ES2588738T3 - Secuencias de consenso de proteínas del virus Chikungunya, moléculas de ácido nucleico que las codifican, y composiciones y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Secuencias de consenso de proteínas del virus Chikungunya, moléculas de ácido nucleico que las codifican, y composiciones y métodos de uso de las mismas Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 90 % homóloga a SEQ ID NO: 13; una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 90 % homóloga a SEQ ID NO: 15; una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de consenso de la proteína E1 del CHIKV de consenso y es un fragmento de SEQ ID NO: 4 que codifica al menos 250 aminoácidos; una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de consenso de la proteína E1 del CHIKV de consenso y es un fragmento de SEQ ID NO: 4 que codifica al menos 250 aminoácidos y que comprende además una secuencia líder de IgE; una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de consenso de la proteína E2 del CHIKV de consenso y es un fragmento de SEQ ID NO: 5 que codifica al menos 210 aminoácidos; una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de consenso de la proteína E2 del CHIKV de consenso y es un fragmento de SEQ ID NO: 5 que codifica al menos 210 aminoácidos y que comprende además una secuencia líder de IgE; una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de consenso de la proteína de cápside del CHIKV de consenso y es un fragmento de SEQ ID NO: 6 que codifica al menos 125 aminoácidos; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de consenso de la proteína de cápside del CHIKV de consenso y es un fragmento de SEQ ID NO: 6 que codifica al menos 125 aminoácidos y que comprende además una secuencia líder de IgE.

Description

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cápside del CHIKV de consenso con la secuencia líder de IgE. SEQ ID NO: 10 se refiere a la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 4 que es la proteína E1 del CHIKV de consenso sin la secuencia líder de IgE. SEQ ID NO: 11 se refiere a la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 5 que es la proteína E2 del CHIKV de consenso sin la secuencia líder de IgE. SEQ ID NO: 12 se refiere a la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 6 que es la proteína de cápside del CHIKV de consenso sin la secuencia líder de IgE. SEQ ID NO: 13 se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica Env de consenso, que es secuencia de Kozak-secuencia líder de IgE-secuencia de codificación de CHIKV-E3-sitio de escisión-secuencia de codificación de CHIKV-E2-sitio de escisión-secuencia de codificación de CHIKV-E1-señal de detención-señal de detención. SEQ ID NO: 14 se refiere a la secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 13, que es la secuencia de la proteína Env de consenso que es secuencia líder de IgE-CHIKV-E3-sitio de escisión-CHIKV-E2-sitio de escisiónsecuencia de codificación de CHIKV-E1. SEQ ID NO: 15 se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica Env de consenso correspondiente a SEQ ID NO: 13, pero sin la secuencia líder de IgE, es decir, secuencia de codificación de CHIKV-E3-sitio de escisiónsecuencia de codificación de CHIKV-E2-sitio de escisión-secuencia de codificación de CHIKV-E1-señal de detención-señal de detención. SEQ ID NO: 16 se refiere a la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 15, que es la secuencia de la proteína Env de consenso sin la secuencia líder de IgE, es decir, CHIKV-E3-sitio de escisión-CHIKV-E2-sitio de escisión-secuencia de codificación de CHIKV-E1. SEQ ID NO: 17 se refiere a la secuencia de aminoácidos de la secuencia líder de IgE. GCCGCCACC es una secuencia de Kozak preferida.
Cuando las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de consenso son absorbidas por las células del individuo, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de consenso se expresan en las células, y, por lo tanto, las proteínas se administran al individuo. Los aspectos de la divulgación proporcionan métodos de administración de las secuencias de codificación de las proteínas de consenso sobre un plásmido; o como parte de vacunas recombinantes y como parte de las vacunas atenuadas.
De acuerdo con algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones y usos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo contra el CHIKV. La vacuna puede ser cualquier tipo de vacuna tal como una vacuna viva atenuada, una vacuna recombinante, o una vacuna de ácido nucleico o de ADN.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende una, dos o las tres proteínas de consenso. En algunas realizaciones, la vacuna comprende secuencias de codificación de dos proteínas de consenso de la misma molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la vacuna comprende secuencias de codificación de dos proteínas de consenso de dos moléculas de ácido nucleico diferentes. En algunas realizaciones, la vacuna comprende secuencias de codificación de tres proteínas de consenso de la misma molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la vacuna comprende secuencias de codificación de tres proteínas de consenso, en la que las secuencias de codificación de dos están en la misma molécula de ácido nucleico y las secuencias de codificación de la tercera están en una segunda molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico comprende las secuencias de codificación de E1 y E2, y la otra comprende secuencias de codificación de la cápside;
o una molécula de ácido nucleico comprende secuencias de codificación de E1 y de la cápside, y la otra comprende secuencias de codificación de E2, o una molécula de ácido nucleico comprende las secuencias de codificación de E2 y la cápside, y la otra comprende secuencias de codificación de E1. En algunas realizaciones, la vacuna comprende secuencias de codificación de tres proteínas de consenso en las que hay tres moléculas de ácido nucleico diferentes y cada una comprende una secuencia de codificación diferente.
