JPS61289888A - ワクシニアｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクシニアウィルスはボックスウイルス群のオルトボッ
クスウイルスのプロトタイプである。本ウィルスの生物
学および複製に関してはモス（Ｂ。

Ｍｏ５ｓ）により詳細に記載されている［ボックスウイ
ルス（“Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ”　、Ｃｏｍｐｒｅｈｅ
ｎｓｉｖｅＶｉｒｏｌｏ（ＩＶ）　、フレンケルー］ン
ラート（１１゜Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　）お
よびワグナ−（Ｒ，Ｗａｇｎｅｒ）編集、Ｐｌｅｎｕｍ
　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、第４巻、４０５〜
４７４頁［１９７４年コ］：ボックスウイルス（“Ｐｏ
ｘｖ　ｉ　ｒｕｓｅｓ”、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ＢｌｏｌＯ（１ｙｏｆＡｎｉ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　、ナ
ヤク（０、Ｐ、ＮａＶａｋ　）　ｍ集、Ｈａｒｃｅｌ口
ｅｋｋｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ　、第２巻、８４９〜
８９０頁［１９７８年］：“キャッピングおよびメチル
化酵素による５′末端のラベル化”　、ＧｅｎｅＡｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　へｎａｌｙｓｉｓ、キ
リキアン（Ｊ、Ｇ。

Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ）およびパブクス（Ｔ、　Ｓ、　
Ｐａｐｃｓ　）編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎａｒｔｈ
−１１ｏ１１ａｎｄ　、第２巻、２５４〜２６６頁［１
９８１年］）。アデノウィルス、ヘルペスシンプレック
スウィルスおよびワクシニアウィルスなどのように遺伝
子の大きい動物ＤＮＡウィルスのいくつかのものがクロ
ーニング用ベクタ一として使われてきているが、後者の
組換え体のみが完全な感染性を保持したままで外来遺伝
子を発現している。一方、ワクシニアウィルスを生ワク
チンとして使用する多くの経験も蓄積している。

宿主範囲が広いこと、外来遺伝子に対する能力が大きい
ことおよびガン遺伝子形質転換の誘導がないことなどが
ワクシニアウィルス組換え体の生ワクチンとしての可能
性を高めている。組換えワクシニアウィルスの生ワクチ
ンとしての利用についての最新の総説はスミス（Ｇ、Ｌ
、Ｓｍ１ｔｈ　）ら（バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃＥｎｏｉｎ
ｅｅｒｉｎａ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）　、２巻、３８３〜
４０７頁［１９８４年］）により、組換えワクシニアウ
ィルスの生物学およびワクシニアのプロモーター制御下
による外来遺伝子の発現を含め、述べられている。

本発明は、ワクシニアＤＮＡ、好ましくは分子ｆｉｌ　
１０００　（１１ｋＤａ、）　（Ｄ塩基性ポリペプチド
をコードするワクシニアウィルスの後期発現遺伝子の５
′に結合する転写調節配列、外来遺伝子をボックスウイ
ルスに挿入するのに有り）な粗換えベクター、そのよう
な転写調節配列に機能的に外来遺伝子が結合し、対応す
るポリペプヂドの発現を可能とする感染性絹換えボック
スウイルスおよびそのような感染性組換えボックスウイ
ルスに基づく生ワクヂンに関するものである。本発明で
使用する好ましいボックスウイルスはワクシニアウイル
スである。

ウイテク（　Ｒ．　Ｗｉ　ｔｔｅｋ　）ら（Ｌ’０ロシ
−（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．＞　４　９巻、３７１　〜３７８
頁［１９８４年コ）によりマツプされているワクシニア
ウイルスの１１ｋＤａの主要構造ポリペプヂドを］一ド
づ−る遺伝子はその５′　〜領域を含めて配列が決定さ
れている。上記遺伝子のＤＮＡ配列およびそれに由来寸
るアミノ酸配列を以下に示す。

一　　　１　１　　　一 ＧＴ八〇，八八八Ｔ’ｒＣＴＴ（’，Ｔ八Ｔ（’，ＴＣ
ＴＴＴ八八ＣＴ八ＣＴＴＧＣＡＴＡＧ八■八ＧＧＴ八へ
ＴＴ八ＣＡＧＴＧへｒＧｃｃＴへＣＡＴＧＣＣＧＴＴＴ
ＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＡＧ八ＴＧＣＧＴＣＴＡＧ
ＡＡＧＣＧ八ＴＧＣＴ八ＣＧＣＴＡＧＴＣ八Ｃ八八丁Ｃ
ＡＣＣΔＣＴＴＴＣＡＴ八ＴＴＴ八Ｇ八八■八■八ＴＧ
ＴＡＴＧＴＡ＾＾八八■八■ΔＧＴ八Ｇ八八１’ＴＴＣ
八ＴＴＴＴＧＴＴＴ川ＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴ八ＴＣ ５′　一側の領域はワクシニアの初期遺伝子の相当する
領域（ワイアー（Ｊ．Ｐ．Ｗｅｉｒ）およびモス（Ｂ．
Ｈｏｓｓ）　、ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）　５　
１巻、６６２〜６６９頁［１９Ｂ４年１）或いは多くの
真核細胞遺伝子に特有な共通配列とはほとんど相同性が
ない。さらに、１　１　ｋＤａ３１１仏子の５′　一側
領域からおよそ１００塩基対以下のＤＮＡ断片内にワタ
シニアウイルスの後期遺伝子発現の正しい制御に必要な
全ての転写調節シグナルが存在Ｊ−ることがわかった。

従って、本発明は次の式で示す転写調節配列、またはそ
のサブユニット（断片）で外来遺伝子を制御下で発現可
能なものより成る。

一　１３　ー ５゜　　　　　　　ＣＴ八９八　　　　　　八〇ＣＧへ
　　　　ＴＧＣＴ八ＣＧＣＴＡ　　　　　ＧＴＣＡＣ　
　　　　　　ＡＡＴＣＡ　　　　　ＣＣＡＣＴＴＴＣＡ
Ｔ　　　　ＡＴＴＴＡ　　　　　ＧＡ＾■＾　　　■＾
ＴＧＴＡＴＧＴＡ　　　　　ＡＡＡ八■　　　　　　八
■八０■　　　　八０八ＡＴＧＣＴＡＴ　　　　　ＡＡ
八ＴＧ　　　　　　　３゜さらに、上記転写調節配列の
３′末端の２番目の位置から数えて１３塩基対以内のＤ
ＮＡ断片がワクシニアウイルスの後期遺伝子の発現の正
しい制御にとって好ましい要素であることがわかった。

従って、そのような３′末端転写調節配ダ１（断片）も
本発明に属するものであり、本出願に包含される。

さらに、本発明は前述の転写調節配列の、欠失、挿入、
置換、一個またはいくつかのヌクレオチドの転換および
それらの組み合わせを含む変異であ一　１４　一 つてボックスウイルスの後期プロモーター（機能的変異
）どして機能づるものを含む。

上述の転写調節配列１１の機能的変異の具体例は以下に
示す式で代表される。

５°　　　　　　　　　ＣＴ八へＡ　　　　　　　へＧ
ＣＧへ　　　　　　ＴＧＣＴＡＣＧＣＴＡ　　　　　Ｇ
ＴＣＡＣＡへＴＣＡ　　　　　　　ＣＣＡＣＴＴＴＣＡ
Ｔ　　　　　へＴＴＴへ　　　　　　Ｇへへ■＾　　　
　　　■へＴＧＴΔＴＧＴへ　　　　へへへへ■　　　
　　　へ■へＧＴ　　　　　　　へＧへへ■ＴＴＣへＴ
　　　　　ＴＴＴＧＴ　　　　　　　ＴＴＴＴＴ　　　
　　　　へへへＧＧへＴＣＴＡ　　　　　Ｔへ＾へ■　
　　　　　へへへ１　　　　　　３′および ５°　　　　　　　　　ＣＴ八へＡ　　　　　　　八Ｇ
　Ｃ，Ｇ八　　　　　　ＴＧＣＴＡＣＧＣＴＡ　　　　
ＧＴＣＡＣへへＴＣＡ　　　　　　　ＣＣＡＣＴＴＴＣ
＾■　　　　へＴＴＴへ　　　　　　ＧへへＴＡ　　　
　　　　ＴＡＴＧＴ八ＴＧＴへ　　　　Δへへへ１　　
　　　　八ＴＡＧＴ　　　　　　　ＡＧＡ八■へＴＣ八
Ｔへ　　　　ＴＴＴＧＴ　　　　　　　ＴＴＴＴＴ　　
　　　　　ＴＣＴ八■へＧ八Ｈへ　　　　へＡへ■＾　
　　　　　ＡＡＧ　　　　　　　　　３　’本発明はさ
らに、原核ＩＩｌ胞或いは真核細胞ポリペプチドをコー
ドする外来遺伝子に作用できるように結合したワクシニ
アの主要後期１１　ｋＤａ遺仏子の転写調節配列の少な
くとも一つより成るキメラ遺伝子と、そのキメラ遺伝子
に結合したボックスウイルスゲノムの非必須部分と、ベ
クターの複製原点および抗生物質耐性遺伝子を含む絹換
えベクターをも含む。キメラ遺伝子の翻訳開始部位はワ
クシニアの主要１１　ｋＤａ遺伝子の転写調節配列或い
は原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードする外
来遺伝子が有している。外来遺伝子の翻訳開始部位を利
用することににリコドン形成や融合たん白の生物活性に
伴なう問題を回避できる。ワクシニアの主要１１ｋＤａ
ｌ伝子の転写調節配列の翻訳開始部位或いは外来遺伝子
の翻訳開始部位を用いた好ましい組換えベクターは実施
例１〜４に例示している。

本発明の組換えベクターは文献によく知られている方法
（パニカリ（［）、ｐａｎｉｃａｌｉ　）およびパオレ
ツテイ（Ｅ、Ｐａｏｌｅｔｔｉ）　、Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　
、　７９巻、４９２７〜４９３１頁［１９８３年］；バ
ニカリ（Ｄ。

