CN101224307B - 急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2，即融合基因pIRES-PML-RARα-hIL-2。本发明还公开了上述DNA疫苗可应用于制备治疗急性早幼粒细胞白血病的药物。本发明利用PML-RARα融合基因构建DNA疫苗用于根除APL的MRD，本发明提供了一个可以诱导产生特异性抗APL免疫效应的PML-RARα-hIL-2双基因DNA疫苗，为治疗APL的DNA疫苗的研发提供重要的数据和资料。本发明方法还可以为其他治疗性肿瘤DNA疫苗的研究所借鉴。本发明的DNA疫苗能清除APL患者体内的微小残留病变，最终达到治愈APL的目的。
Description
技术领域
本发明属于血液肿瘤免疫治疗技术领域，特别涉及一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2质粒)及其制备方法和应用。
背景技术
免疫疗法治疗肿瘤与白血病是目前的一个趋势，DNA疫苗具备诸多传统疫苗所不能比拟的优势，能够诱导特异性体液免疫与细胞免疫。急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是目前治疗效果最好的一种白血病，但肿瘤的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)却很难被现行治疗方案根除，寻找一种能够根除APL的MRD的治疗方案迫在眉睫。
尽管针对急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)的联合化疗方案已经取得很大进展，患者的预后也有了较大改善，但肿瘤的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)却很难被现行治疗方案彻底消灭。由于许多白血病患者体内都存在由于染色体易位所形成的融合基因，利用融合基因作为诱导产生特异性抗白血病治疗的靶点已经成为众多研究人员追求的目标。由于体外表达的蛋白不一定具有与体内蛋白一致的天然构象，而且外源蛋白进入体内后以诱导体液免疫反应为主，而DNA疫苗则能够有效地克服这些缺陷，同时诱导体液免疫和细胞免疫。利用PML-RARα[早幼粒白血病基因(PML)与维甲酸受体α(RARα)基因]融合基因制备DNA疫苗是有希望根除急性APL的MRD的方法之一。
目前对于APL的治疗主要有传统化疗和诱导分化治疗，虽然现有的治疗方法已经能够在很大程度上提高患者的生存质量，患者的预后也有了较大改善，但肿瘤的MRD却很难被现行治疗方案彻底消灭。骨髓移植虽然能够根除MRD，但骨髓来源少，配型成功率低，高昂的移植费用以及严重的移植相关并发症限制了该疗法的推广。在化疗结束后辅以APL特异的DNA疫苗治疗是有希望根除MRD的方法之一。
大约有70％APL患者体内存PML-RARα融合基因，该融合基因是APL发病以及应用全反式维甲酸治疗有效的分子基础，是一个特异的白血病抗原。表达PML-RARα的细胞可诱导T细胞克隆性增殖，提示该细胞内的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到细胞表面，因此可以利用PML-RARα融合蛋白或融合基因诱导机体产生特异性免疫应答，或者诱导机体产生针对PML-RARα的特异性CTL，达到免疫治疗的目的。Padua等研究发现利用跨越PML-RARα融合基因的融合点的基因片段构建的DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生特异性免疫保护作用。
目前对于制备PML-RARα基因疫苗特异性目的基因的选择尚无定论，如何筛选出具有最佳免疫原性的PML-RARα基因片段仍是此类研究所面临的核心问题。目前尚未有融合基因pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2(人白细胞介素2)的构建。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒)。该融合基因pIRES-PML-RARα(384 bp)-hIL-2是能够在真核细胞内同时表达PML-RARα和hIL-2蛋白的质粒。本发明利用基因克隆和重组技术构建了急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒)，并研究了通过体外细胞转导后基因和蛋白表达；小鼠体内注射免疫后不同时期的基因和蛋白表达、抗体产生和特异性CTL效应等的效应。
本发明的另一目的在于提供上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的应用。所述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗是一种能够在真核细胞中同时表达PML-RARα蛋白和hIL-2蛋白的DNA疫苗，它能够诱导APL患者机体产生针对APL细胞的特异性CTL从而清除患者体内的微小残留病变，达到治愈APL的目的。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα 384-hIL-2，所述DNA疫苗PML-RARα 384-hIL-2(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒)由pIRES质粒、PML-RARα基因和hIL-2基因组成，所述PML-RARα基因(大小为384bp)序列如下：
CAA
AGCgtctccaatacaacgacagcccagaagaggaagtgcagccagacccagtgcccca