En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de E1 de consenso que incluye la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de E1 de consenso sin la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso con la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 7 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso es SEQ ID NO: 10 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso con la secuencia líder de IgE es un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % homóloga a SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso sin secuencia líder de IgE es un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % homóloga a SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de E2 de consenso que incluye la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO:
2. En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de E2 de consenso sin la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la proteína E2 de consenso con la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 8 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína E2 de consenso es SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína E2 de consenso con la secuencia líder de IgE es un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % homóloga a SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso sin secuencia líder de IgE es un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % homóloga a SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de la cápside de consenso que incluye la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de E1 de consenso sin la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO:
6. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso con la secuencia líder de IgE es SEQ ID NO: 9 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso es SEQ ID NO: 12o un fragmento de
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la misma. En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso con la secuencia líder de IgE es un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % homóloga a SEQ ID NO: 9 En algunas realizaciones, la proteína E1 de consenso sin secuencia líder de IgE es un 80%, 90%, 95%, 98% o 99% homóloga a SEQ ID NO: 12.
Puede haber múltiples genes en una sola molécula de ácido nucleico o múltiples moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico comprende secuencias de codificación de E1 y E2, y la otra comprende secuencias de codificación de la cápside; o una molécula de ácido nucleico comprende secuencias de codificación de E1 y la cápside, y la otra comprende secuencias de codificación de E2, o una molécula de ácido nucleico comprende secuencias de codificación de E2 y la cápside, y la otra comprende secuencias de codificación de E1. En algunas realizaciones, la vacuna comprende secuencias de codificación de tres proteínas de consenso en las que hay tres moléculas de ácido nucleico diferentes, y cada una comprende una secuencia de codificación diferente. La vacuna puede comprender una combinación de dos o más secuencias de consenso para E1, E2 y la cápside.
En algunas realizaciones, las vacunas comprenden una Env de consenso del CHIKV que comprende E1, E2 y E3 unidas entre sí como un único gen quimérico. En algunas realizaciones, las secuencias de consenso individuales están unidas entre sí con secuencias que codifican un sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende fragmentos de cada una de E1, E2 y E3, de modo que la expresión del gen quimérico en un individuo genera una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 90 % homóloga a SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 95 % homóloga a SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 98 % homóloga a SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 99 % homóloga a SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada uno de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 90 % homóloga a SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 95 % homóloga a SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 98 % homóloga a SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, el gen quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 99 % homóloga a SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias para que la expresión de la proteína en un individuo genere una respuesta inmunitaria contra cada uno de E1, E2 y E3.
En algunas realizaciones, las vacunas comprenden una Env del CHIKV de consenso que codifica secuencias de aminoácidos de consenso para E1, E2 y E3 unidas entre sí. En algunas realizaciones, las secuencias de consenso individuales están unidas entre sí con secuencias que codifican un sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, el gen quimérico codifica fragmentos de cada una de E1, E2 y E3, siendo las secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo inmunogénicas e inductoras de una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, la proteína Env del CHIKV de consenso comprende la SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma que comprende suficientes secuencias, siendo las secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo inmunogénicas e inductoras de una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, la proteína Env del CHIKV de consenso comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % homóloga a SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma, siendo las secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo inmunogénicas e inductoras de una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, la proteína Env del CHIKV de consenso comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % homóloga a SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma, siendo las secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo inmunogénicas e inductoras de una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, la proteína Env del CHIKV de consenso comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma, siendo las secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo inmunogénicas e inductoras de una respuesta inmunitaria contra cada una de E1, E2 y E3. En algunas realizaciones, la proteína Env del CHIKV de consenso comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 % homóloga a SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma, siendo las secuencias de aminoácidos codificadas
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dispositivo electromecánico o mecánico, pues los elementos pueden funcionar como un dispositivo o como elementos separados comunicados entre sí. El componente de electroporación es capaz de administrar el pulso de energía que produce la corriente constante en el tejido deseado, e incluye un mecanismo de retroalimentación. El conjunto de electrodos incluye un grupo de electrodos que tiene una pluralidad de electrodos en una disposición espacial, en el que el conjunto de electrodos recibe el pulso de energía desde el componente de electroporación y administra el mismo al tejido deseado a través de los electrodos. Al menos uno de la pluralidad de electrodos es neutro durante la administración del pulso de energía, y mide la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al componente de electroporación. El mecanismo de retroalimentación puede recibir la impedancia medida y puede ajustar el pulso de la energía administrado por el componente de electroporación para mantener la corriente constante.