Ｐａｎ１ｃａｌｉ）ら、ＲＮＡＳ、８０巻、５３６４〜
５３６８頁［１９８４年コ；フコ；（Ｇ、Ｌ、Ｓｍ１ｔ
ｈ　）ら、上述：マケツｈ　（Ｈ，Ｈａｃｋｅｔｔ　）
ら、ピロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　／Ｉ　９巻、８
５７〜８６４頁［１９８４年］）ににり以下のステップ
に従って構築される。

（ａ）ボックスウイルスＤＮＡを含むベクターを調製す
る。該ＤＮＡは （ｉ）少なくとも一つの制限酵素部位に隣接して少なく
とも一つの転写調節配列、および（ｉｉ）上記調節配列
おＪ：び制限酵素部位に結合したボックスウイルスゲノ
ムの非必須部分からのＤＮＡ とから成る。

（ｂ）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
少なくとも一個の外来遺伝子を上記転写調節配列に隣接
する上記制限酵素部位に挿入する。

原核細胞又は真核細胞ポリペプチドを］−卜する外来遺
伝子をまだ持たないで、ワクシニアの主要後期１１ｋＤ
ａ遺伝子の少なくとも一個の転写調節配列より成る組換
えベクター中間体も本発明の目的であり、上述のステッ
プ（ａ）に従い、ワクシニアの主要後期１１ｋＤａｌ伝
子の転写調節配列が、１１　ｋＤａ遺伝子の翻訳開始部
位を含み、或いはさらに加えて、１１ｋＤａ３１！仏子
の翻訳開始部位とｍＲＮＡの開始点との間の領域で終結
している。

組換えベクターを構築するために用いられるベクターは
いずれの便利なプラスミド、コスミド或いはファージで
もよい。便利なプラスミド、］スミド或いはファージの
ビークルは、例えば実験車゛モレキュラークローニング
（ＭＯＩｅＣＩＪｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　）　”　、マ
ニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　：　１
９８２年に記載されている。本発明で組換えベクターの
構築に用いられるプラスミド源としての好ましいベクタ
ーはＤＢＲ３２２およびｐｕｃｓである。

キメラ遺伝子を結合するために使用されるＤＮＡはボッ
クスウイルスゲノムの非必須領域に由来する。そのよう
な非必須領域の例はチミジンキナ・−ゼ（ＴＫ＞遺伝子
（ワイアー（Ｊ、Ｐ、１４ｅｉｒ）およびモス（Ｂ、Ｈ
０３Ｓ）、シロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　）　、４６巻
、５３０〜５．３７頁［１９８３年］）である。

本発明で用いられる好ましい非必須領域はボックスウイ
ルスのデミジンキナーゼ遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝
子に隣接するＤＮＡの部分とから成る。特に好ましいも
のはワクシニアウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子とそ
れに隣接するワクシニアＤＮＡの断片である。非必須領
域の調製法は実施例１に詳細に記載されている。

本発明の組換えベクターに挿入される外来遺伝子は原核
細胞または真核細胞ポリペプチドを］−ドする広範囲の
遺伝子（Ｄ　Ｎ　Ａ　３ｆ４仏子或いはＲＮＡ１ｌ伝子
のＤＮＡコピー）から選択される。例えば、外来遺伝子
は酵素、ホルモン、免疫調節、抗ウィルス性成いは抗癌
性を示すポリペプチド、抗体、抗原および原核細胞また
は真核細胞由来の他の有用なポリペプチドを］−ドする
。本発明で用いられる好ましい外来遺伝子はマラリア抗
原、特にプラスモジウｂ　（ＰｌａＳｍＯｄｉｔｌｍ　
ｆａｌｃｉＤａｒｕｍ　＞の５．１表面抗原（ホープ（
１，八、ｆｌｏｐｅ）ら、後述）をコードする遺伝子お
よびマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺
伝子（チャン（Ａ、Ｃ。

ＬＣｌｌａｎ（Ｊ　）ら、”Ｅ、ｃｏｌｉにおＣノるフ
ェノタイプ発現　（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　　ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｏｒ　　ａ
　　ＤＮ八へｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　
ｍｏｕｓｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔ
ａｓｅ　）　”　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２
７５巻、６１７〜６２４頁［１９７Ｂ年］）である。

ｐｌ−（Ｇ　Ｓ群のプラスミドが本発明の組換えプラス
ミドベクターの特有の実例である。その調製法は実施例
１〜４に詳細に記載している。本発明の絹換えベクター
を調製するのに有効なプラスミドを含有するＥ、ＣＯ１
＋株は１９８５年２月２１日付はテトイッチェー１ｊ−
ムルング（ｏｅｕｔｓｃｈｅ　ｓａｔｎｍ日Ｉｎｇｖａ
ｎ　Ｈｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　）　　（Ｄ　Ｓ
　Ｍ　）に寄託番号それぞれＤＳＭ−３２４８およびＤ
ＳＭ−３２４９として寄託されている。Ｅ、ｃｏｌｉ　
　Ｃ６００（Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＤＩ−１１＞およびＥ、ｃｏｌｉ　　ＲＲ
１（ＡＴＣＣ−３１３４３）のような他のダラム陰性宿
主も利用でき、マニアティス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）らに
よる実験ｍ　”モレ＊ニーｙ　−り０−ニン’）　（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ−２〇　− ＣＩｏｎｉｎ（１）　”　（上述）に記載されている。

上に記載したキメラ遺伝子を含み、発現する適当な感染
性組換えボックスウイルスは文献（スミス（Ｇ、Ｌ、Ｓ
ｍ１ｔｈ　）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ　）　２巻、３８３〜４０７
頁［１９８４年］　：　Ｈ０ＨａＣｋｆ３ｔｔら、上述
）によく知られる方法により得られ、次のステップＪ：
り成る。

（ａ）ボックスウイルス属のウィルスに感染した少なく
とも一個のｖＡ胞を得る。

（ｂ）上記細胞を組換えベクターで形質導入し、ボック
スウイルスのＤＮＡと組換えベクターに含まれるボック
スウイルスＤＮＡの少なくとも一部分との間で相同組換
えを起す。

（Ｃ）上記細胞より原核細胞又は真核細胞ポリペプチド
をコードする上記外来遺伝子を発現することのできる感
染性組換えボックスウイルスを選択的方法により単離す
る。

感染性組換えボックスウイルスの調製に使用できる適当
な真核宿主細胞としては（：、Ｖ−１、ＲＫ−１３、Ｔ
Ｋ’−１４３或いはその他の細胞がある。

本発明で使用される好ましい真核宿主細胞はＲＫ−１３
である。

感染性組換えワクシニアウィルスＲＶＶ１がらＲＶＶ８
までが本発明の特有の例である。それらの調製および単
離の詳細は実施例１〜４に示されている。

本発明の感染性組換えワクシニアウィルスを用いて発現
されるたん白質の例はマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
、クロラムフエニ］−ルアレヂルトランスフエラーゼお
よびマラリア表面抗原であり、特にプラスモジウム（Ｐ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の５．１表
面抗原である。

感染性組換えボックスウイルスを用いて原核細胞又は真
核細胞ポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を発現す
る方法はよく知られている（スミス（Ｇ、　Ｌ、Ｓｍ１
ｔｈ　）ら、上述；キーニー（Ｈ，Ｐ。

に１ｅｎｙ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３１
２巻、１６３〜１６６巻［１９８４年１；スミス（Ｇ、
　Ｌ。

Ｓｍ１ｔｈ　）ら、ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　
、２２４巻、３９７〜３９９頁［１９８４年］：パオレ
ツテイ（［、ｐａｏｌｅｔ口）ら、ＰＮＡＳ、８１巻、
１９３〜１９７頁［１９８４年］；パニカリ（Ｄ、　Ｐ
ａｎ１ｃａｌ　ｉ　）ら、上述）。その方法は、目的の
外来遺伝子がボックスウイルスの転写調節配列に対して
有効に結合した感染性組換えボックスウイルスを適当な
宿主に感染し、宿主を適当な条件下で培養し、目的ポリ
ペプチドを免疫的、酵素的ｄ５よび電気泳動的な方法に
より検出するものである。

従って、感染性組換えボックスウイルスは動物又はヒト
で免疫応答を誘発し、該外来遺伝子によりコ・−ドされ
るた／υ白の少なくとも抗原部分に対する抗体を生産す
るのに十分な相換えボックスウイルスの濃度を含む種を
動物又はヒ１〜に接種することにより、生ワクチンとし
て使用することも出来る。本発明に於いて防御用免疫に
使用する好ましい感染性組換えボックスウイルスは感染
１ｊ１組換えワクシニアウィルスである。特に９Ｔまし
いムのはマラリア表面抗原、特にプラスモジウｌ＼（Ｐ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）の５．
１表面抗原を発現するものである。

ヒトに使用する感染性組換えワクシニアウィルスはカブ
ラン（Ｃ，にａｐｌａｎ＞により（プルメトブレチン（
Ｂｒ、　Ｒｅｄ、　ＢＬＩｌｌ、）　２５巻、１３１〜
１３５頁［１９６９年１）記載されるように調製できる
。

ワクチン接種に適した調製物は０．０５ｒｄ当り１０〜
１０８個のプラーク形成単位を含有していなければなら
ない。ワクチンは４０〜５０％のグリセロール含有緩衝
溶液中で凍結し、或いは凍結乾燥状態で保存できる。後
進地域での使用にはワクチンを凍結乾燥することが必須
である。ワクチン接種は皮下注射で行なう。ワクチンの
一滴を消毒した皮膚の小部分に塗り、表皮のＦを直ちに
鋭い消毒針又はナイフで刺す。集団ワクチン接種の際は
接種器を使用する。

本発明の一般的記載は終り、以下に示す図を参照に次の
実施例によってさらによく本発明が理解される。

（図の説明） 図に用いられる記号は： ■■−はワクシニアウィルスのＴＫ−１仏子を示す。

口〉　　はワクシニアウィルスの１１　ｋ［）ａたん白
の転写調節配列を示す。

＝＝　はＰｌａｓｉｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
の５．１抗原の遺伝子を示す。

Ｂ　　はマウスジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子を示
す。

〈第１図＞ａ）はｐＢＲ−３２２およびワクシニアウィ
ルスのｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　■’“ＪＩ＋断片より成り、
ワクシニアウィルスのＴ１〈−遺伝子を含むプラスミド
１）ＢＲ−Ｊの構築の概略を図示したものである。