ggaaggtcatcaagatggagtctgaggaggggaaggaggcaaggttggctcggagctccccggagcagcccaggcc
cagcacctccaaggcagtctcaccaccccacctggatggaccgcctagccccaggagccccgtcataggaagtgaggt
cttcctgcccaacagcaaccacgtggccagtggcgccggggaggcagccattgagacccagagcagcagttctgaaga
gatagtgcccagccctccctcgccaccccctctaccccgcatctacaagccttgctttgtctgtcaggac
CGC；
所述PML-RARα基因片段是384bp，实际上有效片段是360bp，ATG为启始密码子，TGA为终止密码子；前后的序列为酶切位点等。
所述hIL-2基因(大小为487bp)序列如下：
GGCAC
ACA
TACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCA
CTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAA
GAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTT
TGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACA
TTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTG
TCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAA
GCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTA
ATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGC
TGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTT
GTCAAAGCATCATCTCAACACTGACT
ATA。
所述hIL-2基因片段是487bp，ATG为启始密码子，TGA为终止密码子；前后的序列为酶切位点等。
上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα 384-hIL-2的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先提取NB4细胞的RNA通过逆转录合成cDNA，然后利用引物PP3和PP4通过PCR扩增出PML-RARα基因；扩增的PCR产物标记为PML-RARα，其大小为384bp；
将扩增的基因PML-RARα利用T4 DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出pIRES-PML-RARα；
所述的PP3：5’CAA
AGCATGGTCTCCAATACAACGA 3’，其中，方框内GCTAGC为Nhe I酶切位点；
所述的PP4：5’GCGTCAGTCCTGACAGACAAAG 3’，其中方框内ACGCGT为Mlu I酶切位点。
(2)然后通过PCR从Jurkat细胞的cDNA中扩增出hIL-2基因
用引物PI3、PI4(外侧引物)和PI1、PI2(内侧引物)进行巢式PCR，扩增hIL-2基因，扩增的PCR产物大小为487bp。
所述的PI1：5’GGCAC
ACAATGTACAGGATGCAACTCC 3’；方框内GTCGAC为Sal I酶切位点；
所述的PI2：5’TAT
TCAAGTCAGTGTTGAGATGATG 3’；方框内GCGGCCGC为NotI酶切位点。
所述的PI3：5’TTGTTCAAGAGTTCCCTATC 3’；
所述的PI4：5’TGAAACCATTTTAGAGCC 3’；
(3)将上述扩增得到的hIL-2基因利用T4 DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES-PML-RARα的多克隆位点B中，经过测序正确后，构建了pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2质粒即DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2。
所述步骤(1)扩增反应条件为：预变性94℃1min，退火60℃1min；延伸72℃1min，共进行40个循环；首次预变性为94℃3min，末次延伸为72℃10min。
所述步骤(2)扩增反应条件为：首先94℃预变性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1min循环30次，最后72℃总延伸6min。
上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα 384-hIL-2 (即pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒)可应用于制备治疗急性早幼粒细胞白血病的药物。
本发明与现有技术的相比，具有如下优点和有益效果：
1、该DNA疫苗是一个能够在真核细胞内同时表达PML-RARαt和hIL-2蛋白的质粒，将该DNA疫苗注射到急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内能够激发机体产生针对APL细胞的特异性免疫效应，从而达到根除患者体内的微小残留病变的目的。可应用于制备治疗急性早幼粒细胞白血病的药物。