En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos puede administrar el pulso de energía en un patrón descentralizado. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos puede administrar el pulso de energía en el patrón descentralizado a través del control de los electrodos en virtud de una secuencia programada, y la secuencia programada es introducida por un usuario en el componente de electroporación. En algunas realizaciones, la secuencia programada comprende una pluralidad de pulsos administrados por orden, en el que cada pulso de la pluralidad de pulsos es administrado por al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia, y en el que un pulso subsiguiente de la pluralidad de pulsos es administrado por uno diferente de al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia.
En algunas realizaciones, el mecanismo de retroalimentación se realiza por hardware o software. Preferentemente, el mecanismo de retroalimentación se realiza con un circuito de bucle cerrado analógico. Preferentemente, esta retroalimentación se produce cada 50 μs, 20 μs, 10 μs o 1 μs, pero es preferentemente una retroalimentación en tiempo real o instantánea (es decir, esencialmente instantánea según lo determinado mediante técnicas disponibles para la determinación del tiempo de respuesta). En algunas realizaciones, el electrodo neutro mide la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al mecanismo de retroalimentación, y el mecanismo de retroalimentación responde a la impedancia y ajusta el pulso de energía para mantener la corriente constante en un valor similar al valor deseado. En algunas realizaciones, el mecanismo de retroalimentación mantiene la corriente constante de forma continua e instantánea durante la administración del pulso de energía.
Cuando es absorbida por una célula, la una o más construcciones genéticas pueden permanecer presentes en la célula como una molécula extracromosómica funcional. El ADN puede introducirse en las células, donde está presente de forma transitoria, en forma de un plásmido o plásmidos. Como alternativa, se puede administrar ARN a la célula. También se contempla proporcionar la construcción genética como un minicromosoma lineal que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación. Las construcciones génicas pueden formar parte del material genético en microorganismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que se administran a los sujetos. Las construcciones génicas pueden formar parte de genomas de vacunas virales recombinantes en las que el material genético se mantiene extracromosómico. Las construcciones genéticas incluyen elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ácido nucleico. Los elementos incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada y una señal de poliadenilación. Además, los potenciadores suelen requerir la expresión génica de la secuencia que codifica la proteína diana o la proteína inmunomoduladora. Es necesario que estos elementos se unan operativamente a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores sean operativos en el individuo en el que se administran.
Un codón de iniciación y un codón de parada se consideran, en general, parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al que se administra la construcción génica. Los codones de iniciación y terminación deben estar en fase con la secuencia de codificación.
Los promotores y las señales de poliadenilación usados deben ser funcionales dentro de las células del individuo.
Los ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, incluyen, pero sin limitación, los promotores del virus de simio 40 (SV40), el promotor del virus del tumor de mama de ratón (MMTV), Virus de la Inmunodeficiencia Humana (MV) tal como el promotor de repetición terminal larga (LTR) del BIV, virus de Moloney, ALV, citomegalovirus (CMV) tales como el promotor temprano inmediato del CMV, virus de Epstein Barr (EBV), virus del sarcoma de Rous (RSV), así como promotores de genes humanos tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y metalotioneína humana.
Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, incluyen, pero sin limitación, las señales de poliadenilación de SV40, la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (bgh-PolyA) y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se usa la señal de poliadenilación de SV40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego Calif.), conocida como señal de poliadenilación de SV40.
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producir construcciones de ADN que sean funcionales en las células.
En algunas realizaciones, se pueden proporcionar construcciones de genes para producir secuencias de codificación de las proteínas inmunomoduladoras descritas en el presente documento unidas al péptido señal de IgE.