ｂ）はｐＢＲ−３２２およびワクシニアウィルスのト１
ｉｎｄｌＴＩ−Ｆ断片の右側から成り、ワクシニアウィ
ルスの１１　ｋＤａたん白の転写調節配列を含むプラス
ミド１）ＢＲ−Ｆｌの構築の概略を図示したものである
。

く第２図〉はワクシニアウィルスのＴ　Ｋ　−遺伝子プ
ラスその先行配列のプラスミドｐｕｃ−ｓへのザブクロ
ーニングによるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ構築の概略を図
示したものである。

〈第３図〉はワクシニアウィルスの１１　ｋＤａたん白
の転写調節配列のＴ　Ｋ　−遺伝子への挿入によるプラ
スミドｐＵｃ−ＴＫ／１１　ｋＤａの構築の概略を図示
したものである。

〈第４図〉は１１ｋＤａたん白の転写調節配列のＥｃｏ
ＲＩ制限酵素部位の上流をＸｍｎ　Ｉ制限酵素部へと変
換し、プラスミド１）ＨＧＳ−１を得る概略を図示した
ちのである。

〈第５図＞ａ）はＴＫ−遺伝子に挿入した１１ｋＤａた
ｌυ白の転写調節配列で開始する転写物のためのヌクレ
アーゼＳ１プローブの単離および放射標識の概略を図示
したものである。

ｂ）はＴＫ−遺伝子の調節配列で開始する転写物のため
のヌクレアーゼＳ１の単離お、Ｊ：び放射性ラベル標識
の概略を図示したものである。

〈第６図〉の上部はヌクレアーＬ’Ｓ１によるＲＮＡ転
写物（〜−（ハ））のマツピングの概略図を図示したも
のである。下部はＴＫ−転写物（２５０ｂｒｌ）および
１１　ｋ［）ａ転写物（２６０ｂｒ））のヌクレアーゼ
Ｓ１７ツピングのＸ線写真である。感染細胞からのＲＮ
Ａを感染後、３時間目（１列目と２列目）および７時間
目（３列目と４列目）に採取した。

〈第７図〉上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮＡ転写物
のマツピングの概略を示す。下部はそれぞれＲＶＶ−２
（ｐｌ−ＩＧｓ　−２，１列目および２列目）おにびＲ
ＶＶ−３（ＤＩ−ＩＧＳ−２Δ１５．３列目と４列目）
に感染した細胞から得たＲＮＡ転写物のヌクレアーゼＳ
１マツピングのＸ線フィルム現像である。ＲＮＡは感染
後、４時間目（１列目と４列目）および８時間目（２列
目と３列目）に抽出した。

“Ｍ　ＩＩと記した列はＤＢＲ−３２２のｌ−Ｉ　Ｄ　
ａ■断片の３２Ｐラベル標識物の夫々示した長さくｂｐ
）のものを含むものである。ＴＫ遺伝子或いは挿入した
１　１　ｋＤａの調節配列で開始するそれぞれのＲＮＡ
転写物に相当する位置も示した。

〈第８図〉はプラスモジウム（Ｐ　ｌ　ａｓｍｏｄ　ｉ
ｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　５．１抗原Ｃ１Ｉｏｒｌ
ｅら、上述〉のプラスミド１−ＩＧＳ−２へのクローニ
ングと構築されるプラスミドｐＩＩＧｓ−２１５，１の
概略の図示である。

〈第９図〉はプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）　５．１抗原を含むウィルスＲＶ
Ｖ−４で感染した細胞の間接免疫蛍光を示づ。

Ａ図の細胞は４５０〜４９０ｎｍで撮影し、Ｂ図は位相
差で撮影したものである。

〈第１０図〉はプラスミドｐＨＧ　Ｓ　−２／　Ｄ　Ｈ
ＦＲの構築の概略を図示したものである。

〈第１１図〉はプラスミドｐｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−２／　
Ｉ’）　ｌ−Ｉ　ＦＲ−Ｆの構築の概略を図示したもの
である。

〈第１２図〉はプラスミドｐＨＧ　Ｓ　−Ａ　／　Ｄ　
ＨＦＲの構築の概略を図示したものである。

〈第１３図〉はプラスミドｐＨＧｓ−Ｆ／ＤＩ−ＩＦＲ
の構築の概略を図示したものである。

〈第１４図〉上部はＲＮＡ転写物（今ｖ怜）のヌフレア
ーゼＳ１によるマツピングの概略を示す。予想されるバ
ンドの長さく３５０ｂｐ）を示した。下部はＲＶＶ−６
（ｐＩ−ＩＧＳ　−２／ＤＨＦＲ）、ＲＶＶ−７（ｔＮ
−ＩＧＳ−Ａ／ＤＩ−Ｉ　Ｆ　Ｒ）およびＲＶＶ−８（
＋）ＨＧｓ−Ｆ／ＤＨＦＲ＞に感染した細胞からのＲＮ
Ａ転写物のヌクレアーゼＳ１マツピングのＸ線写真であ
る。初期ＲＮＡはそれぞれのウィルスで感染させた細胞
を１００μｆｉ／ｍＱのシクロへキシミド存在下（＋と
表記した列）でインキュベート後６時間口に抽出した。

後期ＲＮ△は感染後８時間および２４時□間目（それぞ
れ８および２４と記した列）に抽出した。“Ｍ″と記し
た列はｐＢＲ−３２２のトＩｔ’）ａＩＩ断片の３２Ｐ
放射標識物より成り、図に示した長さくｂｐ）である。

転位（変異）した１　１　ｋＤａ調節配列から開始する
ＲＮＡ転写物に対応するＳ１保護バンドの位置を図に示
しである。

一般的方法 以下の操作は別に記載しない限り、マニアティス（Ｈａ
ｎｉａｔｉＳ）ら（上述）に述べられているように行な
った。３７°Ｃに於ける制限酵素消化（１００〜１０１
頁）；３７℃に於けるバクテリアアルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）ににる脱り／ｖｆ１２（１３３〜１３４
頁）；１４℃でのＴ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーシ
ョン（３９０〜３９１頁）：ｉｏｏμｇ／ｄのアンピシ
リン含有１−８−培地寒天プレート上でのＥ、ｃｏｌｉ
　　ＨＢ１０１塩化力ルシュウム処理細胞へのＤＮＡ導
入および形質転換株の選択（２５０〜２５１頁）；Ｄ’
ＮＡプラスミドの調製（８６〜９４頁）；１４℃に於け
るＤＮＡポリメラーゼ■の大断片（フレナラ断片）によ
る−重鎖ＤＮＡ部分の修復（１１３〜１１４頁）；アガ
ロースゲルからのＤＮＡの分離および断片の精製（１６
４〜１６７頁）；サブクローニングへの合成りＮＡリン
カ−の使用（３９２〜３９７頁）：室温に於ける一本鎖
ＤＮＡ部分のヌクレアーゼＳ１による除去（１４０頁）
；動物細胞からのｍＲＮＡの単離（１９１〜１９３頁”
）：ｍＲＮＡのヌクレアーゼＳ１マツピング（２０７〜
２０９頁）；マクサム−ギルバート法ににるＤＮへの配
列決定（４７５〜４７８頁）。培養細胞：つ看ナギ腎（
ＲＫ−１３＞（クリス１へフイニス（Ｇ、Ｊ。

ＣｈｒｉＳｔＯｆｉｎｉＳ）おＪ：びヒ゛−ル（八６．
１．Ｂｅａｌｅ　）　ニジニーパス　バクト（Ｊ、Ｐａ
ｔｈ、Ｂａｃｔ、）　９５巻、３７７〜３８１頁［１９
６８年］）；ネズミ肉腫ウィルスによりトランスフオー
ムされたヒト骨髄肉腫細胞（ヒトＴＫ−１／１３細胞、
寄託番号Ｇ　Ｍ　５８８７、ヒユーマン　ジエネテイク
　ミュークンミルセル　レボジトリ−（１０１ｍａｎ　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＨｌｌｊａｎｔＣｅｌｌ　　Ｒｅｐｏ
ｓｉｔｏｒｙ、　　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｆｏｒ　
　ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、　ｃｏｐｅｗｏｏ
ａ　ｓｔ、、　Ｃａｎｄｏｒ）　、Ｎ　、　Ｊ　。

０８１０３、ＵＳＡ）。細胞の維持は５％ウシ胎児血清
、１００μ９／ｄのストレプトマイシンおにび１００１
　Ｕ／−のペニシリン添加イーグル最少必須培地（Ｅ−
ＭＥＭ）中、湿度８０％、５％Ｇ　Ｏ２下にて記載した
温度で行なった。

〈実施例１〉 八、プラスミドｐ　ｔ３　Ｒ−ＪおよびｐＢＲ−Ｆｌの
構筆〈第１ａ図および１ｂ図） ワタシニアウイルス（ＶＶ）ＤＮＡ　（ＷＲ株）１０μ
９を１００単位の制限酵素Ｈｉ　ｎｄＩＩ［で完全に消
化する。ＶＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（ワイ
アー（Ｊ、　Ｐ、誓ｅｉｒ）およびモス（Ｂ。

ＨＯ８Ｓ）、ピロロジー（Ｊ、ＶｉｒｏｌｏｏＶ）　４
６巻、５３０〜５３７頁［１９８３年］）を含むｌ−（
ｉ　ｎ　ｄ　ｌ１ｌＪ−断片（およそ５ｋｂ）およびＦ
−断片（およそ１４−　ｋ　ｂ　）をアガロースにり分
離する。１μ９のプラスミドｐＢＲ−３２２（サヂフエ
（Ｊ、Ｇ。

５ｕｔｃ＋ｔｒｒｅ　）　、”完全ヌクレオチド配列（
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　　ｐＢ　Ｒ−３２２）”、Ｃｏ１
ｄ　５ｐｒｉｎｏ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕ
ａｎｔ　Ｂｉｏｌ、、４３巻、７７〜９０頁［１９７９
年］）を１単位の制限酵素Ｈｉ　ｎｄｌ［で完全に消化
し、遊離末端を１単位のバクテリアアルカリフォスファ
ターゼ（、Ｂ　Ａ　Ｐ　）　　　　　。