2、本发明利用PML-RARα融合基因构建DNA疫苗用于根除APL的MRD，本发明提供了一个可以诱导产生特异性抗APL免疫效应的PML-RARα(384bp)-hIL-2双基因DNA疫苗，为治疗APL的DNA疫苗的研发提供重要的数据和资料。
3、本发明利用肿瘤相关抗原或肿瘤特异抗原与细胞因子基因共同构建DNA疫苗)还可以为其他治疗性肿瘤DNA疫苗的研究所借鉴。
4、本发明的DNA疫苗能清除APL患者体内的微小残留病变，最终达到治愈APL的目的。
附图说明
图1为PIRES-PML-RARα-hIL-2双表达质粒构建流程图。
图2为PCR扩增获得的PML-RARα基因片段图。
其中，Lane 2：PML-RARα(384bp)的PCR产物384bp。
图3为pIRES-PML-RARα(384 bp)重组质粒等双酶切鉴定图。
其中，Lane 3：pIRES-PML-RARα(384 bp)/Nhe I+Mlu I。
图4为PCR扩增获得的hIL-2基因的电泳检测图。
图5为pIRES-PML-RARα-hIL2和pIRES-hIL-2重组质粒用Sal I进行单鉴定图。
其中，Lane 2：pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2/Sal I+Not I；
Lane 3：pIRES-hIL-2/Sal I+Not I。
图6为pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒中PML-RARα测序比对结果图。
图7为pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒中hIL-2测序比对结果图。
图8为pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒转染后A549细胞后cDNAPCR产物电泳图。
其中，Lane 1：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)的A549细胞cDNA作为模板，PP3，PP4作为引物；
Lane 2：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2的A549细胞cDNA作为模板，PP3，PP4作为引物；
Lane 3：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2的A549细胞cDNA作为模板，PI1，PI2作为引物；
Lane 4：转染了pIRES-hIL-2的A549细胞cDNA作为模板，PP3，PP4作为引物。
图9为点杂交结果图。
其中，1：阳性对照；
2：转染了pIRES-PML-RARα(384 bp)-hIL-2的A549细胞培养上清液；
3：转染了pIRES-hIL-2的A549细胞培养上清液；
4：转染了pIRES的A549细胞培养上清液。
图10为ELISA实验结果图。
其中，由左至右标本加样顺序依次如下：
管1：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)的A549细胞上清液；
管2：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2的A549细胞上清液；
管3：转染了pIRES-hIL-2的A549细胞上清液；
管4：转染了pIRES的A549细胞上清液；
管5：未转染任何质粒的A549细胞上清液。
图11为HE染色观察注射部位肌肉组织细胞聚集情况图。
其中，A：PML-RARα-IL2-pIRES质粒组；
B：IL2-pIRES质粒组；
C：PML-RARα-pIRES质粒组；
D：pIRES质粒组。
图12为小鼠脾脏细胞针对NB4细胞的杀伤性图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒)的构建
构建流程图如图1所示，利用RT-PCR扩增PML-RARα基因，将该基因插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出pIRES-PML-RARα(384bp)，然后通过PCR从Jurkat细胞cDNA中扩增出hIL-2基因，将该基因插入到pIRES-PML-RARα(384bp)的多克隆位点B中构建pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2，经过测序正确后，成功构建了PML-RARα384-hIL-2即pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2质粒。
具体步骤如下：
1 pIRES-PML-RARα重组质粒的构建
1.1PML-RARα基因的扩增
从NB4细胞株中提取RNA逆转录合成cDNA作为模板(NB4细胞的RNA提取和cDNA合成均按常规方法进行)，用上游引物PP3、下游引物PP4进行PCR扩增PML-RARα基因，总反应体积为20μL，其中含2μL cDNA和1U聚合酶其余各试剂的终浓度为：引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，1×Buffer缓冲液。反应在PCR扩增仪中进行，共进行40个循环，94℃1min(首次为3min)；退火60℃1min；延伸72℃1min(末次为10min)，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶在100伏电压下电泳。电泳结果如图3所示，产物片段大小与预期结果相符。扩增的PCR产物标记为PML-RARα(384bp)(见图2)，其大小为384bp。