Una realización de la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico para la administración por vía intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o tópica, o para la administración por lavado al tejido mucoso seleccionada del grupo que consiste en administración por inhalación, vaginal, rectal, uretral, bucal y sublingual.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se administra a las células conjuntamente con la administración de un potenciador de la función del polinucleótido o un agente facilitador de vacunas genéticas. Los potenciadores de la función de los polinucleótidos se describen en las patentes de EE.UU. n.º 5.593.972 y
5.962.428. Los agentes facilitadores de vacunas genéticas se describen en la patente de EE.UU. n.º 5.739.118. Los coagentes que se administran conjuntamente con moléculas de ácido nucleico pueden administrarse como una mezcla con la molécula de ácido nucleico o administrarse por separado simultáneamente, antes o después de la administración de las moléculas de ácido nucleico. Además, también se pueden administrar en combinación con la construcción genética otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios, y que pueden administrarse junto con un potenciador de la función del polinucleótido incluyendo factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tales como a-interferón, gamma-interferón, GM-CSF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL10, IL-12 e IL-15, así como factor de crecimiento de fibroblastos, agentes tensioactivos tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOM), análogo de LPS, incluyendo monofosforil lípido A (WL), péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno, y escualeno y ácido hialurónico. En algunas realizaciones, se puede usar una proteína inmunomoduladora como potenciador de la función del polinucleótido. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se proporciona en asociación con poli(lactida-co-glicólido) (PLG), para mejorar la administración/absorción.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden de aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 2.000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden de aproximadamente 5 nanogramos a aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se formulan de acuerdo con el modo de administración que se vaya a usar. En los casos en los que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, son estériles, apirógenas y exentas de partículas. Preferentemente, se usa una formulación isotónica. En general, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico y vacunas recombinantes para su uso en la inducción de respuestas inmunes contra el virus Chikungunya. La vacuna puede ser una vacuna viva atenuada, una vacuna recombinante, o una vacuna de ácido nucleico o ADN.
La/s molécula/s de ácido nucleico se pueden proporcionar como ADN de plásmido, moléculas de ácido nucleico de vectores recombinantes o como parte del material genético proporcionado en una vacuna atenuada. Como alternativa, en algunas realizaciones, la proteína de consenso se puede administrar como una proteína, además de las moléculas de ácido nucleico que las codifican o en lugar de las moléculas de ácido nucleico que las codifican.
Las construcciones genéticas pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína diana o una proteína inmunomoduladora unida operativamente a elementos reguladores necesarios para la expresión génica. De acuerdo con la invención, se proporcionan combinaciones de construcciones génicas que incluyen una construcción que comprende una forma expresable de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana y una construcción que incluye una forma expresable de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína inmunomoduladora. La administración a una célula viva de la/s molécula/s de ADN o ARN que incluyen la combinación de construcciones génicas da lugar a la expresión del ADN o ARN y a la producción de la proteína diana y una o más proteínas inmunomoduladoras. Se produce una mejor respuesta inmune contra la proteína diana.
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inmunizados y sin tratamiento durante 1 h a 37 ºC. La IgG unida se detectó usando IgG anti-ratón de cabra-HRP (Research Diagnostics, NJ) a una dilución de 1:5000. La enzima unida se detectó mediante la adición de la solución de sustrato cromógeno TMB (R&D Systems), y se leyó a 450 nm en un lector EL312e Bio-Kinetics de Biotek. Todas las muestras de suero se ensayaron por duplicado [22].
Resultados
Expresión de las construcciones de consenso:
Se verificaron las expresiones de las tres construcciones de consenso de CHIKV usando múltiples técnicas. Para visualizar las proteínas producidas in vitro, se realizó un ensayo de transcripción y traducción acoplado a T7 in vitro marcado con S35. Los productos de la traducción se inmunoprecipitaron usando el anticuerpo con marcador de His, y se realizó el análisis en gel. El análisis de SDS-PAGE y el análisis radiográfico mostraron que cada construcción (envoltura E1 y E2, y la cápside) se desarrolla a su peso molecular predicho teóricamente (Fig. 2A). A continuación, se trató de examinar la expresión de estas construcciones en células de mamíferos in vivo. Tras la transfección a células BHK-21, se extrajeron las proteínas tras tres días y se detectó la expresión usando anticuerpos policlonales específicos mediante análisis de transferencia Western (Fig. 2B). En las células transfectadas a la construcción de la envoltura E1, se observó una proteína de 52 kDa, observándose una proteína de 36 kDa en las células transfectadas a la construcción de la cápside tras la inmunotransferencia con anticuerpos específicos.