で１時間脱りん酸する。２０ｎ（＋のＨｉｎｄｌｌ切断
線状ＤＢＲ−３２２ど１１００ｎのＨｉｎｄｌ［ｌＪ−
断片とＦ−断片とをそれぞれとを１単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合し、［、ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１細胞に導
入する。アンピシリン耐性の形質転換株それぞれ４株を
選び、１００μｇ／　ｔｎＱのアンピシリン含有ＬＢ−
培地で生育させる。これらの培養物よりＤＮＡを標準法
により単離し、その大きさおよびＪ−断片の場合はｌ−
１ｉ　ｎ　ｄ　ｌｌ、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩの、又
Ｆ−断片の場合はト１ｉｎｄｌｌ［、Ｓａｊ！　Ｉおよ
びＢｑ！Ｉの制限酵素切断部位の存在を分析する。アガ
ロースゲル電気泳動後、予想されるパターンを示したプ
ラスミドをそれぞれｐＢＲ−Ｊおよび１）ＢＲ−Ｆと命
名した。

プラスミドｐＢＲ−Ｆ１μびを２単位の制限酵素ＣＪａ
Ｉで完全に消し、ＤＮＡを０．８％アガロースゲルにの
せる。５．６ｋｂの断片（プラスミドｐＢＲ−３２２お
よび１．２５ｋｂの挿入部分より成る）を記載どおり単
離した。このプラスミド５０ｎａを１単位のＴ４リガー
ゼを用いて再び環状化してＨ８１０１に記載どおりに導
入する。

アンピシリンに耐性な４個の形質転換株を選び、１００
μ９　／　ｍＱのアンピシリン含有ＬＢ−培地に生、育
させる。これらの株からＤＮＡを常法により単離し、そ
の大きさおよびＨｉ　ｎｄｌｌｌ、Ｃｊ！ａＩおよびＥ
Ｃ０ＲＩの制限酵素部位の存在を分析する。アガロース
ゲルによる電気泳動後で予想されるパターンを示した一
つのプラスミドを１）ＢＲ−Ｆｌと命名した。

Ｂ、プラスミドｐＬＪＣ−ＴＫの構築（第２図）２μび
のプラスミドｐＢＲ−Ｊを５単位の制限酵素ｌ−１ｐ　
ａ　ＩＩで完全消化し、−重鎖ＤＮＡ末端を４単位のＤ
ＮＡポリメラーゼ１大断片（フレナラ断片）で修復する
。続いてそのＤＮＡを５単位の制限酵素１−１１ｎｄｌ
［［で完全消化し、ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで
分離し、１３１０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルか
ら単離する。２μりのプラスミドｐＵｃ−８（ビエラ（
Ｊ。

Ｖｉｅｒｒａ）およびメツシング（Ｊ、Ｈｅ５ｓｉｎｏ
　）、”　ｐ　ｕ　ｃプラスミド（Ｔｈｅ　ｐＵｃ　ｐ
ｌａｓｍｉｄｓ、　ａｎＨ１３ｍｐ７−ｄｅｒｉｖｅｄ
　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ　　ａｎｄ　　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　
　ｗｉｔｈ　　５ｙｔｈｅｔｉｃｕｎｉｖｅｒｓａｌ　
ｐｒｉｍｅｒｓ　）”、ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９巻、
２５９〜２６８頁［１９８２年］）を５単位の制限酵素
ＥＣ０ＲＩで完全消化し、−重鎖ＤＮＡ末端を８１緩衝
液中２単位のヌクレアーゼＳ１で室温１時間処理して除
去づる。続いてこのＤＮＡを５単位の制限酵素１−１　
ｉ　ｎ　ｄ　［７で完全消化し、遊離末端を２単位のＢ
ＡＰで１時間脱りん酸化し、ＤＮＡを０．８％アガロー
スゲルで分離し、２．７ｋｂの断片を前述の如くアガロ
ースにり単離する。

５０ｎｇのこのｐＵｃ−８断片を２００μｇの精！１１
１３１０ｂｐＶＶ断片ど１単位のＴ／ｌＤＮＡリガーゼ
を用いて環状化し、環状ＤＮＡをｌ−Ｉ　Ｂ　１０１に
導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転換株を選
択し、１００μ’Ｊ　／　ｍＱのアンピシリンを含む［
Ｂ−培地で培養する。これらの株よりＤＮＡを常法に従
って単離し、その大きさおにび制限酵素ｌ−１ｉ　ｎ　
ｄ　ＩＩＩ、ＥＣ０ＲＩおよびＸｂａＩ切断部位の存在
を分析した。アガロースゲル電気泳動で予想されるパタ
ーンを示した一つのプラスミドを１）ｔＪｃ−ＴＫと命
名した。

＝　３５− Ｃ，プラスミドｐＵｃ−ＴＫ／１１　ｋＤａの構築く第
３図） ５０Ｉ１９のプラスミドｐＢｆｌ−Ｆ１を制限酵素ＥＣ
０ＲＩおよびＸｂａ工のぞれぞれ２００単位で完全消化
し、１．２％アガロースゲルでＤＮＡを分離する。１０
４−ｂｐのＤＮＡ断片を単離し、−重鎖ＤＮＡ末端を４
単位のフレナラ断片で修復し、合成ＥｃｏＲＩリンカ−
（ＣＧＡＡＴＴＣＧ）をつける。ＦＣＯＲＩＣＯＲ−を
つけたこの新しいＤＮＡ断片（１１０ｂｐ）はＶＶの１
１　ｋＤａ転写調節配列Ｊ：り成る。１０μｑのプラス
ミドｐＵＣ−ＴＫを５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで完全
開化後、ＤＮＡをか＝呑％アガロースゲルで分離し、ユ
１友゛ ４ｋｂの線半ＤＮＡ断片を単１１１抽出１−る。５０ｎ
ｇのＥＣ０ＲＩで線状化したＤ　Ｕ　Ｃ−Ｔ　Ｋベクタ
ーを１単位のＴ４ＤＮＡリガーげを用いて１０ｒ＋９の
１００ｂｐプロモーター断片と結合し、１−ＩＢｌｏｌ
に導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転換株を
選択し、１００μ９／ｒｄのアンビシリン含有ＬＢ−培
地で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、その大
きさおよびＦＣＯＲＩおにびｌ−１ｐｈ■制限酵素部位
の存在を分析した。６％アクリルアミドゲル上での電気
泳動で予想されるパターンを示した一つのプラスミドを
ＤＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａと命名シタ。

０、プラスミドＩ）ＨＧＳ　−１の構築（第４図）１０
μ９のＤＵＣ−ＴＫ／１１　ｋＤａを１単位の制限酵素
ＦｃｏＲＩ　　３７℃３０分間の処理で部分消化（５％
まで）行ない、−重鎖ＤＮＡ末端を４単位のフレナラ断
片を用い、１４℃で修復する。ＤＮＡを０１８％アガロ
ースゲルで分離し、ｐＵＣ−ＴＫ／１１　ｋＤａプラス
ミド（４１０１ｂｐ）の線状型を単離した後、その’＋
ｏｎａを２単位の７４ＤＮＡリガーゼで環状化し、ＨＢ
　１０’　１に導入する。アンピシリン耐性の形質転換
株８株を選択し、１００μｇ／ｄのアンピシリン含有１
−　Ｂ−培地中で生育させる。これらの培養物からＤＮ
Ａを単離し、その大きさおよび制限酵素ＥＣＯＲ■、Ｘ
ｍｎＩおよびｌ−１＋　ｎ　ｄ　Ｉ［［切断部位の存在
を分析する。アガロースゲルの電気泳動で予想されるパ
ターンを示したプラスミドを選択し、１４８ｂｐのＣＪ
！ａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を塩基配列決定した。第３頁（
本和英１２頁）に記載する配列を示し、ＥＧＯＲＩの切
断部位を含むプラスミドをｐｌ−ＩＧｓ−１と命名した
。

［、Ｉ］換えワクシニアウィルス（・ＲＶＶ−１）の横
筈 ３３°Ｃに適応させたＲＫ−細胞に細胞当り０．１プラ
一ク形成単位（ｐｆｕ）のワクシニアウィルス温度感受
性変異株ｔｓ７　（ドリリエン（Ｒ。

Ｄｒｉｌｉｅｎ　）おにびスペナー（Ｄ、５ｐｅｈｎｅ
ｒ　）　、ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏ（ＩＶ）　１３１
巻、３８５〜３９３頁（１９８３年））を感染ざぜる。

３３°Ｃの許容温度下２時間後、細胞をカルシウムりん
酸ＤＮＡ沈でん物で記載されるように１−ランスフエク
トする（ワイアー（Ｊ、Ｐ、Ｗａｉｒ）ら、ブロク　ナ
ショナルアカデミ−サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７９巻１２１０〜１２１７Ｉ頁（１９
８２年〕）。ワクシニアウィルスの１１　ｋＤａ３ｆｆ
ｉ仏子の転写」１節配列がＴＫ−遺伝子の中に挿入して
保有する適当な絹換えプラスミド（ｐ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ
　−１）２０ｎｓど共沈で／υさせたワクシニア野生株
ＤＮＡ　（ＷＲ株）を２Ｘ１０６個の細胞当り６０ｎｇ
用いた。３９．５℃で２日間インキュベート〜した後、
細胞を超音波処理で破壊し、ウィルス粒子中のＴＫ陰竹
（ＴＩＥ’−）の数を１００　／ｌ　’ｊ　／　ｍ（！
の臭化デオキシウリジン存在下ヒ１〜ＴＫ−１４３細胞
で滴定して測定する。野生型ＤＮＡと絹換えプラスミド
とでトランスフエフｌ−した細胞中の方が野生株ＤＮＡ
のみでトランスフエフ１〜した細胞の約２００侶ＴＫ−
表現型ウィルスが増加していた。プラークをとり、ウィ
ルスを再度３０μｑ／ｄ臭化デオキシウリジン存在下で
ヒｌ〜−ＴＫ″１４３−＠胞でｆｆｉ製する。保存ウィ
ルスを臭化デオキシウリジン非存在下でＲＫ−１３細胞
で作製する。ＲＶＶ−１ウイルスをブ■ツ１−−ハイブ
リダ１〜ゼーションによりＴＫ−Ｍ転子中に挿入された
１１ｋｌ’）ａプロモーターの存在をマーカーとして選
択するくマケット（Ｈ，Ｈａｃｋｃｔｔ　）ら、Ｐ　ｒ
ｏｃ　。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９巻７
４１５〜７／ＩＩ９頁（１９８２年〕）。