PP3：5’CAA
AGCATGGTCTCCAATACAACGA 3’；方框内为Nhe I酶切位点；
PP4：5’GCG
TCAGTCCTGACAGACAAAG 3’；方框内为Mlu I酶切位点。
1.2酶切
E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化PML-RARα(384bp)基因PCR产物，将纯化后的PCR产物和pIRES质粒用Nhe I和Mlu I进行双酶切处理，具体反应体系见表2。反应体系旋涡振荡混匀后置于PCR仪中，37℃反应5小时。
表2PML-RARα基因片段PCR产物和pIRES质粒双酶切反应体系
| PML-RARα基因PCR产物 | pIRES质粒 | |
| 10×M BufferNheINlu IDNA灭菌水 | 2uL1.3μL1.3μL10uL5.4μL | 2uL1.3μL1.3μL5uL10.4μL |
| 合计 | 20uL | 20uL |
1.3连接
纯化上述酶切反应产物，酶切后的PML-RARα基因片段与经过同样酶切处理的pIRES质粒利用T4 DNA连接酶进行连接反应。体系配好混匀后16℃过夜，连接产物4℃保存，尽量24h内进行转化。连接反应体系共25μl，包括：2.5μL10×Buffer，5μL PCR产物，3μL载体，1μLT4 DNA连接酶和13.5μL灭菌水。
经过上述步骤将扩增的基因PML-RARα(384bp)插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出pIRES-PML-RARα(384bp)重组质粒。
1.4转化、筛选鉴定阳性克隆
将构建好的pIRES-PML-RARα(384bp)重组质粒常规转化大肠杆菌后，16小时左右长出菌落。每个培养皿随机挑选数个单菌落，分别置于100μL LB培养液(Amp 100μg/mL)中，旋涡震荡混匀。取溶解单菌落的培养液1μL作为模板分别配以相应的引物PP3，PP4进行PCR(扩增体系和方法同1.1)。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶在100伏特电压下进行电泳。
1.5提取质粒及酶切鉴定
收集扩增的大肠杆菌利用质粒提取试剂盒提取pIRES-PML-RARα(384bp)重组质粒；将提取的重组质粒分别用NheI和Mlu I进行双酶切鉴定，酶切反应体系共20μL，包括：2μL 10×Buffer，1μL NheI，1μL Mlu I，10μL DNA和6μL灭菌水。体系配好后旋涡振荡混匀，然后置于PCR仪中37℃反应12小时，酶切产物100伏电压下用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果如图3所示，从pIRES-PML-RARα(384bp)中切下来的PML-RARα基因片段，大小为384bp，与预期结果相符。
1.6重组质粒序列分析鉴定
构建的pIRES-PML-RARα(384bp)重组质粒经过双酶切鉴定正确后，还需要进行测序以验证插入多克隆位点A(MCS A)序列的正确性，从插入片段的上游开始延顺时针方向采用双脱氧链末端终止法进行单向测序，引物序列为“GGCACCTATTGGTCTTACTG”标记为PC1。测序结果与Genbank中PML-RARα融合基因序列比对结果如图6所示，由该图可以看出重组质粒中的插入的PML-RARα(384bp)基因序列完全正确。
2 pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建
2.1PCR扩增hIL-2基因
取经过传代培养的Jurkat细胞，向细胞培养液中加入PHA使其终浓度为10mg/L，经过24小时培养后，hIL-2 mRNA能够在Jurkat细胞中高效表达[70]。常规方法提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板。用引物PI3、PI4(外侧引物)和PI1、PI2(内侧引物)进行巢式PCR，扩增hIL-2基因，扩增的PCR产物大小为487bp。总反应体积为20μL，其中含2μL cDNA和1U聚合酶其余各试剂的终浓度为：引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，1×Buffer缓冲液。反应在PCR扩增仪中进行。反应条件：首先94℃预变性3 min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1min循环30次，最后72℃总延伸6min。扩增产物在100伏特电压下，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图4)。
PI1：5’GGCAC
ACAATGTACAGGATGCAACTCC 3’；方框内为Sal I酶切位点；
PI2：5’TAT
TCAAGTCAGTGTTGAGATGATG 3’；方框内为Not I酶切位点；
PI3：5’TTGTTCAAGAGTTCCCTATC 3’；
PI4：5’TGAAACCATTTTAGAGCC 3’。
2.2酶切
