NapsinA、NapsinB、Cathepsin D、Renin蛋白、Cathepsin E及胃蛋白酶的序列特征后，选择了一段序列为SFYLNRDPEEPDGGD的多肽作为免疫原制备兔多抗，并且从一级序列的特异性到三级结构的特征，多肽序列DPEEPD 都处于核心重要的地位(Vesna Schauer-Vukasinovic,DanielBur,Dorothee Kling,Fiona Gru<<ninger,Thomas Giller.Human napsin A:expression,immunochemical detection,and tissuelocalization.FEBS Letters. 1999,462:135-139)。不同的抗体，包括兔多抗、兔单抗及不同的鼠单抗用于肿瘤诊断，其效能也不相同，Lena Tran等利用购自Biocare Medical公司的鼠单抗TMU-Ad02、Cellmarque公司的鼠单抗MRQ60、同样是Cellmarque 公司的兔多抗产品及来自Leica的鼠单抗IP64进行非小细胞肺癌的诊断研究，发现这些抗体的敏感度从59％到83％，存在差异，特异性从67％到89％，也不相同(Lena Tran,Johanna S.M.Mattsson,Nodin,Per Maria Planck,Karin Johan Botl ing,Patrick Micke,Hans VariousAntibody Clones of Napsin A,Thyroid Transcription Factor 1,and p40andComparisons with Cytokeratin 5and p63in Histopathologic Diagnostics of Non–Small Cell Lung Carcinoma.Applied Immunohistochemistry&MolecularMorphology.2016,24(9):648–659). 除用于肺癌诊断外，NapsinA抗体用于其他肿瘤的诊断也有探索(江晓红,袁军,付亚军.Napsin A在卵巢上皮性癌中的鉴别诊断应用研究.中国妇幼保健.2016,31(4))。

在应用中，为提高诊断的敏感度和特异性，往往需要将不同的抗体组合使用，申请号CN201080017399.4的发明专利《测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒、测定试剂盒及测定方法》公开了一种可识别腺癌细胞质中的Napsin-A、腺癌细胞核中的TTF-1的抗体组成的ADC抗体鸡尾酒，以及可识别鳞状细胞癌细胞质中的CK14和位于鳞状细胞癌的细胞核上的p63的抗体组合为SCC抗体鸡尾酒的组合方式，并展示了其应用效果。申请号为201310081206.7的发明专利《肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法》提供了一种将Napsin A、 TTF-1、CK5/6抗体组合使用，以克服现有肺癌组织学不易分型，免疫组织化学技术分别检测耗时费力的不足。

发明内容

为了克服以上技术问题，提供一种适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测的，具有特异性和敏感性的Napsin A单克隆抗体。

发明人提供了一种抗Napsin A单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15487 的杂交瘤细胞株产生。所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC NO 15487，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Napsin A蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Napsin A蛋白中的SEQID1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID6所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG2b亚型。

发明人还提供了一种抗Napsin A单克隆抗体的制备方法，所述单克隆抗体的制备方法，包括免疫原的制备：选取Napsin A蛋白C末端的第238位至 268位氨基酸序列为抗原肽，所述抗原肽与KLH载体蛋白偶联后得到免疫原，所述抗原肽的氨基酸序列为SEQID2所示的氨基酸序列。

发明人还提供了一株分泌抗Napsin A蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株21A5，所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC NO 15487，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在Napsin A蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：

(1)本发明获得的单克隆抗体由杂交瘤21A5分泌产生，能特异性识别重组表达的人NapsinA蛋白和人细胞中的NapsinA蛋白，可以特异性检测能够检测高表达NapsinA蛋白的肺细胞、肾细胞、T淋巴细胞等正常组织和非小细胞肺癌的肿瘤组织。

(2)本发明获得的杂交瘤21A5为一种IgG2b亚型抗体，与天然NapsinA3 蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

(3)因本发明获得的单克隆抗体杂交瘤21A5由特殊选择的多肽作为免疫原，因此具有限定的识别表位，可与Cathepsin D及Cathepsin E等相似的分子明确区分，更利于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blotting) 中的蛋白检测。

附图说明

图1为NapsinA与相似蛋白的序列比对以及抗原肽选择图，下划线部分为本发明选择的抗原多肽区域。

图2为21A5杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果，其中Marker为蛋白分子量标记，1为BSA-Napsin A-PEP偶联产物，2为未经多肽偶联的BSA载体蛋白。

图3为肺腺癌肿瘤的染色结果对比图；其中21A5染色结果为+++， TMU-Ad02染色结果为++。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1多肽合成及与载体蛋白的化学偶联

从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号为P15391的 Napsin A蛋白序列作为标准序列，其序列如序列表SEQID1所示，通过BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具比较其与其他同家族蛋白的序列差异，并以DNASTAR8.0软件(www.dnastar.com)的Protean模块进行二级结构、抗原性和表面可及性分析。