「、クローニングおよびヌクレアーゼＳ１プローブの作
製 （第５ａ図） プラスミドｌ）　Ｉ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−１の１０μｑを２
単位の制限酵素Ｔａｑ　Ｉで部分消化する（１０％まで
）。

続いてＤＮＡを２０単位の制限酵素＠　ｉ　ｎｄｌ［［
で完全消化し、アガロースゲル上で分離した後、１１３
５ｂｐのＤＮＡ断片を単離する。この断片１１００ｎを
１単位のＴ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用い、それぞ
れ１単位の）ｌｉｎｄｌ［と（、ｊ！ａＩで完全消化し
たプラスミド１）ＢＲ３２２２５ｎｇと結合し、ＨＢｌ
ｏｌに導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転換
株を選択し、１００μｇ／威のアンピシリン含有Ｌ　Ｂ
−培地に生育させる。これらの　　　　ｊ株からのＤＮ
Ａを単離し、その大きさおにび制限酵素Ｈｉ　ｎｄｌｌ
、ＥＣ０ＲＩおよびＣｊ！ａＩ切断　４０一 部位の存在の有無を分析する。アガロースゲル−Ｌで予
想されるパターンを示すプラスミドを選び、次の方法で
ヌクレアーゼ８１　　ＤＮＡプローブ作製するのに用い
る。１０μｑのプラスミドをそれぞれ２０単位のＣ１ａ
Ｉおよびｌ−１ｉｎｄｌ［ｒ完全に消化し、遊離末端を
１０単位のＢＡＰで脱りん酸してから１，６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を単離し、そのＱ、１μｍｏｌを使用前に１単位
のポリヌクレオヂドキナーゼ（ＰＮＫ）および１　ｐｍ
ｏｌノγ−３２Ｐ−チオキシアデノシン三りん酸で標識
する。続いてＤＮＡを１単位の制限酵素Ｒ６Ａｌで完全
に消化する。

ｂ、ＴＫ転写物のためのヌクレアーゼＳ１プローブ（第
５ｂ図） プラスミドｐＵｃ−ＴＫ５μｑを制限酵素ｃｚａ■で完
全に消化し、遊離末端を５単位のＢＡＰで脱りん酸後、
ＤＮＡを制限酵素１−（ｉｎｄｌＩ［で完全消化する。

ＤＮＡを０．８％の低温融解アガロース上で分離１し、
７３７　ｂｐのＤＮＡを断片を単離する。Ｓ１プローブ
をＰＮＫおよびγ−３２Ｐ一デオキシアデノシン三りん
酸で常法で標識する。

Ｇ、ＲＮＡ転写物の５７Ｓ１マツピングＲＫ−１３の集
密単層細胞ぺ１へり皿（直径５　ｃｍ　）二枚をそれぞ
れ細胞当り１Ｑｐｆｕの組換えＲＶＶ−１ウイルスで感
染し、それぞれ３時間および７時間後にＲＮＡを抽出す
る。ＲＮＡを１００μｍの０．２％ＳＤＳにけん濁し、
２等分してそれぞれＴＫ−遺伝子の３２Ｐ−標識Ｓ１プ
ローブ２０゜ｏ　ｏ　ｏ　ｃｐｍおよび１１　ｋＤａ転
写調節配列を添、加し、′／１ｏ容量のＮａ０ＡＣおよ
び２１／２容量のエタノールで沈でんさせる。ペレット
を５０μｌのＳ１ハイブリダイゼーシヨン用緩衝液に再
溶解し、１００℃３分間加熱後１６時間４２℃でインキ
ュベートする。インキＪべ一１〜後／１５０μ（の１倍
ヌクレアーゼＳ１緩衝液およびヌクレアーゼ８１２５単
位を加える。消化は１時間後にＥＤＴＡ　（最終濃度５
０ｍＭ）およびＳＤＳ　（＠終濃度０．５％）で停止さ
せる。水酸化ナトリウムを終濃度０．２５Ｎとなるにう
に添加し、４５℃１時間後に反応液を３Ｍ酢酸でｐＨ７
に中和する。

＝　４２　− 残留するＤＮＡを５μグのｔＲＮＡを担体として用いて
沈でんさせ、８０％エタノールで洗滌後、２０μｍのフ
ォルムアミド緩衝液に溶解し、８％アクリルアミド−８
Ｍ尿素配列決定ゲルにのせる。

ゲルはコダック社製Ｘ線フィルムを用いて２４時間強化
スクリーンで感光する。Ｘ線写頁を第６図に示す。感染
後３時間口ではＴＫプロモーターからの転写物のみ検出
される（スロット１）が、感染１１７時間目間口挿入し
た１　１　ｋＤａプロモーターから開始したＳ１保護バ
ンド（２６０ｂ１１）が強く検出され、ＴＫ転写物は微
但にしか検出できない。従って、挿入した１　１　ｋＤ
ａ調節配列は感染後期に作用すると結論できる。

〈実施例２〉 １５の構築 プラスミドｐ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−１３μびを１０単位
の制限酵素ＥＣ０ＲＩで完全に消化し、デオキシデミジ
ン三りん酸を終濃度１００μＭを含有するＴ４ポリメラ
ーゼ緩衝液（マニアティス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）ら、上
述）中でＤＮＡを１単位のＴ４ＤＮ△ポリメラーゼと３
７℃でインキュベ−１〜する。３０分後に６５℃１０分
に加熱して反応を停止する。反応液をヌクレアーゼＳ１
緩衝液で１０倍に希釈し、−重鎖ＤＮＡ末端を２単位の
ヌクレアーゼＳ１で１時間処理して除去する。合成りａ
ｍＨＩリンカ−（５゛−＾ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴ−３
“）をＤＮＡの平滑末端に結合し、１１００ｎのＤＮＡ
を１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにて自己結合させた４１
１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて１時間消化し、
１１Ｂ　１０１に導入する。アンピシリン耐性の８０個
の形質転換株を選択し、１００μｇ／＃ｌｉ！のアンピ
シリン含有ＬＢ−培地中で培養する。これらの株からＤ
ＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素ＢａｍＨＩの
切断部位の有無を分析する。制限酵素３ａｍＨＩ切断部
位を有するＤＮＡを選び、それぞれのＤＮＡ２０μりを
それぞれ５０単位のＢａｍｔ−ＩＩおにびＣｌ！ａＩＴ
”完全に消化する。ＤＮＡをアクリルアミドゲルで分離
し、それぞれ１５６および１４１　ｂｐのＤＮＡ断片を
単離して各断片を１単位位のフレナラ断片およびα−３
２Ｐ−デオキシグアニジン三りん酸を用いて１３μｍＩ
部位で標識してマキサム−ギルバート法で配列決定を行
なった。５’−ＡＡＡＧＧ八ＴＣＣへ３°　（ＢａｍＨ
Ｉリンカ−を示す）の配列の前に次のような配列を有す
るＤＮＡを選択した。

Ｎｏ　　　１：　　　５°−ＣＴＡＧＡ　ＡＧＣＧＡ　
ＴＧＣＴＡ　　ＣＧＣＴＡ　　ＧＴＣＡＣＡ＾ＴＣＡ　
　ＣＣＡＣＴ　　ＴＴＣ＾■＾ＴＴＴＡ　　Ｇ＾八へＡ
　　ＴＡＴＧＴ　　ＡＴＧＴＡ　　Ａ＾＾八Ｔへ八ＴＡ
ＧＴ　　ＡＧＡ＾Ｔ　　ＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴ　　ＴＴ
ＴＴＴ　　ＴＣＴ八Ｔへ　ＧＣＴＡＴ　　Ａ＾八へ−３
゜Ｎｏ　　　２：　　　５°−ＣＴＡＧＡ　　ＡＧＣＧ
Ａ　　ＴＧＣＴＡ　　ＣＧＣＴＡ　ＧＴＣＡＣＡＡＴＣ
Ａ　　ＣＣＡＣＴ　　ＴＴＣＡＴ＾ＴＴＴＡ　　ＧＡＡ
Ｔ＾　ＴＡＴＧＴ　　ＡＴＧＴＡ　ＡＡ八へＴ　　ＡＴ
ＡＧＴ　　ＡＧ＾＾Ｔ　　ＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴ　ＴＴ
ＴＴＴ　−３゜ Ｎｏ、　１およびＮｏ、　２の配列を有するＤＮＡ５μ
りをそれぞれ１０単位の制限酵素３ａｍ）１１．１３よ
びＨｉｎｄｌｌを用いて完全に消化する。ＤＮＡをアガ
ロースゲルで分離し、それぞれ８８８および８７３　ｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離する。各１１００ｎを１単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを用い、それぞれ５０−モル過剰の合
成りＮＡ断片５°−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ−３゜および
５’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３’と結合する。続いて
ＤＮＡを３００単位の制限酵素ＥＣ０ＲＩで８時間消化
し、６％アクリルアミドゲルにかけてそれぞれ８９８お
よび８８３　ｂｐの断片を単離する。

２μｇのプラスミドｐｔ−ＩＧＳ−１をそれぞれ５単位
の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびト１ｉｎｄｌｌで完全消化
し、ＤＮＡをアガロースゲルで分離して３．２ｋｂの断
片を単離する。この３，２ｋｂの断片２５ｎｇを５０Ｂ
ｇの８９８および８８３　ｂｐ断片を１単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いてそれぞれ結合し、ＤＮＡをＨ８１０
１に導入する。各々アンピシリン耐性形質転換株４株を
選択し、１００μｇ／Ｉｄのアンピシリン含有ＬＢ−培
地で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、その大
きさおよび制限酵素ＥＣ０Ｒ１，３ｍａ　■およびＢａ
ｍＨＩの切断部位の有無を分析する。各々アガロースゲ
ル電気泳動後、予想するパターンを示すプラスミドをそ
れぞれｐｌ−ＩＧＳ　−２（Ｎｏ、１配列を含むもの）
おにびｌ）　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−２△１５（Ｎｏ、２）
と命名した。