E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化hIL-2基因PCR产物，将纯化后的PCR产物和pIRES-PML-RARα重组质粒以及pIRES质粒用Xbal I和Sal I进行双酶切处理，酶切反应体系共40μL，包括：8μL 10×Tango Buffer，2μL Xba I，2μL Sal I，10μLDNA和18μL灭菌水。反应体系旋涡振荡混匀后置于PCR仪中，37℃反应5小时。
2.3连接
纯化上述酶切反应产物。酶切后的hIL-2 PCR产物与经过同样酶切处理的pIRES-PML-RARα重组质粒利用T4 DNA连接酶行连接反应。体系配好混匀后16℃过夜，连接产物4℃保存，尽量24h内进行转化。连接反应体系共10μL，包括：1μL 10×Buffer，1μL PCR产物，2μL载体，1μL T4 DNA连接酶和5μL灭菌水。
经过上述步骤将扩增的hIL-2基因插入到pIRES质粒的多克隆位点B中构建出pIRES-hIL-2和pIRES-PML-RARα(3 84bp)-hIL-2重组质粒。
2.4转化及筛选鉴定阳性克隆
取溶解单菌落的培养液1μL作为模板用PI1、PI2作为引物进行菌落PCR扩增体系和方法同2.1。
2.5常规提取质粒及酶切鉴定
将提取的pIRES-hIL-2和pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒用Sal I和Not I分别进行单酶切鉴定，酶切反应体系共20μL，包括：4μL 10×Tango Buffer，1.5μLXba I，1.5μL Sal I，6μL DNA和7μL灭菌水。体系配好后旋涡振荡混匀，然后置于PCR仪中37℃反应12小时，酶切产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果如图5所示，从各重组质粒中切下来的hIL-2基因片段大小均为458bp，与预期结果相符。
2.6重组质粒测序鉴定
从插入片段的下游开始延逆时针方向进行单向测序，测序引物序列为“CGTCCATTCGCCATTCAG”标记为PC2，测序比对结果(见图7)显示：插入到pIRES-PML-RARα(384bp)重组质粒多克隆位点B(MCS B)中的hIL-2序列，与Genebank中的hIL-2序列是完全一致的。
实施例2研究构建的急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒)转染真核细胞后基因和蛋白表达
1筛选合适的待转染细胞，由于悬浮细胞的转染效率较低，为了进一步提高转染效率我们采用了贴壁细胞用于转染。利用LipofectamineTM2000 Kit转染A549细胞，经巢式PCR证明A549细胞总RNA中不含有hIL-2基因及PML-RARα基因，因此可以将插构建的pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒转染A549细胞株。利用LipofectamineTM 2000Kit转染A549细胞，将培养板放入5％CO2培养箱中(37℃)培养，4～6小时后将培养基更换为含有胎牛血清和抗生素的培养基，48小时后收集上清液和细胞。
2 RT-PCR检测
收集转染后培养48小时的A549细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板，分别用引物PP3，PP4(用于扩增PML-RARα基因，384bp)和PI1，PI2(用于扩增hIL-2基因，458bp)进行PCR扩增，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶在100伏特电压下电泳。确定PML-RARα/hIL-2基因转录情况。
3翻译水平(点杂交)检测外源质粒在真核细胞中的表达
由于细胞因子蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，在细胞培养上清液中浓度较高，因此收集转染后培养48小时的A549细胞上清液(含hIL-2蛋白)，冷冻浓缩干燥后作为样品，用于点杂交实验检测hIL-2蛋白在A549细胞中的表达情况，结果见图9。由该图可以看出转染了pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2和pIRES-hIL-2的A549细胞培养上清液点杂交结果均为阳性，说明pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2和pIRES-hIL-2重组质粒能够在A549细胞中表达hIL-2蛋白，并且该蛋白能够与hIL-2抗体发生特异结合。
4取转染后的A549细胞裂解液(含PML-RARα蛋白)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PML-RARα蛋白表达情况(考马斯亮兰染色)。
5ELISA
按说明书要求配好ELISA试剂盒各种试剂，配制的标准品浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、0pg/mL。分别将标本和不同浓度标准品(100uL/孔)加入相应反应孔中，用封板胶封住反应孔，37℃孵育90分钟。洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100uL/孔)，用封板胶封住反应孔，37℃孵育60分钟。洗板4次。除空白孔外，加入酶结合物工作液(100uL/孔)，用封板胶封住反应孔，37℃孵育30分钟。洗板4次。加入显色剂(100uL/孔)，避光37℃孵育15～20分钟。加入终止液(100uL/孔)，混匀后立刻测量OD450值。加入转染了pIRES-PML-RARα(384)-hIL-2的A549细胞上清液(标本2)和转染了pIRES-hIL-2的A549细胞上清液(标本3)的孔在加入显色剂孵育15分钟后呈现出明显的肉眼可见的蓝色，说明这两种上清液中含有重组质粒表达的hIL-2；其余标本孔均未出现显色反应，说明这些标本中不含有hIL-2，这与预期结果是一致的，说明重组质粒已经成功的转染了A549细胞，并且能够在细胞中正常地表达目的蛋白。以仅加入显色剂和终止液的孔作为空白孔，根据标准品OD450值绘制的hIL-2标准曲线，由该曲线可以查出标本2和标本3中hIL-2的浓度分别约为130pg/ml和60pg/ml。ELISA实验照相结果见图10。