选定蛋白的第238位至268位氨基酸作为抗原肽，并在该序列的C末端添加一个半胱氨酸用于和载体蛋白KHL的偶联，得到免疫原。免疫原由抗原肽、KLH载体蛋白及将二者的二硫键组成。该抗原肽命名为Napsin A-PEP，其序列如序列表中SEQID2所示。相似蛋白的氨基酸序列比对以及设计的抗原肽位置见附图1。

(1)将20mg SMCC((N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯, 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester)溶于2mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺, Dimethylformamide)。

(2)将0.8ml KLH(钥孔血蓝蛋白，keyhole limpet hemocyanin)加入到25ml三角瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使载体蛋白终浓度为15mg/ml。

(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH中，室温搅拌反应1h。

(4)用1L 1×PBS(pH 7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。

(5)将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。

(6)将3.0mg多肽用0.6ml 1×PBS(pH 7.2)溶液溶解。

(7)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman 试剂(上海索宝生物科技有限公司)储备液，再加入10μl多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15继续实验；0.05<OD 值<0.15，需要补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。

(8)将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4 小时。

(9)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman 试剂储备液，再加入10μl交联后的多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上，可以进行免疫实验；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。

按上述方法制备的免疫原与牛血清白蛋白(BSA)的交联，所得的交联产物命名为BSA-Napsin A-PEP，用于对抗体的筛选，亲和力测定和免疫印迹分析。

实施例2：21A5杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中得到的免疫原用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫 4-6周龄雌性Balb/c小鼠或者ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC) 以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm， 5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma 公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween 的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)， 37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a， IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2b亚型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的BSA-Napsin A-PEP偶联产物，包被浓度为2μg/ml, 100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h， PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1： 20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％ TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M 硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为6.72×10⁸。

三、单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的BSA-Napsin A-PEP偶联产物用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：以BSA-Napsin A-PEP偶联产物及BSA载体蛋白作为对照，上样约50ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。预染蛋白分子量标记PageRuler^TM Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific，货号26616)。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的 TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由21A5杂交瘤培养上清(1：4稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液 (北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统 (Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。结果可见图2杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果，该株抗体可与偶联至BSA载体蛋白的抗原特异结合，与载体蛋白无结合，其条带位置在70kDa附近。

实施例5抗体的可变区序列测定

培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA。取9μl总RNA，加入2.5 μLoligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μldNTPs，混合均匀，70℃保温 5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μ l的5×逆转录酶缓冲液，2.5μl DTT(0.1M)及1μl逆转录酶(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μl 反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增使用的引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV.B1直至MHV.B12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。

MHV.B1:5’-GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’

MHV.B2:5’-CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’

MHV.B3:5’-CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’

MHV.B4:5’-AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’

MHV.B5:5’-GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’

MHV.B6:5’-GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’

MHV.B7:5’-CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’

MHV.B8:5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’

MHV.B9:5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’

MHV.B10:5’-GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’

MHV.B12:5’-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’

MHC.F:5’-GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物MKC.F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。

MKV.B1:5’-GATGTTTTGATGACCCAAACT-3’

MKV.B2:5’-GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’

MKV.B3:5’-GATATTGTGATAACCCAG-3’

MKV.B4:5’-GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’

MKV.B5:5’-GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’

MKV.B6:5’-GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’

MKV.B7:5’-GATATCCAGATGACACAGACT-3’

MKV.B8:5’-GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’

MKV.B9:5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’

MKV.B10:5’-GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’

MKC.F:5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μl和1U热启动Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒， 72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μl PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，选条带清晰的位置，切胶回收，克隆至T载体测序。

实施例6.组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入 -20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片 2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30 分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟) -100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体(21A5)和市售抗体(TMU-Ad02)在不同人体肿瘤组织芯片(包括肺腺癌74例、肾透明细胞癌58例、肺腺癌46例、甲状腺乳头状癌35例) 上的进行同步检测并比较检测结果。

NapsinA的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表。

本抗体(21A5)和市售临床抗体(TMU-Ad02)，阳性符合率达到100％，本抗体临床价值得到验证。同时，在8例样本中，本抗体的染色强度高于市售抗体，说明本抗体在肿瘤组织的特异性同市售抗体相当，敏感性与亲和力高于市售抗体。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

在正常组织中，本抗体(21A5)和市售临床抗体(TMU-Ad02)阴性和阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

本发明对在非小细胞肺癌病人组织细胞核表达的Napsin A蛋白，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。将抗原肽与KLH载体蛋白进行化学交联以提高其免疫原性，得到免疫原。将免疫原与牛血清白蛋白(BSA)化学偶联，用于抗体的交叉筛选，减少识别KLH抗体的干扰。

筛选获得的抗体上清利用包含多种病理组织的组织芯片进行筛查，获得基本的染色特异性、敏感度和特异性评价数据，对于初选合格的杂交瘤细胞株用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为Ig2b亚型单克隆抗体，并通过对杂交瘤细胞的mRNA逆转录后扩增出编码其重链和轻链可变区的基因序列。对于最终获得的单克隆抗体以多种组织样本和多种抗体进行IHC方法检测，确定用途。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗Napsin A蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 10