Inmunogenicidad humoral
Los presentes inventores tienen la hipótesis de que la fuerza de los presentes inmunógenos de consenso para proteger contra el virus CHIK letal recaerá en el grupo celular del sistema inmune. Además, los anticuerpos de reacción cruzada, pero no neutralizantes, pueden proporcionar un cierto grado de protección contra la gravedad de la enfermedad. Para determinar si las presentes construcciones inducen respuestas de anticuerpos, se realizó un ELISA de anticuerpos en suero de ratón inmunizado con CHIK para determinar el título de los anticuerpos de los sueros obtenidos tras las inmunizaciones de ADN que se ensayaron para determinar la respuesta de los anticuerpos por ELISA. El anticuerpo IgG específico anti-E1 de los sueros de los ratones inmunizados con la envoltura E1 fue significativamente superior que en los sueros de los ratones inmunizados con control de vector (Fig. 3A). Del mismo modo, el anticuerpo IgG específico anti-E2 y el anticuerpo IgG específico anti-cápside en los sueros de ratones inmunizados con las construcciones de envoltura E2 y de cápside respectivamente fueron significativamente superiores que en los sueros de ratones inmunizados con control de vector (Fig. 3B y C). Estos resultados apoyaron aún más los medios alternativos de administración de plásmidos, en concreto, la electroporación aumentó la respuesta de producción de anticuerpos hacia el inmunógeno de vacuna de ADN.
Inmunogenicidad celular
A continuación, se determinó la capacidad de las construcciones de E1, E2 y cápside para inducir las respuestas de CTL CD8+ mediante ensayos ELISpot de IFN-γ. Las construcciones de envoltura E1 y E2 de consenso, así como las vacunas de cápside fueron capaces de inducir fuertes respuestas de IFN-γ en ratones C57BL/6 tras tres inmunizaciones (Fig. 4A, 5A y 6A). Para la caracterización molecular de las respuestas inmunes celulares inducidas por la envoltura E1, se realizó el ensayo ELISpot contra una biblioteca de péptidos que abarcaban toda la envoltura E1. Se usaron setenta y cuatro péptidos 15-meros con 9 solapamientos de aminoácidos entre ellos, que abarcaban los restos 1-435 de la proteína E1, y péptidos que abarcaban 1-423 de la proteína E2. Las envolturas indujeron un epítope dominante HSMTNAVTI en la proteína E1 (Fig. 4B) e IILYYYELY en la proteína E2 (Fig. 5B). Del mismo modo, para la proteína de cápside, se realizó el ensayo ELISpot contra una biblioteca de péptidos que abarcaban toda proteína de cápside. Se usaron cuarenta y cinco péptidos 15-meros con solapamientos de 9 aminoácidos entre ellos, que abarcaban los restos 1-261 de la proteína de cápside. El epítope dominante ACLVGDKVM fue inducido por la construcción de cápside (Fig. 5B). Cabe señalar que el epítope dominante que es inducido por la construcción CHIKV-E1 porta la mutación 226A-V, lo que sugiere que la construcción también puede inducir eficazmente la respuesta inmune contra el virus mutante recién surgido. Este hallazgo puede sugerir que la respuesta inmune puede ser capaz de impulsar la evolución del virus a través del proceso de selección celular.
Discusión
La evaluación de la respuesta inmune inducida en los ratones C57BL/6 mostró que las construcciones eran altamente inmunogénicas y que provocaron la respuesta inmune de linfocitos T en términos de una respuesta y proliferación de IFN-γ. Los datos del ELISpot del presente estudio sugieren que la magnitud de la respuesta de IFN-γ fue generalizada en cuanto al número obtenido de manchas. Aunque se sabe que la proteína de envoltura y cápside en otros virus alfa relacionados es inmunogénica, poco se sabe sobre la inmunogenicidad de las proteínas de envoltura y cápside del Chikungunya. La generación de producción de IFN-γ a partir de esplenocitos por agrupaciones de péptidos de la matriz de diferentes regiones de la envoltura E1 y la cápside identificaron los epítopes dominantes de linfocitos T HSMTNAVTI y ACLVGDKVM en las proteínas E1 y cápside, respectivamente. Se encontró el aumento de los niveles totales de IgG en los ratones vacunados en comparación con los de los controles no vacunados, lo que sugiere la inducción de una potente respuesta inmune humoral. Actualmente, se
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