表1IL-2检测标准品及标本的OD450值
| 标准品浓度(pg/ml) | OD<sub>450</sub>值 | 标本编号 | OD<sub>450</sub>值 |
| 500.00 | 2.269 | 1 | 0.101 |
| 250.00 | 1.549 | 2 | 0.887 |
| 125.00 | 0.820 | 3 | 0.328 |
| 62.50 | 0.379 | 4 | 0.089 |
| 31.25 | 0.183 | 5 | 0.073 |
| 15.63 | 0.089 | ||
| 7.80 | 0.052 | ||
| 3.90 | 0.047 |
其中，
标本1：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)的A549细胞上清液；
标本2：转染了pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2的A549细胞上清液；
标本3：转染了pIRES-hIL-2的A549细胞上清液；
标本4：转染了pIRES的A549细胞上清液；
标本5：未转染任何质粒的A549细胞上清液。
实施例3 研究小鼠体内注射免疫急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARα(384bp)-hIL-2重组质粒)后不同时期的基因和蛋白表达、抗体产生和特异性CTL效应等
30只6～8周的健康纯系雄性BALB/c小鼠随机均分为5组(每组6只)，各小鼠分别于第1周、2周、4周各免疫1次，共3次。A组：每次于双侧股四头肌肌内分别注射pIRES 200μg；B组：每次于双侧股四头肌肌内分别注射PML-RARα-pIRES 200μg；C组：每次于双侧股四头肌肌内分别注射PML-RARα-hIL-2-pIRES 200μg；D组：每次于双侧股四头肌肌内分别注射hIL-2-pIRES 200μg；E组：每次于双侧股四头肌肌内分别注射生理盐水200μg。于2次免疫和末次免疫接种后第7d将每组小鼠随机选3只处死，分离出胫前肌。用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学染色法检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录和表达；ELISA法检测小鼠血清中INF-γ含量；LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL活性。
结果：(1)在小鼠注射部位肌肉组织的常规石蜡切片(HE染色)可见在各组肌肉间隙中发现有不同程度的淋巴细胞浸润，呈散在或不连续性的簇状分布(图11)。小鼠肌肉组织提取的RNA中可检测(RT-PCR和实时定量PCR)到PML-RARα基因及hIL-2基因的表达。(2)利用间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗PML-RARa蛋白的抗体(荧光显微镜和流式细胞仪检测标记NB4细胞)结果发现在初次免疫后7周四组小鼠血清中存在特异性抗体，而对照组为阴性(图8)。(3)在初次免疫小鼠第7周时，疫苗免疫组小鼠脾细胞(体外培养7天后)，效应细胞：靶细胞为10∶1，经LDH检测显示其对NB4细胞具有特异性细胞毒性作用，对NB4细胞的杀伤率明显高明显高于Molt4细胞对照组(图12)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα 384-hIL-2及其制备方法和应用
<130>38
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>384
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>PML-RARα基因
<400>1
caagctagca gcatggtctc caatacaacg acagcccaga agaggaagtg cagccagacc 60
cagtgcccca ggaaggtcat caagatggag tctgaggagg ggaaggaggc aaggttggct 120
cggagctccc cggagcagcc caggcccagc acctccaagg cagtctcacc accccacctg 180
gatggaccgc ctagccccag gagccccgtc ataggaagtg aggtcttcct gcccaacagc 240
aaccacgtgg ccagtggcgc cggggaggca gccattgaga cccagagcag cagttctgaa 300
gagatagtgc ccagccctcc ctcgccaccc cctctacccc gcatctacaa gccttgcttt 360
gtctgtcagg actgaacgcg tcgc 384
<210>2
<211>487