Ｂ１組換えウ−１’　、＋１／　スＲＶ　Ｖ　−２ｔ３
よびＲＶＶ−３（７）数置 組換えウィルスＲＶＶ−２およびＲＶＶ−３をそれぞれ
プラスミドｐｌ−ＩＧＳ　　２およびｐＨＧ　Ｓ−２△
１５を用いて前述のように構築する。それぞれ−個のウ
ィルスについて変異した１　１　ｋＤａ転写調節配列（
それぞれＮｏ、　１およびＮｏ、　２　）がＴＫ−遺伝
子中に挿入した状態で存在づることをブロワ１〜−ハイ
ブリダイゼーシヨン（マケツ１〜（Ｈａｃｋｅｔｔ　）
ら、上ｉＭ　）　ｋ：　Ｊ：　リｍｆ認シタ。

Ｃ，ヌクレアーゼＳ１プローブのクローニングＴＫ−遺
伝子に挿入した転写調節配列Ｎｏ、　１およびＮｏ、　
２の転写物のためのヌクレアーゼＳ１プローブの調製は
それぞれプラスミドｐ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ−２およびｐｌ
−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−２Δ１５を用い、実施例１のＦ、ａに
記載したとおりに行なつｌｃ。

Ｄ、ＲＮＡ転写物の５’　８１７”／ｅ”／７ウィルス
感染後それぞれ４時間目および８時間目のＲＮＡ転写物
はぞれぞれウィルスＲＶＶ−２およびＲＶＶ−３、およ
びそれぞれの１１　ｋＤａ転写調節配列（それぞれＮｏ
、　１おＪ：びＮｏ、　２配列含有）のＴＫプロモータ
ーからのＲＮＡ転写物の８１１０−ブを用い、前述のと
おり調製する。Ｘ線フィルムを第７図に示す。感染後４
時間目では（スロット１および４）ＴＫプロモーターか
らの転写物のみ検出される。これらの転写物は感染後８
時間目には検出できない。一方、ウィルスＲＶＶ−２（
ｐ　ＨＧ　Ｓ−２挿入）が感染した細胞では強いＳ１保
護バンドが検出される。しかしＲＶＶ−３（ｐ）−ＩＧ
ｓ−２Δ１５挿入）ではＳ１保護バンドは見られない。

この事は、ＡＴＧから５′に１５ｂｐ削除すると変異転
写調節配列から開始する転写が不活化することを示して
いる。

〈実施例３〉 Ｖ−４おにびＲＶＶ−５の構築 プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐ
ａｒｕｍ　＞のメロンイト５．１表面抗原（ホープ（１
，＾、１Ｉｏｐｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、１３巻、３６９〜３
７９頁（１９８５年〕）を含むプラスモジウム（Ｐｌａ
ｓｍｏｄ目＋ｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）　ｃ　Ｄ　
ＮＡ断片にＥｃｏＲＩリンカ−を結合したちの１１００
ｎと、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、遊離末端を１
単位のＳＡＰで脱りん酸したプラスミドｐＨＧ５−２お
よびｐｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ−２△１５のそれぞれ５０％ｇと
を１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、得られ
るＤＮＡをトｌ８１０１に導入する。それぞれで４個の
アンピシリン耐性形質転換株を選択し、それらを１００
μｆＪ　／　ｍｅのアンピシリン含有ＬＢ−培地で培養
する。これらの株からＤＮＡを単離し、その大きさおよ
び制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＩ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｆｌの
部位の存在を分析する。アガロースゲル電気泳動で予想
されるパタ−ンを示すプラスミドをそれぞれｐＨＧ５−
２１５．１およびｌ）　１−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−２Δ１５１
５．１と命名した。

組換えウィルスＲＶＶ−４およびＲＶＶ−５はそれぞれ
プラスミドｐ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ−２／　５　、１および
ｐＨＧ５−２△１５１５．１を用いて既に述べた通りに
構築し、選択する。

Ｃ９間接的免疫蛍光法 ＲＫ−１３細胞を８０％の集密度まで生育させ、マラリ
ア５．１抗原を相同組換えによりウィルスゲノムに安定
に組込んだ組換えワクシニアウィルスＲＶＶ−４或いは
ＲＶＶ−５を細胞当り０．１プラ一ク形成単位（ｐｆｕ
）で感染させる。感染１時間後に細胞をりん酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）で洗滌し、新しい培地を添加する。ウィル
ス感染をさらに１６時間続ける。細胞を培養皿からかき
取り、２０００ｘｙの遠心分離にて集めてＰＢＳで一回
洗滌する。およそ１０４個の細胞をスライドグラ−５〇
　　− スにのせ、風乾後−２０℃のアセ１〜ンで１０分間固定
し、風乾する。固定した細胞をＰＢＳで希釈したウサギ
の抗５．１抗原と３７℃２０分間インキュベートする。

続いてＰＢＳで３回洗滌し、再び風乾する。次に固定し
た細胞をＰＢＳで希釈したヤギ抗つザギＦＩＴＣ血清と
３７℃と２０分インキュベートし、ＰＢＳで３回、蒸溜
水で１回洗滌した後風乾する。細胞にＰＢＳ−グリセリ
ン（１：１）をのせ、カバーグラスで覆う。細胞を４５
０〜４９０ｎｍ顕微鏡下で蛍光を分析する。結果を第９
図に示す。Ａ図はウィルスＲＶＶ−４で感染した蛍光細
胞を示し、８図は可視光線下の感染細胞を示す。ウィル
スＲＶＶ−５で感染した細胞は蛍光を示さず、１１　ｋ
Ｄａ−ＡＴＧの上流の欠失により調節配列が失活するこ
とを表わしている。しかしＡＴＧのＧ残基を除去しても
転写或いは翻訳に影響はない。

〈実施例４〉 結合して含有する組換えワクシニアウィルス［（又１０
図） プラスミドｐ　ｌ−ｌ　Ｇ　Ｓ−２２μ９を２１１１位
の制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全に
消化する。ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分１ｉｌ
ｌ　Ｌ。

ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩベクター（〜４ｋｂ）を単離す
る。

プラスミドｐＤｓ−１、ｔｏｌ”　　（１９８４年１２
月１１日付けでゲッチンゲン　ドイツヂエザムルンク（
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎｔ（ｉｋ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　）　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）にＤ
ＳＭ−３１３５番として寄託されている）２μりをそれ
ぞれ２単位の制限酵素［３ａ　ｍ　ｆ−ｌ　ＩおよびＥ
ｃｏＲＩで完全消化し、マウスジヒドロ葉酸、レダクタ
ーゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）　’／Ｉ！仏子を含むおよそ９２
０ｂ１１の断片を単離する。Ｂ　ａ　ｍ　ｌ−Ｉ　Ｉお
よびＥＣ０ＲＩで消化したｐ　ＨＧ　Ｓ　−２２０μグ
とマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含むＢａｍ
ＨＩ−Ｅｃ。

ＲＩ断片１００μりとを１単位の７４．　Ｄ　ＮＡリガ
ーゼを用いて結合し、得られるＤＮＡをｌ−Ｉ　８１０
１に導入する。１００μ’Ｊ　／　ｍＱのアンピシリン
に耐性な８個の形質転換株を選び、１００μ９／ｒｄ。

のアンピシリン含有Ｌ　Ｂ−培地で培養する。これらの
菌からＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素ＥＣ
０ＲＩ、１３　ａ　ｍ　ｌ−Ｉ　ＩおよびＳａＣ工の部
位の存在を分析する。予想されるパターンを示す一つの
プラスミドをｐＨＧ５−２／Ｄｆ−（ＦＲと命名した。

Ｂ、プラスミドｐＨＧ　Ｓ　−２／　ｌ）　ＨＦ　Ｒ−
Ｅの構築（第１１図） ２μ７のプラスミドｐｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−２を２単位の
制限酵素ＥＣ０ＲＩで完全消化し、遊離末端を１単位の
バクテリア　アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で脱
り／ｖ酸する。ＥＣ０ＲＩ消化ベクターを低融点（ＬＭ
）アガロースで単離する。２μ９のプラスミドｐＤＳ−
１、ｔｏ１＋を２単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化
し、マウスＤ）ＩＦＲ遺伝子を含むおよそ９２０ｂｒｌ
の断片をＬＭアガロ一スから単離づ−る。２０μｑのＥ
ｃｏＲＩ消化ベクターｐ　Ｉ−Ｉ　Ｇ　Ｓ−２および１
１００ｔ１のＥＣＯＲ■−断片を１単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合し、ＤＮＡをＨＢ　１０１に導入する。１
００μｑ／ｍｅのアンピシリンに耐性な８個の形質転換
株を選び、１００μｇ／ｄのアンピシリン含有ＩＢ培地
中で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、その大
きさおよび制限酵素ＥＣ０ＲＩおよびＳａＣ■の切断部
位の存在を分析する。アガロースゲル電　　　　　′気
泳動で予想されるパターンを示す一つのプラスミドをｌ
）　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−２／　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ−Ｅ
　（第１１図）と命名した。

Ｃ，プラスミドｐ　ＨＧ　Ｓ−Ａ　／　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ
　Ｒの横築（第１２図） プラスミドｐｌ−１Ｇｓ−２／ＤＨＦＲ−ＥＩＯμりを
それぞれ１０単位の制限酵素ＥＣ０ＲＩおよび５ａｃＩ
で完全消化し、およそ２７５ｂｐの断片を８％アクリル
アミドゲルより単離する。２７５ｂｐのＥＣ０ＲＩ−８
ａＣＩ断片をそれぞれ５０ｐｍｏ　ｌの合成断片５’−
Ｔ＾ＴＡＡＡＴＡ−３°および５°−静ＴＴＴＡＴＴＴ
＾ＴＡ−３°と５０ｍＨＮａＣｊ！含有のりガーゼ緩衝
液中で１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。

１４℃２時間の反応の後、ＤＮＡを１単位の制限酵素５
ａｃＩで完全消化し、上記合成配列を含有する２　８３
　ｂｐの断片を単離する。

プラスミドＤ　ｌｌ　Ｇ　Ｓ　　２△１５２μｑを４単
位の制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、５′の一本鎖を
Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■の大断片（
フレナラ断片）で修復し、酵素を６５℃１０分間加熱し
て失活させる。続いてＤＮ＼Ａを１単位のＣ１ａ■で完
全消化し１５２ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲルで
単離する。