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser Pro Pro Pro Leu Leu Gln Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu

1 5 10 15

Leu Asn Val Glu Pro Ser Gly Ala Thr Leu Ile Arg Ile Pro Leu His

20 25 30

Arg Val Gln Pro Gly Arg Arg Ile Leu Asn Leu Leu Arg Gly Trp Arg

35 40 45

Glu Pro Glu Leu Pro Lys Leu Gly Ala Pro Ser Pro Gly Asp Lys Pro

50 55 60

Ile Phe Val Pro Leu Ser Asn Tyr Arg Asp Val Gln Tyr Phe Gly Glu

65 70 75 80

Ile Gly Leu Gly Thr Pro Pro Gln Asn Phe Thr Val Ala Phe Asp Thr

85 90 95

Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Arg Arg Cys His Phe Phe Ser

100 105 110

Val Pro Cys Trp Leu His His Arg Phe Asp Pro Lys Ala Ser Ser Ser

115 120 125

Phe Gln Ala Asn Gly Thr Lys Phe Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Gly Arg

130 135 140

Val Asp Gly Ile Leu Ser Glu Asp Lys Leu Thr Ile Gly Gly Ile Lys

145 150 155 160

Gly Ala Ser Val Ile Phe Gly Glu Ala Trp Glu Pro Ser Leu Val Phe

165 170 175

Ala Phe Ala His Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Gly Phe Pro Ile Leu

180 185 190

Ser Val Glu Gly Val Arg Pro Pro Met Asp Val Leu Val Glu Gln Gly

195 200 205

Leu Leu Asp Lys Pro Val Phe Ser Phe Tyr Leu Asn Arg Asp Pro Glu

210 215 220

Glu Pro Asp Gly Gly Glu Leu Val Leu Gly Gly Ser Asp Pro Ala His

225 230 235 240

Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Phe Val Pro Val Thr Val Pro Ala Tyr Trp

245 250 255

Gln Ile His Met Glu Arg Val Lys Val Gly Pro Gly Leu Thr Leu Cys

260 265 270

Ala Lys Gly Cys Ala Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Leu Ile Thr

275 280 285

Gly Pro Thr Glu Glu Ile Arg Ala Leu His Ala Ala Ile Gly Gly Ile

290 295 300

Pro Leu Leu Ala Gly Glu Tyr Ile Ile Leu Cys Ser Glu Ile Pro Lys

305 310 315 320

Leu Pro Ala Val Ser Phe Leu Leu Gly Gly Val Trp Phe Asn Leu Thr

325 330 335

Ala His Asp Tyr Val Ile Gln Thr Thr Arg Asn Gly Val Arg Leu Cys

340 345 350

Leu Ser Gly Phe Gln Ala Leu Asp Val Pro Pro Pro Ala Gly Pro Phe

355 360 365

Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Leu Gly Thr Tyr Val Ala Val Phe Asp

370 375 380

Arg Gly Asp Met Lys Ser Ser Ala Arg Val Gly Leu Ala Arg Ala Arg

385 390 395 400

Thr Arg Gly Ala Asp Leu Gly Trp Gly Glu Thr Ala Gln Ala Gln Phe

405 410 415

Pro Gly

<210> 2

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Ser Asp Pro Ala His Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Phe Val Pro Val Thr

1 5 10 15

Val Pro Ala Tyr Trp Gln Ile His Met Glu Arg Val Lys Val Gly Cys

20 25 30

<210> 3

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gaggtgcagc tgcagcagtc tggacctagc ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaaga cttctggata cacatccact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg ggttggaggt tttactccta acagttatgc tactaactac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtaggca agtcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attattgtgc aagagactcc 300

tacgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gatatcatgc tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgca catattaatg gagacaccta tttagaatgg 120

tttctgcaga taccaggcca gtctccaaag ctcctgatat acaaagttcc caaacgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaacgttc agatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 5

<211> 114

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Gly Phe Thr Pro Asn Ser Tyr Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 6

Asp Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ala His Ile

20 25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Ile Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Arg

85 90 95

Ser Asp Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

Claims

1.一种抗Napsin A蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15487的杂交瘤细胞株产生。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别NapsinA蛋白。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别NapsinA蛋白中的SEQID1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID6所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG2b亚型。

7.一种抗NapsinA单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体免疫原的制备：选取Napsin A蛋白C末端的第238位至268位氨基酸序列为抗原肽，所述抗原肽与KLH载体蛋白偶联得到抗体免疫原，所述抗原肽的氨基酸序列为SEQID2所示的氨基酸序列。

8.一株分泌抗Napsin A蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株21A5，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO 15487。

9.权利要求1-6任一所述的单克隆抗体，在Napsin A蛋白免疫检测中的用途。

10.根据权利要求9所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。