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>hIL-2基因
<400>2
ggcacgtcga cacaatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac 60
ttgtcacaaa cagtgcacct acttcaagtt ctacaaagaa aacacagcta caactggagc 120
atttactgct ggatttacag atgattttga atggaattaa taattacaag aatcccaaac 180
tcaccaggat gctcacattt aagttttaca tgcccaagaa ggccacagaa ctgaaacatc 240
ttcagtgtct agaagaagaa ctcaaacctc tggaggaagt gctaaattta gctcaaagca 300
aaaactttca cttaagaccc agggacttaa tcagcaatat caacgtaata gttctggaac 360
taaagggatc tgaaacaaca ttcatgtgtg aatatgctga tgagacagca accattgtag 420
aatttctgaa cagatggatt accttttgtc aaagcatcat ctcaacactg acttgagcgg 480
ccgcata 487
Claims (5)
1.一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)首先提取NB4细胞的RNA通过逆转录合成cDNA，然后利用引物PP3和PP4通过PCR扩增出PML-RARα基因；扩增的PCR产物标记为PML-RARα，其大小为384bp；
将扩增的基因PML-RARα利用T4DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出pIRES-PML-RARα；
所述的PP3：5’CAAAGCATGGTCTCCAATACAACGA 3’，其中，方框内GCTAGC为Nhe I酶切位点；
所述的PP4：5’GCG
TCAGTCCTGACAGACAAAG 3’，其中方框内ACGCGT为Mlu I酶切位点；
(2)然后通过PCR从Jurkat细胞的cDNA中扩增出hIL-2基因
用引物PI3、PI4和PI1、PI2进行巢式PCR，扩增hIL-2基因，扩增的PCR产物大小为487bp；
所述的PI1：5’GGCAC
ACAATGTACAGGATGCAACTCC 3’；方框内GTCGAC为Sal I酶切位点；
所述的PI2：5’TAT
TCAAGTCAGTGTTGAGATGATG 3’；方框内GCGGCCGC为Not I酶切位点；
所述的PI3：5’TTGTTCAAGAGTTCCCTATC 3’；
所述的PI4：5’TGAAACCATTTTAGAGCC 3’；
(3)将上述扩增得到的hIL-2基因利用T4DNA连接酶与pIRES-PML-RARα进行连接，插入到pIRES-PML-RARα的多克隆位点B中，经过测序正确后，构建了pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒即DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2。
2.根据权利要求1所述的一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)扩增反应条件为：预变性94℃1min，退火60℃1min；延伸72℃1min，共进行40个循环；首次预变性为94℃3min，末次延伸为72℃10min。
3.根据权利要求1所述的一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)扩增反应条件为：首先94℃预变性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1min循环30次，最后72℃总延伸6min。
4.如权利要求1所述制备方法得到的急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2，其特征在于，所述DNA疫苗由pIRES质粒、PML-RARα基因和hIL-2基因组成，所述PML-RARα基因序列如下：CAAGCTAGCAGCATGGTCTCCAATACAACGACAGCCCAGAAGAGGAAGTGCAGCCAGACCCAGTGCCCCAGGAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGGTTGGCTCGGAGCTCCCCGGAGCAGCCCAGGCCCAGCACCTCCAAGGCAGTCTCACCACCCCACCTGGATGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACTGA ACGCGTCGC；
所述hIL-2基因序列如下：GGCACGTCGACACAATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGA GCGGCCGCATA。
5.权利要求4所述的急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2在制备治疗急性早幼粒细胞白血病的药物中的应用。
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