プラスミドｐ　ＨＧ　Ｓ　−２／　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ
２μりをそれぞれ２単位の制限酵素（１！ａＩおにびＳ
ａＣ■で完全消化し、およそ４．６ｋｂのベクターを１
Ｍアガロースで単離する。上述の合成断片を含むＥｃｏ
ＲＩ−８ａｃＩ断片１００　ｆｌｇと１１ｋＤａの転写
調節配列の一部を含むＣｊ！ａＩ−ＢａｍＨＩ断片１０
０μ９とを１単位のＴ４ＤＮＡリガーピを用いて２０μ
！？の０１ａＩ−８ａｃＩ消化ベクターｐＨＧ５−２／
ＤＨＦＲと結合し、得られるＤＮＡを１１Ｂ　１０１に
導入する。アンピシリン耐性の１６個の形質転換株を選
択し、１００μ９／ｌｒｉのアンピシリン含有ＬＢ培地
中で生育させる。これらの株よりＤＮＡを単離し、その
大きさおよび制限酵素ＥＣ０ＲＩおよび５ａｃＩの部位
を分析する。アクリルアミドゲル電気泳動後予想される
パターンを示した一つのプラスミドを配列決定した。プ
ラスミドは次の配列を有し、ｐＨＧｓ−Ａ／ＤＨＦＲと
命名した。

Ｎ０３； ５°−ＣＴＡＧＡ　ＡＧＣＧＡ　ＴＧＣＴ＾ＣＧＣＴＡ
　ＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡ　ＣＣＡＣＴ　ＴＴＣＡＴ＾Ｔ
ＴＴＡ　　ＧＡＡＴＡ　　ＴＡＴＧＴ　　ＡＴＧＴＡ　
　ＡＡＡ＾ＴＡＴ八ＧＴ　　Ａへ＾＾Ｔ　　ＴＴＣＡ丁
ＴＴＴＧＴ　ＴＴＴＴＴ　ＡＡＡＧＧ　ＡＴＣＴＡ　Ｔ
＾＾ＡＴ　ＡＡ＾■３゜Ｄ、プラスミドｐＨＧｓ−Ｆ／
ＤＨＦＲの構築（第１３図） プラスミドｐＨＧ５−２／ＤＩ−ＩＦＲ１０μ３をそれ
ぞれ１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩおよび３ａｃＩで完
全消化し、２６８　ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲ
ルで単離する。２００μｑのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　−Ｓ　
ａ　ｃ　Ｉ断片を各１ｐｍｏｌ（７）合成りＮＡ断片５
’−ＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡ＾ＴＡＡＡ−３’および
５　’−ＧＡＴＣＴＴＴ＾ＴＴＴ静ＴＣＧＡＴＡＧＡ−
３°と、終濃度５０ｍＨのＮａＣｊ！含有リガーゼ緩衝
液中１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。１
４℃で２時間反応後、ＤＮＡを１単位の制限酵素ＳａＣ
■で消化し、上記配列を含む２９０　ｂｐの断片を単離
する。プラスミドｐＨＧ５−２Δ１５１０μびをそれぞ
れ１０単位の制限酵素Ｃｊ！ａＩおよびＤｒａＩで完全
消化し、１３０ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲルよ
り単一１する。

上述の合成断片を含むＢａｍｔ−ｌｌ−５ａｃ４断片お
よび１１ｋＤａ転写調節配列を含むＣＪ！ａＩ−Ｄｒａ
丁断片それぞれ１００μグを１単位の７４ＤＮＡリガー
ピを用いてＣｊ！ａ■−８ａＣＩ消化ベクターｐＨＧ５
−２／ＤＨＦＲ５０μｑと結合し、ＤＮＡをＨ８１０１
へ導入する。アンピシリン耐性の１６個の形質転換株を
選び、１００μｇ／威のアンピシリン含有ＬＢ−培地で
培養する。これらの菌よりＤＮＡを単離し、その大きさ
および制限酵素５ａｃＩおよびＣｊ！ａＩの部位の存在
を分析する。アクリルアミドゲルの電気泳動で予想する
パターンを示す一つのプラスミドを配列決定し、ｐＨＧ
Ｓ−Ｆ／Ｄｔ−ＩＦＲと命名した。

以下の配列を含有する。

Ｎｏ　４： ５°−ＣＴＡＧＡ　　ＡＧＣＧＡ　ＴＧＣＴＡ　　ＣＧ
ＣＴＡ　　ＧＴＣＡＣ＾＾ＴＣＡ　　ＣＣＡＣＴ　　Ｔ
ＴＣ＾■ＡＴ丁ＴＡＧＡ＾ＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＡＡ
＾＾＾ＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴ　
ＴＴＴＴＴ　ＴＣＴＡＴ　ＣＧＡＴＴ　ＡＡＡＴＡ　Ａ
ＡＧ　　３゜組換えウィルスＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７お
よびＲＶＶ−８を前述のとおり、それぞれプラスミドｐ
ＨＧ５−２／ＤＨＦＲ，ｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲおよび
ｐＨＧｓ−Ｆ／ＤＨＦＲを用いて構築する。それぞれよ
り一つのウィルスを選び、変異１１　ｋＤａ転写調節配
列（それぞれＮｏ、　１　、Ｎｏ、　３およびＮα４）
およびＶＶＴＫ−’ＩＩ伝子に挿入されたＤＨＦＲＩ伝
子より成るキメラ遺伝子の存在をプロットーハイブダイ
ゼーション（ＨａＣｋｅｔｔら、前述）により確認した
。

「、ヌクレアーゼＳ１プローブの調製 プラスミドｐｌ−ＩＧＳ−２／ＤＩ−ｌＦＲ，ｐｉ−Ｉ
ＧＳ−Ａ　／　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲおよびＤ　Ｉ−Ｉ　
Ｇ　Ｓ−Ｆ　／　Ｄ　ＨＦ　Ｒのそれぞれ１０μりを１
０単位の制限酵素ＡＣＣＩで完全に消化し、遊離末端を
１単位のＢΔＰを用いて脱りん酸してから酵素をフェノ
ール、フェノール−クロロボルム ロボルムで抽出して除去する。ＤＮＡを沈でん化し、＠
離末端を２倍モル吊過剰の３２Ｐ−γ−ＡＴＰ存在下で
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてりん酸化する。酵素
を６５℃１０分処理して失活させ、ＤＮＡを５単位の制
限酵素ｌ−Ｉ　ｉ　ｎ　ｄ　ｌ［で完全消化する。おＪ
：そ１２００ｂｐの断片を１ＭアガロースよりＩ１１１
１ＩＩシ、ＡＣＣＩ部位が対称に標識されたＳ１プロー
ブとする。

Ｇ．ＲＮＡ転写物の５′Ｓ１マツピングＲＫ−１３単層
細胞に細胞当り５　ｐｆｕの組換えウィルスＲＶＶ−６
、ＲＶＶ−７おにびＲＶＶ−８をそれぞれ感染させる。

１００μｇ／ｄのシフ口へキシミド（シグマ社製）を含
有する培地中で、培養した感染後６時間目の細胞Ｊ：り
初期ＲＮＡを調製する。後期ＲＮＡは感染後８時間おに
び２４４時間目ウィルス感染細胞より単位する。Ｓ１マ
ツピングは上記１項記載のとおり調製したＤ　Ｉ−Ｉ　
Ｆ　Ｒ転写物に対する標識Ｓ１プローブを用い、実施例
１、Ｇ項に記載したどおりに行なう。

Ｘ線写真を第１４図に示す。Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ転写物
はシクロヘキシド存在下で培養した感染細胞から調製の
ＲＮＡには検出されない。これは１　１　ｋＤａ調節配
列Ｎｏ．　１　、３および４は転写の初期には活性がな
いことを示ず（第１４図十と表示の列）。

それぞれＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７およびＲＶＶ−８のウ
ィルスを感染した細胞で感染後８および２４４時間目は
Ｄ　Ｈ　Ｆ　Ｒ転写物（矢印で示す）は検出される（第
１４図、それぞれ８および２４と示している）。Ｉ）　
ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ−Ａ　／　Ｄ　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒおよびｐ
ＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲそれぞれの挿入ベクター■ に存在する変異１　１　ｋＤａ調節配列由来のＤＨＦＲ
転写物の量は挿入ベクターｐＨＧｓ−２／ＤＨＦＲに存
在する１　１　ｋＤａ調節配列Ｎｏ．　１に由来するＤ
ＨＦＲ転写物と比較して少なくとも３〜４倍増加してい
る。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はｐＢＲ−３２２およびワクシニアウィルスの
Ｉ−ｌｉ　ｎ　ｄ　ｍ“Ｊ″断片り成り、ワクシニアウ
ィルスのＴＫ−１伝子を含むプラスミドｐＢＲ−Ｊの構
築の概略を図示したものである。 第１ｂ図はｐＢＲ−３２２およびワクシニアウィルスの
Ｈｉｎｄｌ［Ｉ−Ｆ断片の右側から成り、ワクシニアウ
ィルスの１　１　ｋＤａたん白の転写調節配列を含むプ
ラスミドｐＢＲ−Ｆｌの構築の概略を図示したものであ
る。 第２図はワクシニアウィルスのＴＫ−遺伝子プラスその
先行配列のプラスミドｐＬＩｃ−８へのサブクローニン
グによるプラスミドｐＵｃ−ＴＫ構築の概略を図示した
ものである。 第３図はワクシニアウィルスの１　１　ｋＤａたん白の
転写調節配列のＴＫ−１伝子への挿入によるプラスミド
ｌ）ＵＣ−ＴＫ−／１　１　ｋＤａの構築の　。 概略を図示したものである。 第４図は１　１　ｋＤａたん白の転写調節配列のＥＣＯ
ＲＩ制限酵素部位の上流をＸｍｎ工制限酵素部へと変換
し、プラスミドｐ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−　１を得る概略
を図示したものである。 第５ａ図はＴＫ−遺伝子に挿入した１　１　ｋＤａたん
白の転写調節配列で開始する転写物のためのヌクレアー
ゼＳ１７０ーブの単離および放射標識の概略を図示した
ものである。 第５ｂ図はＴＫ−遺伝子の調節配列で開始する転写物の
ためのヌクレアーゼＳ１の単離および放射性ラベル標識
の概略を図示したものである。 第６図の上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮＡ転写物（
−ｍ−ｗ−→）のマツピングの概略を図示したものであ
る。下部はＴＫ−転写物（２５０ｂｐ）および１　１　
ｋＤａ転写物（２６０ｂｐ）のヌクレアーゼＳ１７ツピ
ングのＸ線写真である。感染細胞からのＲＮＡを感染後
３時間目（１列目と２列目）および７時間目（３列目と
４列目）に採取した。 第７図の上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮＡ転写物の
マツピングの概略を示す。下部はそれぞれＲＶ　Ｖ　−
２（ｐｌ−ｌ　Ｇ　Ｓ　−２，１死目おにび２死目）、
ｉ５Ｊ：びＲＶＶ−３（ＤＩ−ＩＧＳ−２△１５．３死
目と４死目）に感染した細胞から得たＲＮＡ転写物のヌ
クレアーゼＳ１７ツピングのＸ線フィルム現像である。 ＲＮＡは感染後、４時間口（１死目と４死目）および８
時間口（２死目と３列目）に抽出した。Ｉｆ　Ｍ　ＩＩ
と記した列はｒ）ＢＲ−３２２のｌ−１ｐ　ａ　Ｔ［断
片の３２Ｐラベル標識物の夫々示した長さくｂｐ）のも
のを含むものである。ＴＫ−遺伝子或いは挿入した１　
１　ｋＤａの調節配列で開始するそれぞれのＲＮＡ転写
物に相当する位置も示しｌこ　。 第８図はプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｔ’ａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）　５．　ｉ抗原（ｌｌｏｐｅら、上
述）のプラスミドｐ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ−２へのクローニ
ングと構築されるプラスミドｌ）　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｓ　−
２／　５　、１の概略の図示である。 第９図は生物の形態を示す写真であって、プラスモジウ
ム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）
　５　、１抗原を含むウィルスＲＶＶ−４で感染した細
胞の間接免疫蛍光を示す。写真ａの細胞は４５０〜４９
０ｎｍで撮影し、写真すは位相差で撮影したものである
。 第１０図はプラスミドｐ　ＨＧ　Ｓ−２／　Ｄ　Ｉ−Ｉ
　Ｆ　Ｒの構築の概略を図示したものである。 第１１図はプラスミドｐ　ｌ−（Ｇ　Ｓ−２／　Ｄ　Ｉ
−Ｉ　Ｆ　Ｒ−「の構築の概略を図示したものである。 第１２図はプラスミドｐＨＧ５−Δ／　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ
　Ｒの構築の概略を図示したものである。 第１３図はプラスミドＤＨＧＳ−Ｆ／Ｄ）−（ＦＲの構
築の概略を図示したものである。 第１４図の上部はＲＮＡ転写物（−□　）のヌクレアー
ゼＳ１によるマツピングの概略を示す。 予想されるバンドの長さく３５０ｂＩ））を示した。 下部１；ｊ：　ＲＶ　Ｖ　−６（１）　ＨＧ　Ｓ　−２
／　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ）、ＲＶＶ−７（ｐｌ−（ＧＳ
−Ａ／ＤＨＦＲ）およびＲＶＶ−８（ｐＨＧＳ−Ｆ／Ｄ
ＨＦＲ）に感染し　　　　　また細胞からのＲＮＡ転写
物のヌクレアーゼＳ１７ツピングのＸ線図である。初期
ＲＮＡはそれぞれのウィルスで感染させた細胞を１００
μグ／威のシクロへキシミド存在下（＋と表記した列）
でインキュベーＩ・後６時間口に抽出した。後期ＲＮＡ
は感染後８時間および２４時時間口それぞれ８および２
４と記した列）に抽出した。１１　Ｍ　＋１と記した列
はｐＢＲ−３２２のＨｐａＩＩ断片の３２Ｐ放射標識物
より成り、図に示した長さくｂｐ）である。 転位（変異）した１　１　ｋｌ）ａ調節配列から開始す
るＲＮＡ転写物に対応するＳ１保護バンドの位置を図に
示しである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ボックスウイルスの後期プロモーターとして機能す
   る遺伝情報を含む以下の式で表わす転写調節配列または
   そのサブユニット、或いは上記転写調節配列の一個又は
   数個のヌクレオチドの欠損、挿入、置換またはそれらの
   組合せなどによる機能を保持した変異配列。 【遺伝子配列があります】 ２）次の式で示される第１）項記載の転写調節配列。 【遺伝子配列があります】 ３）次の式で示される第１）項記載の転写調節配列。 【遺伝子配列があります】 ４）次の式で示される第１）項記載の転写調節配列。 【遺伝子配列があります】 ５）次の式で示される第１）項記載の転写調節配列。 【遺伝子配列があります】 ６）（ａ）ベクター由来の複製開始点 （ｂ）抗生物質耐性遺伝子 （ｃ）第１）項〜第５）項記載の転写調節配列の少なく
   とも一つと原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコード
   する外来遺伝子とが機能的に結合したものより成るキメ
   ラ遺伝子および （ｄ）上記キメラ遺伝子を結したボックス・ウイルス遺
   伝子の非本質的部分からのＤＮＡより成る組換えベクタ
   ー。 ７）キメラ遺伝子の翻訳開始部位がボックスウイルスの
   転写調節配列にある第６）項記載の組換えベクター。 ８）キメラ遺伝子の翻訳開始部位が原核細胞又は真核細
   胞をコードする外来遺伝子にある第６）項記載の組換え
   ベクター。 ９）グラム陰性細菌中で複製可能なプラスミドである第
   ６）項〜第８）項のいずれか記載の組換えベクター。 １０）Ｅ．ｃｏｌｉ株中で複製可能な第９）項記載の組
   換えベクター。 １１）該外来遺伝子がマラリア抗原をコードする第６）
   項および第８）項〜第１０）項のいずれか記載の組換え
   ベクター。 １２）マラリア抗原がプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄ
   ｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のポロゾイトおよび／
   又はメロゾイトの表面抗原である第１１）項記載の組換
   えベクター。 １３）マラリア抗原が５．１抗原である第１２）項記載
   の組換えベクター。 １４）該ボックスウイルスＤＮＡがワクシニアウイルス
   ＤＮＡである第６）項〜第１３）項のいずれかに記載の
   組換えベクター。 １５）ｐＨＧＳ群の一つである第９）項〜第１４）項の
   いずれかに記載の組換えベクター。 １６）ｐＨＧＳ−１である第１５）項記載の組換えベク
   ター。 １７）ｐＨＧＳ−２である第１５）項記載の組換えベク
   ター。 １８）ｐＨＧＳ−２／５．１である第１５）項記載の組
   換えベクター。 １９）ｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲである第１５）項記載の
   組換えベクター。 ２０）ｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲである第１５）項記載の
   組換えベクター。 ２１）第１）項〜第５）項のいずれかに記載の転写調節
   配列が原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
   遺伝子と機能的に結合しているキメラ遺伝子を含み、該
   外来遺伝子の発現が可能な感染性組換えボックスウイル
   ス。 ２２）キメラ遺伝子の翻訳開始部位がボックスウイルス
   の転写調節配列にある第２１）項記載の感染性組換えボ
   ックスウイルス。 ２３）キメラ遺伝子の翻訳開始部位が原核細胞又は真核
   細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝子にある第２１
   ）項記載の感染性組換えボックスウイルス。 ２４）該外来遺伝子がマラリア抗原をコードする第２１
   ）項および第２３）項記載の感染性組換えボックスウイ
   ルス。 ２５）マラリア抗原がプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄ
   ｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイトおよび
   ／またはメロゾイト表面抗原である第２４）項記載の感
   染性組換えボックスウイルス。 ２６）マラリア抗原が５．１抗原である第２５）項記載
   の感染性組換えボックスウイルス。 ２７）感染性組換えワクシニアウイルスである第２１）
   項〜第２６）項記載の感染性組換えボックスウイルス。 ２８）ＲＶＶ群の一つである第２７）項記載の感染性組
   換えワクシニアウイルス。 ２９）ＲＶＶ−１である第２８）項記載の感染性ワクシ
   ニアウイルス。 ３０）ＲＶＶ−２である第２８）項記載の感染性ワクシ
   ニアウイルス。 ３１）ＲＶＶ−４である第２８）項記載の感染性ワクシ
   ニアウイルス。 ３２）ＲＶＶ−７である第２８）項記載の感染性ワクシ
   ニアウイルス。 ３３）ＲＶＶ−８である第２８）項記載の感染性ワクシ
   ニアウイルス。 ３４）以下のステップより成る第６）項〜２０）項のい
   ずれか記載の組換えベクターの製造方法。 （ａ）ボックスウイルスＤＮＡを含有するベクタ−を調
   製し、該ＤＮＡは （ｉ）少なくとも一つの制限酵素切断部位に隣接して少
   なくとも一個の転写調節配列および（ｉｉ）該調節配列
   および該制限酵素切断部位を結合したボックスウイルス
   の非必須断片からのＤＮＡとから成り、 （ｂ）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
   少なくとも一個の外来遺伝子を該転写調節配列に隣接す
   る該制限酵素部位に挿入する。 ３５）該ボックスウイルスＤＮＡがワクシニアウイルス
   ＤＮＡである第３４）項記載の方法。 ３６）以下のステップより成る第２１）項〜第３３）項
   のいずれかに記載の感染性組換えボックスウイルスの製
   造方法。 （ａ）第３４）項または第３５）項に従って組換えベク
   ターを調製する。 （ｂ）ボックスウイルス属に属するウイルスにより感染
   した少なくとも一個の細胞を得る。 （ｃ）該細胞を該組換えベクターでトランスフェクショ
   ンし、そこで、該ボックスウイルスのＤＮＡと該組換え
   ベクターに含まれるボックスウイルスＤＮΛの少なくと
   も一部分とが相同組換えを起させる。そして、 （ｄ）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
   該外来遺伝子を発現することの出来る感染性組換えボッ
   クスウイルスを該細胞より選択的な方法により単離する
   。 ３７）該ボックスウイルスＤＮＡがワクシニアウイルス
   ＤＮＡである第３６）項記載の方法。 ３８）第２１）項〜第２８）項および第３１）項のいず
   れかに記載の感染性組換えボックスウイルスおよび生理
   的に適合性のある担体とを含む生ワクチン。 ３９）上記２１）項〜３３）項記載の感染性組換えボッ
   クスウイルスの防御的免疫成立への使用。